(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2016-0084175 (43) 공개일자 2016년07월13일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 38/16 (2006.01) A61K 36/237 (2006.01) C07K 14/415 (2006.01) (52) CPC 특허분류 A61K 38/168 (2013.01) A61K 36/237 (2013.01) (21) 출원번호 10-2015-0000749 (22) 출원일자 2015 년 01 월 05 일 심사청구일자 없음 전체청구항수 : 총 4 항 (71) 출원인 권영아 서울강남구압구정로 29 길 71, 12 동 1403 호 ( 압구정동, 현대아파트 ) (72) 발명자 최원철 인천광역시남구경원대로 884, 103 동 401 호 ( 주안동, 더월드스테이트아파트 ) 권성필 서울특별시송파구동남로 193, 103 동 103 호 ( 가락동, 가락쌍용아파트 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이처영, 장제환 (54) 발명의명칭식물유래루테리온의암줄기세포의성장및 / 또는분화억제용도 (57) 요약 본발명은식물유래루테리온의암줄기세포의성장및 / 또는분화억제용도에관한것으로, 보다구체적으로는식물유래루테리온을함유하는암줄기세포의성장및 / 또는분화억제용조성물및식물유래루테리온을이용한암줄기세포의성장및 / 또는분화억제방법에관한것이다. 본발명에따른식물유래루테리온은, 암줄기세포의성장및 / 또는분화를효율적으로억제하므로, 암의근원을치료하는항암제로유용하다. 대표도 - 도 2-1 -
(52) CPC 특허분류 C07K 14/415 (2013.01) (72) 발명자 전현정 미국매사추세츠주소머빌, 19 센트럴스트릿, 아파트 28 호, 02143 권영아 서울강남구압구정로 29 길 71, 12 동 1403 호 ( 압구정동, 현대아파트 ) 최석훈 서울특별시강남구압구정로 29 길 71, 구현대아파트 12 동 1403 호 ( 압구정동 ) 최창훈 서울특별시강남구압구정로 29 길 71, 구현대아파트 12 동 1403 호 ( 압구정동 ) - 2 -
명세서청구범위청구항 1 식물유래루테리온을유효성분으로함유하는암줄기세포의성장및 / 또는분화억제용조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 상기식물은강활 (Ostericum koreanum Maximowicz), 독활 (Aralia continentalis Kitagawa), 형개 (Schizonepeta tenuifolia Briquet), 방풍 (Saposhnikovia divaricata Schischkin), 생지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel), 복령 (Poria cocos Wolf), 전호 (Angelica decursiva Franchet et Savatier), 차전자 ( 질경이 (Plantago asiatica Linne)), 지골피 ( 구기자 (Lycium chinense Miller)), 시호 (Bupleurum falcatum Linne), 택사 (Alisma orientale Juzepzuk), 목통 (Akebia quinata Decaisne), 현삼 (Scrophularia ningpoensis Hemsley), 괄루인 (Trichosanthes kirilowii Maximowicz), 저령 (Polyporus umbellatus Fries), 황련 (Coptis japonica Makino), 고삼 (Sophora flavescens Solander ex Aiton), 황백 (Phellodendron amurense Ruprecht), 지모 (Anemarrhena asphodeloides Bunge), 숙지황 (Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel), 산수유 (Cornus officinalis Siebold et Zuccarini), 목단피 (Paeonia suffruticosa Andrews), 복분자 (Rubus coreanus Miquel), 인동등 (Lonicera japonica Thunberg), 박하 (Mentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud ex Holmes), 치자 (Gardenia jasminoides Ellis), 연교 (Forsythia viridissima Lindley), 우방자 (Arctium lappa Linne), 미후등 ( 다래 (Actinidia arguta PLANCH)), 미후도 (Actinidia arguta Fructus), 목과 (Chaenomelis Fructus), 포도근 (Vitis vinifera Radix), 노근 (Phragmitis Rhizoma), 엥도 (Prunus tomentosa Thunb), 오가피 (Acanthopanax sessiliflorum SEEM), 송화분 (Pinus densiflora S. et Z), 저두강반시 (rice bran on a mallet head), 청송절 (Pinus tabulaeformis), 교맥미 (Semen Fagopyri), 옻나무 (Rhus verniciflua), 천궁 (Cnidium officinale Makino), 당귀 (Angelica Gigas Nakai), 진피 (Citri