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1 The Journal of Korean Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology 2008;21(3) : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 강문여 김종한 최정화 박수연동신대학교한의과대학안이비인후피부과학교실 Effects of Salviae miltiorrhizae Radix Extract on Gene Expression of Dendritic cells. Wen-Lih Chiang Jong-Han Kim Jeong-Hwa Choi Su-Yeon Park Objectives and Methods : Salviae miltiorrhizae Radix (SMR) promotes blood circulation to remove blood stasis, cools the blood to relieve carbuncle, clears away heat from the heart and tranquilizes the mind. This study was designed to investigate the effects of SMR on immuno-potentiative action in terms of changes in the genetic profile of dendritic cells (DC) using by microarray analysis. Results and Conclusion : In this experiment, treatments with more than 250 μg / ml upto 1000 μg / ml of SMR elevated the proliferation rates of DC. Microscopic observations confirmed the tendency on proliferation rates. Expression levels of genes related with cellular methabolic process, cell communication, and macromolecule metabolic process were elevated by treatment with SMR in comparison of functional distribution in a Biological Process. In molecular functions, expression levels of genes related with receptor activation, nucleotide binding and nucleic acid binding were elevated. In cellular components, expression levels of genes related to cellular membrane-bound organelles were elevated. In addition, expression levels of genes related to Wnt signalling pathways and the glycerophospholipid metabolism were elevated through analysis using pathway analysis between up-and down-regulated genes in cells treated with SMR. Finally, genes related to JAK2, GRB2, CDC42, SMAD4, B2M, FOS and ESR1 located the center of Protein interaction network of genes through treatment with SMR. Key words : Salviae miltiorrhizae Radix, Dendritic cells. Ⅰ. 서론 교신저자 : 김민정, 동신대학교부속목동한방병원안이비인후피부과학교실 (Tel: , mj0820@freechal.com) 접수 2008/11/07 수정 2008/12/04 채택 2008/12/05 단삼 (Salviae Miltiorrhizae Radix) 은脣形科에속한다년생본초인丹蔘 (Salvia miltiorrhiza Bunge) 의뿌리와根莖을건조한것으로活血祛瘀, 52

2 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 凉血消癰의效能이있어癥瘕積聚, 癰瘡腫毒등의증상을치료한다 1). 약리작용으로는심혈관계에작용하여관상동맥의혈류량을증가시키고, 미세순환을개선시키며, 혈액계통에서는혈장의점도를강하시키고적혈구의비중을조절하며, 항혈전작용을한다. 또한, 간세포의변성, 괴사및염증반응을감소시키며간섬유조직의증식을억제하여補肝作用을하며신장에도작용하여신장세포손상을방지한다 2). 戴 3) 는丹蔘등의活血化瘀하는효능이있는藥이通經氣, 活血脈하여氣血의流注를流暢하게發揮하게함으로써免疫機能의活性化를促進시키며이는祛瘀生新이라는理論에立脚하고있다고하여단삼과면역기능이관계있음을설명하였다. 단삼에대한실험적연구로는免疫細胞및腫瘍細胞에미치는效果에관한연구 4) 가있으며단삼의면역기능 5) 및면역조절작용에관한연구 6) 도이루어져면역기능이있음을밝혔으나, 이논문은선행연구와다르게단삼이면역기능에관계하는수지상세포의유전자발현에미치는영향에관한항목으로면역기능을밝히고자하였다. 이에본저자는면역기능활성화에영향을미치는수지상세포에단삼을투여하고나타나는유전자의발현변화를 Microarray 법을통해분석하여유의한결과가도출되어이에보고하는바이다 Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 세포주생쥐유래수지상세포주 (Dendritic cell) 인 DC-1 세포주는서울대학교의과대학으로부터냉동상태로분주받아실험에사용하였다. 분주받은세포주는해동되어배양액속에분주된후, 2주 이상계대배양하여실험실에충분히적응시킨후증식률 (Doubling Time) 이서울대학교에서제공한자료와거의일치하게되었을때, 충분히적응하였다고생각하고실험에사용하였다. 2) 약재본실험에서사용된단삼 (SMR, Salviae miltiorrhizae Radix) 은꿀풀과에속한다년생초본인丹蔘의뿌리를건조절편한것으로동신대학교광주한방병원을통하여구입하여동신대학교한의과대학본초학교실에서사용하였다. 3) 시약및기기 Fetal bovine serum (Gibco LOT. NO , FBS) 및, mrna 분리를위한 Trizol reagent (invitrogen, Cat# ) 은진성SMR ( 광주, 한국 ) 을통하여구입하였고, RPMI 1640 (Sigma, R4130), penicillin -streptomycin(100 units/ ml, 100 μg / μl ), Trypsin-EDTA (Sigma) 및기타시약은 Sigma(St. Louis, MO, USA) 제품을구입사용하였다. 측정을위해 Micro-plate reader (Bio-rad, CA), 광학현미경 (Olympus, Japan) 등이사용되었다. 2. 방법 1) 세포주수지상세포주인 DC-1의생육배지로는 RPMI 1640 배지를사용하였고, 배지에는 10% FBS와 penicillin-streptomycin(100 units/ ml, 100 μg / μl ) 을첨가하였다. 세포주의계대배양은 2일간격으로시행하였고, 부착세포의탈착을위해서 Trypsin -EDTA를사용하였다. DC-1 세포주는 5% CO 2 가공여되는배양기속에서 37 를유지하며배양되었다. 53

