(72) 발명자 런드버그, 커리너, 빙스보 스웨덴에스 횔비켄콜휘츠벡스크후리스배그 호앙, 트룩, 티, 킴, 댄 덴마크디케이 코펜하겐에스 4 텔레막스가데

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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) A61K 39/04 ( ) C07K 14/35 ( ) A61P 11/00 ( ) C07K 19/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제출원일자 ) 2010 년 04 월 23 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2011 년 11 월 24 일 (86) 국제출원번호 PCT/DK2010/ (87) 국제공개번호 WO 2010/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2010 년 10 월 28 일 PA 년 04 월 24 일덴마크 (DK) 전체청구항수 : 총 18 항 (54) 재활성화를예방하기위한결핵백신 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2012년02월16일 (71) 출원인 스태튼스세룸인스티튜트 덴마크디케이 코펜하겐에스오레스타즈불러바드 5 (72) 발명자 디트리히, 제스 덴마크디케이 코펜하겐엔 1 뇌레브로가데 200 비 안데르센, 피터 덴마크디케이 브뢴스회이스파레스홀름바이 47 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인대아 (57) 요약 본발명은결핵복합체미생물 ( 결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔 ) 의종에의하여야기되는잠복결핵감염의재활성화를예방하기위하여, 모두가상호의존적으로분비가요구되고발병에필수적인것으로알려진 ESX-1 분비시스템에모두속하는 ESAT6, CFP10 및 EspA. ESAT6, CFP10 및 EspA 과같이구조적으로발현되는항원들을목표로함으로써, 잠복감염된대상에투약되는백신에의하여결핵복합체 ( 결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔 ) 의종에의하여야기되는감염을치료하는것에대한것이다. 이들분비된항원들은박테리아전염 (dessemination) 및세포막용균에결정적이다. 예컨대, Ag85 의발현이감염후곧하향조절되는것에반하여, ESAT6, CFP10 및 EspA 은또한질병의서로다른단계에서구조적으로발현되는항원들이다. 놀랍게도면역원성구조적으로발현되는항원들은노출후백신으로서투약되는경우감염잠복을유지함으로써잠복결핵감염의재활성화를예방한다. 대표도 - 도 4-1 -

2 (72) 발명자 런드버그, 커리너, 빙스보 스웨덴에스 횔비켄콜휘츠벡스크후리스배그 호앙, 트룩, 티, 킴, 댄 덴마크디케이 코펜하겐에스 4 텔레막스가데

3 특허청구의범위청구항 1 M. 튜버쿨로시스 (M. tuberculosis) 의감염동안구조적으로발현되는항원또는상기항원을코드하는핵산을포함하며결핵의재활성화를예방하는잠복감염된대상에투약하는백신또는면역원성조성물. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기구조적으로발현되는항원은, ⅰ) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 32, 33 및 34 ⅱ) 예컨대 T 세포에피토프인상기 ⅰ) 의서열중어느하나의면역원성부위 ; 및 ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 의서열들중어느하나에적어도 70% 의서열일치성을가지며, 동시에면역원성인아미노산서열상동체로구성되는군으로부터선택되는 ESX-1 분비시스템에속하는것을특징으로하는조성물. 청구항 3 제 2항에있어서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12 또는 13 면역원성부위의혼합물과같은면역원성부위의혼합물을포함하는조성물. 청구항 4 제 3항에있어서, 상기항원은서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 31으로구성되는군으로부터선택되는것을특징으로하는조성물. 청구항 5 제 1항또는제 2항에있어서, 상기폴리펩타이드는마이코박테리아과의박테리아에의하여발현되는항원과융합되는것을특징으로하는조성물. 청구항 6 제 5 항에있어서, 상기융합파트너는구조적으로발현되는항원인것을특징으로하는조성물. 청구항 7-3 -

4 제 6 항에있어서, CFP10 에융합된 ESAT6 를포함하는것을특징으로하는조성물. 청구항 8 제 1항내지제 7항중어느한항에있어서, 마이코박테리아유전자를발현하는바이러스또는박테리아와같은유전자-변형된생물인생재조합백신중에서선택되는추가적인전달시스템, 또는상기전술한단백질의유전자또는유전자단편을발현하는플라스미드인 DNA 백신, 또는항원보강제와같은전달시스템에서전달되는단백질자체로부터유도되는합성펩타이드또는단백질자체인단백질백신과같은면역원성전달시스템을포함하는조성물. 청구항 9 제 8 항에있어서, 상기항원보강제는 DDA/TDB 및 / 또는폴리 I:C 를포함하는것을특징으로하는조성물. 청구항 10 제 1 항내지제 9 항중어느한항에있어서, 상기아미노산서열은폴리펩타이드가자체 - 항원보강효과를갖도록지질화되는것을특징으로하는조성물. 청구항 11 잠복결핵의치료용도를위하여제 1 항내지제 7 항중어느한항에서규정된군으로부터선택되는항원. 청구항 12 예컨대마이코박테리움튜버쿨로시스, 마이코박테리움아프리카눔또는마이코박테리움보비스인병독성마이코박테리아에의하여야기되는결핵감염의재활성화에대하여, 제 1항내지제 10항중어느한항의백신또는면역원성조성물을동물에게투여하는단계를포함하는, 인간을포함한동물의치료방법. 청구항 13 제 12 항에있어서, 상기백신또는면역원성조성물은급성기후및 / 또는잠복기감염동안투여되는것을특징으로하는방법. 청구항 14 제 12항에있어서, 상기방법은병독성마이코박테리아에의하여잠복감염된개체 (subject) 를확인하는단계를포함하는것을특징으로하는방법

5 청구항 15 제 14항에있어서, 상기병독성마이코박테리아에의하여잠복감염된개체는구조적으로발현된항원으로자극한후 IP10의검출, HBHA에대한반응의인비트로검출, 콴티페론 (Quantiferon) 검사또는망뚜 (Mantoux) 투베르쿨린피부테스트 (TST) 와같은진단절차에서확인하는것을특징으로하는방법. 청구항 16 예컨대, 마이코박테리움튜버쿨로시스, M. 보비스및 M. 아프리카눔인결핵복합체종에의하여야기되는잠복감염의재활성화에대한백신의제조를위한, 제 1항내지제 7항중어느한항에서규정된군으로부터선택되는항원의용도. 청구항 17 제 16 항에있어서, 상기백신은급성기감염후및 / 또는잠복기감염동안투여되기위한것을특징으로하는용도. 청구항 18 제 16항또는제 17항에있어서, 상기백신은제 1항내지제 7항에서규정된하나또는그이상의면역원성부위를포함하는것을특징으로하는용도. 명세서 [0001] 기술분야본발명은 ESAT6, CFP10 및 ESX-1 분비시스템결핵유래의다른항원들과같이본질적으로발현된항원들을타겟으로함으로써, 결핵복합체미생물들 ( 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), M. 보비스 (M.bovis), M. 아프리카눔 (M.africanum)) 의종에의하여야기되는잠복결핵감염의재활성화를예방하기위하여잠복감염된대상에게투약할수있는백신을개시한다. [0002] 배경기술 WHO에의하면, 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis(m. tuberculosis)) 이야기하는인간결핵은연간약 3백만명의사망의원인이되는심각한전세계적인건강상의문제이다. 1960년대및 1970년대동안신종결핵 (TB) 의전세계적인발병률은감소하였으나, 부분적으로는 AIDS의출현및다제내성결핵균주의발생때문에, 최근수십년간이러한경향은현저히변하였다. [0003] 결핵균복합체의생물들은다양한질병을일으킬수있으나가장흔한침범경로는박테리아의흡입에의한것 이다. 이는폐감염을야기하는데, 폐감염은결국에는신체의다른부위로퍼질수있다. 보통은, 이러한감염 - 5 -

6 은면역시스템에의하여성장이제한되며, 이로써감염된대상의대부분은기침및열외증상은거의보이지않고, 기침및열은결국은완화된다. 대략 30% 의사람들은감염을유지하는것이불가능하며, 그들은원발성질병 (primary disease) 으로발전하는데, 많은경우이는결국은치명적인것으로판명된다. 그러나감염을명백히조절하는이러한사람들조차도대개는그들의남은삶동안감염된채로유지된다. 확실히수년간또는심지어수십년간건강한사람들이결핵을갑자기발전시키는데, 이는수년전에그들이감염되었던동일한생물에의하여야기된것으로판명된다. 결핵균복합체 (TB complex) 의 M. 튜버쿨로시스 (M. tuberculosis) 및다른생물들은마이코박테리아 (mycobacteria) 가면역반응에침범하여불응비복제또는느린속도로복제가일어나는단계 (slowly-replicating stage) 에서오랜기간살수있다는점에서특이하다. 이는잠복결핵이라불리며, 오늘날세계인구의대략 1/3에게영향을끼치는것으로추정되는, 매우심각한전세계적인건강상의문제이다 (Anon., 2001). [0004] 현재임상용도로이용가능한유일한백신은 BCG인데, 이는그효능에대하여아직논쟁의문제가남아있다. 비록 BCG가 1차감염의동물모델에서일관되게잘기능한다고하더라도, 그것은결핵의유행을통제하는데에는명백하게실패하였다. 마찬가지로, BCG 백신접종은소아결핵 ( 이는 1차감염때문이다 ) 으로부터는보호하는것으로보이나, 성인질병 ( 이는종종유년기에얻은잠복감염의재활성화이다 ) 에대하여는보호를하지못하거나거의보호를제공하지못한다. 또한현재마이코박테리아에민감하거나 (sensitize) 또는잠복감염된대상에게백신접종하는것은효과가없는것으로보인다. [0005] M. 튜버쿨로시스감염의진행은본질적으로도 1에서도시하는대로 3 단계로이루어진다. 급성기동안, 면역반응이증가하여감염을통제할수있고, 그결과박테리아의부담이정점에이르고감소하기시작하는때까지박테리아는기관내에서증가한다. 그이후, 박테리아부담이낮은수준에서안정적으로유지되는잠복기가확립된다. 이단계에서, M. 튜버쿨로시스가활동적인증식으로부터휴면 (dormancy) 으로가서, 본질적으로비복제가되며육아종 (granuloma) 내에남아있게된다는것이최근의생각이었다. [0006] 그러나, 최근, 지속적으로낮은박테리아수를보이는단계에서조차박테리아군중적어도일부는활동성대사상태에있는것이명확하여졌다 (Talaat AM et al. 2007). 그러므로이들박테리아는살아남으며, 활동성대사를유지하고, 강한면역반응에도불구하고복제한다. 그러므로감염된대상에서는비복제 (non-replicating) 박테리아 ( 이들이세포내에위치하기면역시스템이감지하는것을매우어려울수있다 ) 및면역숙주내에서마주치는적대적인환경에적응하기위한시도인, 활동적이지만변화된발현프로필 (profile) 을갖는천천히복제되는박테리아간에균형이있다. 종래의예방백신들을잠복감염된실험동물들에가할때활성이부족하다는점이예시하듯, 이단계에있는박테리아는현재결핵분야에서개발중인대부분의예방백신이전형적으로목표로하는것은아니다 (Turner 2000). [0007] 어떤경우, 균형은병원체쪽으로기울어져, 박테리아가급격히복제를시작하고감염된대상내박테리아수가증가하는재활성단계로감염이진행된다. 매우강한면역압력하감염잠복된대상내에서복제하는박테리아는본발명의백신접종전략의목표이다. 예방백신들을잠복감염된실험동물들에가할때활성이부족하다는점이예시하듯, 이러한잠복감염단계에있는박테리아는현재결핵분야에서개발중인대부분의예방백신이전형적으로목표로하는것은아니다 (Turner 등 2000). 강한숙주면역반응이주요한예방백신항원 Ag85 및 PstS과같은많은항원들의하향조절에이르게된다는것이현재알려져있는바, 이는놀라운것은아니다 (Rogerson, BJ et al 2006). Ag85B의경우, 감염이후 Ag85B 발현에는초기과도증가가있으나, 감염 2주후에이미박테리아 Ag85B 발현수준은피크기동안 M.tb의 CFU 당 0.3 전사물 (transcript) 에서 CFU 당 0.02 전사물로떨어지며, 이러한낮은수준은적어도감염후 100일까지유지된다. 그러므로감염 2주후어느시점에서든박테리아의 2% 미만이활동적으로 Ag85B를발현시킨다 ( 동일책 ). Ag85B의낮은발현은감염후 3주또는그이후폐에서 Ag85B에대한반응에서 IFN-g를만들수있는 T 세포의수가급격히떨어지는것에의하여지지된다. [0008] 이에반하여, 어떤항원들은감염의다른단계들에서계속해서더욱안정적으로 ( 구조적으로 ) 발현되는데, 그예 - 6 -

