J. Ginseng Res. Vol. 27, No. 2, 47-51(2003) 홍삼산성다당체 (RGAP) 와항암제의병용투여에의한항암시너지효과곽이성 김영숙 신한재 송용범 박종대 # KT&G 중앙연구원 (2003 년 2 월 14 일접수, 2003 년 5 월 17 일수리 ) Anticancer Activities by Combined Treatment of Red Ginseng Acidic Polysaccharide (RGAP) and Anticancer Agents Yi-Seong Kwak, Young-Sook Kim, Han-Jae Shin, Yong-Bum Song and Jong-Dae Park # Div. of Ginseng Research, KT&G Central Research Institute, Taejon 305-805 (Received February 14, 2003, Accepted May 17, 2003) Abstract : Synergistic anticancer activities of red ginseng acidic polysaccharide (RGAP) showing immunomodulatory activity were evaluated by combined treatment with anticancer agents such as Cyclophosphamide (CY) or 5-Fluorouracil (5-FU) in experimental tumor models. The combined treatment of RGAP (100 mg/kg) and CY (3 mg/kg) exhibited 71% of survival rate in life span of sarcoma 180-bearing mice, while single treatment of RGAP (100 mg/kg) and CY (3 or 10 mg/kg) exhibited 43, 14 and 43% of survival rates, respectively. In addition, when RGAP (100 mg/kg) was administered in combination with 5-FU (2.5 mg/kg) to sarcoma 180 tumor-bearing mice, higher survival rate was found when compared with RGAP or 5-FU treatment alone. Moreover, tumor weights in LL/2 lung carcinoma-bearing mice treated combined with RGAP (100 mg/kg) and 5-FU (5 or 10mg/kg) was obviously decreased when compared with 5-FU alone. These results suggest that clinical trials of RGAP as an adjuvant in cancer chemotheraphy can be higly feasible. Key words : Panax ginseng, Red Ginseng Acidic Polysaccharide (RGAP), synergistic anticancer activity, cyclophosphamide, 5-fluorouracil. 서 인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer) 으로부터분리된다당체는다양한면역조절작용을통한항암작용이보고되고있다. 1~4) 다당체는일반적으로중성다당체및산성다당체로나뉘어지는데, 산성다당체는 galacturonic acid, glucuronic acid, mannuronic acid 등의산성당이다량함유된분자량 15,000 이상의다당체를말하며중성다당체에비해면역체계에미치는영향이크다고알려져있다. 5) 인삼중백삼물추출물로부터분리된 ginsan이 Th1 세포와 macrophage 유래의 cytokine 을유도하여 killer cell을활성화시킴으로써암세포를사멸시킬수있음이보고되었다. 6) 또한백삼으로부터저혈당작용을갖는다당체 21종 (Panaxan A-U) 이분리된바있다. 7~10) 론 # 본논문에관한문의는이저자에게로 ( 전화 ) 042-866-5534; ( 팩스 ) 042-861-1949 (E-mail) jdpark@gtr.kgtri.re.kr 홍삼은수삼을증숙하여건조한것으로이러한수치과정중에수삼또는백삼과다른성분이생성된다고알려져있다. 