3 2) 약물의준비세척되고세절된상태로구입된단삼 100 g을증류수 1,500 ml에전기약탕기 ( 대웅, 한국 ) 을이용하여 3시간동안전탕한후, 거즈로걸러전탕액을얻었다. 얻어진전탕액을 5,000 Xg에서 10분간원심분리하여찌꺼기는버리고상청액을얻은다음가온감압건조법으로 70 를유지하면서건조분말을얻었다. 이렇게하여얻어진추출물은 35 g으로수율은 35% 였다. 추출물을실험에사용하기위하여 PBS에녹인후, 2000 rpm에서 15분간원심분리하여찌꺼기를제거하고, 상청액을얻었다. 얻어진상청액은와트만지로거른다음최종적으로 0.22 μm크기의필터 (Syringe filter, Whatman) 로걸러멸균을대신하였다. 이렇게하여얻어진검액은소량씩나누어 -20 에보관하였다가사용직전해동하여사용하였다. 3) 세포증식률측정도진도사에서개발한독특한 highly water-soluble tetrazolium salt인 WST-8,2-(2- methoxy-4-nitro phenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4- disulfo-phenyl)-2h-tetrazolium, monosodium salt 를사용하여살아있는세포를정량하는방법 7) 을사용하였다. 먼저 96-well plate (Nunc, Netherlands) 에측정하고자하는대상세포주를웰당 5 X 10 3 의분량으로분주하고, 37, 5% CO 2 가공여되는환경에서 24시간을배양하여부착및안정화를시행하였다. 24시간의배양이끝난후, 상기한방법으로제조된 SMR을최종농도 1000 μg / ml, 500 μg / ml, 250 μg / ml, 125 μg / ml 62.5 μg / ml이되게배양액에희석하여부착및안정화된세포주에공급하고, 24시간동안배양하였다. 24시간동안의배양이끝난후, 각 well당 10 μl의 CCK-8 (CCK-8 sol., Dojindo, Japan) 용액을첨가하고 37, 5% CO 2 가공여되는환경에서 3시간동안방치하였다. 3시간후, Micro-plate reader를이용하여 450 nm파장에서흡광도를측정하였다. 정상대조군으로는약물을첨가하지않은 well을사용하였고, 결과는정상대조군에대한백분율로환산하여나타내었다. 4) 세포배양형태의현미경적관찰 SMR이수지상세포의증식에미치는영향을현미경상관찰하기위하여 6-well plate(tpp, Switzerland) 에 개의세포를분주하고 37, 5% CO 2 가공여되는환경에서 24시간을배양하여부착및안정화를시행하였다. 24시간의배양이끝난후, 세포증식률및세포독성측정에서와같은방법으로 SMR을투여하고 24시간동안배양하였다. 배양이끝난후, 광학현미경으로세포의형태및밀도를관찰하였다. 5) RNA 분리를위한약물처리및실험군분류 개의수지상세포를 100 Φ dish (SPL, 한국 ) 에분주한후, 37, 5% CO 2 가공여되는환경에서 24시간을배양하여부착및안정화를시행하였다. 24시간의배양이끝난후, 실험군은 SMR 을 250 μg / ml농도로투여하고다시 24시간동안배양하였다. 정상대조군으로는실험군과동일한조건에서배양된후, 동일한용량의인산완충액을투여하였다. 6) RNA 분리 Microarray 분석을위한 RNA 분리는 Florell 등 8) 의방법을변형하여시행되었다. 상기한방법으로약물을투여하고 24시간이지난후, 생육배지를완전히제거한다음, 인산완충액을이용하여 3 번수세하였다. 수세과정이끝난후, 각각의 dish에 2 ml의 Trizol reagent를넣고 pipet을이용하여세포를분리수거한다음바로동결시킨후액체질소에보관하였다가 RNA 분리에사용하였다. 동결세포로부터전RNA를분리하였는데, 이 54

4 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 것은 Qiagen에서제시한방법에따라이루어졌다. 7) RNA 추출정도관리 Total RNA를아가로스겔상에서전기영동한후 28S/18S RNA의비율을측정하여정도관리하여분석적합판정을확인한후실험을진행하였다. Microarray 실험에있어서결과에영향을주는여러가지 factor들중가장중요한것이 RNA이며 9), 이 RNA 상태를확인하기위해 Agilent사의 Bioanalyzer2100을사용하여 rrna ratio (28S /18S ribosomal RNA) 를확인함으로써판정하였다. 8) DNA 칩을이용한실험 45K oligo-chip 10) 을이용하여실험을수행하였다. 탐침준비와혼성화반응은 3DNA array detection system을이용하여수행하였다 (Genisphere, PA). 형광표지된 cdna 제작시 20 μg total RNA를사용하였다. 어레이를씻어낸후 ScanArray scanner (Perkin-Elmer, Boston, MA) 로스캔하였다. 정상 RNA를레퍼런스로사용하여 DNA 칩상의대다수 cdna spots (85% 이상 ) 이검출됨을확인하였다. 9) 데이터분석이미지파일에서 IMAGENE 4.0 (Bio-discovery, Marina del Rey, CA) 를사용하여 1차데이터를얻은후 LOcally WEighted Scatterplot Smoothing method (Lowess method) 11) 를사용하여표준화하였다. 모든칩상의 spot에서, 각채널의형광강도가배경의형광강도보다 1.4배더큰경우에한해제대로측정된것으로판단하여선별하였고, 시료에서제대로측정되지않은것은제외시켰다. 발현비율은 CLUSTER를이용하여순차적클러스터링한후 TREEVIEW (M.B. Eisen, lbl.gov) 12) 를이용하여시각화하였다. 유전자기능분석은 FatiGo algorithms ( bioinfo.cipf.es) 를이용하여수행하였다. 클래스간비교분석을통해얻어진결과는 False Discovery Rate (FDR) 값이 0.05 이하일때의미있는것으로판단하였다. 단백질결합은 BOND 데이터베이스 ( unleashedinformatics.com) 에서얻어진인간단백질데이터베이스로 cytoscape program ( 버전 2.4) 을이용하여분석하였다. 3. 통계처리세포증식율실험결과에대한통계적분석은통계패키지인 Sigma plot (Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.) 를이용하였다. 실험성적은평균 ± 표준편차 (mean±sd) 로나타내었으며, 실험군간평균의차이를검정할때에는 student's t-test로검정하여 p-값이 0.05 미만일때유의한차이가있는것으로판정하였다. Ⅲ. 성적 1. 수지상세포의증식율에미치는영향 SMR의투여는농도에비례하여수지상세포의증식율을증가시키는경향을보였으며, 투여농도 250 μg / ml이상에서수지상세포의증식률을유의하게증가시켰다. 대조군의증식율을 100% 로하였을때, 250, 500, 1000 μg / ml투여에의한증식율은각각 129.2±8.0, 196.7±11.3, 195.0±10.3% 였다 (Fig. 1). 2. 수지상세포의증식형태및밀도에관한영향 SMR의세포증식율에미치는영향을육안적으로재확인하기위하여수지상세포에 SMR을처리한다음현미경을이용하여증식형태및밀도를관찰한결과투여농도와비례하여세포증식에의한밀도가증가하는경향이나타났다 (Fig. 2). 55