Unshius Pericarpium), 적하수오 (Polygonum multiflorum Thunberg), 백수오 (Cynanchum wilfordii Hemsley), 인삼 (Panax ginseng C. A. Meyer), 백출 (Atractylodes japonica Koidzumi), 창출 (Atractylodes lancea De Candlle), 건강 ( 생강 (Zingiber officinale Roscoe)), 육계 ( 계피 (Cinnamomum cassia Presl)), 청피 ( 귤나무 (Citrus unshiu Markovich)), 곽향 (Agastache rugosa O. Kuntze), 자소엽 (Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo), 대추 (Zizyphus jujuba Miller var. inermis Rehder), 감초 (Glycyrrhiza uralensis Fischer), 부자 (Aconitum carmichaeli Debeaux), 향부자 (Cyperus rotundus Linne), 황기 (Astragalus membranaceus Bunge), 백작약 (Paeonia lactiflora Pallas), 소회향 (Foeniculum vulgare Miller), 고량강 (Alpinia officinarum Hance), 대복피 (Areca catechu Linne), 반하 (Pinellia ternata Breitenbach), 남성 (Arisaema amurense Maximowicz var. serratum Nakai), 익지 (Alpinia oxyphylla Miquel), 지실 ( 탱자나무 (Poncirus trifoliata Rafinesque)), 후박 (Magnolia ovobata Thunberg), 목향 (Aucklandia lappa Decne), 오수유 (Evodiae rutaecarpa Bentham), 파고지 (Psoralea corylifolia Linnㅹ ), 총백 ( 파뿌리 (Allium fistulosum Linnㅹ )), 사인 (Amomum villosum Loureiro), 산사 (Crataegus pinnatifida Bunge), 마황 (Ephedra sinica Staph), 감국 (chrysanthemum indicum Linne), 질경 ( 도라지 (Platycodon grandiflorum)), 행인 ( 살구나무 (Prunus armeniaca var. ansu Max.)), 백지 (Angelica dahurica BENTH. et HOOK), 맥문동 (Liriope muscari BALL), 천문동 (Asparagus cochinchinensis Merr), 산약 ( 참마 (Dioscorea japonica THUNB)), 산조인 (Zizyphus jujube), 용안육 (Dimocarpus longan Lour), 원지 (Polygala tenuifolia), 석창포 (Acorus graminens SOLAND), 오미자 (Schizandra chinensis BAALL), 건율 (Castanea crenata S.et Z.), 의이인 (Coix lachryma-jobi var. ma-yuen), 나복자 ( 무 (Raphanus sativus L)), 갈근 ( 칡 (Pueraria thunbergiana)), 황금 (Scutellaria baicalensis GEORG), 고본 (Angelica tenuissima NAKAI), 녹용 (Cervi Parvum Cornu), 대황 (Rheum palmatum), 승마 (Cimicifuga heracleifolia KOM), 백자인 (Biota orientalis ENDL), 상백피 ( 뽕나무 (Morus alba L)), 관동화 (Tussilago farfara), 백과 (Gingko biloba L), 사향풀 (Thymus vularis) 및조각 (Gleditsia japonica Miquel var.koraiensis Nakai) 으로구성된군으로부터선택되는약용식물인것을특징으로하는조성물. - 3 -
청구항 3 제 2 항에있어서, 상기약용식물은 Rhus verniciflua stokes 인것을특징으로하는조성물. 청구항 4 식물유래루테리온을처리하는것을특징으로하는암줄기세포의성장및 / 또는분화억제방법. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은식물유래루테리온 (Luterion; 미토콘드리아유사미세물질 ) 을이용한암줄기세포성장및 / 또는분화 억제방법및식물유래루테리온을함유하는암줄기세포억제용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 배경기술암줄기세포가설은크게두개의구성요소로이루어져있다. 첫째, 종양은조직의줄기세포에서발생한다는것. 둘째, 그세포로부터발생하여구성된종양은줄기세포의기본특성을가지고있어야한다는것이다. 암줄기세포 (Cancer stem cells; CSCs) 는특정암샘플에서발견되는, 모든세포유형으로분화할수있는능력을가지는정상적인줄기세포와같은특성을가지는암세포이다. 악성종양이보이는다양한이질성이줄기세포의다양한분화성과일치하며, 많은표적치료에도불구하고끊임없이발현되는암세포의약물저항성은줄기세포의기본특성과일치하는데이로써종양의발생과줄기세포를연관지어생각할수있으며, 암줄기세포는새로운표적치료분야가될수있음을추측할수있다. 암줄기세포는줄기세포의특징인다양한세포유형으로의자가재생과분화과정을통해종양을형성할수있다. 