7 가 ESAT6이다. 초기감염단계이후 ESAT-6 발현수준은 M. 튜버쿨로시스 CFU 당 0.8 전사물로안정된다. 이것은 Ag85B보다더욱높은전사수준이며, 이러한수준은감염후적어도 100일까지안정적으로유지된다 (Rogerson, BJ 등 2006). 또한전사데이터는감염부위에서감염의뒷단계에서의 ESAT-6의강한 T 세포인식을보이는면역데이터에의하여뒷받침된다 ( 동일책 ). 이러한구조적인발현패턴은이들분자들이병원체의결정적인중요성인본질적인기능, 즉병원체가면역숙주내에서생존하기위하여구조적으로발현될필요가있는유전자들에의존하는기능을달성한다는것을보여주는중요한특징이다. 이들분자들은본발명의기초이며, 잠복감염된대상들에투약되는백신에서특히중요한항원들인데, 이는이들이박테리아라이프스타일의모든단계를목표로하고, 그러므로활성을위하여가장폭넓은가능한성분 (basis) 를갖기때문이다. 이는비복제지속기 (persistence) 동안마이코박테리아에의하여상향조절되는항원을확인하는데주목해온최근의생각과는다른것이다 (Andersen, P. 2007, WO , WO , Lin MYand Ottenhoff TH 2008; Leyten EM. 등 2006). 비록이러한항원들이비복제지속기동안상향조절되기는하나, 비복제박테리아로부터이용가능한양은인지 (detection) 또는보호면역작동체 (effector) 기능을유발하기위한합리적인역치이하인바, 그것들이항상면역인식에이용가능한것은아니다. [0009] 반면, ESX-1 분비시스템유래의몇몇단백질들은높은면역원성을보였으며높은수준으로발현되었다. ESX- 1은몇몇병원성마이코박테리아에서보존되며, 결핵균 (tubercle bacilli) 의발병력에관여한다. ESAT-6, CFP10 및 EspA의분비에있어개개의 ESX-1 단백질의기여는잘보고되어왔으며 ((Pym AS 등 2003; Guinn Kl 등, 2004;Stanley, SA 등. 2003; Brodin, P. 등. 2006; MacGurn JA 등. 2005; Raghavan, S. 등. 2008), 작동체분자들의기능은박테리아가퍼지는것과포식소체 (phagosome) 를피하는멤브레인용균인것으로나타났다 (Gao LY 등 2004; Smith J. 등 2008). [0010] 재활성화로이끄는인자들및잠복감염을통제하는면역반응의완전한특성들은대부분알려져있지않다. 그러나책임있는우세한세포타입의변화에대하여는몇가지증거가있다. 급성기동안감염의조절에 CD4 T 세포가필수적이면서도충분한반면, 연구는잠복기에는 CD8 T 세포반응이더중요하다는것을제안한다 (van Pinxteren LA 등 2000). [0011] 당업자가쉽게인정하듯이, 유전자의발현은그것을좋은백신후보로만드는데충분하지않다. 한단백질이 M. 튜버쿨로시스의잠복감염동안면역시스템에의하여인식되는지여부를확인하는유일한방법은상기단백질을생산하고, 그것을여기에기재한적절한검사로시험하는것이다. 이점에있어서, 우리그룹은 ESAT-6 (Early Secretory Antigen Target-6) 와같이, 마이코박테리아에의하여강하게발현되는항원들이감염의모든단계의대상, 사실특히잠복감염된대상에서인식된다고주장한다 (Boesen, Ravn, Doherty 2002). [0012] 그러나자연적인감염동안준비되는 ESAT-6 특이적 T 세포들은, 비록그것들이많은수로존재한다고하더라도, 감염성질환에대한방어 (protective) T 세포로서낮은활성및매우제한된수명을가지며, 궁극적으로분화되는 T 세포들인거의독점적인소위작동체 (effector) 발현형이다 (Seder R, et al. 2008). 이는결핵재활성화로부터보호하기위해본연구에서주장되는백신에의하여촉진되는고품질, 소위다기능성 (polyfunctional) T 세포와는현저하게다른것이다. [0013] 그것은노출후 (post exposure) 백신으로서유용한고발현면역원성단백질들과는거리가먼데, 이는다수가과민반응을일으켜상황을악화시키기때문이다. 이것은 Kock의오리지널투베르쿨린 (tuberculin) 백신의의학시험에서명백히증명된것이다. 상기백신은피부및폐결핵을포함하는다양한형태의질병으로부터고통받는환자들에게노출후백신으로서처치되었다. 이시험은완벽한실패였으며기록된환자들중몇몇은심각한과민반응때문에사망하였다 ((Guttstadt A. 1891). 1차감염동안발현하는것으로알려지고백신으로서시험된수백개의항원들중 6개미만이중요한후보로증명되었다. 지금까지오직하나의항원이노출후백신으로서잠재성을갖는것으로나타났다 (Lowrie, 1999). 그러나이백신은지금까지인간에사용하기에는승인되지않은실험기술인 DNA 백신으로서처리할때오직작동했다. 게다가이기술은이프로토콜을이용하는백신접종이비특이적보호또는심지어질병악화를유도한다고주장하는다른그룹들과논쟁이있는것으로알려졌다 - 7 -

8 (Turner, 2000). [0014] 그러므로질병의재활성화로부터감염된대상을보호하기위한, 효과적인노출후백신접종전략이강하게요 구된다. 선행기술문헌 [0015] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) Andersen, P (1), 7-13 ( 비특허문헌 0002) Anon Global Tuberculosis Control. WHO Report. ( 비특허문헌 0003) Arend, SM., Infect Immun (6): ( 비특허문헌 0004) Brodin, P. et al. Infect Immun. 2006, 74, ( 비특허문헌 0005) Cote-Sierra J, et al 1998, Gene Oct 9;221(1):25-34 ( 비특허문헌 0006) Doherty TM et al., 2002, J Clin Microbiol. Feb;40(2): ( 비특허문헌 0007) Gao LY et al 2004, Molecular Microbiology ( 비특허문헌 0008) Gosselin et al., J. Immunol. 149: ( 비특허문헌 0009) Guinn Kl et al, 2004, MoI Microbiol. 51, ( 비특허문헌 0010) Guttstadt, A Die Wirksamkeit des Koch'schen Heilmittels gegen Tuberculosis, Po-lykliniken und Pathologisch/Anatomischen Institute der Preussischen Universitaten. Springer, Berlin. ( 비특허문헌 0011) Harboe, M., et al 1998 Infect. Immun. 66:2; ( 비특허문헌 0012) Hougardy et al 2007, PLoS ONE. Oct 3;2(10):e926 ( 비특허문헌 0013) Kilgus J et al, J Immunol Jan 1 ;146(1): ( 비특허문헌 0014) Leyten EM. Et al. Microbes Infect (8): ( 비특허문헌 0015) Lin MYand Ottenhoff TH, Biol. Chem. 2008, 389 (5): ( 비특허문헌 0016) Lowrie, D.B. et al 1999, Nature 400: ( 비특허문헌 0017) Lustig et al 1976, Cell Immunol 24(1 ):164-7 ( 비특허문헌 0018) MacGurn JA et al. MoI Microbiol. 2005, 57: ( 비특허문헌 0019) Merrifield, R. B. Fed. Proc. Am. Soc. Ex. Biol. 21: 412, 1962 and J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963 ( 비특허문헌 0020) Mowat et al 1991, Immunology 72(3): ( 비특허문헌 0021) Mustafa, AS et al. 2000, Clin. Infect. Dis. 30 (suppl. 3) S201-S205 ( 비특허문헌 0022) Nagai et al 1991, Infect. Immun 59:1 ; ( 비특허문헌 0023) Olsen AW et al, Eur J Immunol Jun; 30(6): ( 비특허문헌 0024) Pym AS et al Nat Med 2003, 9, 533-9; ( 비특허문헌 0025) Pearson, WR. et al Proc Natl Acad Sci U S A1 85, ( 비특허문헌 0026) Raghavan, S. et al. 2008, Nature 454,

9 ( 비특허문헌 0027) Ravn, P. et al J.lnfect.Dis. 179: ( 비특허문헌 0028) Rolph, MS, and I. A. Ramshaw Curr.Opin.lmmunol.9: ( 비특허문헌 0029) Rogerson, BJ et al Immunology 2006, 118, Rosenkrands, I., et al 1998, Infect, lmmun 66:6; ( 비특허문헌 0030) Ruhwald M. et a/ 2008 PLoS ONE. Aug 6;3(8):e2858 ( 비특허문헌 0031) Sambrook et al Molecular Cloning; A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 1989 ( 비특허문헌 0032) Seder, Nat. Rew. Immunol. 2008;8(4): ( 비특허문헌 0033) Sinigaglia F et al. Nature 1988 Dec 22-29;336(6201): ( 비특허문헌 0034) Skjøt, RLV., et a/ 2000, Infect, lmmun 68:1; ( 비특허문헌 0035) Smith J. et al. 2008, Infect lmmun 76, ( 비특허문헌 0036) Stanley, SA et al Proc Natl Acad. Sci USA 100: ( 비특허문헌 0037) Stryhn. A., et al 1996 Eur. J. Immunol. 26: ( 비특허문헌 0038) Turner, OC ef a/ 2000 Infect lmmun. 68:6: ( 비특허문헌 0039) Talaat AM et al. 2007, J of Bact 189, ( 비특허문헌 0040) Thompson J., et al Nucleic Acids Res : ( 비특허문헌 0041) Ulmer J. B et al 1993, Curr. Opin. Invest. Drugs 2(9): ( 비특허문헌 0042) van Pinxteren LA et al Eur. J. Immunol. 30: 발명의내용 [0016] 해결하려는과제본발명은결핵복합체미생물들 ( 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), M. 보비스 (M.bovis), M. 아프리카눔 (M.africanum)) 의종에의하여야기되는잠복결핵감염의재활성화를예방하기위하여잠복감염된대상에게투약할수있는백신을개시한다. [0017] 과제의해결수단본발명은 ESAT6, CFP10 및 ESX-1 분비시스템결핵유래의다른항원들과같이본질적으로발현된항원들을타겟으로함으로써, 결핵복합체미생물들 ( 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis), M. 보비스 (M.bovis), M. 아프리카눔 (M.africanum)) 의종에의하여야기되는잠복결핵감염의재활성화를예방하기위하여잠복감염된대상에게투약할수있는백신을개시한다. [0018] 발명의효과본발명은결핵복합체미생물 ( 결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔 ) 의종에의하여야기되는잠복결핵감염의재활성화를예방하기위하여, 모두가상호의존적으로분비가요구되고발병에필수적인것으로알려진 ESX-1 분비시스템에모두속하는 ESAT6, CFP10 및 EspA. ESAT6, CFP10 및 EspA과같이구조적으로발현되는항원들을목표로함으로써, 잠복감염된대상에투약되는백신에의하여결핵복합체 ( 결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔 ) 의종에의하여야기되는감염을치료하는것에대한것이다. 이들분비된항원들은박테리아전염 (dessemination) 및세포막용균에결정적이다. 예컨대, Ag85의발현이감염후곧하향조절되는것에반하여, ESAT6, CFP10 및 EspA은또한질병의서로다른단계에서구조적으로발현되는항원들이다. 놀랍게도면역원성구조적으로발현되는항원들은노출후백신으로서투약되는경우감염잠복을유지함으로써잠복결핵감염의재활성화를예방한다