5 3. DNA 칩이미지 Fig. 1. Effects of SMR on proliferation rates of dendritic cells in vitro DC-1 Cells were attached 96-well plate, and added SMR as indicated concentrations respectively. After 24 hr incubation, proliferation rates were measured using altered MTT methods. Values are expressed as percentage of control. Result are presented as mean±sd. **P < 0.01, and ***P < vs. non-treated Control(n=6). SMR을투여한수지상세포의 DNA 칩이미지는 Fig. 3에표시하였다. Agilent Whole Human Genome 44K 올리고칩을사용하여세포의전체유전체변이를분석하였다. Cy3와 cy5로구성된 two colors system을사용하였기때문에, 적색과녹색스팟으로표현되어졌다. 대부분의유전자는의미있는변화를보이지않았기때문에대부분의스팟이노란색으로나타났다 (Fig. 3). 4. DNA 칩표준화원천이미지에서얻어진 1차데이터 (Fig. 4A) 를 lowess 기법을사용해표준화하였다 (Fig. 4B). 표준화과정을통해, 이전의왜곡된비형태가 0을기점으로하는일직선형태의 log 비로변화되었다. Fig. 2. Effects of SMR on morphology and proliferation density of dendritic cells in vitro DC-1 Cells were attached 6-well plate, and added 0, 125, 250, 500 and 1000 μg / ml of SMR respectively. After 24 hr incubation, morphology and proliferation density were observed using microscope. (A) non-treated control group, (B) 125 μg / ml treated group, (C) 250 μg / ml treated group, (D) 500 μg / ml treated group, (E) 1000 μg / ml treated group. 56

6 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 감소되었거나증가된유전자들의기능을분류하였을때, 비슷한기능별분포를보여주고있다는것을확인할수있었다. 그러나이들유전자사이의차이를좀더세분화해서관찰할필요가있었으며그결과가 Fig. 5, 6, 7에나와있다. 생물학적과정의경우세포대사조절, 세포신호전달, 거대분자대사과정등의세포내기능과관련된항목들에서증가유전자와감소유전자간에유의한 (P<0.05) 차이를보였다 (Fig. 5). 분자기능분포의경우에서는수용체활성, 뉴클레오티드결합및핵산접합등의항목에서유의한변화가나타났다 (P<0.05) (Fig. 6). 세포성분에서는세포막경계소기관등의항목에서차이를나타내었다 (Fig. 7). Fig. 3. Raw image of microarray A total sequence set of ~45,000 oligo-nucleotides were printed onto glass microscope slides. The probe preparation and hybridization were performed using 3DNA array detection system with 20 μg of total RNA from cells. Untreated cells was used as reference RNA. Fig. 4. Signal distribution of microarray (A) Vertical axis represents log cy5 intensity and horizontal axis represents log cy3 intensity. Normalization of microarray (B) Primary data from raw image were normalized using lowess method. Vertical axis represents log ratio and horizontal axis represents log intensity of all spots after normalization. 5. 생물학적과정, 분자기능및세포구성요소항목에서의기능분포비교 Fig. 5. Comparison of functional distribution in Biological Process Genes were analyzed in Biological Process category in ontology. The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Biological Process. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category. Red and Green color represent percentage of up-regulated and down-regulated genes in each functional category. P<0.05 was considered significant. 본연구의결과에나타내지는않았지만발현이 57