이러한세포들은종양내에서눈에띄는숫자로계속유지되고재발과전이를일으켜새로운종양을생기게한다. 따라서, 암줄기세포를표적으로하는특정한치료법의개발이암환자들의생존과삶의질의향상에희망을주고있으며, 특히전이성암환자에있어서더욱그렇다. 현존하는암치료방법은대부분동물모델을기반으로발전하였고, 동물모델에서는그치료법이종양이줄어드는데에효과가있는것으로여겨졌다. 그러나동물은인간의질병에대해완벽한모델이될수없다는한계가있다. 특히, 쥐는생존기간이 2년을넘지않기때문에암의재발을연구하기에는더욱어렵다. 어떤암치료법의효능은주로종양부피의비율이얼마나감소되는지로측정된다. 그러나암줄기세포는종양의아주작은비율만을차지하기때문에, 치료제가줄기세포에특정적으로작용할것이라고기대하기어렵다. 도 1에서와같이, 전통적인화학요법은종양의큰부분을구성하지만새로운세포를생산할수는없는, 이미분화되었거나분화하고있는세포만을죽인다는것을알수있다. 암줄기세포조직은이러한세포를다시생성해내며, 암줄기세포자체에치료제가작용하기힘들어암을재발시킬수있다는데에문제가있다 (Wikipedia). 기존의항암요법인화학요법 (chemotherapy) 은독자적으로또는다른치료법 ( 방사능요법등 ) 과조합하여현재암을치료하기위한가장일반적이며효율적인치료도구로사용되고있는것중의하나이다. 그러나, 상기약물의사용에있어서, 이들이암세포뿐만아니라암세포가아닌일반적인세포에도역으로작용할수있다는사실또한문제가된다. 암줄기세포에대한관심은항암치료가종양내의이러한세포군을효과적으로표적화하여치료하지못한데서항암치료가실패하고종양의재발로연결된것은아닌가하는데있다. 많은세포독성항암제는대개빠르게증식하는세포를표적으로하고있어서아마도약물에대한반응은실제적으로이행증폭세포에대한반응이었을것이고천천히증식하는특징을가진암줄기세포는세포독성항암요법에서살아남을수있었을것이다. 기저세 - 4 -
포형 (basal cell phenotype) 유방암은분화과정의초기단계의유선모세포 (earliest mammary progenitor cell) 에서기원한것으로여겨지며, 예후가불량하고기존의항암요법에내성을나타낸다고알려져있는데, 항암치료의실패원인이암줄기세포에대한표적치료가안되었기때문이란것을지지하는좋은예라할수있다 (KR 10-1289033). 이러한문제점을해결하기위해한국등록특허 KR 10-1289033에서는뇌종양세포로부터암줄기세포를확립하고, 상기암줄기세포의성장억제용조성물인 2-파이론유래화합물을개시한바있다. [0009] [0010] [0011] 지금까지암줄기세포에대한연구에는제한성도많고, 종양의형성이나유지에서의역할에대해서는아직까지확실하게밝혀진것은없다. 정상줄기세포에는손상을주지않으면서암줄기세포만을표적으로하는치료를효율적으로수행하기위해서는암줄기세포의유지와조절에중요한분자생물학적인특성이나그조절경로에대한지식과이해가필요하다. 기존에는암줄기세포를직접적으로타겟팅하는항암제나천연물유래추출물의연구는거의없는실정이었다. 종래의기술은암줄기세포의직접적인타겟유전자를억제하는실험으로암줄기세포를억제하거나또는암줄기세포의상위신호전달단백질을억제하여암줄기세포를억제하는연구들이진행되어졌다. 그러나많은종양환자에있어서종양유전자의변이나단백질의변이로이러한타겟팅실험이어려움이많았다. 이에, 본발명자들은화학물질이나신호전달단백질을암줄기세포에처리하는대신, 식물로부터분리된미토콘드리아유사미세물질인루테리온 (Luterion) 이암줄기세포의성장또는분화를효과적으로억제한다는것을규명하고본발명을완성하게되었다. 발명의내용 [0012] 해결하려는과제 본발명의목적은새로운개념으로암줄기세포의성장또는분화를억제하는방법및조성물을제공하는데있 다. [0013] [0014] [0015] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은식물유래루테리온을유효성분으로함유하는암줄기세포의성장및 / 또는분화억제용조성물을제공한다. 본발명은또한, 식물유래루테리온을투여하는것을특징으로하는암줄기세포의성장및 / 또는분화억제방법을제공한다. [0016] [0017] 발명의효과 본발명에따른식물유래루테리온은, 암줄기세포의성장및 / 또는분화를효율적으로억제하므로, 암의근원을 치료하는항암제로유용하다. [0018] [0019] 도면의간단한설명 도 1 은암줄기세포특이적인치료와전통적인암치료를비교하여보여주는모식도이다. 도 2는식물유래미세물질인루테리온을공초점레이저주사현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope, Zeiss) 으로촬영한사진으로그크기를함께나타낸것이다. 도 3은식물유래미세물질인루테리온을미토트랙커 (Mito-tracker) 로염색한다음, 그발색유무를관찰한사진을나타낸것이다. 도 4는식물유래미세물질인루테리온을로다민123(Rhodamine123) 으로염색한뒤그발색유무를관찰한사진을나타낸것이다. - 5 -
도 5는식물유래미세물질인루테리온의형광 / 비형광사진을비교하여나타낸것이다 (A: 야누스그린B(Janus Green B) Positive; B: 로다민 123(Rhodamine 123) Positive; C: 미토트랙커 (Mito-tracker) Red Positive; D: 무염색 ). 도 6은식물유래미세물질인루테리온이로다민 123, 미토트랙커레드, 야누스그린B(Janus green B) 에의하여공통적으로염색한뒤그발색유무를나타낸것이다 (A: 야누스그린B(Janus Green B) Positive; B: 로다민 123(Rhodamine 123) Positive; C: 미토트랙커 (Mitotracker) Red Positive; D: 무염색 ). 