즉, 백삼에존재하는 malonyl-ginsenoside Rb 1, Rb 2, Rc, 는 malonyl기가떨어져서 ginsenoside-rb 1, Rb 2, Rc, Rd가생성되며 ginsenoside의 C-20 위치의 glycosyl 잔기가이탈하거나, C-20 위치의수산기가이성화되어 20(S)-ginsenoside Rg 3, 20(R)-ginsenoside Rg 2, 20(S)-ginsenoside Rh 2, 20(R)- ginsenoside Rh 1 으로전환된다. 11) 따라서수삼및백삼과다른홍삼의생리활성차이는홍삼제조과정중발생하는화학성분의차이때문으로생각된다. 다당체의경우도백삼에서분리된다당체와홍삼에서분리된다당체는그화학적성상이다를것으로예상되나아직까지홍삼으로부터분리된다당체의구조에대한연구는전무한형편이며활성에대한연구도미미한실정이다. 저자들은홍삼으로부터홍삼알콜추출물을제조하고남은잔사로부터홍삼산성다당체 (RGAP, red ginseng acidic polysaccharide) 를분리하한바있다. 백삼으로부터 4,12) 47
48 곽이성 김영숙 신한재 송용범 박종대고려인삼학회지 분리한 ginsan과 RGAP의화학적조성을비교시 ginsan은산성당이 43.1% 인데반해홍삼으로부터분리한 RGAP는산성당을 56.9% 를함유하고있었고, ginsan의중성당조성은 glucose, galactose 였으나, 3,6) RGAP는 glucose, arabinose, 12) rhamnose, galactose를함유하여홍삼다당체는백삼다당체인 ginsan과는화학적조성이다른새로운산성다당체임을제시한바있다. 또한 RGAP를마우스에투여시 macrophage를증가시키고 nitric oxide synthase를유도시켜면역조절작용을나타내며, natural killer 세포및 macrophage를활성화시켜면역조절에대한항암작용을나타냄을보고한바있다. 13,14) 본연구에서는 RGAP가항암제와병용투여로항암제의치료효과를증가시키고항암제의면역억제에대한심각한부작용을경감시킬수있는항암보조치료제로서의사용가능성을알아보기위해RGAP와기존의항암제인 cyclophophamide 및 5- fluorouracil과병용투여하여항암시너지효과를관찰하였다. 실험방법 1. 실험재료실험에사용된시료는 6 년근홍삼 (Panax ginseng C.A. Meyer, 양삼 30 지, 한국인삼공사 ) 으로부터알콜추출물을제조하고남은홍삼잔사를사용하였다. HEPES, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine, penicillin/streptomycin solution, HBSS, DMEM, RPMI 1640 medium 등은 GIBCO (Grand Island, NY, USA) 제품을구입해사용하였다. 항암제 CY (cyclophophamide) 및 5-FU (5-fluorouracil) 은 Sigma (St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였고그밖의시약은시판특급시약을사용하였다. 2. 실험동물 C57BL/6계및ICR계마우스수컷을대한바이오링크 ( 음성, 충북, 대한민국 ) 에서구입하여실험에사용하였다. 4-5주령의동물을구입하여무작위로폴리카보네이트 cage에 5 마리씩분리, 수용하여최소한 1주이상순화시켰으며, 사료 ( 삼육, 대한민국 ) 와수돗물을자유로이섭취시켰다. 동물실의환경조건은실내온도 23±3 o C, 상대습도 40-60% 를유지하였고, 150-300 Lux의조도로 12 시간씩명암을조절하였다. 3. 암세포배양 LL/2 lung carcinoma cell line (ATCC CRL-1642) 은 ATCC로부터분양받았다. LL/2 lung carcinoma는 10% heat-inactivated FBS, 1.5 g/l 의 4 mm glutamine, 100 µg/ ml의 sodium bicarbonate, 100 U/ml의 streptomycin, 100 U/ml의 penicillin, 4.5 g/l의 glucose가함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's minimal essencial Medium) 에서배양하였다. 배양은 CO 2 배양기 (VISON사, 대한민국 ) 를이용하여 37 o C에서 5% CO 2 상태로배양하였다. 4. 홍삼산성다당체 (RGAP) 의분리홍삼알콜추출후남은잔사를 60 o C 에서 2 일동안열풍건조한후조분쇄하였다. 전보 12) 와같이홍삼알콜추출잔사를열수 (95-100 o C 에서 3 시간씩,4 회반복 ) 로추출한후대량분리를위해한외여과기 (Ultrafiltration Kit, Milipore Co., MA, USA) 를이용하여분자량 10 KD 이상과이하로나누었다. 이중분자량 10 KD 이상의고분자량화합물에 95% 의에탄올을 5 배 (v/v) 가해 4 o C 에서 24 시간방치한후열풍건조하여 RGAP 를제조하였다. 