7 Fig. 6. Comparison of functional distribution in Molecular Function Genes were analyzed in Molecular Function category in ontology. The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Molecular Function. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category. Red and Green color represent percentage of up-regulated and down-regulated genes in each functional category. P<0.05 was considered significant. 6. 단삼처리에의해증가및감소된수지상세포유전자의경로분석 수지상세포에단삼추출물을처리하여증가및감소된유전자와이들의경로를분석하여보았다. 그결과 3개의주요경로가확인되었는데, Wnt signaling pathway 및 Glycerophospholipid metabolism 에관여하는유전자는발현이증가하였으며, Neuroactive ligand-receptor interaction 에관여하는유전자들은발현이감소되었다 (Fig. 8). Fig. 7. Comparison of functional distribution in Cellular Component Genes were analyzed in Cellular Component category in ontology. The horizontal bar represents the percentage of specific functional category in Cellular Component. The list was arrayed in decreasing percentage of functional category. Red and Green color represent percentage of up-regulated and down-regulated genes in each functional category. P<0.05 was considered significant. 7. 인체시스템에서단백질네트워크와단삼추출물처리에의해변화된유전자들의상호작용네트워크 단삼추출물처리에의해유전자들의발현변화가있다는것을확인하였다. 더나아가이들유전자들간의상호작용에대해알기위하여단백질상호작용을이용한네트워크분석을수행하였다. Fig. 9와 10은칩에존재하는유전자에해당하는단백질의상호작용을보여주는그림이다. Fig. 9에서는노란색으로표시된도형이단삼처리에의해수지상세포에서발현이증가한단백질을나타내며, Fig. 10에서는노란색으로표시된도형이발현감소된단백질을나타낸다. 확인된단백질네트워크의개개의그림을살펴 58

8 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 보면 (A, B, C 및 D) 각각의단백질들을직접확인할수있었다. JAK2, GRB2, CDC42, SMAD4 등의단백질은발현이증가되었고, GRB2, B2M, 랜, ESR1 등의단백질은발현이감소되었다. 즉, JAK2, GRB2, CDC42, SMAD4, B2M, FOS 및 ESR1 등의단백질이다른여러단백질과상호작용한다는것을확인할수있었으며, 따라서이들단백질이약물의세포내작용에매우중요한역할을수행할것으로예측된다. Fig. 8C. Glycerophospholipid metabolism Fig. 8D. Neuroactive ligand-receptor interaction Fig. 8A. Pathway analysis Fig. 8. Pathway analysis between up-and down-regulated genes in cells treated with Salvia Miltiorrhizae Radix extract (Fig. 8A) Involvement of these genes on different pathway was analyzed. The horizontal bar represents the percentage of genes on each pathway. The list was arrayed in decreasing percentage of pathway involvement. Top 3 pathways were showed in detail in which the up or down-regulated genes were colored in red or green, respectively. The represented pathways were obtained from KEGG. Fig. 8B. Wnt pathway 59

9 Fig. 9A Fig. 9C Fig. 9B Fig. 9D Fig. 9. Protein interaction network of genes up-regulated by treatment with Salvia Miltiorrhizae Radix extract Yellow circles marked were shown in detailed view. Each circle have name of the protein. JAK2 (A), GRB2 (B), CDC42 (C), and SMAD4 (D) were placed on core positions with intensive interactions with other proteins. Ⅳ. 고찰단삼 (Salviae Miltiorrhizae Radix) 은脣形科에속한다년생본초인丹蔘 (Salvia miltiorrhiza Bunge) 의뿌리와根莖을건조한것으로性味는微寒, 苦하고心, 肝經으로歸經하며活血祛瘀, 凉血 消癰의效能이있어癥瘕積聚, 癰瘡腫毒등의증상을치료한다 1). 문헌적으로 神農本草經 13) 上經에 味苦微寒, 主心腹邪氣, 腸鳴幽幽如走水, 寒熱積聚, 破癥際瘕, 止煩滿, 益氣 라고기재되어있고 東醫寶鑑 14) 에서는 性微寒味苦無毒. 治脚軟疼痺, 四肢不遂, 60

10 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 Fig. 10A Fig. 10C Fig. 10B Fig. 10D Fig. 10. Protein interaction network of genes down-regulated by treatment with Salvia Miltiorrhizae Radix extract Yellow circles marked were shown in detailed view. Each circle have name of the protein. GRB2 (A), B2M (B), FOS (C), and ESR1 (D) were placed on core positions with intensive interactions with other proteins. 排膿止痛, 生肌長肉, 破宿血, 補新血. 이라고하였다. 성분으로 tanshinone Ⅰ,Ⅱ, dihydrotanshinone, cryptotanshin one, methyltanshinonate, methylene hanshiquinone 및 β-sitosterol 등이있으며 1), 약리작용으로는심혈관계에작용하여혈관확장으로관상동맥의혈류량을증가시키고, 미세순환을개선시키며, 혈액계통에서는혈장의점도를강하시키고적혈구의비중을조절하며, 항혈전작용을하며또한간세포의변성, 괴사및염증반응을감소시키며간섬유조직의증식을억제하여補肝作用을하며신장에도작용하여신장세포손상을방지하는것으로보고되었다 2). 단삼에대한실험적연구로는林 15) 과朴 16) 등의丹蔘藥鍼이急性腎不全에미치는영향에관한연구, 免疫細胞및腫瘍細胞에미치는效果에관한연구 4), 抗癌活性과 apoptosis에미치는影響에관한연 구 17) 등이있으며최근에는단삼의면역기능 5) 및 면역조절작용에관한연구 6) 도이루어지고있다. 韓醫學에서免疫의槪念은疾病의發生및進展을人體의正氣와病因인邪氣의抗爭및消長進退의過程으로본正邪論에서그關聯性을찾아볼수있으며, 疾病發生과進行에대한病理理論을보면正氣와邪氣의力量對備에의하여疾病이發生, 轉歸, 治療된다는正邪論의認識과가장가깝다 18-19). 61