도 7은식물유래미세물질인루테리온의형광염색부위크기를측정하여루테리온의크기 (50~800nm) 를나타낸것이다 (A: 야누스그린B(Janus Green B) 반응크기측정 ; B: 로다민 123(Rhodamine 123) 반응크기측정 ; C: 미토트랙커 (Mito-tracker) Red 반응크기측정 : D: 무염색반응크기측정 ). 도 8은루테리온이이중막구조를가진다는것을확인한 TEM 전자현미경사진이다. 도 9는루테리온이내부에핵산을함유하는것을확인한원자현미경사진이다. 도 10은루테리온내부에 RNA가함유되어있는지여부를분석한바이오아날라이저결과이다 (L: Control; 1: 50nm이하, 2: 50 100nm, 3: 100 200nm, 4: 200 400nm). [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] 발명을실시하기위한구체적인내용달리정의되지않는한, 본명세서에서사용된모든기술적및과학적용어들은본발명이속하는기술분야에서숙련된전문가에의해서통상적으로이해되는것과동일한의미를갖는다. 일반적으로, 본명세서에서사용된명명법및이하에기술하는실험방법은본기술분야에서잘알려져있고통상적으로사용되는것이다. 본발명의암줄기세포는다양한암세포로분화할수있는능력을가진미분화세포로서, 상기암은암종 (carcinoma), 림프종 (lymphoma), 모세포종 (blastoma), 육종 (sarcoma), 지방육종 (liposarcoma), 신경내분비종 (neuroendocrine tumor), 중피종 (mesothelioma), 신경초종 (schwanoma), 수막종 (meningioma), 샘암종 (adenocarcinoma), 흑색종 (melanoma), 백혈병 (leukemia), 악성림프종 (lymphoidmalignancy), 편평세포암종 (squamous cell cancer), 편평상피세포암 (epithelial squamous cell cancer), 폐암 (lung cancer), 소세포폐암 (small-cell lung cancer), 비소세포폐암 (non-small cell lung cancer), 폐샘암종 (adenocarcinoma of the lung), 폐편평암종 (squamous carcinoma of the lung), 복막종 (cancer of the peritoneum), 간세포성종 (hepatocellular cancer), 위암종 (gastric or stomach cancer), 위장관종 (gastrointestinal cancer), 췌장암 (pancreatic cancer), 뇌암, 아교모세포종 (glioblastoma), 자궁경부암 (cervical cancer), 난소암 (ovarian cancer), 간암 (liver cancer), 방광암 (bladder cancer), 간암 (hepatoma), 유방암 (breast cancer), 결장암 (colon cancer), 직장암 (rectal cancer), 결장직장암 (colorectal cancer), 자궁내막또는자궁암 (endometrial or uterine carcinoma), 침샘암 (salivary gland carcinoma), 신장암 (kidney and renal cancer), 전립선암 (prostate cancer), 외음암 (vulval cancer), 갑상선암 (thyroid cancer), 간암종 (hepatic carcinoma), 항문암종 (anal carcinoma), 음경암종 (penile carcinoma), 고환암 (testicular cancer), 식도정맥류암 (esophageal cancer), 담도암 (biliary tract) 및두경부암 (head and neck cancer) 으로구성되는군으로부터선택될수있으나, 이에국한되는것은아니다. 암줄기세포 " 분화억제 " 는세포가분열증식하여성장하는동안에서로구조나기능이특수화하는현상, 즉생물의세포, 조직등이각각에게주어진일을수행하기위하여형태나기능이변해가는것을억제하는것을말한다. 일반적인줄기세포의분화는전능성 (Totipotency; 개체를형성할수있는분화능을말하며, 임신초기에수정란이갈라지면서일란성쌍둥이가생기는것과같은이치 ), 만능성 (Pluripotency; 태아나성체의모든세포로가는분화능을말하며, 초기수정란세포가분열하면서여러장기로분화되기전단계의세포로써이러한세포는심장, 췌장, 간, 피부, 신경등등다양한장기로분화가가능 ), 다능성 (Multipotency; 제한된배엽의세포로만가는분화능을말하며, 제한된장기로만분화가가능 ) 을모두포함하나, 암줄기세포분화의형태는주로정해진기관내의세포형태로만분화하는다능성 (multipotency) 을의미한다. 상기암줄기세포 " 성장억제 " 는암줄기세포의자가재생 (self-renewal) 및세포수의증식 (proliferation) 을억제하는것을의미하며, 암줄기세포유지 (mainternance) 억제, 암줄기세포악성화 (malignance) 억제및암줄기세포침윤활성 (invasive) 억제를포함하는의미이다. 본발명에서사용되는 " 억제제또는저해제 (inhibitor)" 는암줄기세포의성장또는분화와관련된활성을억제, 차단또는감소시키는물질을의미한다. 억제제의활성메커니즘은특별히제한되지않는다. 예를들어, - 6 -