10 [0019] 도면의간단한설명 도 1: M. 튜버쿨로시스감염과정은본질적으로 3 기 (phase) 를통하여진행된다. 도 2: 재활성화를예방하기위한노출후백신접종의모델. 도 3: TB 백신접종모델. 노출후백신의시험을위하여 SSI에서사용한모델의도식적인개요. 마우스들은에어로졸경로에의하여병독성 M. tb로감염된다. 감염후 6주부터 12주까지마우스들은잠복 TB 상태를확립시키기위하여항생제로처리된다. 마우스들은 3 주간격으로 2에서 3회백신접종되는데, 이는노출후백신후보들로감염된지 10주후에시작한다. 이마우스들은질병을재활성화시키도록시간이허용되고, 대략 20주후, 백신의보호효험 (protective efficacy) 을평가하기위하여폐들을박테리아수를평가한다. 도 4: Ag85가아닌 ESAT6에의하여보호가유도되는노출후백신마우스들은실시예 1의도식적인개요에따라감염되고, 치료되며백신접종되었다. 마우스들은감염후 30-40주사이에희생시켰으며, 이시점에서폐들이박테리아부하 (load) 가평가되거나 ( 도 A, C-E), ESAT6에대한감염전반에걸쳐, 박테리아부하가몇몇시점에서결정된도 4B에기재되어있듯이평가되었다. (A 및 B) 대조군동물에비교한 ESAT6 백신접종된박테리아부하. (C) 대조군동물에비교한 Ag85B 백신접종된박테리아부하. (D) Ag85B 백신접종된군및대조군동물에모두비교한백신접종된 ESAT-6 펩믹스 (pepmix)( 전장 ESAT6 서열을커버하는오버랩핑펩타이드들의풀 (pool)) 의박테리아부하. (E) 재활성화에대한보호로, 그다음에 Ag85B- ESAT-6 (H1) 의노출후백신접종을하는데, 이는비-백신접종된대조군마우스에비교하여백신접종된것이다. 도 4A, C-E의모든데이터는평균이함께그려진, 각각대상동물을나타내는도트플롯 (dot plots) 으로개시되며, 반면도 4B는평균 ± 평균의표준에러 (standard error of the mean (SEM)) 로개시되며, 6 대상동물들을나타낸다 (B). 모든통계적인분석은짝지워지지않은 t-테스트 ( 도 A-C 및 E) 또는 p<0.05가중요하게고려되는 Turkey의다중비교시험 (Tukey's multiple comparison test)( 도 D) 을이용하여수행되었다. 도 5: ESAT-6 노출후백신접종은다기능성 (polyfunctional) T 세포를유도한다. 비-백신접종되거나또는 ESAT-6 백신접종된동물의감염된폐의세포들이항-CD4, -CD8, -IFN-γ, -TNF-α 및 -IL-2로염색되기 (staining) 전에 ESAT-6로인비트로에서자극되었다. (A 및 B) 사이토카인프로파일들은 CD4 T 세포들을 IFN-γ 양성 (+) 또는 IFN-γ 음성 (-) 세포들로먼저나눔으로써결정되었다. IFN-γ+ 및 IFN-γ- 세포들은모두 TNF-α 및 IL-2의생산과관련하여분석되었다. 원그래프 (A 및 B) 는사이토카인생산프로파일에따라색깔로부호처리되고, 주어진사이토카인생산프로파일에양성인 CD4+ T 세포반응 (ESAT-6 특이적 CD4 T 세포밖으로 ) 의부분들 (fractions) 을요약하였다. (C) 사이토카인들의모든가능한조합이막대그래프의 x축상에나타나있으며, 사이토카인들의임의의조합을발현하는 ESAT-6 백신접종된마우스 ( 검은막대 ) 또는비-백신접종된마우스 (( 회색막대 ) 내 ESAT-6 특이적 CD4+ T 세포들의퍼센트는각각면역화그룹으로주어졌다. (D) 잠복감염된마우스들은 ESAT-6로 2 회백신면역되고, 마지막백신면역후 20주에, 보호효험을결정하기위하여폐들이박테리아수를위하여평가되었다 (**p<0.01, One way ANOVA Tukey's 다중비교시험 ). 도 6: 모든노출후실험의풀분석 (pooled analysis) ESAT6, Rv3871, Ag85B, Rv3905, Rv3445, RvO569 또는 Rv2031c( 도 A), Ag85B-ESAT6 (H1) 또는 Ag85B-ESAT6- Rv2660 (H56)( 도 B) 가노출후백신접종에사용된대상실험을위하여, 항원보강제 (adjuvant) 대조군의박테리아부하의중앙값 (median) 이, 전술한항원중하나로백신면역된백신면역군의각각의대상마우스의박테리아부하와비교되었다. 도 A 및 B에서, 각각의도트는보호수준, 즉, 항원보강제대조군에비교하여백신접종에의하여부여된 Log10 CFU에해당하고, 몇몇의비의존적실험으로구성된다. (A) 단일항원 ESAT6, Rv3871, Ag85B, Rv3905, Rv3445, RvO569 또는 Rv2031c를위하거나 (B) 또는 ESAT 단독에비교한하이브리드항원 H1 및 H56을위한 Log10 보호. Kruskall Wallis 다중비교시험을이용하여서로다른군들간의중앙값비교를위하여통계적분석을적용하였다. p<0.05가중요하게고려되었다. 도 7: ESAT6 및대조군동물에비교한 Rv3871로노출후백신접종의효과. 마우스들은감염되고, 치료되고, 감염후 10, 13 및 18 주에백신면역되었다. 감염후 36주에마우스들을끝내고, 백신면역된마우스및비-백신면역된식염수대조군마우스양쪽으로부터의폐림프구들이, Rv3871( 도 7A) 또는 ESAT6( 도 7B) 로인비트로로재자극되었다. ELISA 에의하여평가된 IFN-γ 방출및샘플들이 3회에

11 걸쳐수행되었다. 데이터들은평균 ±SEM 으로나타내었다. 백신들에의하여부여된보호효험은, 전체폐 - 균질현 탁액 (homogenate) 으로부터배양된폐의박테리아를셈으로써, 결정되었다 (n=16-18). 도트플롯으로나타낸데이 터로, 각각의도트는대상동물을가리키며, 중앙값으로나타낸다 ( 빨간선 ). [0020] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은잠복감염된대상에노출후 (post-exposure) 투여되며, M. 튜버쿨로시스의감염동안구조적으로발현되는항원또는상기항원을코드하는핵산을포함하는결핵재활성화를예방하는백신또는면역원성조성물을개시한다. [0021] 바람직하게는상기조성물은 ESX-1 분비시스템에속하며구조적으로발현되는항원들인 ESAT6 ( 서열번호 1), CFP10 ( 서열번호 2), EspA ( 서열번호 3), Rv3614c ( 서열번호 4), Rv3615c ( 서열번호 5), EspR ( 서열번호 6), Rv3868 ( 서열번호 7) Rv3869 ( 서열번호 8), Rv3870 ( 서열번호 9), Rv3871 ( 서열번호 10), Rv3872 ( 서열번호 11), Rv3873 ( 서열번호 12), Rv3876 ( 서열번호 13), Rv3877 ( 서열번호 14), Rv3878 ( 서열번호 15), Rv3879c ( 서열번호 16), Rv3880c ( 서열번호 17), Rv3881c ( 서열번호 18), Rv3882c ( 서열번호 32), Rv3883c ( 서열번호 33), Rv3865c ( 서열번호 34), 또는예컨대 T 세포에피토프인이들서열들중어느하나의면역원성부위, 또는이들서열들중어느하나와적어도 70% 의서열일치성을갖고동시에면역원성인아미노산서열상동체 (analogue) 를포함한다. [0022] 또는, 상기조성물은바람직하게는서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 31 로구성 되는군으로부터선택되는면역원성부위의혼합물을포함한다. [0023] 본발명의또다른예는상기폴리펩타이드가마이코박테리아과 (family) 의박테리아에의하여발현되는항원과 융합하는 (fuse) 조성물이며, 이때바람직하게는융합파트너는구조적으로발현되는항원이다. 바람직한융합 단백질은 CFP10 에융합된 ESAT6 를포함한다. [0024] 본발명의조성물은바람직하게는마이코박테리아유전자를발현하는바이러스또는박테리아와같은유전자-변형된생물인생 (live) 재조합백신중에서선택되는추가적인전달시스템, 또는상기전술한단백질의유전자또는유전자단편을발현하는플라스미드인 DNA 백신, 또는항원보강제 (adjuvant) 와같은전달시스템에서전달되는단백질자체또는단백질자체로부터유도되는합성펩타이드인단백질백신과같은면역원성전달시스템을포함한다. 항원보강제는바람직하게는디메틸디옥타디시암모니움브로마이드 (dimethyldioctadecylammonium bromide (DDA)), 퀼 A(Quil A), 폴리 I;C(poly I:C), 암모니움하이드록사이드 (aluminium hydroxide), 프로인트불완전항원보강제 (Freund's in-complete adjuvant), IFN-γ, IL-2, IL-12, 모노포스포릴리피드 A(monophosphoryl lipid A (MPL)), 트레홀로스디마이코레이트 (Treholose Dimycolate (TDM)), 트레할로스디베헤네이트 (Trehalose Dibehenate) 및무라밀디펩타이드 (muramyl dipeptide (MDP)) 로구성되는군으로부터선택되며, 가장바람직하게는 DDA/TDB 및 IC31과같이다기능성 (polyfuctional) T 세포반응을촉진하는항원보강제이다. 가장바람직한항원보강제는 DDA/TDB 및 / 또는폴리 I:C를포함한다. 또는상기아미노산서열은폴리펩타이드가자체-항원보강효과를갖도록지질화 (lipidate) 된다. [0025] 본발명은또한잠복결핵의치료및감염의재활성화예방용도를위하여상기기재된항원들을개시한다. [0026] 예컨대마이코박테리움튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움아프리카눔 (Mycobacterium africanum) 또는마이코박테리움보비스 (Mycobacterium bovis) 인병독성마이코박테리아에의하여야기되는결핵감염의재활성화에대한, 인간을포함하는동물의치료방법은전술한백신또는면역원성조성물을동물에투여하는단계를포함하는데, 상기백신또는면역원성조성물은, 급성기감염동안또는그이후및 / 또는잠복기감염동안과같이, 감염후에투여한다