11 여기에서正은正氣즉生命活動의原動力이며生體의調節防禦및適應能力을말하고各種臟腑組織機管의機能活動에서부터外部環境에대한適應力과病因에對한抗病力을뜻하고邪氣란病邪를말하며人體의正常的인生命活動을沮害하고人體와外部環境사이의相對的平衡狀態를破壞하는各種有害因子로六淫外邪나體內의病理的産物인瘀血, 痰飮등을指稱하였다 18-20). 素問 21) 上古天眞論에서는 眞氣從之精神內守病安從內 라하였고刺法論 21) 에서는 正氣存內邪不可于 라하였으며評熱病論 21) 에서는 邪氣所湊其氣必虛 라하였고 靈樞 21) 百病始生篇에서는 風雨寒熱, 不得虛. 邪不能獨傷人 이라하여人體의正氣가旺盛하면비록邪氣가있어도致病하기어렵고疾病을豫防함을說明하였다. 疾病의發生시正氣가아직크게損傷받지않았을경우에는邪氣를먼저治療함으로써邪氣가더욱發展되지못하게되어身體에對한傷害作用도消失또는中止되고臟腑經絡등의病理的損傷과精, 血, 氣, 津液등의物質的損傷이恢復되어이들精, 血, 氣, 津液이邪氣에影響을받아痰飮, 瘀血이되는二次病理進行도防止되며이로因하여陰陽이새로이相對的平衡을이루게되어疾病은治癒되는것이다. 이는瀉劑의投與를통한祛瀉法지만이또한正氣恢復에影響을준다는面에서扶正과祛邪는相互密接하다고생각된다 22). 예로는戴 3) 는丹蔘, 紅花, 川芎등의活血化瘀하는藥이通經氣, 活血脈하여氣血의流注를流暢하게發揮하게함으로써免疫機能의活性化를促進시키며이는祛瘀生新이라는理論에立脚하고있다고하였다. 이에저자는活血祛瘀劑로外科疾患에應用되는丹蔘이면역기능활성화에미치는영향을수지상세포의유전자발현측면에서살펴보기위하여본실험을기획하였다. 인체의면역계는크게자연면역 (innate immunity) 와획득면역 (acquired immunity) 으로구분할수있다 23). 자연면역은병원체나조직의손상을인식하여획득면역에관여하는세포에신호를보내는능력을지니고있는데, 대식세포 (Macrophage), 자연살해세포 (Natural killer cell) 가대표적이며, 이외에도다양한 cytokine이관여한다고알려져있다 24-25). 이러한강력한면역시스템이순조롭게작동하기위해서는항원을제시해주는항원제시세포 (Antigen presenting cell) 의활성화가필수적이다. 이러한역할을하는면역세포로 B 세포와대식세포등이알려져있었으나, 최근 90년대에들어전문적인항원제시세포가수지상세포 (DC, Dendritic cell) 임이알려졌다 26-27). 수지상세포는수지 (dendrite) 를가지고있는형태때문에붙여진이름으로생체내가장강력한항원전달세포로알려져있다 28). 골수의전구세포로부터기원하는수지상세포는뇌를제외한거의모든조직에산재해있으며, 말초단핵구 (PBMC) 에는 1% 미만으로존재한다 29). 수지상세포는다른세포에비하여항원전달분자 (CDIa, MHC-Ⅰ, MHC-Ⅱ), 부속 / 동시자극분자 (CD40. CD58, CD80, CD86 등 ), 세포내부착분자 (CD50, CD54) 그리고항원흡수에필요한다양한수용체 (CD11b, CD32, CD64, macrophage mannose receptor, DEC-205) 를많이발현한다 30-32). 따라서이와같은많은표면항원분자와수용체들때문에수지상세포는다양한감염원과항원그리고주위환경의변화에민감하게반응한다. 수지상세포는항원을 T 세포에게공여하여 T 세포를활성화시킴으로써면역반응의시작에매우중요한역할을한다. 이들이가지는 T 세포활성화능력은대식세포의 50배에달하며, 면역기능의활성화측면에서수지상세포의역할에버금가는기능의다른면역계세포를찾기는힘들다 33-34). 수지상세포는세포표면에다양한활성화인자들을표출할수있다. 휴지기의수지상세포에는 T 세 62