' 암줄기세포억제제 ' 는종양발생 (tumorigenesis) 에서의암줄기세포의활성을억제, 차단또는감소시키는물 질을포함할수있다. [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] " 치료 " 는이롭거나바람직한임상적결과를수득하기위한접근을의미한다. 본발명의목적을위해서, 이롭거나바람직한임상적결과는비제한적으로, 증상의완화, 질병범위의감소, 질병상태의안정화 ( 즉, 악화되지않음 ), 질병진행의지연또는속도의감소, 질병상태의개선또는일시적완화및경감 ( 부분적이거나전체적으로 ), 검출가능하거나또는검출되지않거나여부를포함한다. 또한, " 치료 " 는치료를받지않았을때예상되는생존율과비교하여생존율을늘이는것을의미할수도있다. " 치료 " 는치료학적치료및예방적또는예방조치방법모두를가리킨다. 상기치료들은예방되는장애뿐만아니라이미발생한장애에있어서요구되는치료를포함한다. 질병을 " 완화 (Palliating)" 하는것은치료를하지않은경우와비교하여, 질병상태의범위및 / 또는바람직하지않은임상적징후가감소되거나및 / 또는진행의시간적추이 (time course) 가늦춰지거나길어지는것을의미한다. 본발명에서사용하는용어 " 루테리알 (Luterial)" 및 " 루테리온 (Luterion)" 은각각동물및식물에존재하는생명인자 (living organism) 로서, 바이러스와유사한정도부터약 500nm까지 ( 정상피션단계 50~500nm/ 비정상퓨전단계 800nm 내외혹은그이상 ) 의크기를가지는미세물질을본발명자가명명한것이다. 상기루테리알및루테리온은 DNA 및 RNA를포함하며 ( 도9~ 도10), 운동성과부착성을가진다는점에서엑소좀 (exosome) 이나미소포 (microvesicle) 와는구별된다. 미토콘드리아는야누스그린 B(Janus green B) 및형광염색인로다민123(Rhodamine123), 미토트랙커 (Mitotracker), 아크리딘오렌지 (Acridine Orange), 및 DAPI에의해발색이확인되는데, 상기루테리온및루테리알도미토콘드리아와동일한염색약에의해발색이확인되며 ( 도 2 내지도 7), 미토콘드리아와유사하게이중막을가진막구조로서내부크리스테 (cristae) 구조를완성하지않은상태의구조를가지고 ( 도 8), 미토콘드리아와동일한레이저파장범위에서관찰된다는점에서 " 유사미토콘드리아 ", " 미토콘드리아유사체 " 혹은 " 미토콘드리아전구체 (proto-mitochondria)" 라고도지칭할수도있다. 인간을포함한동물의경우에는혈액, 타액, 림프관, 정액 질액, 모유 ( 특히, 초유 ), 제대혈, 뇌세포, 척수, 골수에존재하며 " 루테리알 " 로지칭된다. 아울러, 식물에존재하는물질은 " 루테리온 " 으로지칭된다. 식물루테리온은특히줄기부분에다량존재한다. 루테리알은시그널링, 세포분화, 세포사멸뿐아니라세포사이클및세포성장의조절과도관련이있을것으로예상되는데, 본발명자는그중에서도루테리알이암의진단에밀접한관련이있음을발견한바있다 ( 대한민국특허출원 10-2013-0082060호 ). 구체적으로, 정상적인루테리알이나루테리온은암세포의성장을막고, 세포를건강한면역체계로되돌리는역할을하는것으로예상되는데, 그역할은유전자를정상화시키는가능성을지닌 RNAi(RNA interference; RNA 간섭 ) 에의해수행되는것으로추정된다. 이와같이, 건강한사람이나동물의혈액내에서루테리알은 RNA 내에있는정보체계가정상궤도에서벗어나이상질환을유발하는단백질을생산하도록지시할경우, 이를인위적으로간섭하여암등의질병발생을억제하도록작용하며, 크기가 200-500nm 이상으로성숙하였을때에는에너지대사에도관여하며, 특정한파장을조사 ( 照射 ) 하였을때, 반응발현으로빛에너지증폭기능을하며, 엽록체처럼반응하는것으로확인된다. 이에, 이러한루테리알이정상적인역할을수행하지못할경우에는항상성및 ATP 생산에결정적인장애를유발하여, 호흡및에너지대사모두에질병을유발시킬수있다. 정상적인역할을수행하지못하는돌연변이루테리알은, 정상적인루테리알과는생태및특성이상이하여그크기나형태가다양하다. 구체적으로, 정상적인루테리알의경우는이중포자를형성한후, 더이상증식하지는않으나, 암환자나만성질병을가지는환자의혈액내에서발견되는돌연변이루테리알의경우에는줄기세포와유사하게무한히증식하는특성을가져 600-800nm 이상부터, 어떤것은 200μm(200,000nm) 이상의크기를가진다. 또한, 바이러스와유사하게적혈구, 백혈구, 혈소판등에침입하여생장하거나, 다른루테리온이나루테리알과응집하는특성을보인다. 한편, 사람또는동물의혈액에서유래한루테리알의경우에는생체외에서는빠른시간내에용해되어소멸되거나형태가변하는특성이있어관찰자체가어려우며, 비정상적인환경하에두는경우에는 24시간이내에정상적인루테리알도돌연변이루테리알로변이되어질병의치료에이용하는데어려움이있다. 그러나식물유래루테리온은혈액유래루테리알과는달리실온에서도빠른시간내에용해되거나소멸되지는않으며, 장기간보관하여도퓨전 (fusion) 하여돌연변이화되지않는특성이있다. 뿐만아니라, 환자의혈액유래의돌연변이된루테리알과반응하여더이상퓨전 (fussion) 이발생하지않도록그생장을억제하고, 환자의 - 7 -
혈액유래의성숙단계에있는루테리알의성숙을억제하여루테리알이돌연변이되거나퓨전 (fusion) 하여생장 하는것을억제할수있다. [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] 상기식물유래루테리온의특성은루테리온의 RNAi 기능에의한것으로예상되는데, 이러한 RNAi 기능을이용하여특정질병을갖는환자유래의루테리알의돌연변이화또는성숙을억제하거나예방할수있어, 궁극적으로는특정질병을치료하거나예방하는물질로, 또는그러한물질을스크리닝하는데이용될수있을것이라예상된다. 한편, 본발명자들은식물유래루테리온을분리하고, 그특성을규명하여특허를출원한바있다. 