산성당및중성당의구성당의분석은전보 12) 와같았다. 5. 암세포이식쥐에대한수명연장및항종양효과암세포이식쥐에대한수명연장효과는 sarcoma 180 세포를이용한복수암모델을이용하여측정하였다. 즉, 다량의세포를얻기위해서 sarcoma 180 복수암세포를 ICR 마우스의복강에접종한후계대배양하여유지하였다. 수명연장효과는암세포를 1 10 6 cells/ml 농도로 1회 200 µl를마우스의복강에이식하고 24시간후부터 RGAP를 1일 1회 7일간복강투여한후생존율을관찰하였다. 생존율은암세포이식흰쥐의개체수 / 최초흰쥐의개체수 100으로계산하였다. 또한항종양효과는 HBSS (Hank's balanced salt solution without sodium bicarbonate and phenol red) 에현탁한 LL/2 lung carcinoma 암세포 (1 10 6 cells/ml) 를 5-6주령의 C57BL/6 마우스 (20.0 ±0.2 g) 의등에 200 µl를피하이식하였다. 피하이식 24 시간후부터 RGAP 또는항암제를 1일 1회 7일간복강투여한후발생한종양을떼어내서무게를측정하였다. RGAP와항암제의병용투여효과를알아보기위해서는 RGAP 투여 30분후에항암제를투여하였다. 6. 통계분석실험결과는평균 ± 표준편차로나타내었으며, 결과의유의성검정은 student's t-test 로분석하였다. 결과및고찰 1. 항암제 Cyclophosphamide (CY) 와 RGAP 의항암시너지작용
Vol. 27, No. 2(2003) 홍삼산성다당체 (RGAP) 와항암제의병용투여에의한항암시너지효과 49 Cyclophosphamide (CY) 는 alkylating agent로서 DNA replication 및 RNA transcription을억제하여항암작용을나타내며급, 만성백혈병, 여러가지고형암에널리사용되는항암제이지만심각한면역억제 ( 면역독성 ) 작용을나타낸다. 15) 본실험은면역조절에의해항암작용을나타내는 RGAP를항암제 CY와병용투여함으로써저용량의항암제를사용하여항암효과를극대화시키고항암제의면역억제와같은부작용및독성을감소시킬수있음을제시하고자하였다. 먼저 RGAP (100 mg/kg) 및 CY (3, 10 mg/kg) 단독투여군과 RGAP (100 mg/kg) 와 CY (3 mg/kg) 병용투여군의 sarcoma 180 암세포를이식한마우스에서 30 일간생존율을조사하였다 (Fig. 1). Sarcoma 180 암세포만을투여한대조군흰쥐는암세포투여 15일이후부터급격히생존율이감소하기시작하여 19일째에는 0% 의생존율을나타내었다. RGAP 단독투여군은완만한생존율감소을나타내었고, 암세포투여 17 일이후부터 30일까지의생존율이 40% 로 14일간지속되었다. CY (3 mg/kg) 은암세포투여 15 일이후부터생존율감소를나타내어 20일이후에는 14% 의생존율을나타내었다. 고용량인 CY (10 mg/ kg) 은 21일이전까지는약 70% 이상의높은생존율을나타내어 RGAP 단독투여군보다높았지만 22일이후부터는 43% 로써 RGAP와동일한수치를나타내었다. 반면 RGAP와 CY (3 mg/kg) 병용투여군은암세포투여 22일때까지 100% 의생존율을나타내었고투여 30일후에도 71% 의높은생존율을나타내었다. 이상의결과로부터암세포투여 30일후계산된 RGAP 및 CY (3, 10 mg/kg) 단독투여군의수명연장효과는 각각 43, 14, 43% 로나타났으나, RGAP와 CY 병용투여군에서는 71% 로나타나서 CY 단독투여군보다높은수명연장효과를나타내었다 (Fig. 1). 이러한결과는 RGAP와저용량의 CY를병용투여시고용량의 CY 투여보다그이상의효과를나타내는시너지효과가있음을나타내었다. 한편, RGAP와항암제 CY의 LL/2 lung carcinoma에대한병용투여효과를조사하기위해기본실험으로 RGAP (100 mg/kg) 과 CY 3 mg/kg의병용투여효과를조사한결과뚜렷한효과가관찰되지않았다. 일반적으로복수암보다고형암에대한항암제투여시고용량을투여해야효과를나타낸다고알려져있다. 본실험에서도고형암인 LL/2 lung carcinoma에대해서는저용량인 CY 3 mg/kg에서는효과가관찰되지않았다. 따라서용량을증량하여 CY (10, 20 mg/kg) 의단독투여와 RGAP (100 mg/kg) 와 CY (10 mg/kg) 또는 CY (20 mg/kg) 를병용하여생성된종양의무게를관찰하였다 (Fig. 2). 대조군의종양무게는 469±134 mg인데반해단독투여군 RGAP (100 mg/kg), CY (10 mg/kg), CY (20 mg/kg) 의경우는각각 339 ±163, 324 ±71, 167±183 mg이였으며, RGAP와 CY (10 또는 20 mg/kg) 병용투여군에서는 287 ±132과 128± 81 mg으로 CY 단독투여군에비하여각각 11%, 23% 의종양무게를감소시키는것으로나타내었다 (Fig. 2). 