12 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 포를활성화시킬수있는 CD80, CD86, MHC Class II 등으로대표되는표지인자들의발현이매우낮지만, 일단균주에서유리되는 Lipopolysaccharide (LPS) 등의활성화물질에의하여활성화되면상기한표면항원 (surface marker) 들을표출하여효율적인항원제시기능을수행하게된다 35-36). 일반적인세포의특성은특정단백질하나에의하여결정된다기보다는유사거나계통적기능을가진다양한단백질군의특성에의하여결정되는경향을보인다 37). 이러한이유에서최근수천에서수만개에이르는유전자의발현을동시에관찰할수있는 DNA 칩기술의개발은이러한종합적관찰을가능하게하였다 38). Array에는 filter array, oligonucleotide array와 cdna microarray의 3가지종류가있다. 본연구에서사용한방법인 cdna microarray는분자생물학적기법으로볼때 Northern blot의역실험이라고할수있으며, Inverted northern blot 또는 Reverse northern이라불리운다 38-39). 현재약물기전을밝히기위해서는, 대용량분석을통해얻어진모든종류의데이터를시스템생물학을이용하여분석하는접근법이일반적으로사용되고있으며 40), 가까운미래에신약개발이나약물기전연구에있어많은부분이생물정보학이나시스템적접근방식을통해이루어질것이다 41). 본연구에서는수지상세포에대한 SMR 투여의효과를분자수준에서파악하기위하여 DNA 칩을이용하여유전자들의발현정도를측정하였다. 일반적으로수지상세포의증식율을증가시키는것은면역기능의활성화에관여할가능성이높다 42). 본논문의결과를살펴보면, 250 μg / ml이상의 SMR 투여군에서유의할만한세포증식율의증가를보였다 (Fig. 1). 이러한증식율의증가양상과현미경적관찰결과상의밀도는유사한경향을보였다 (Fig. 2). 이러한결과는 SMR이수지상세포의증식율증가를통하여면역반응의활성화에 기여할가능성이있는것으로해석된다. 또한, 상기한결과를바탕으로추후계속될 DNA를이용한유전자발현정도측정에 250 μg / ml농도를사용하기로결정하였다. Microarray 분석법을이용한유전자발현조사에서 250 μg / ml농도의 SMR 처리는대다수의유전자에특별한영향을미치지않았으며, 발현이변화한유전자수는소수였다 (data not shown). 발현이변화한유전자를바탕으로생물학적과정, 분자기능및세포구성요소관련유전자의발현정도를각각비교하여본결과생물학적과정에서는세포대사조절, 세포신호전달등의세포의생장및분화와직접적으로관련이있는유전자들이유의한차이를보였다. 이러한결과는앞서제시한증식율의증가와동일한맥락에서해석된다. 분자기능분포의경우에도수용체활성, 뉴클레오티드결합및핵산접합등에관련된유전자의발현이증가하였는데, 수용체활성은외부의신호를세포내로전달하는과정에관여하고뉴클레오티드결합및핵산접합등은세포분화와관련있으므로이역시 Fig. 1과 Fig. 2에서제시한결과와동일한맥락에서해석된다. SMR 처리에의하여증가하거나감소한수지상세포유전자들을세포대사관련경로별로재분석한결과 Wnt signalling pathway, Glycerophospholipid metabolism과관련된유전자군의발현이증가하였다 (Fig. 8). Wnt는인간의 oncoprotein으로서처음발견되었으며나중에는발생과정에중요한단백질이라는것이알려졌다 43). Wnt가결합하는리셉터는 Frizzled 계열의리셉터이다 44). 이것은 GPCR (G-protein coupled receptor) 인데실제로 G-protein 신호와 PI3K 신호도유발할수있다 45). Wnt 경로에관여하는주요한단백질로 b-catenin이라는다기능단백질이있다. 이단백질은일반적으로평상시에는 Cadherin과결합하여세포와세포의부 63

13 착에관여한다. 그런데, Wnt가 Frizzled를통해신호를유발시키면어떤단계를거쳐서 Dishevelled라는단백질이활성화되고, 여기에 ck1이라는 kinase가 Dishevelled와결합한다 46). 이러한일련의과정을통하여 b-catenin이 phosphorylation되는것을막고, 이러한안정된상태의 b- catenin은핵내로들어가서 wnt target gene들을발현시킨다 46). Wnt target gene으로알려진것으로 c-myc이대표적이다 47). c-myc은세포증식및분화에필수적인단백질이다. 본연구의결과에서 Wnt 관련유전자들의발현이전반적으로증가한것은결국 SMR의투여가세포증식과분화를일으키는데중요한 c-myc과같은유전자를발현시키고그결과세포증식을일으킨것으로해석할수있다. 인지질 (phospholipid) 은 glycerophospholipid 와 sphingophospholipid로분류되며, 세포막, 핵기타세포질의구성성분이다, 또한, 단백질합성에도관여한다 48). 본연구의결과에서 Glycerophospholipid metabolism 과관련된유전자의발현증가도상기한결과들과마찬가지고세포증식에직접적으로관여함으로써같은맥락으로이해된다. 마지막으로, SMR 처리에의해변화되는유전자중에서향후새로운약물의신규타겟이될수있는유전자를선별하기위하여단백질상호작용을이용한네트워크분석을수행한결과, 원발성골수섬유증 (primary myelofibrosis) 과관련있는 JAK2 49), 세포의증식및분화에관련된신호전달체계와관련된 GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) 50), 세포분화등의세포주기의조절과관련된 CDC42 51), 대장암과관련이있는 SMAD4 52), 다발성골수종 (Multiple Myeloma) 과관련이있는 B2M 53), 전사인자로서세포분열에관여하는 FOS 54) 및여성호르몬인에스트로젠의수용체와 관련깊은 ESR1 (Estrogen receptor 1) 55) 등의단백질이다른여러단백질과상호작용한다는것을 확인할수있으며, 따라서이들단백질이약물의세포내작용에매우중요한역할을수행할것으로예측된다. 상기한유전자들은대부분 oncogene에속하여암종과의관련성을가지고있는것처럼보이나, oncogene은대부분세포의증식분화에관여하는필수적인유전자군에속하고, 암종의발현은이러한 oncogene의과발현 (overexpression) 에의한것이므로이를구분할필요가있는것으로생각된다. 이상의결과로부터본저자는단삼추출물의투여는수지상세포의증식율을증가시킴으로써면역기능활성화에관여할가능성이있으며, 수지상세포의증식율증가에는 Wnt signalling pathway, Glycerophospholipid metabolism 등이관여할가능성이높다고생각하며, 관련단백질의정량등을통한추가연구를통하여상기한가설을입증할필요가있다고생각한다. 또한이러한결과는추후단삼의면역기능연구에중요한자료가될것으로생각한다. Ⅴ. 결론단삼이수지상세포의증식율및유전자발현양상에미치는영향을관찰하기위하여, DC-1 세포주에단삼을처리하고증식율을관찰한다음과같은결론을얻었다. 1. 투여농도 250 μg / ml이상에서유의하게수지상세포의증식율을증가시켰다. 2. 현미경상관찰에서투여농도와비례하여형태및밀도의증가가관찰되었다. 3. 생물학적과정의경우세포대사조절, 세포신호전달, 거대분자대사과정등의세포내기능과관련된항목들에서유전자발현의유의한차이를보였다. 64