상기분리된식물유래루테리온은다음과같은특성을가진다 : (a) 50~800nm의원형내지타원형으로, 운동성이있음 ; (b) 핵산함유 ; (c) 면역화학형광염색시미토콘드리아와유사한반응을나타냄 ; (d) 퓨전 (fusion) 및 / 또는피전 (fission) 생태양식을나타냄 ; (e) 퓨전이없을경우크기가 500nm까지성숙하고, DNA 함유유사미토콘드리아로성숙하며, SEM 또는 TEM 전자현미경사진상에서미토콘드리아와유사한구조를나타냄 ; (f) 엑소좀과는다른빛반응을나타냄 ; (g) IR 조사시피전 (fission) 이발생함 ; (i) 자가형광 (autofluorescence) 을나타냄 ; (j) 200~400nm 크기에서 ATP를생산함 ; (k) 이중막구조 ; (l) 부착성이있음 ; 및 (m) 혈액유래루테리알과반응시, 혈액유래루테리알의융합 (fusion) 을억제하거나피션 (fission) 을촉진함. 상기식물유래루테리온은그밀도가 1 이하로지방및지질보다는높은밀도를가지며단백질보다는낮은밀도를나타내므로, 수증기증류법에의하여식물로부터분리할수있다. 본발명의일실시예에서는식물유래루테리온을분리한다음, 암줄기세포에처리한결과, 암줄기세포의성장과분화가억제되는것을확인하였다. 따라서, 본발명은식물유래루테리온을유효성분으로함유하는암줄기세포의성장및 / 또는분화억제용조성물에관한것이다. 본발명에있어서, 루테리온은옻나무 (Rhus verniciflua) 유래인것을특징으로할수있으나, 암줄기세포의성장및 / 또는분화억제능을가지는한, 이에국한되지는않는다. 예를들면, 표 1~4에기재된약용식물유래루테리온을사용할수있으며, 루테리온은모든식물에존재하므로표 1~4에기재된약용식물로그소스가제한되지는않는다. - 8 -
[0053] [ 표 1] [0054] [0055] [ 표 2] [0056] - 9 -
[0057] [ 표 3] [0058] - 10 -
[0059] [ 표 4] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] 이와같은특성을갖는식물루테리온이암줄기세포의분화또는성장을억제하는메커니즘은다양하다. 예를들면, 암줄기세포의직접적인타겟유전자를억제하거나또는암줄기세포의상위신호전달단백질을억제하여암줄기세포를억제할수있다. 다만, 이미언급한바와같이, 본발명의식물유래루테리온은 RNA간섭 (RNAi) 메커니즘을통해암줄기세포의분화또는성장을억제하는것으로추정된다. RNA 간섭 (RNA interference; RNAi) 에대한정의는다음과같다. RNAi는세포내에서활성화상태의유전자와그렇지않은유전자를구별하는역할을한다. microrna(mirna) 와 small interfering RNA(siRNA) 와같은두가지의작은 RNA 분자 (small RNA molecules) 가이현상의중심에있다. RNA는유전자의직접적인산물이며, 앞에서언급된작은 RNA( 이하 small RNA로표기 ) 들은다른 RNA에결합하여이들의활성을증가시키거나감소시킬수있다. mrna가단백질을발현하는것을억제하는것이적절한예일것이다. RNAi 현상은바이러스와전위인자 (transposon) 와같은기생유전자로부터세포를보호하는기능을가짐과동시에일반적인유전자의발현을조절하는기능을한다. 동물을포함한많은진핵생물에서발견되는 RNAi 경로는, 긴이중가닥 RNA(double-stranded RNA, dsrna) 를 20 개내외의뉴클레오티드로절단하는기능을하는 Dicer 효소에의해개시된다. Dicer의핵산내부가수분해효소 (endonuclease) 활성이이와같은작용을가능하게해준다. 이들가닥중 guide strand로알려진한가닥은 RNA-induced silencing complex(risc) 의일부로편입된다. 이와같은작용의결과중가장잘알려진유전자침묵 (post-transcriptional gene silencing) 의경우, guide strand가 mrna 분자의상보적인서열과짝을이루어, RISC 복합체의촉매활성부분인 Argonaute에의한절단이유도됨으로써일어난다. 반응초기의체내 sirna 의농도와관계없이개체전체에영향을주는것으로알려져있다. RNAi는이와같이유전자의발현에대해선택적이면서강력한영향을행사하며, 또한 ( 식물에서더잘적용되는경향이있지만 ) 특정한 dsrna를합성하여원하는유전자의억제를유도할수있다는점때문에실험실에서는 in vitro와 in vivo 조건모두를활용한다. 각세포에서특정유전자를큰규모로억제 (shut off) 하는용도로도활용될수있다. - 11 -
[0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] RNAi의생물학적기능으로, 유전자발현의감소 (Down-regulation) 가있다. 인트론 mrna(intronic mrna) 와유전자간 mrna(intergenic mirna) 모두를아우르는, 체내에서발현된 mirna들은번역억제과정이라든지, 형태형성 (morphogenesis) 시간을조절하거나줄기세포와같이미분화되거나불완전하게분화된세포유형을유지하는등의발생과정을조절하는데가장중요한역할을담당한다. 체내에서발현된 mirna가유전자발현의감소에기여하는과정이 1993년 C. elegans를통해밝혀졌다. 식물에서는이와유사한예로써, 애기장대 (Arabidopsis) 의 "JAW microrna" 가식물의모양을조절하는여러유전자의조절에관여한다는사실이확인된바있다. 식물에서 mirna에의해조절받는유전자의대부분이전사인자들이다. 이들개체에서의 mirna 활성은 F-box 단백질뿐만아니라전사인자들을포함하는핵심적인조절유전자 (regulatory gene) 의발현을조절함으로써전체적인유전자간의연결고리를조절하며, 상당히광범위하다고할수있다. 인간을포함하는많은종에서 mirna는종양 (tumor) 형성이나세포주기조절장애 (dysregulation) 의원인이되기도한다. 따라서, mirna는종양유전자 (oncogene) 와종양억제유전자 (tumor suppressor) 의기능모두를수행한다고볼수있다. 이와반대로, 유전자발현을증가 (Up-regulation) 시키는기능도존재한다. 