2. 항암제 5-Fluorouracil (5-Fu) 와 RGAP의항암시너지작용 5-Fu는 pyrimidine 유도체로서핵산대사를억제하여항암작 용을나타내는데주로유방암, 대장암 용되지만골수억제, 구강, 소화기, 위암 궤양, 간, 췌장암등에사및신장손상등 Fig. 1. Survival rate after the combined treatment of RGAP and cyclophosphamide (CY) in sarcoma 180 tumor-bearing mice. The ICR mice were administered intraperioneally with RGAP (100 mg/kg), CY (3 mg/kg), CY (10 mg/kg) and RGAP (100 mg/kg+cy 3 mg/kg) for consecutive 7 days after the intraperioneal inoculation of sarcoma 180 cells (1 10 6 /ml). Survival rates were observed for 30 days. R100 (- -), CY3 (- -), CY10 (- -) and R100+CY3 (- -) means RGAP (100 mg/kg), CY (3 mg/ kg), CY (10 mg/kg) and RGAP (100 mg/kg + CY 3 mg/ kg), respectively. Fig. 2. Tumor weights after combined treatment of RGAP and cyclophophamide (CY) in LL/2 lung tumor-bearing mice. C57BL/6 mice were administered intraperioneally with RGAP and/or CY for consecutive 7 days at 24 h after a subcutaneous inoculation of tumor cells (1 105). The tumor weights were determined at the 12th days after tumor inoculation. R100, CY10, CY20, R100+CY10 and R100+CY20 indicates RGAP (100 mgg/kg), CY (10 mg/ kg), CY (20 mg/kg), RGAP (100 mg/kg+cy10 mg/kg) and RGAP (100 mg/kg+cy20 mg/kg), respectively. * p<0.05 vs control, ** p<0.01 vs control.
50 곽이성 김영숙 신한재 송용범 박종대고려인삼학회지 의부작용을일으키는항암제이다. 15) RGAP를 5-FU와병용투여하면서 sarcoma 180 암세포이식마우스에서 30일간수명연장효과를조사하였다. RGAP (100 mg/kg) 및 5-FU (5, 10 mg/kg) 는단독투여하였고 RGAP (100 mg/kg) 와 5-FU (5 mg/kg) 는병용투여하였다 (Fig. 3). 암세포이식 30일에서의생존율은대조군이 0% 이었지만 RGAP (100 mg/kg) 및 5-FU (2.5, 5 mg/kg) 단독투여군은각각 25.0, 37.5, 87.5% 이었으며, RGAP와 5-FU (2.5 mg/kg) 병용투여군은 62.5% 로 5-Fu 단독투여군의 37.5% 생존율보다 1.7 배높았으나 5-FU (5.0 mg/kg) 단독투여군보다는낮았다 (Fig. 3). 지금까지조사된 sarcoma 180 암세포에대한 RGAP와항암제 CY 및 5-FU의병용투여에의한항암효과를요약하면 Table 1과같다. Table 1에나타낸바와같이암세포만을투여한대조군의생존일수 (survival days) 는 16.4±1.71일인반면 CY (3, 10 mg/kg), RGAP (100 mg/kg) 단독투여군의 경우는각각 22.2±1.93, 24.2±2.49, 23.6±1.96 일로써생존일수가증가하였다. 아울러 RGAP (100 mg/kg) 와 CY (3 mg/ kg) 의병용투여군에서는 28.9 ±1.85일로가장높은생존일수연장효과를나타내었다.5-FU항암제의경우대조군의생존일수는 16.4±1.33일이었고5-FU (2.5, 5.0 mg/kg), RGAP (100 mg/kg) 는각각 25.4±4.14, 29.3±2.21, 23.1± 6.17일로생존일수가증가되었다. RGAP와 5-FU (2.5 mg/kg) 병용투여군은생존일수가 25.6±5.23일로써 5-FU (2.5 mg/kg) 와비슷하였으나 5-FU (5.0 mg/kg) 보다는낮은수준이었다. 한편 LL/2 lung carcinoma에대한rgap와 5-FU 병용투여에의한항종양시너지효과를조사하였다. 