12 [0027] 이방법은구조적으로발현된항원으로자극한후 IP10 의검출, HBHA 에대한반응의인비트로검출, 콴티페론 (Quantiferon) 검사또는망뚜 (Mantoux) 투베르쿨린피부테스트 (TST) 와같은진단절차에의하여병독성마이 코박테리아에의하여잠복감염된개체를확인하는단계를포함한다. [0028] 본발명은또한, 예컨대마이코박테리움튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis), M. 보비스 (M. bovis) 및 M. 아프리카눔 (M. africanum) 인결핵복합체종에의하여야기되는잠복감염의재활성화에대한노출후 (postexposure) 백신또는면역원성조성물의제조를위한, 전술한항원의용도를개시하는데, 상기백신또는면역원성조성물은전술한바와같이하나또는그이상의면역원성부위를포함하며, 급성기감영동안또는그이후및 / 또는잠복기동안과같은감염후투여를위한것이다. [0029] 마이크로박테리아의병원체로서의성공은그것이그것의숙주와상호작용하는복잡하고정교한방식-분화된 ESX-1 박테리아단백질-분비시스템에의하여부분적은로통제되는방법-때문이다. 이 ESX-1 시스템은박테리아단백질 ( 예컨대, ESAT-6, CFP10 및 EspA) 을숙주세포로전달하며그것은병독성에결정적이다. 간균 (bacilli) 으로부터분비된후, ESAT-6 단백질은포식소체막 (phagosomal membrane) 내에구멍 (pore) 를형성하여, 간균이포식소체내그것의봉쇄로부터세포질로피할수있도록하며, 이로써그것은세포에서세포로퍼지는것을촉진한다. [0030] 구조적인발현패턴은이들분자가병원체에게는결정적으로중요한필수기능, 병원체가면역숙주내에서생존하기위하여구조적으로발현될필요가있는유전자들에의존하는기능을수행하는것을설명하는중요한특징이다. 이들분자들은본발명의기초이며, 이들이박테리아생활양식의모든단계를목표로하고, 그러므로활성을위한가장넓은가능한성분 (basis) 를갖고있기때문에잠복감염된대상에투여하기위한백신에서는특히중요한항원들이다. [0031] ESAT6, CFP10 및 EspA은모두분비에요구되며, 이들은모두병독성에필수적인것으로알려진 ESX-1 분비시스템에속한다. 이들분비된항원들은박테리아전염 (dessemination) 및세포막용균 (lysis) 에결정적이다. 예컨대, Ag85의발현이감염후곧하향조절되는것에반하여, ESAT6, CFP10 및 EspA은또한질병의서로다른단계에서구조적으로발현되는항원들이다. 면역원성구조적으로발현되는항원들은치료적백신으로서투여시감염잠복을유지함으로써잠복결핵감염의재활성화를예방한다. [0032] 정의 [0033] [0034] 다기능성 T 세포 용어에의하여다기능성 (polyfunctional) T 세포는 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α 또는 IL-2 의모든사이토카인과 IFN-γ 및 TNF-α 의두다른사이토카인중적어도하나를동시에발현시키는 T 세포로이해된다. [0035] [0036] 폴리펩타이드본발명에서 " 폴리펩타이드 " 라는단어는그것의보통의의미를갖는다. 그것은아미노산잔기가공유펩타이드결합으로연결된전장단백질, 올리고펩타이드, 짧은펩타이드및그것의단편을포함하는임의의길이의아미노산사슬이다. [0037] 폴리펩타이드는글리코실화되거나, ( 예컨대, Mowat 등 1991 에기재된바와같이팔미토일록시숙시니마이드 (palmitoyloxy succinimide) 나 Lustig 등 1976 에기재된바와같이도데카노일클로라이드 (dodecanoyl

13 chloride) 로화학적지질화에의하여 ) 지질화 (lipidate) 되거나, 인공군을포함하거나, 또는예컨대 his- 태그 또는시그널펩타이드와같은추가적인아미노산을포함함으로써화학적으로변형될수있다. [0038] 그러므로각각의폴리펩타이드는특정아미노산으로특징되며, 특정핵산서열에의하여코드된다. 이러한서열들은재조합또는합성방법에의하여생산된변이체 (variant) 들및상동체 (analogue) 들을포함하며, 이러한폴리펩타이드서열들은재조합폴리펩타이드내하나또는그이상의아미노산잔기의치환, 삽입 (insertion), 추가 (addition) 또는결실에의하여변형되며여기에기재된임의의생물학적시험에서여전히면역원성을갖는것으로이해된다. 치환은바람직하게는 " 보존적 " 이다. 이들은하기표 1에의하여정의된다. 두번째칼럼의동일블럭및바람직하게는세번째칼럼의동일행의아미노산들은서로치환될수있다. 세번째칼럼의아미노산들은 1 글자기호로나타낸다. 표 1 [0039] 지방족비극성 GAP 방향족 극성 - 하전되지않은 (uncharged) 극성 - 하전된 (charged) ILV CSTM NQ DE KR HFWY [0040] 본발명에서바람직한폴리펩타이드는생물이잠복감염과관련된스트레스에처했을때생산되는 M. 튜버쿨로시스유래의면역원성항원이다. 이러한항원은예컨대 M. 튜버쿨로시스세포및 / 또는 M. 튜버쿨로시스배양여과물로부터유래할수있다. 그러므로상기항원들중하나의면역원성부위를포함하는폴리펩타이드는면역원성부위만으로구성될수도있고, 추가적인서열을포함할수도있다. 추가적인서열은원래의 M. 튜버풀로시스항원으로부터유래할수도있으며, 이종기원일수도있고 (heterologous), 이러한서열들은면역원성일수도있으나꼭그럴필요는없다. [0041] 각각의폴리펩타이드는특정핵산서열에의하여코드된다. 이러한서열들은그것의변이체및상동체를포함하며, 이러한핵산서열들은하나또는그이상의핵산의치환, 삽입, 추가또는결실에의하여변형된것으로이해될수있다. 치환은바람직하게는아미노산서열에는아무런변화를일으키지않으나, 단백질발현을강화시키도록도입될수있는코돈선호도 (codon usage) 내침묵치환이다. [0042] 본문맥에서용어 " 실질적으로순수한폴리펩타이드단편 " 은그것이본래결합된 (associated) 다른폴리펩타이드물질을많아야 5 중량 % 포함하는폴리펩타이드제조를의미한다 ( 다른폴리펩타이드물질은낮은퍼센트, 예컨대, 많아야 4%, 많아야 3%, 많아야 2%, 많아야 1 %, 및많아야 1/2% 인것이바람직하다 ). 실질적으로순수한폴리펩타이드는적어도 96% 순수한것, 즉, 폴리펩타이드가적어도 96 중량 % 의제조시존재하는총폴리펩타이드물질로구성되는것이바람직하며, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99,25%, 적어도 99,5%, 및적어도 99,75% 와같은더높은퍼센트가바람직하다. 폴리펩타이드단편이 " 본질적으로순수한형태 " 인것, 즉, 폴리펩타이드단편이그것이본래관련된다른항원이본질적으로없는, 즉, 결핵복합체또는병독성마이코박테리아에속하는박테리아유래의임의의다른항원이없는것이특히바람직하다. 이는하기자세히기재한대로비 (non)-마이코박테리아숙주세포내재조합방법인수단으로폴리펩타이드단편을제조하거나, 또는널리알려진고체또는액체상펩타이드합성방법, 예컨대, 메리필드 (Merrifield) 가기재한방법이나그변형으로폴리펩타이드단편을합성하여달성할수있다. 본발명의목적에있어서, 상기 " 실질적으로순수한폴리펩타이드또는폴리펩타이드단편 " 의정의는마이코박테리아또는비-마이코박테리아기원의다른정제되거나합성된항원들과결합하여 (in combination) 존재하는폴리펩타이드또는폴리펩타이드단편을배제하는것은아니다

14 [0043] 용어에의하여 " 병독성마이코박테리아 " 는동물또는인간에게결핵병을야기할수있는박테리아로이해된다. 병독성마이코박테리아는 M. 튜버쿨로시스, M. 아프리카눔, 및 M. 보비스를포함하나이에제한되는것은아니 다. 적절한동물의예는소, 주머니쥐 (possum), 오소리 (badger) 및캥거루들이다. [0044] " 감염된대상 " 은병독성마이코박테리아에의한미시적으로판명된감염또는배양인대상및 / 또는항 - 결핵화 학치료에대하여반응하고결핵으로임상에서진단된대상이다. 결핵의임상적인진단, 검경 (microscopy) 및배 양은당업자에게널리알려져있다. [0045] 용어에의하여, "PPD- 양성대상 " 은 PPD( 정제된단백질유도체 (purified protein derivative)) 가 IFN-γ 의방출 에의하여결정되는양성인비트로기억반응 (recall response) 를유도하는대상또는망뚜시험이양성을보 인대상으로이해된다. [0046] " 잠복감염된대상 " 은병독성마이코박테리아, 예컨대, M. 튜버불로시스에감염되었으나활동성결핵의징후를보이지않은대상으로이해된다. 백신접종, 예컨대, BCG 접종된대상이나결핵치료를받은대상은 PPD 반응성을시험하면이들은양성일것으로예상되므로비록현재로서는증명하는것이불가능하지만, 이들의체내에마이코박테리아를여전히보유하고있을것으로보인다. 그럼에도불구하고, 가장정확한점에서, " 잠복감염된 " 은그들의조직내에 M. 튜버쿨로시스가존재하면서도임상적으로아프지는않은임의의대상을묘사하는데사용된다. 잠복감염된대상은망뚜투베르쿨린피부테스트 (Mantoux tuberculin skin test (TST)), 콴티페론 (Quantiferon) 시험과같은오늘날임상적으로이용되는많은방법에의하여확인될수있으며, 앞으로는최근제안된 HBHA(Hougardy 2007) 에대한반응의인비트로검출또는 ESAT6에의한인비트로자극후 IP10의검출 (Ruhwald 2008) 과같은감염의특정단계를진단하는더욱민감한수단들이있을것이다. [0047] 용어에의하여 " 재활성화 : 는비복제박테리아 ( 그것들이세포내위치하기때문에면역시스템이이를감지하기는매우어려울수있다 ) 과면역숙주내에서마주치는적대적인환경에적응하기위한시도에서활동적이나변화된발현프로파일 (profile) 을갖는천천히복제하는 (slowly replicating) 박테리아사이의균형이병원체측으로기울어져, 박테리아가다시급격히복제하기시작하고감염된대상내박테리아의수가증가하는단계로감염이진행하는상황으로이해된다. 매우강한면역압력하잠복감염된대상내이들박테리아는본발명의백신접종전략의목표이다. [0048] 용어에의하여 "IFN-γ" 는인터페론 - 감마로이해된다. IFN-γ 의측정은면역반응의징후로사용된다. [0049] 용어에의하여 " 핵산단편 " 및 " 핵산서열 " 은 DNA, RNA, LNA (locked nucleic acids), PNA, RNA, dsrna 및 RNA-DNA-하이브리드를포함하는임의의핵산분자로이해된다. 비-자연적으로발생하는뉴클레오시드 (nucleoside) 를포함하는핵산분자또한포함된다. 용어는용도에의존적인임의의길이, 예컨대 10부터 뉴클레오티드까지의핵산분자들을포함한다. 핵산분자가약학적, 예컨대 DNA 치료로사용되거나본발명에의하여폴리펩타이드의생산방법에사용되는경우, 바람직하게는약 18에서약 1000 뉴클레오타이드의길이를갖고, 선택적으로벡터에삽입되며, 적어도하나의에피토프를코드하는분자가이용된다. [0050] 이명세서에서, 문맥이다르게요구하지않는한, " 포함한다 " 는단어또는 " 포함한다 " 또는 " 포함하는 " 과같은 그것의변형은언급한구성요소, 또는전체 (integer) 또는구성요소또는전체의군을함유하는것을의미하 며, 임의의다른구성요소, 전체또는구성요소또는전체의군을배제하는것이아니다. [0051] 구조적으로발현되는유전자들은폐에서의결핵균 CFU 수와서로관련된후, 감염 3 주후이후의시점에서, 군 수준 (population level) 에서 mrna 의자세한분석후, 폐에서 in vivo 로동등하게잘발현되는유전자들이다. 이