14 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 4. 분자기능분포측면에서수용체활성, 뉴클레오티드결합및핵산접합등의항목에서유전자발현의유의한차이를보였다. 5. 세포성분에서는세포막경계소기관등의항목에서유전자발현의유의한차이를보였다. 6. 세포내신호전달체계별로분류해본결과 Wnt signalling pathway 및 Glycerophospholipid metabolism에관여하는유전자군의발현은증가하였고, Neuroactive ligand-receptor interaction 에관여하는유전자군의발현은감소하였다. 7. 단백질상호작용을이용한네트워크분석결과 JAK2, GRB2, CDC42, SMAD4, B2M, FOS 및 ESR1 등의단백질이상호작용네트워크의중심부에위치하고있었다. 참고문헌 1. 全國韓醫科大學本草學敎室共著. 本草學. 서울 ; 영림사. 2004; 宗先禎外. 丹蔘製劑臨床應用槪況. 山東中醫學院學報, 1992; 戴新民. 中醫免疫學. 臺北 ; 啓業書局. 1985; 진천식, 강성도, 정현우. 免疫細胞및腫瘍細胞에미치는丹蔘의效果. 대한동의병리학회지. 1998;12(2): 서영찬, 배현수, 홍무창, 신민규. 단삼이루프스 Model NZB/wF1 Mouse의면역기능에미치는영향. 대한동의생리학회 : 학술대회논문집. 2006: 은재순. 단삼물추출액의면역조절작용. 동의생리병리학회지. 2001;15(6): Roslev P, King GM. Application of a Tetrazolium Salt with a Water-Soluble Formazan as an Indicator of Viability in Respiring Bacteria. Appl Environ Microbiol. 1993;59(9): Florell SR, Coffin CM, Holden JA, Zimmermann JW, Gerwels JW, Summers BK, Jones DA, Leachman SA.Preservation of RNA for functional genomic studies: a multidisciplinary tumor bank protocol.mod Pathol. 2001;14(2): Weis S, Llenos IC, Dulay JR, Elashoff M, Martínez-Murillo F, Miller CL.Quality control for microarray analysis of human brain samples: The impact of postmortem factors, RNA characteristics, and histopathology. J Neurosci Methods. 2007;165(2): Kwon KH, Kim SJ, Kim HJ, Jung HH. Analysis of gene expression profiles in cholesteatoma using oligonucleotide microarray. Acta Otolaryngol. 2006;126(7): Zahurak M, Parmigiani G, Yu W, Scharpf RB, Berman D, Schaeffer E, Shabbeer S, Cope L.Pre-processing Agilent microarray data.bmc Bioinformatics. 2007;8: Pavlícek A, Hrdá S, Flegr J.Free-Treefreeware program for construction of phylogenetic trees on the basis of distance data and bootstrap/jackknife analysis of the tree robustness. Application in the RAPD analysis of genus Frenkelia.Folia Biol (Praha). 1999;45(3): 神農本草經. 北京 ; 科學技術文獻出版社. 1996: 許浚. 東醫寶鑑. 서울 ; 法人文化社. 1999: 임춘우, 서정철, 윤현민, 장경전, 송춘호, 안창범. 丹蔘藥鍼이急性腎不全家兎의신세뇨관에미치는영향. 대한침구학회지. 2001;18(2):

15 16. 朴世貞, 張慶全, 宋春活, 安昌範. 丹蔘藥鍼이 Rhabdomyolysis에의한急性腎不全에미치는영향. 대한침구학회지. 1999;16(2): 崔善美, 崔昇勳, 安圭錫. 단산의항암활성과 apoptosis에미치는영향. 대한동의병리학회지. 2000;14(2): 安圭錫外著. 東醫病理學. 서울 ; 高文社. 1990: 23-7,78-80, 方藥中外著. 實用中醫內科學. 上海 ; 上海科學技術出版社. 1988: 金完熙, 崔達永編著. 臟腑辨證論治. 서울 ; 成輔社. 1985: 洪元植編. 精校黃帝內經. 서울, 東洋醫學硏究院出版社. 37, 55, 57, 69, 78, 82, 87, 118, 119, 122, 169, 213, 249, 256, 292, 304, 305, 318, 319, 326, 347, 348, 김영희, 이병렬. 구기자분획약침이마우스의면역기능에미치는영향. 대한침구학회지. 1996;13(2): Fearon DT, Locksley RM. The instructive role of innate immunity in the acquired immune response. Science. 1996:5;272 (5258): Brightbill HD, Libraty DH, Krutzik SR, Yang RB, Belisle JT, Bleharski JR, Maitland M, Norgard MV, Plevy SE, Smale ST, Brennan PJ, Bloom BR, Godowski PJ, Modlin RL.Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors. Science. 1999:30;285 (5428): Aliprantis AO, Yang RB, Mark MR, Suggett S, Devaux B, Radolf JD, Klimpel GR, Godowski P, Zychlinsky A.Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 1999:30;285(5428): 김도순, 박정은, 서권일, 고성룡, 이종원, 도재호, 이성태. 고려홍삼의수지상세포활성화효과. 고려인삼학회지. 2006;30(3): Thomas R, Lipsky PE. Dendritic cells: origin and differentiation.stem Cells. 1996; 14(2): Banchereu J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998;392: Fearnley PB, Whyte LF, Carnoutsos SA, Cook AH Hart DN. Monitoring human blood dendritic cell numbers in normal individuals and in stem cell transplantation. Blood. 1999;93: Stockwin LH, McGonagle D, Martin IG, Blair GE. Dendritic cells; immunological sentinels with a central role in health and disease, Immunol Cell Biol. 2000;78: Jiang W, Swiggord WJ, Heuflerc, Peng M, Mirza A, Steinman RM, et al, The receptor DEC-205 expressed by dendritic cells and thymic epithelial cells is involved in antigen processing. Nature. 1995;375: Sallusto F, Cella M, Danieli C, Lanzavecchia A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macro molecules in the major histocompatibility complex class Ⅱ compartment; down regulation by cytokines and bacterial products. J Exp med. 1995; 182: Hart DN. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response. Blood. 1997;90(9): 66