대조군, RGAP (100 mg/kg), 5-FU (5, 10 mg/kg) 단독투여군의종양무게는 894± 439, 875± 447, 666± 329, 451± 219 mg 이었으며, RGAP (100 mg/kg) 와 5-FU (5 mg/kg) 또는 5-FU (10 mg/kg) 병용투여군의종양무게는각각 528± 38, Fig. 3. Survival rate after the combined treatment of RGAP and 5-Fluorouracil (5-Fu) in sarcoma 180 tumor-bearing mice. The ICR mice were administered intraperioneally with RGAP and/or 5-Fu for consecutive 7 days at 24 h after the intraperioneal inoculation of sarcoma 180 cells (1 106). The suvival rates were observed for 30 days. The groups of R100 (- -), 5-Fu 2.5 (- -), 5-Fu 5.0 (- -) and R100+5-Fu 2.5 (- -) indicates RGAP (100 mg/kg), 5-Fu (2.5 mg/kg), 5-Fu (5.0 mg/kg) and RGAP (100 mg/kg+5-fu 2.5 mg/kg), respectively. Fig. 4. Tumor weight after the combined treatment of RGAP and 5-Fluorouracil (5-Fu) in LL/2 lung tumor-bearing mice. C57BL/6 mice were administered intraperioneally with RGAP and 5-Fu for consecutive 7 days at 24 h after the subcutaneous inoculation of tumor cells (1 105). The tumor weights were determined at the 12th days after tumor inoculation. The groups of R100, 5-Fu 5, 5-Fu 10, R+5-Fu5 and R+5-Fu10 indicates RGAP (100 mg/kg), 5- Fu (5 mg/kg), 5-Fu (10 mg/kg), RGAP (100 mg/kg+5-fu 5 mg/kg) and RGAP (100 mg+5-fu 10 mg/kg), respectively. *p<0.05 vs control, **p<0.01 vs control. Table 1. Anticancer effect after the combined treatment of RGAP and cyclophosphamide (CY) or 5-fluorouracil (5-FU) Tumor Compound Dose (mg/kg) Survival days (means.d.) TC (%) P Sarcoma 180 Sarcoma 180 Control 16.4±1.71 100 CY 3 22.2±1.93 135 p<0.01 CY 10 24.2±2.49 147 p<0.01 RGAP 100 23.6±1.96 144 p<0.01 RGAP+CY(3) 100, 3 28.9±1.85 176 p<0.01 Control 16.4±1.33 100 5-FU 2.5 25.4±4.14 155 p<0.01 5-FU 5.0 29.3±2.21 179 p<0.01 RGAP 100 23.1±6.17 141 p<0.01 RGAP+5-FU(2.5) 100, 2.5 25.6±5.23 156 p<0.05
Vol. 27, No. 2(2003) 홍삼산성다당체 (RGAP) 와항암제의병용투여에의한항암시너지효과 51 234± 198 mg으로 5-FU (5, 10 mg/kg) 단독투여군의종양무게에비해각각 21%, 49% 감소되었다 (Fig. 4). 이상과같이 RGAP와항암제 CY 및 5-FU의병용투여는 sarcoma 180 암세포이식마우스와 LL/2 lung carcinoma 이식마우스에서항암제단독투여또는고용량의항암제투여에서보다항암작용이크거나같은효과를나타내었다. 이러한결과는 RGAP를항암제 CY 및 5-FU 등과병용투여하면항암제를저용량으로사용하고도고용량과유사한효과를나타냄을의미한다. 또한숙주의면역성을증가시키는 RGAP를항암제와병용투여시항암제가나타내는면역억제와같은심각한부작용을경감시키고항암효과를증가시킬수있음을제시한다. 버섯류로부터분리된 lentinan, polysaccharide K 등은암치료를위한보조제로서이미활용되고있으며, 홍삼으로부터분리된다당분획은 CY 투여로야기된면역독성을감소시킴이보고된바있다. 