15 러한정의로부터, 구조적유전자들은하나의박테리아레벨에서는다르게발현될수있다. 유전자발현을정량화하는방법은정량적 PCR(quantitate PCR) 이다. " 동등하게잘 " 은전의측정으로부터 +/- 5 배내인것으로정의된다. 비교는항상현재의바로전의시점과한다. 측정들간의시간은감염및전의측정간의시간보다길수없는데, 즉 (e.c), 만약유전자발현이감염후 3주에최초로측정되었다면, 두번째측정은감염후 6주보다늦게될수없고, 세번째는감염후 12 주보다늦을수없는등이다. [0052] 구조적으로발현하는항원들은구조적으로발현하는유전자들의산물인폴리펩타이드또는이들폴리펩타이드들 의부분이다. [0053] [0054] 서열일치성 " 서열일치성 (sequence identity)" 이라는용어는동일한길이의두뉴클레오티드서열간또는동일한길이의두아미노산서열간의상동성 (homology) 의정도를정량적으로측정한것을가리킨다. 비교될두서열은단백질서열의말단에서간격 (gap) 의삽입또는대체적으로는, 절단 (truncation) 을허용하는가능한최적의적합상태 로정렬되어야한다. 서열일치성은로계산될수있으며, 이때 Ndif는정렬될때두서열의비-일치성잔기 (non-identical residues) 의총수이고, N ref 는서열중하나의잔기의수이다. 그러므로 DNA 서열 AGTCAGTC은서열 AATCAATC과 75% 의서열일치성을가질것이다 (Ndif=2 및 Nref=8). 간격은특정잔기의비특이성으로산출되는데, 즉, DNA 서열 AGTGTC는 DNA 서열 AGTCAGTC과 75% 의서열일치성을가질것이다 ((Ndif=2 및 Nref=8). 서열일치성은대체적으로 BLASST 프로그램에의하여계산될수있는대, 예컨대, BLAST 프로그램 (Pearson, 1988, 또는 이다. 본발명의한관점에서, 정렬은 hompson J., et a/ 1994, available at 에의하여기재된디폴트 (default) 변수를가지고서열정렬방법 ClustalW에의하여수행된다. [0055] 서열일치성의바람직한최소의퍼센트는적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어 도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및적어도 99.5% 와같이적어도 80% 이 다. [0056] [0057] 면역원성부위발명의바람직한예에있어서, 폴리펩타이드는 B-세포또는 T-세포의에피토프와같은폴리펩타이드의면역원성부위를포함한다. 폴리펩타이드의면역원성부위는동물또는인간및 / 또는여기에기재된임의의생물학적검사 (assay) 에의하여결정되는생물학적샘플에서면역반응을유도하는폴리펩타이드의부분이다. 폴리펩타이드의면역부위는 T-세포에피토프또는 B-세포에피토프일수있다. 면역원성부위들은폴리펩타이드의하나또는몇몇의상대적으로작은부분들과연결될수있으며, 그것들은폴리펩타이드서열곳곳에분산되어있을수도있고, 폴리펩타이드의특정부분에위치할수도있다. 몇몇폴리펩타이드의경우, 에피토프들이폴리펩타이드를커버하는전장서열곳곳에분산되어있는것이증명되었다 (Ravn et al 1999). 면역반응동안인식되는적절한 T-세포에피토프를확인하기위하여, 예컨대폴리펩타이드로부터유래한 20 아미노산잔기길이를갖는 MHC 클라스 Ⅱ 에피토프의검출을위하여올리고펩타이드오버랩핑 (overlapping) 을이용할수있다. 이들펩타이드들은생물학적인검사 (assay) 에서시험될수있고 ( 예컨대, 여기에기재된 IFN-γ 검사 ), 이들중일부는펩타이드내 T 세포에피토프가존재하는증거로서, ( 그리고이로써면역원성인 ) 양성반응을준다. ESAT-6 및 CFP10의경우이러한연구는항원의모든부분이 T-세포에피토프를포함한다는것을보여주었다 (Mustafa et al. 2000, Arend SM et al. 2000). MHC 클라스 Ⅰ 에피토프의검출을위하여, 결합할펩타이드들을예측하고 (Stryhn et al. 1996), 이후에이들펩타이드를합성적으로 (synthetic) 생산하며, 예컨대, 여기에기재한바와같이 IFN-γ 검사인적절한생물학적검사에서시험할수있다. 이펩타이드들은바람직하게는, 예컨대, 폴리펩타이드로부터유래한 8~11 아미노산잔기의길이를갖는다. B-세포에피토프들은, 예컨대 Harboe et al 1998에기재된대로관심있는폴리펩타이드를커버하는오버랩핑 (overlapping) 펩타이드들에대한 B-세포인식분석에의하여결정될수있다. 이정의와일치하여, 여기에기재된폴리펩타이드의면역원성부위는면역반응을유도

16 하는부위로서확인될수있다 : 이하의 " 면역반응 " 의정의참조. [0058] 비록 T-세포에피토프의최소길이가적어도 6 아미노산인것으로알려졌지만, 이러한에피토프들은아미노산들의더긴스트렛치들 (stretches) 로구성되어있는것이정상이다. 그러므로본발명의폴리펩타이드단편은적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 및적어도 30 아미노산잔기와같은, 적어도 7 아미노산잔기의길이를갖는다. 그러므로, 본발명방법의중요한예에서, 폴리펩타이드단편은많아야 40, 35, 30, 25, 및 20 아미노산잔기와같이, 많아야 50 아미노산잔기의길이를갖는것이바람직하다. 10 내지 20 아미노산잔기사이의길이를갖는펩타이드가 MHC 클라스 Ⅱ 에피토프로서가장효과적일것으로확인되고, 그러므로본발명방법에서사용되는폴리펩타이드단편의특히바람직한길이는 15, 14, 13, 12 및심지어 11 아미노산잔기와같은 18인것으로예상된다. 7 및 12 아미노산잔기사이의길이를갖는펩타이드들이 MHC 클라스 Ⅰ 에피토프로서가장효과적일것으로확인되고, 그러므로본발명방법에서사용되는폴리펩타이드단편의특히바람직한길이는 10, 9, 8 및심지어 7 아미노산잔기와같은 11일것으로예상된다. [0059] 폴리펩타이드의면역원성부위들은유전적으로이종적인 (heterogeneous) 인간군 (population) 의넓은부분 ( 높은빈도 ) 또는적은부분 ( 낮은빈도 ) 에의하여인식될수있다. 또한일부면역원성부위들은다른것들이낮지만여전히중요한면역반응을유도하는데반하여 ( 준우성 (subdominant)), 높은면역반응 ( 우성 (dominant)) 을유도한다. 높은빈도 >< 낮은빈도는넓게분포한 MHC 분자 (HLA 타입 ) 에결합한면역원성부위에대하여또는다중 (multiple) MHC 분자들에의하여라도관련있을수있다 (Sini-gaglia, 1988, Kilgus, 1991). [0060] 그러나새결핵백신을위한후보분자들을준비하는문맥에서, 준우성에피토프들은우성에피토프만큼이나관 련이있는데, 이는이러한에피토프들이강하게또는광범위하게인식되지않는다는사실에관계없이, 이러한 에피토프들이보호를유도할수있다는것이알려졌기때문이다 (Olsen, 2000). [0061] [0062] 변이체본발명의폴리펩타이드들의공통된특징은실시예에서나타나듯이면역반응을유도하는그것들의특성이다. 치환, 삽입, 추가또는결실에의하여생산되는본발명의폴리펩타이드의변이체는여기에기재된임의의검사에의하여결정되듯이면역원성일수있는것으로이해된다. [0063] [0064] 면역대상 면역대상 (immune individual) 은병독성마이코박테리아에의한감염이깨끗하거나통제되었거나, 또는 M. 보비 스 BCG 백신접종과같은예방백신접종을받은사람또는동물로정의된다. [0065] [0066] 면역반응 면역반응은하기방법들중하나에의하여모니터 (monitor) 될수있다. [0067] 인비트로세포반응은관련된폴리펩타이드로면역되거나또는병독성마이코박테리아로전에감염되거나 현재감염된인간또는동물로부터회수한림프구내증식을유도하거나또는이로부터의 IFN-γ 와같은관련 사이토카인의방출유도에의하여결정된다. 웰당 세포부터 세포까지포함하는부유액에폴리펩타이드의면역원성부위또는폴리펩타이드를첨가함으로써상기유도를수행한다. 혈액, 비장, 간또는폐로부터분리한세포및ml부유액당 20 μg을넘지않는농도가되는폴리펩타이드또는면역원성부위의첨가및 2~5 일간수행되는자극. 세포증식의모니터링을위하여, 세포들은방사성표지된티미딘 (Thymidine) 으로펄스 (pulse) 되며, 배양 16-22시간후액체섬광계수법에의하여증식을검출하였다. 양성반응은백그라운드 + 2 표

17 준편차보다많은반응인것으로정의한다. IFN- γ의방출은당업계에널리알려진 ELISA 방법에의하여결정될수있다. 백그라운드 +2 표준편차를넘는반응인양성반응. IL-12, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, TGFβ와같이, IFN-γ이아닌다른사이토카인이폴리펩타이드에대한면역반응을모니터링할때적절할수있다. 면역반응을검출하는또다른그리고더욱민감한방법은 ELISpot 방법으로, 이때세포를생산하는 IFN-γ 의빈도가결정 (determine) 된다. IFN- γ 항체들 (PharMingen) 로미리코팅된 ELIspot 플레이트 (MAHA, Millipore) 에서, 각각혈액, 비장또는폐로부터분리된선별된수의세포들 (graded numbers of cells) 이폴리펩타이드또는면역원성부위의존재하 시간동안배양되어 ( 전형적으로는 1 ~ 세포 / 웰사이이다 ), ml당 20 μg을넘지않는농도가된다. 플레이트는그다음, 비오틴화된 (biotinylated) 항-IFN-γ 항원과함께배양되고, 그후스트렙타비딘-알칼라인파스파타제 (streptavidin-alkaline phosphatase) 배양을한다. IFN-γ 생산세포는스팟 (spot) 을일으키는관련기질 (substrate) 에 BCIP/NBT(Sigma) 을가하여확인한다. 이들스팟은해부현미경 (dissection microscope) 을이용하여셀수있다. 이것은또한 PCR 기술을이용하여관련사이토카인을코드하는 mrna의존재를결정하는가능성이기도하다. 보통하나또는그이상의사이토카인이예컨대 PCR, ELISPOT 또는 ELISA를이용하여측정된다. 특정폴리펩타이드에의하여유도되는이들중임의의사이토카인의양의중요한증가또는감소가폴리펩타이드의면역활성평가에이용될수있다는것은자명할것이다. [0068] 인비트로세포반응은또한 M. 튜버쿨로시스 - 감염된사람또는면역대상으로부터유래한 T 세포주를이용 하여결정될수있는데, 상기 T 세포주는살아있는마이코박테리아, 박테리아세포의추출물또는 IL-2 를첨가 하고 10~20일된배양여과액으로부터유래한것이다 세포 ~ 세포를포함하는 T 세포주에ml부유액당 20 μg을넘지않는폴리펩타이드를첨가하여수행하는유도및 2~6일간수행되는배양. IFN-γ의유도또는다른관련사이토카인의방출은 ELISA에의하여검출된다. T 세포의자극은또한전술한바와같이방사성표지된티미딘을이용하여세포증식을검출함으로써모니터될수있다. 양검사를위하여, 백그라운드 +2 표준편차를넘는반응인양성반응. [0069] 인비보세포반응은, 주사또는적용후 72~96 시간적어도 5mm 의지름을갖는양성반응, 병독성마이코 박테리아에의하여임상적으로 (clinically) 또는준임상적으로 (subclinically) 감염된대상에, 많아야 100 μg의 면역원성부위또는폴리펩타이드를진피주사또는국부적용패치후양성 DTH 반응으로서결정될수있다. [0070] 인비트로체액성반응은면역또는감염된대상내특정항원반응에의하여결정된다. 항원의존재는 ELISA 기술또는웨스턴블럿에의하여결정될수있으며, 폴리펩타이드또는면역원성부위는니트로셀룰로스막또는폴리스티렌표면에흡수된다. 혈청은바람직하게는 1:10부터 1:100까지 PBS에서희석되며, 흡수된폴리펩타이드에첨가되며, 1~12 시간동안배양이수행된다. 표지된 2차항체를이용하여, 특정항체의존재는 OD, 예컨대 ELISA에의하여결정될수있으며, 양성반응은백그라운드 +2 표준편차를넘는반응이거나, 또는대체적으로웨스턴블럿에서의가시적반응이다. [0071] 또다른관련된변수는항원보강제내폴리펩타이드를백신접종한후, 또는 DNA 백신접종한후유도된동물모델내보호의측정이다. 적절한동물모델은영장류, 기니피그, 쥐이며, 이들은병독성마이코박테리아의감염에의하여시험감염 (challenge) 된다. 유도된보호의판독 (readout) 은비-백신접종된동물에비교한목표기관내박테리아부하 (load) 의감소, 비-백신접종된동물에비교한연장된생존기간및비-백신접종된동물에비교한감소된체중감소일수있다. [0072] [0073] [0074] 제조방법일반적으로, M. 튜버쿨로시스항원, 및이러한항원을코드하는 DNA 서열은다양한절차들중임의의것을이용하여제조할수있다. 그것들은전술한바와같이절차에의하여배양여과액또는 M. 튜버쿨로시스세포로부터원래 (native) 단백질로