16 강문여외 3 인 : 단삼이수지상세포의유전자발현에미치는영향 Bell D, Young JW, Banchereau J.Dendritic cells.adv Immunol. 1999;72: Kronin V, Winkel K, Süss G, Kelso A, Heath W, Kirberg J, von Boehmer H, Shortman K.A subclass of dendritic cells regulates the response of naive CD8 T cells by limiting their IL-2 production.j Immunol. 1996;157(9): Süss G, Shortman K.A subclass of dendritic cells kills CD4 T cells via Fas/Fas-ligand-induced apoptosis.j Exp Med. 1996;183(4): Brown PO, Botstein D.Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.nat Genet. 1999;21(1 Suppl): 김진혁, 이용성. CDNA microarray. 천식및알레르기학회지 2001;21(3): Jeffrey SS, Fero MJ, Børresen-Dale AL, Botstein D.Expression array technology in the diagnosis and treatment of breast cancer. Mol Interv. 2002;2(2): Hong Y, Ho KS, Eu KW, Cheah PY. A susceptibility gene set for early onset colorectal cancer that integrates diverse signaling pathways: implication for tumorigenesis. Clin Cancer Res. 2007;13 (4): Galbraith DW. The daunting process of MIAME. Nature Nov 2;444(7115): Pimpinelli N, Santucci M, Romagnoli P, Giannotti B.Dendritic cells in T- and B-cell proliferation in the skin.dermatol Clin. 1994;12(2): Nusse R, Theunissen H, Wagenaar E, Rijsewijk F, Gennissen A, Otte A, Schuuring E, van Ooyen A.The Wnt-1 (int-1) oncogene promoter and its mechanism of activation by insertion of proviral DNA of the mouse mammary tumor virus.mol Cell Biol. 1990;10(8): Bafico A, Gazit A, Pramila T, Finch PW, Yaniv A, Aaronson SA.Interaction of frizzled related protein (FRP) with Wnt ligands and the frizzled receptor suggests alternative mechanisms for FRP inhibition of Wnt signaling.j Biol Chem. 1999;274 (23): Kawasaki A, Torii K, Yamashita Y, Nishizawa K, Kanekura K, Katada M, Ito M, Nishimoto I, Terashita K, Aiso S, Matsuoka M.Wnt5a promotes adhesion of human dermal fibroblasts by triggering a phosphatidylinositol-3 kinase/akt signal.cell Signal. 2007;19(12): Semba S, Kusumi R, Moriya T, Sasano H.Nuclear Accumulation of B-Catenin in Human Endocrine Tumors: Association with Ki-67 (MIB-1) Proliferative Activity. Endocr Pathol. 2003;1(3): You Z, Saims D, Chen S, Zhang Z, Guttridge DC, Guan KL, MacDougald OA, Brown AM, Evan G, Kitajewski J, Wang CY.Wnt signaling promotes oncogenic transformation by inhibiting c-myc-induced apoptosis.j Cell Biol. 2002;157(3): Holmsen H, Hindenes JO, Fukami M.Glycerophospholipid metabolism: back to the future.thromb Res. 1992;67(3): Kennedy JA, Barabé F, Patterson BJ, 67

17 Bayani J, Squire JA, Barber DL, Dick JE.Expression of TEL-JAK2 in primary human hematopoietic cells drives erythropoietin-independent erythropoiesis and induces myelofibrosis in vivo.proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(45): Berry DM, Nash P, Liu SK, Pawson T, McGlade CJ. "A high-affinity Arg-X-X-Lys SH3 binding motif confers specificity for the interaction between Gads and SLP-76 in T cell signaling". Curr. Biol. 2002;12 (15): Johnson DI.Cdc42: An essential Rho-type GTPase controlling eukaryotic cell polarity. Microbiol Mol Biol Rev. 1999;3(1): Schutte M. DPC4/SMAD4 gene alterations in human cancer, and their functional implications.ann Oncol. 1999;10 Suppl 4: Bataille R, Grenier J, Sany J. Unexpected normal serum beta microglobulin (B2M) levels in multiple myeloma. Anticancer Res. 1987;7: Karin Milde-Langosch. The Fos family of transcription factors and their role in tumourigenesis. European Journal of Cancer 2005;41(16): Bonnelye E, Aubin JE. Estrogen receptorrelated receptor alpha: a mediator of estrogen response in bone.j Clin Endocrinol Metab. 2005;90(5):