프로모터에부분적으로상보적인 RNA 서열들 (sirna와 mirna) 은유전자의전사량을증가시킬수있으며 RNA activation이라불린다. 이들 RNA들이어떻게유전자의발현을증가시킬수있는지에관한부분적인매커니즘이알려져있다. 이때 dicer와 argonaute 가관여하며, 히스톤이탈메틸화된다. 같은질환이라도환자각각의유전적환경은상이한바, 본발명은환자개개인의특이적인패턴에맞는치료방법을제공하는 " 맞춤형치료 " 의일종으로, RNAi와유전적특징을기반으로환자들을세분화하고환자맞춤형치료기술을적용하기위한것이다. RNAi와관련하여식물유래루테리온이암줄기세포의억제기능을가진다는것은본발명에서처음규명하였다. 즉, 본발명은정상세포에는전혀영향을미치지않으며, 암줄기세포의유지 (maintenance), 악성화 (malignance) 및침윤활성 (invasive) 을저해하는식물유래루테리온의선택적항암요법에관한것이다. " 선택적 " 이란본발명의루테리온이비-암줄기세포에는영향을끼치지않고암줄기세포의성장만을저해하는능력을말한다. 본발명에서선택적항암은 " 코돈의상보적결합 " 이라는원리에의하여이루어진다. 이하본발명에대해구체적으로설명한다. 암환자의암줄기세포유전자에발생한 SNP( 단일염기다형 ) 는정상인과달리변화된변이코돈을갖게하고, 이는곧종양을발생시킨다. 예를들면 CGU는아르기닌을코딩하는데 T(U)GU (C-->T(U) SNP) 로바뀐경우종양특히, 백혈병이발생될수있다. 또한, GGT(U) 는글리신을코딩하는데 GT(U)T(U)(G-->T(U) SNP) 로나타날경우종양질환이빈번함을예측할수있다. 이러한변이된코돈과상보적인코돈을갖는 sirna 또는 mirna를포함하는식물루테리온을암줄기세포에처리할경우, 상기 sirna 또는 mirna가암줄기세포의변이된코돈과상보적으로결합하여 RNAi 시킴으로써암줄기세포유전자의발현을억제하게된다. 다만환자의변이코돈의종류가각각다른바, 이와상보적인코돈을특별히많이함유하는식물의루테리온을처리해주어야한다. 예를들어, 정상루테리온에 AGG 코돈을가지고있던사람이 SNP로인해 CGG 변이코돈을갖게되었다면, CGG와상보적인 GCC 코돈을많이함유하는식물유래정상루테리온을처리해주어야상보적결합으로인한 RNAi에의해치료된다. 환자의패턴을세분화하면총 64가지의패턴이생성된다. 코돈의 3개뉴클레오타이드중어느하나의서열이정상인과달라질환이유발될수있는 SNP의수는 4개의염기종류와 3개의뉴클레오타이드위치중어느하나에 기반한경우의수를고려하여, 그조합이최대 64 가지 (=4 3 ) 임에근거한것이다. 이를바탕으로, 환자에서발견 될수있는변이패턴은 64 개로분류할수있다. [0072] [0073] [0074] 루테리온유래질환특이적유전자가분류되는 64개의코돈패턴과관련하여, DNA의경우 A, T, G 및 C 또는 RNA 경우 A, U, G 및 C의종류로부터아미노산이코딩되는 3개의핵산을조합하여 64개의발현패턴으로분류하였다. 본발명에따른 " 상보코돈 " 은변이포함코돈을 RNAi 시킬수있는 3개의염기포함서열로, 변이포함코돈에직접적으로결합하여이들의활성을감소시키는 3개의뉴클레오타이드포함서열을의미할수있다. 본발명의루테리온함유조성물은임의의적합한수단에의해인간또는동물대상에투여될수있다. 인간또는동물대상에게투여는경구또는비경구적방법으로, 근육내, 뇌내, ( 정맥내포함 ) 을혈관, 피하, 비강내, 심장내, 뇌실내, 복강내또는경피투여될수있으며, 일반적으로주사에의하여투여될수있으며, 바람직하게는, 혈관주사 ( 예 : 정맥 ) 또는근육주사형태로투여될수있으며, 환자의특성에따라, - 12 -
투여에필요한경로를조정할수있다. [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] 본발명의조성물은비경구, 근육내, 뇌내, ( 정맥내포함 ) 혈관, 심장내, 뇌실내, 복강내, 피하, 비강내또는경피투여를포함한임의의적합한수단용으로제형화될수있다. 비경구투여를위한조성물은또한버퍼, 희석제및다른적당한첨가제를포함할수있으며, 멸균수용액을포함할수있다. 본발명의조성물은루테리온이외에약학적으로허용가능한담체, 증점제, 희석제, 완충제, 보존제, 및기타약학적으로허용가능한담체또는부형제등을포함할수있으며, 의약조성물로제형화될수있다. " 약학적으로허용되는담체 ( 부형제 )" 는환자에하나이상의핵산을전달하기위한에이전트또는다른약리학적불활성하고, 본발명의약제학적조성물에사용될수있는약제학적으로허용되는담체로는이들로한정되는것은아니지만이온교환, 알루미나, 알루미늄스테아레이트, 레시틴, 혈청단백질 ( 예, 사람혈청알부민 ), 완충물질 ( 예, 여러인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨소르베이트, 포화식물성지방산의부분적인글리세라이드혼합물 ), 물, 염또는전해질 ( 예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨및아연염 ), 교질성실리카, 마그네슘트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈-계기질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 -차단중합체, 폴리에틸렌글리콜및양모지등이포함된다. 약제학적조성물은멸균주사용수성또는유성현탁액으로서멸균주사용제제의형태일수있다. 이현탁액은적합한분산제또는습윤제 ( 예, 트윈 80) 및현탁화제를사용하여본분야에공지된기술에따라제형될수있다. 멸균주사용제제는또한무독성의비경구적으로허용되는희석제또는용매중의멸균주사용액또는현탁액 ( 예, 1,3-부탄디올중의용액 ) 일수있다. 허용적으로사용될수있는비히클및용매로는만니톨, 물, 링겔용액및등장성염화나트륨용액이있다. 또한, 멸균불휘발성오일이통상적으로용매또는현탁화매질로서사용된다. 