18 서정제될수있다. 면역원성항원들은항원을코드하는 DNA 서열을이용하여재조합형으로생산될수있으며, 발현벡터내도입되어, 적절한숙주내에서발현된다. 숙주세포의예는대장균이다. 그것의폴리펩타이드또는면역원성부위는또한약 100 아미노산보다적게합성적으로생산될수있고, 50 아미노산보다유전적으로적게아미노산들이서열적으로성장하는아미노산사슬에가해지는상업적으로이용가능한고체상기술과같은당업계에널리알려진기술을이용하여제조될수있다. [0075] DNA 백신접종에서정의된폴리펩타이드를코드하는플라스미드 DNA의구조화 (construction) 및제조에서, 대장균과같은숙주균주가사용될수있다. 플라스미드 DNA는관심있는플라스미드를운반하는숙주균주의배양물로부터제조할수있고, 예컨대, 엔도톡신제거단계를포함하는 Qiagen Giga -Plasmid column kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) 를이용하여정제할수있다. DNA 백신접종에사용되는플라스미드 DNA는무-엔도톡신 (endotoxin free) 인것이바람직하다. [0076] [0077] 융합단백질면역원성폴리펩타이드는또한융합단백질일수있으며, 이로써본발명의폴리펩타이드의우수한특성, 방법이달성될수있다. 예를들어, 재조합적으로생산될때폴리펩타이드의이출 (export) 를촉진하는융합파트너들, 폴리펩타이드의정제를촉진하는융합파트너들, 및본발명의폴리펩타이드단편의면역원성을증강시키는융합파트너들이모두관심있는가능성들이다. 그러므로, 본발명은또한적어도하나의폴리펩타이드또는적어도하나의융합파트너및상기정의한면역원성부위를포함하는융합파트너에관련된다. 면역원성을증진시키기위하여, 융합파트너는 ESAT-6, CFP10, EspA, TB10.4, RD1-ORF5, RD1-ORF2, Rv1036, MPB64, MPT64, Ag85A, Ag85B (MPT59), MPB59, Ag85C, 19kDa 리포프로틴 MPT32 및알파-크리스탈린 (alpha-crystallin), 또는상기언급된항원들중임의의것의적어도하나의 T-세포에피토프 (SkjΦt et al 2000; WO ; WO ; US patent application 09/0505,739; Rosenkrands et al 1998; Nagai et al 1991) 와같은결핵복합체에속하는박테리아로부터유래한폴리펩타이드단편과같은 M. 튜버쿨로시스유래의또다른폴리펩타이드일수있다. 본발명은또한본발명의둘또는그이상의포리펩타이드 ( 또는이들의면역원성부위 ) 의상호융합 (mutual fusion) 을포함하는융합폴리펩타이드에관한것이다. 산물의면역원성을증진시킬수있는다른융합파트너들은 IFN-γ, IL-2 및 IL-12와같은림포카인 (lymphokine) 이다. 발현및 / 또는정제를촉진시키기위하여, 융합파트너는예컨대, 박테리아섬모 (fimbrial) 단백질, 예컨대, 섬모 (pilus) 구성성분인섬모소 (pilin) 및 papa; 단백질 A; ZZ-펩타이드 (ZZ-융합은스웨덴의 Pharmacia에의하여판매된담 ); 말토스 (maltose) 결합단백질 ; 글루타티온 S-트랜스페라제, β-갈락토시다제 ; 또는폴리-히스티딘일수있다. 융합파트너들은숙주세포내에서재조합적으로생산될수있고, 이는대장균이될수있으며, 이는서로다른융합파트너들사이에링커영역을유도하는가능성이다. [0078] 다른관심있는융합파트너들은지질화 ((lipidated) 되어면역체계에적합한방식의면역원성폴리펩타이드가존재하게되는, 폴리펩타이드이다. 이러한효과, 예컨대 WO 96/40718 A에기재된바와같이 Borrelia burgdorferi OspA 폴리펩타이드에기초한백신또는 Pseudomonas aeruginosa Oprl lipoprotein (Cote-Sierra J 1998) 에기초한백신으로알려진것이다. 또다른가능성은 kdffuwls신호서열및 N-말단시트신 (cystein) 의면역원성폴리펩타이드에대한 N-말단융합이다. 이러한융합은적절한생산숙주내에서생산될때, N-말단시스틴에서면역원성폴리펩타이드의지질화에재적합하다 (resuit). [0079] 용도 [0080] [0081] 백신백신은특정질병에대한면역을개선시키거나확립하는생물학적조제품이다. 백신은예방적 ( 예컨대, 임의의자연적또는 " 야생 " 병균에의하여장래감염된효과를예방하거나개선시키기위하여 ), 노출후 ( 예컨대, 임상적증상없이잠복감염된대상에서재활성화를예방하기위하여 ) 또는치료적 ( 예컨대, 단독으로치료를단축하기

19 위하여항생제치료와결합하여또는단독으로활성질병을치료하기위하여사용되는백신 ) 일수있다. [0082] [0083] 잠복결핵을위한동물모델 M.tb에의한낮은수준의잠복감염을유도하기위하여, 정상량 (dose) 의 M.tb( 폐에약 150 박테리아 ) 를이용하여동물들을처음에에어로졸감염시켰다. 감염 6 주후, 동물들은 6주간차선의화학요법치료를받으며, 그동안대부분-그러나모든것은아니다-의박테리아들이근절된다. 남아있는박테리아는잠복감염으로확립된다. 하기화학요법치료에서, 일부동물들은잠복감염의재활성화를예방하는백신능력을시험하기위하여백신면역될것이고, 그것은화학요법치료후 5-15 주에자연히발생할것이다. 도 2 참조. [0084] [0085] 단백질백신본발명의또다른부분은본발명에의한융합폴리펩타이드또는폴리펩타이드 ( 또는적어도그것의하나의면역원성부위 ) 를포함하는백신조성물에대한것이다. 이러한백신조성물의최적의수행을확실히하기위하여, 그것은면역적으로약학적으로적절한담체, 비히클또는아쥬반트 (adjuvant) 를포함하는것이바람직하다. [0086] 본발명의폴리펩타이드가동물에의하여인식되는유효한백신은비 - 백신접종된동물에비하여병독성마이코 박테리아에의하여시험감염된후동물모델내에서목표기관내박테리아부하의감소, 생존기간의연장, 및 / 또는감소된체중감소를일으킬수있다. [0087] 적절한담체는예컨대, 플라스틱, 폴리스티렌과같은폴리펩타이드가소수성비-공유상호작용에의하여결합하는폴리머, 또는폴리사카라이드, 또는폴리펩타이드, 예컨대소혈청알부민, 오발부민또는 keyhole limpet haemocyanin과같은폴리펩타이드가공유적으로결합하는폴리머로구성되는군으로부터선택된다. 아쥬반트 (adjuvant) 는바람직하게는디메틸디옥타데실암모늄브로마이드 (di-methyldioctadecylammonium bromide)(dda), 퀼 A(Quil A)), 폴리 O:C(poly I:C), 알루미늄하이드록사이드 (aluminium hydroxide), 프로인트불완전아쥬반트 (Freund's incomplete adjuvant), IFN-γ, IL-2, IL-12, 모노포스포릴리피드 A(monophosphoryl lipid A (MPL)), 트레할로스디마이코레이트 (Tre-holose Dimycolate (TDM)), 트레할로스디베헤네이트 (Trehalose Dibehenate) 및뮤라밀디펩타이드 (muramyl dipeptide (MDP)) 로구성되는군으로부터선택된다. [0088] 유효성분으로펩타이드서열을포함하는백신의제조는일반적으로당업계에잘알려져잇는데, 여기에참조로 모두포함되는 U.S. Patents 4,608,251 ; 4,601,903; 4,599,231 및 4,599,230 가좋은예가될것이다. [0089] 백신의항원보강효과 (adjuvant effect) 를달성하기위한다른방법들은알루미늄하이드록사이드또는인 (alum), 당의합성폴리머 (Carbopol), 열처리에의한백신내단백질의응집, 펩신처리된 (Fab) 항원의알부민에대한재활성화에의한응집, 그람-음성박테리아의리포사카라이드구성성분또는엔도톡신, 또는 C. 파르붐 (C. parvum) 과같은박테리아세포의혼합물, 만니드모노올레이트 (mannide monooleate)(aracel A) 와같은생리적으로수용가능한오일담체내에멀젼, 또는블록대체제 (block substitute) 로사용하는퍼플루오로카본 (perfluorocarbon)(fluosol-da) 의 20 퍼센트용액을가진에멀젼과같은약품의사용을포함한다. 다른가능성은전술한아쥬반트와복합된폴리 I:C와같은 IFN-γ 유도체또는사이토카인와같은면역조절물질의이용을수반한다. [0090] 항원보강효과를달성하기위한또다른흥미로운가능성은 ( 여기참조로서포함된 ) Gosselin et al., 1992 에 기재된기술을이용하는것이다. 간략히말하면, 본발명의항원과같이관련된항원은단핵구 / 대식세포상 Fc γ 수용체에대하여항체 ( 또는항원결합항체단편 ) 와콘쥬게이트 (conjugate) 될수있다