홍삼으로부터분리한 12) RGAP는선천적면역계에서가장주요한역할을담당하는 macrophage 와 NK 세포를활성화시켜항암작용을나타내었다. 그러므 12) 로 RGAP를항암제와병용투여시저용량의항암제를사용하여항암효과를증대시키고항암제의면역억제와같은부작용을감소시켜암치료보조제로서의사용가능성을보이고있다. 요 Sarcoma 180 암세포를이식한마우스에서면역조절작용을갖는홍삼산성다당체 (RGAP) 를항암제 cyclophosphamide (CY) 와병용투여한결과, RGAP (100 mg/kg) 와 CY (3 mg/kg) 의병용투여는고용량의 CY (10 mg/kg) 단독투여보다강한항암작용을나타내었다. 또한 RGAP (100 mg/kg) 과 CY (10 또는 20 mg/kg) 과의병용투여는 CY의단독투여보다 LL/2 폐종양을보다강하게억제하였다. RGAP (100 mg/kg) 와 5-fluorouracil (5-FU) (2.5 mg/kg) 을병용투여하였을때도 sarcoma 180 암세포를이식한마우스에서 5-FU 단독투여군에비해현저한항암시너지효과를나타내었다. LL/2 폐종양에미치는결과에서도 RGAP (100 mg/kg) 와 5-FU (5 또는 10 mg/kg) 병용투여군은항암제단독투여군보다강한항종양효과를나타내었다. 이상의결과로부터 RGAP는항암제 약 CY 또는 5-FU 와병용투여시 sarcoma 180 및 LL/2 폐종양에대해서저용량항암제의사용으로고용량의항암제사용에서와유사한항암효과를나타낼수있어서항암효과를극대화시킬뿐만아니라항암제사용에의한면역독성과같은부작용을경감시킬수있는항암치료보조제로서의사용가능성을제시하였다. 인용문헌 1. Kim, Y. S., Kang, K. S. and Kim, S. I.: Arch. Pharm. Res. 13, 330 (1990). 2. Kim, Y. S., Kang, K. S. and Kim, S. I.: Korean J. Ginseng Sci. 15, 13 (1991). 3. Lee, Y. S., Chung, I. S. Lee, I. R. Kim, K. H., Hong, W. S. and Yun, Y. S. : Anticancer Res. 17, 323 (1997). 4. Park, K. M., Jeong, T. C. Kim, Y. S. Shin, H. J. Nam, K.Y. and Park, J. D.: Natural Product Sciences. 6, 31 (2000). 5. Srivastava, R. and Kulshreshtha, D.K.: Phytochem. 28, 2877 (1989). 6. Kim, K. H., Lee, Y. S. Jung, J. S. Park, S. Y. Chung, H. Y. Lee, I. R. and Yun, Y. S.: Planta Medica. 64, 110 (1998). 7. Konno, C., Sugiyama, K. Kano, M. Takahashi, M. and Hikino, H.: Planata Medica. 50, 443 (1984). 8. Hikino, H., Oshima, Y. Suzuki, Y. and Konno, C.: Shoyakigaku Zasshi. 39, 331 (1985). 9. Konno, C. and Hikino, H.: Int. J. Crude Drug. Res. 25, 53 (1987). 10. Konno, C., Murakami, M. Oshima, Y. and Hikino, H.: J. Ethnopharmacol. 14, 69 (1985). 11. Park, J. D.: Korean J. Ginseng Sci. 20, 389 (1996). 12. Kim, Y. S., Park, K. M. Shin, H. J. Song, K. S. Nam, K. Y. and Park, J. D.: Yakhak Hoeji. 46(2), 113-119 (2002). 13. Park, J. D., Kim, Y. S. Shin, H. J. Park, K. M. Kwak,Y. S. and Toida, T.: Proceedings of the 8th Intl's symposium on ginseng. pp. 266-276 (2002). 14. Park, K. M., Kim, Y. S. Jeong, T. C. Joe, C. O. Shin, H. J. Lee, Y. H. Nam, K. Y. and Park, J. D.: Planta Medica. 67, 122-126 (2001). 15. Katung, B. G.: Katzung's 임상약리학,8 판. 대한의학서적. 서울, pp. 977-1015 (2001).