이러한목적을위해, 합성모노또는디글리세라이드를포함하여자극성이적은어떠한불휘발성오일도사용할수있다. 올레산및이의글리세라이드유도체와같은지방산이약제학적으로허용되는천연오일 ( 예, 올리브유또는피마자유 ), 특히이들의폴리옥시에틸화된것과마찬가지로주사제제에유용하다. 본발명의조성물은치료학적유효량으로투여된다. 투여경로, 그리고필요한섭생투여량은, 특히치료될환자의상태, 연령, 체중의심각성에따라, 다양한파라미터들에따라결정될수있다. 최적투여량은개별구조의상대적효능에따라달라질수있으며, 일반적으로추정된시험관내및생체내동물모델에서효과적인것으로발견 EC50s에기초할수있다. 일반적으로, 투여량은 0.01~100mg /kg이고, 연령, 체중및환자의상태가치료될질병의중증도와빈도및투여경로. 구조의다른투여량은투여, 근육내주사또는조직 ( 정맥주사또는피하 ) 주사인지에따라조절하여투여할수있다. 본발명의조성물은또한경구투여를위한식이성보충제또는기능식품으로서제형될수도있다. 기능식품제형, 또는경구약학적조성물을위해, 적합한부형제는예를들어, 만니톨, 락토스, 글루코스, 수크로스, 녹말, 셀룰로스, 젤라틴, 스테아르산마그네슘, 소디움사카린, 및 / 또는탄산마그네슘과같은약학적등급의담체를포함한다. 경구액체제형의사용을위해, 조성물은예를들어, 수성식염수, 수성덱스트로스, 글리세롤, 또는에탄올, 바람직하게는물또는보통의식염수와같은수성담체중의수화에적당한고체또는액체형태로공급되는용액, 현탁액, 에멀젼, 또는시럽으로서제조될수도있다. 바람직하다면, 조성물은또한습윤제, 에멀젼화제, 또는버퍼와같은비독성보조물질의소량을함유할수도있다. 본발명의루테리온은기능식품적제형에통합될수도있으며, 약용식물추출물을포함할수도있다. [0081] [0082] [ 실시예 ] 이하본발명을실시예에의하여더욱상세히설명한다. 이들실시예는단지본발명을보다구체적으로설명하기위한것으로, 이에의해본발명의기술적범위가이들실시예에국한되지않는다는것은당업계에서통상의지식을가진자에게있어서자명할것이다. [0083] [0084] [0085] 실시예 1: 암줄기세포형성 뇌종양세포 (U87MG, U373MG 한국세포주은행 ) 에서암줄기세포를형성한후 (DMEM/F12(-) + bfgf(20ng/ml) + hegf(20ng/ml)+ B27 stem cell suppliment(1x) 를혼합한배지에서배양하였다. - 13 -
[0086] 상기형성된암줄기세포에대하여, 암줄기세포마커인 CD133, Nestin, Musashi-1 의발현양상을면역형광염색 법 (immunofluorescence stain) 으로확인하고, CD133 의 Papulation 을 FACS 를이용하여분석을하고 Western Bloting 실험을통해단백질발현유무를확인하여암줄기세포임을확인하였다. [0087] [0088] [0089] [0090] 실시예 2: 식물유래루테리온의분리약용식물인옻나무 (Rhus verniciflua stokes) 100g을 20-30배크기즉 2-3리터용기크기에맞추어절단하여용기에넣고, 식물의 5~8배인 500~800g( 바람직하게는식물의 6배즉 600g) 의증류수를용기에투입한후, 80 이하에서전탕을수행하였다. 약 8시간정도전탕을하되, 약 3시간마다 20~30분동안산소로버블링을가하여식물의루테리온이엉기지않도록하였다. 상기버블링후추출시스팀되는기화된수증기를플라스크에수집하였다. 상기수집한수증기를냉각하고응축시켜수득한응축액에 IR광선 ( 파장 : 3 1000μm내외바람직하게는 200~600μm ) 을 1-2시간조사하여루테리온이변이되지않도록하였다. 그후, 0.8μm 이상의직경의공극을구비하는필터를이용하여상기응축액을필터링하여, 필터를통과한응축액만 1200~5000rpm에서 5~10분간반복적으로원심분리하였다. 상기원심분리를통해수득한상등액에는 IR광선을조사하여운동성을가지며모여드는루테리온입자를피펫을이용하여분리하고, 상기분리된루테리온을 50nm 직경의공극을구비하는필터를통과시켜필터링되지않은부분만 PBS로세척하여옻나무유래루테리온을수득하였다. 상기과정에의해장직경 50-800nm인루테리온을수득할수있으며, 이는암시야현미경또는공초점현미경을통하여관찰확인이가능하였다. 상기수득한루테리온은크기에따라 50-200nm ( 발생기 )/ 200-400nm ( 성숙기 )/ 400-600nm ( 분열기 )/ 600-800nm ( 과분열기 ) 로구분하였다. 같은방법으로표 1~4에기재된약용식물로부터루테리온을수득하였다. [0091] [0092] [0093] 실시예3: 암줄기세포에대한식물루테리온의영향 3-1: 루테리온이암줄기세포의증식에미치는영향실시예 1에서형성된암줄기세포를실시예 2에서분리된 50~200nm 루테리온존재하에배양하였다. 그결과, 대조군 ( 루테리온미처리군 ) 에비해, 암줄기세포의증식이현저히억제되는것으로확인하였다. [0094] [0095] 3-2: 루테리온이암줄기세포의분화에미치는영향암줄기세포가분화되는조건하에서, 실시예 2에서분리된 50~200nm 루테리온존재하에암줄기세포의분화를유도하였다. 그결과, 대조군 ( 루테리온미처리군 ) 에서는암줄기세포가분화된반면, 루테리온처리군에서는이러한분화가관찰되지않는것을확인하였다. [0096] [0097] 이상으로본발명의내용을상세히기술하였는바, 당업계의통상의지식을가진자에게있어서, 이러한구체적기술은단지바람직한실시양태일뿐이며, 이에의해본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백할것이다. 따라서본발명의실질적인범위는첨부된청구항들과그것들의등가물에의하여정의된다고할것이다. [0098] [0099] [0100] - 14 -
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