20 [0091] 본백신은용량공식 (dosage formulation) 에양립가능한방식이며, 재활성화를예방하는데효과적이고면역원성인용량으로투여된다. 투여되는양은치료되는, 예컨대, 면역반응을시작하는 (mount) 대상의면역시스템의능력 (capacity), 및원하는보호정도를포함하여, 개체 (subject) 에의존적이다. 적절한용량범위는약 1 μg에서 300 μg의범위, 특히약 10 μg에서 50 μg의범위와같은, 약 0.1 μg에서 1000 μg까지바람직한범위의백신접종당수백마이크로그람의유효성분의체계 (order) 이다. 초기투여및추가주사 (booster shots) 을위한적절한요법 (regimen) 은또한다양하나, 초기투여후이루어지는접종또는다른투여가전형적이다. [0092] 적용방식은널리다양하다. 백신투여를위한현행방식중무엇이든적용이가능하다. 이들은생리학적으로허용가능한분산 (dispersion) 또는고형 (solid) 인생리학적으로허용가능한염에의경구적용, 비경구적으로, 주사또는이와유사한것에의한것을포함한다. 백신의용량은투여경로에의존적이게되고, 백신접종될사람의연령, 이보다덜한정도로는, 백신접종될사람의크기에따라다양하게된다. [0093] 백신은에컨대, 에어로졸, 흡입, 비경구적으로, 예를들어피하또는근육내, 주사에의하여, 전형적으로 (conventionally) 폐내로투여된다. 투여의다른방식을위한적절한다른제형은좌약및일부경우, 구강제형을포함한다. 좌약의경우, 예를들어, 폴리알칼렌글리콜또는트리글리세라이드인전통적인결합체 (binder) 및담체들을포함할수있는데, 이러한좌약들은유효성분 0.5% 에서 10%, 바람직하게는 1-2% 의범위로포함하는혼합물로부터형성될수있다. 경구제형은예컨대, 약학적품질 (grade) 인만니톨, 락토우즈, 전분, 마그네슘스테아레이트, 소듐사카린, 셀룰로스, 마그네슘카보네이트및기타동종의것들인정상적으로이용된부형제를포함한다. 이들조성물들은용액, 부유액, 타블렛 (tablet), 환약 (pill), 캡슐, 지속되는방출제형또는산제 (powder) 의형태를취하며, 유리하게는유효성분을 10-95%, 바람직하게는 25-70% 포함한다. [0094] 많은경우, 백신을복수투여 (multiple administration) 할필요가있을것이다. 대상이이미감염되었거나, 감염되었다고의심되는경우, 종전의백신접종은 1차질병을예방하기에충분한면역을제공하였을수있으나, 앞서논의한바와같이, 이러한면역반응을신장시키는 (boost) 것은잡목감염에대하여는도움이되지않을것이다. 이러한상황에서, 본백신은필연적으로, 재부상하는 (remerging) 결핵감염또는감염의잠복기에대하여유효하게디자인된노출후 (postesposure) 백신이어야한다. [0095] 유전적다양성때문에, 많은대상 (individuals) 들이동일한폴리펩타이드에대해다양한길이의면역반응에반응한다. 그러므로본발명에따른백신은면역반응을증가시키기위하여몇몇의서로다른폴리펩타이드들을포함할수있다. 백신은둘또는그이상의폴리펩타이드또는면역원성부위를포함할수있으며, 모든폴리펩타이드들은상기기재한바와같고, 펩타이드들중전부는아니나일부는병독성마이코박테리아로부터유래할수있다. 뒤의예에서, 폴리펩타이드들에대하여앞에서제시한기준을필연적으로만족시키지않는폴리펩타이드들은, 그것들고유의면역원성때문에반응하거나 EH는단순히항원보강제로서반응할수있다. [0096] 백신은 2-20 과같은 1-20, 또는 3-20 의서로다른폴리펩타이드, 또는 3-10 의서로다른폴리펩타이드들또는 융합폴리펩타이드와같은융합폴리펩타이드를포함할수있다. [0097] [0098] DNA 백신 본발명의핵산단편들은항원의인비보발현을가져오기위하여사용될수있는데, 즉, 핵산단편은참조로 포함된 Ulmer et al 1993 내에리뷰된소위 DNA 백신에사용될수있다. [0099] 그러므로, 본발명은또한본발명에따른핵산단편을포함하는노출후 (post exposure) 백신에대한것이며, 상기백신은백신이투여되는인간을포함하는동물에의한항원의인비보발현을가져오고, 발현된항원의양

21 은인간을포함하는동물내병독성마이코박테리아에의하여야기되는감염의치료를해주기위하여효과적이 다. [0100] 이러한 DNA 백신의효험은아마도면역반응을조절하는능력을갖는폴리펩타이드를코드하는 DNA 단편과함께 발현산물을코드하는유전자를투여함으로써증강될수있을것이다. [0101] [0102] 생재조합백신 (live recombinant vaccines) 노출후백신을위하여세포면역반응을효과적으로활성화시킬하나의가능성은, 바이러스또는비-병원성미생물에서백신내관련항원을발현시킴으로써달성될수있다. 이러한미생물중잘알려진예가마이코박테리움보비스 BCG, 살모넬라 (Salmonella) 및슈노모나 (Pseudomona) 이고, 바이러스들의예는박시니아바이러스 (Vaccinia Virus) 및아데노바이러스 (Adenovirus) 이다. [0103] 그러므로, 본발명의또다른중요한측면은현재이용가능한살아있는 (living) BCG 백신의개선으로, 이는앞서정의한바에따라하나또는그이상의폴리펩타이드를코드하는 DNA 서열의하나또는그이상의카피 (copies) 를미생물이발현을하도록하는방식으로미생물내게놈 (genome) 에도입 (incorporate) 시켜왔다. 면역반응을증강시키기위하여본발명의핵산서열의하나를초과하는카피를도입하는것이고려된다. [0104] 또다른가능성은아데노바이러스또는박시니아바이러스 (Rolph et al 1997) 와같은약독화된바이러스내에본발명에따른폴리펩타이드를코드하는 DNA를통합시키는 (integrate) 것이다. 재조합박시니아바이러스는감염된숙주세포의세포질 (cytoplasma) 내에서복제될수있고, 그러므로관심있는폴리펩타이드가면역반응을유도할수있으며, 이는 TB에대하여보호를유도할것으로생각된다. [0105] 본출원에서인용된모든특허및비특허문헌들은그전체가참고로서, 여기에통합된다. 본발명은하기의비 - 제한적실험예에서좀더자세히설명될것이다. [0106] 실험예 [0107] [0108] 실험예 1: 백신접종을위한뮤린 (MURINE) TB 모델이모델은재활성화를예방하기위하여백신후보능력을시험하기위하여우리실험실에서적응시켰다. 마우스들은초기에에어로졸로병독성 M.tb를감염시켰으며, 박테리아부하를감소시키기위하여, 감염후 6주에항생제처리가시작되었다. 이는마우스내에서저절로일어나지않는인간감염의잠복기를모방하기위한 (mimic) 것이다. 이잠복단계 ( 연속적인낮은박테리아수의단계 ) 동안, 마우스들은두번면역화되고, 백신에의하여재활성화를예방하는능력은마지막면역화후 20주에살아있는 M.tb를비장및폐에서배양함으로써결정된다. 백신효험의판독 (readout) 을위한전제조건인질병의재활성화를위해서는충분한시간을주어야하기때문에, 실험의오랜기간은필요하다 ( 도 3). [0109] [0110] 실험예 2:Ag85가아닌 ESAT6에의하여보호가유도된노출후백신 (postexposure vaccine). ESAT-6 및 Ag85B는단일요소로서, 또한융합분자 Ag85B-ESAT6(H1) 로서예방백신접종에서보호적인 (protective) 것으로증명되었다. 그러나이들항원들이노출후모델에서시험될때 ( 상기실험예 1에서기재한대로 ), 오직 ESAT6만이재활성화기동안보호효과및박테리아성장조절능을가졌다 ( 도 4). 게다가, 도 4B에나타난바와같이, 재활성화에대항한 ESAT6 보호는그자체로, 감염후 W18만큼일찍나타나며, 이러한보호는실험의경과전반에걸쳐유지되었다 ( 감염후 40주까지 ). 이는 Ag85B가노출후백신으로서사용되었을때관찰된때 ( 도 4C 및 D) 과는대조되는데, 이때에는대조군에비하여박테리아부하의중요한감소는없었다. 또한,

22 우리는예방세팅 (prophylactic setting) 에서촉망되는효험을보였던 ESAT-6 및 TB 항원 Ag85B 를포함하는 H1 융합단백질을평가하였다. 이분자가 SSI 노출후모델에서노출후백신으로서이용될때, 그것은박테리아수 를상당히감소시킬수있었다 ( 도 4E). [0111] [0112] 실험예 3: 노출후백신은 ESAT6 펩타이드혼합물 (mix) 에의하여보호를유도하였다. 상기실험예들에서나타났듯이, 대조군에비교하면, 또한 Ag85B에비교하면, ESAT-6 분자는매우활동적이어서 (active), 노출후조건하박테리아부하의감소를야기한다. 게다가 ESAT6의강한활성및노출후백신으로서기능하는능력을입증함으로써, 우리는재조합단백질대신오버랩핑펩타이드의풀 (pool) 로서주어진 ESAT-6가또한대조군및 Ag85B 모두에비교할때재활성화에대하여더나은보호를야기한다는것을보였다 ( 도 4D). [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] 보호실험에서사용된오버랩핑 ESAT-6 펩타이드들 (P1-P13): P1 MTEQQWNFAGIEAAA ( 서열번호 19) P2 NFAGIEAAASAIQGN ( 서열번호 20) P3 ASAIQGNVTSIHSLL ( 서열번호 21) P4 NVTSIHSLLDEGKQS ( 서열번호 22) P5 SLLDEGKQSLTKLAA ( 서열번호 23) P6 KQSLTKLAAAWGGSG ( 서열번호 24) P7 AAWGGSGSEAYQGVQ ( 서열번호 25) P8 GSEAYQGVQQKWDAT ( 서열번호 26) P9 QQKWDATATELNNAL ( 서열번호 27) P1O TATELNNALQNLART ( 서열번호 28) P11 ALQNLARTISEAGQA ( 서열번호 29) P12 TISEAGQAMASTEGN ( 서열번호 30) P13 QAMASTEGNVTGMFA ( 서열번호 31) [0127] [0128] 실험예 5: ESAT-6의노출후백신접종은다기능성 T 세포를유도한다. ESAT-6 특이적세포들의사이토카인발현프로파일에대한 ESAT-6의노출후백신접종의효과를시험하기위하여, 마우스들을먼저에어로졸에의하여병독성 M.tb로감염시키고, 박테리아부하를감소시키고잠복감염을확정하기위하여감염후 6주에항생제처치를시작하였다. 잠복기동안마우스들은 3주간격으로 3회 ( 도 3에기재된바와같이 ) 백신접종되었고, 다기능성 T 세포의수에영향을미치고 M.tb의재활성화를예방하기위한 ESAT-6 백신의능력은마지막백신접종후 20주에결정되었다. 그결과는비-백신접종군에서상당한 ESAT-6 반응이있었으나, 사이토카인발현프로파일은, 특히다기능성 T 세포 (IFN-γ+TNF-α+IL-2+ CD4 T 세포들 ) 의경우, ESAT-6 백신접종된군과는현저하게달랐다는것을보여준다 ( 도 5). 그러므로, 비백신접종된군에비교하여, 우리는 FN-γ/TNF-α CD4 T 세포의수가감소한것을관찰하였으며, FN-γ/TNF-α/IL-2을함께-발현하는삼중양성다기능성 CD4 T 세포들의수가증가한것을관찰하였다. ESAT-6 백신면역된동물들의폐내감소된박테리아수와연관성이있는다기능성 T 세포의존재의증가 ( 도 5D). [0129] [0130] 실험예 6: 감염의초기및잠복기모두에서관련된다른항원들과비교하여, ESAT6의노출후백신면역은더욱지속적으로재활성화에대하여보호한다. 재활성화에대하여어떤항원이가장지속적으로보호하는지결정하기위하여, 우리는모든수행된노출후실험에기초하여정규화된 (normalized) 데이터의풀분석 (pooled analysis) 을하였다. 각각의실험들로부터얻어

23 진데이터들은그룹내각각의마우스들의박테리아부하를대조군의중앙값에대하여비교함으로써정규화 (normalize) 되었는데, 즉, 각각의데이터포인트는대조군중앙값 CFU 및각각의대상동물의 CFU 사이의차이 (Log10 CFU 대조군중앙값-Log 10 CFU 백신군 ) 를가리킨다 ( 도 6). 도 6A에서, 항원들, 잠복관련된항원 RvO569, Rv2031c 및초기항원 Ag85B, ESAT6, Rv3871, Rv3905 및 Rv3445들 ( 이중뒤의둘은 ESAT 패밀리단백질이다 ) 의보호를위하여세트 (se) 된데이터풀 (pooled data) 의비교는, 평가된다른항원들에비교할때 ESAT6 백신접종된동물들이재활성화로부터상당히잘보호된다는것을보여주었다. 게다가, 그후 Rv3871로노출후백신접종에이르른보호수준은, ESX-1 단백질이또한다른항원들에비교할때증가된것으로보인다 ( 도 6A). 특히 ESAT6의활성을추가로입증하기위하여, 우리는 ESAT6에의하여획득되는보호를, 모두 ESAT6를포함하는두개의융합구조체 H1 (Ag85B-ESAT6) 및 H56 (Ag85B-ESAT6-Rv2660) 와비교하였다 ( 도 6B). 분석은상기언급한두융합구조체내포함될때에도 ESAT6 활성이여전히재활성화에대하여보호를야기한다는것을보여준다. [0131] [0132] 실험예 7: ESX-1 패밀리의또다른멤버, Rv3871에의한노출후백신접종은재활성화과정에대하여억제효과를갖는것으로보인다. 우리는 ESAT6과동시에 ESX-1 패밀리의다른멤버를평가하였으며, 비록 ESAT6가유도한면역반응의정도까지는아니라도 ( 도 7A), Rv3871 노출후백신접종이 Rv3871 특이적면역반응을이끈다는것을발견하였다 ( 도 7B). 그렇기는하지만, ESAT6 및 Rv3871은모두식염수대조군에비교할때더큰면역반응을유도하였다. 백신특이적면역반응의유도는, 식염수군에비교할때백신군들모두에서낮은 ( 중앙값 ) 박테리아부하를갖는것과관련되었다. 대조군에서수준이다소증가한것과비교할때이들두군에서의박테리아수가유사한수준이라는점으로입증되듯이, 이는 Rv3871이 ESAT6에비교할때재활성화에대한보호에있어서유사한효과를가질수있을것이라는점을가리킨다 ( 도 7C). 도면 도면

24 도면 2 도면

25 도면 4 도면

26 도면 6 도면 7 서열목록 <110> Statens Serum Institut <120> A tuberculosis vaccine to prevent reactivation <130> DIP110051DK <150> DKPA <151> <160>

27 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 95 <400> 1 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala <210> 2 <211> 100 <400> 2 Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly

28 Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln Met Gly Phe 100 <210> 3 <211> 392 <400> 3 Met Ser Arg Ala Phe Ile Ile Asp Pro Thr Ile Ser Ala Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Ile Gly Ile Pro Asn Gln Gly Gly Ile Leu Tyr Ser Ser Leu Glu Tyr Phe Glu Lys Ala Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Phe Pro Gly Asp Gly Trp Leu Gly Ser Ala Ala Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Asn Arg Asn His Val Asn Phe Phe Gln Glu Leu Ala Asp Leu Asp Arg Gln Leu Ile Ser Leu Ile His Asp Gln Ala Asn Ala Val Gln Thr Thr Arg Asp Ile Leu Glu Gly Ala Lys Lys Gly Leu Glu Phe Val Arg Pro Val Ala Val Asp Leu Thr Tyr Ile Pro Val Val Gly His Ala Leu Ser Ala Ala Phe Gln Ala Pro Phe Cys Ala Gly Ala Met Ala Val Val Gly Gly Ala Leu Ala Tyr Leu Val Val Lys Thr Leu Ile Asn Ala Thr Gln Leu Leu Lys Leu Leu Ala Lys Leu Ala Glu Leu Val Ala Ala

29 Ala Ile Ala Asp Ile Ile Ser Asp Val Ala Asp Ile Ile Lys Gly Thr Leu Gly Glu Val Trp Glu Phe Ile Thr Asn Ala Leu Asn Gly Leu Lys Glu Leu Trp Asp Lys Leu Thr Gly Trp Val Thr Gly Leu Phe Ser Arg Gly Trp Ser Asn Leu Glu Ser Phe Phe Ala Gly Val Pro Gly Leu Thr Gly Ala Thr Ser Gly Leu Ser Gln Val Thr Gly Leu Phe Gly Ala Ala Gly Leu Ser Ala Ser Ser Gly Leu Ala His Ala Asp Ser Leu Ala Ser Ser Ala Ser Leu Pro Ala Leu Ala Gly Ile Gly Gly Gly Ser Gly Phe Gly Gly Leu Pro Ser Leu Ala Gln Val His Ala Ala Ser Thr Arg Gln Ala Leu Arg Pro Arg Ala Asp Gly Pro Val Gly Ala Ala Ala Glu Gln Val Gly Gly Gln Ser Gln Leu Val Ser Ala Gln Gly Ser Gln Gly Met Gly Gly Pro Val Gly Met Gly Gly Met His Pro Ser Ser Gly Ala Ser Lys Gly Thr Thr Thr Lys Lys Tyr Ser Glu Gly Ala Ala Ala Gly Thr Glu Asp Ala Glu Arg Ala Pro Val Glu Ala Asp Ala Gly Gly Gly Gln Lys Val Leu Val Arg Asn Val Val <210> 4 <211>

30 <400> 4 Val Asp Leu Pro Gly Asn Asp Phe Asp Ser Asn Asp Phe Asp Ala Val Asp Leu Trp Gly Ala Asp Gly Ala Glu Gly Trp Thr Ala Asp Pro Ile Ile Gly Val Gly Ser Ala Ala Thr Pro Asp Thr Gly Pro Asp Leu Asp Asn Ala His Gly Gln Ala Glu Thr Asp Thr Glu Gln Glu Ile Ala Leu Phe Thr Val Thr Asn Pro Pro Arg Thr Val Ser Val Ser Thr Leu Met Asp Gly Arg Ile Asp His Val Glu Leu Ser Ala Arg Val Ala Trp Met Ser Glu Ser Gln Leu Ala Ser Glu Ile Leu Val Ile Ala Asp Leu Ala Arg Gln Lys Ala Gln Ser Ala Gln Tyr Ala Phe Ile Leu Asp Arg Met Ser Gln Gln Val Asp Ala Asp Glu His Arg Val Ala Leu Leu Arg Lys Thr Val Gly Glu Thr Trp Gly Leu Pro Ser Pro Glu Glu Ala Ala Ala Ala Glu Ala Glu Val Phe Ala Thr Arg Tyr Ser Asp Asp Cys Pro Ala Pro Asp Asp Glu Ser Asp Pro Trp 180 <210> 5 <211> 103 <400> 5 Met Thr Glu Asn Leu Thr Val Gln Pro Glu Arg Leu Gly Val Leu Ala

31 Ser His His Asp Asn Ala Ala Val Asp Ala Ser Ser Gly Val Glu Ala Ala Ala Gly Leu Gly Glu Ser Val Ala Ile Thr His Gly Pro Tyr Cys Ser Gln Phe Asn Asp Thr Leu Asn Val Tyr Leu Thr Ala His Asn Ala Leu Gly Ser Ser Leu His Thr Ala Gly Val Asp Leu Ala Lys Ser Leu Arg Ile Ala Ala Lys Ile Tyr Ser Glu Ala Asp Glu Ala Trp Arg Lys Ala Ile Asp Gly Leu Phe Thr 100 <210> 6 <211> 132 <400> 6 Met Ser Thr Thr Phe Ala Ala Arg Leu Asn Arg Leu Phe Asp Thr Val Tyr Pro Pro Gly Arg Gly Pro His Thr Ser Ala Glu Val Ile Ala Ala Leu Lys Ala Glu Gly Ile Thr Met Ser Ala Pro Tyr Leu Ser Gln Leu Arg Ser Gly Asn Arg Thr Asn Pro Ser Gly Ala Thr Met Ala Ala Leu Ala Asn Phe Phe Arg Ile Lys Ala Ala Tyr Phe Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr Glu Lys Leu Asp Lys Glu Leu Gln Trp Leu Cys Thr Met Arg Asp Asp Gly Val Arg Arg Ile Ala Gln Arg Ala His Gly Leu Pro Ser Ala Ala Gln Gln Lys Val Leu Asp Arg Ile Asp Glu Leu Arg Arg Ala Glu

32 Gly Ile Asp Ala 130 <210> 7 <211> 573 <400> 7 Met Thr Asp Arg Leu Ala Ser Leu Phe Glu Ser Ala Val Ser Met Leu Pro Met Ser Glu Ala Arg Ser Leu Asp Leu Phe Thr Glu Ile Thr Asn Tyr Asp Glu Ser Ala Cys Asp Ala Trp Ile Gly Arg Ile Arg Cys Gly Asp Thr Asp Arg Val Thr Leu Phe Arg Ala Trp Tyr Ser Arg Arg Asn Phe Gly Gln Leu Ser Gly Ser Val Gln Ile Ser Met Ser Thr Leu Asn Ala Arg Ile Ala Ile Gly Gly Leu Tyr Gly Asp Ile Thr Tyr Pro Val Thr Ser Pro Leu Ala Ile Thr Met Gly Phe Ala Ala Cys Glu Ala Ala Gln Gly Asn Tyr Ala Asp Ala Met Glu Ala Leu Glu Ala Ala Pro Val Ala Gly Ser Glu His Leu Val Ala Trp Met Lys Ala Val Val Tyr Gly Ala Ala Glu Arg Trp Thr Asp Val Ile Asp Gln Val Lys Ser Ala Gly Lys Trp Pro Asp Lys Phe Leu Ala Gly Ala Ala Gly Val Ala His Gly Val Ala Ala Ala Asn Leu Ala Leu Phe Thr Glu Ala Glu Arg Arg Leu

33 Thr Glu Ala Asn Asp Ser Pro Ala Gly Glu Ala Cys Ala Arg Ala Ile Ala Trp Tyr Leu Ala Met Ala Arg Arg Ser Gln Gly Asn Glu Ser Ala Ala Val Ala Leu Leu Glu Trp Leu Gln Thr Thr His Pro Glu Pro Lys Val Ala Ala Ala Leu Lys Asp Pro Ser Tyr Arg Leu Lys Thr Thr Thr Ala Glu Gln Ile Ala Ser Arg Ala Asp Pro Trp Asp Pro Gly Ser Val Val Thr Asp Asn Ser Gly Arg Glu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Gln Ala Glu Leu Asp Arg Gln Ile Gly Leu Thr Arg Val Lys Asn Gln Ile Glu Arg Tyr Arg Ala Ala Thr Leu Met Ala Arg Val Arg Ala Ala Lys Gly Met Lys Val Ala Gln Pro Ser Lys His Met Ile Phe Thr Gly Pro Pro Gly Thr Gly Lys Thr Thr Ile Ala Arg Val Val Ala Asn Ile Leu Ala Gly Leu Gly Val Ile Ala Glu Pro Lys Leu Val Glu Thr Ser Arg Lys Asp Phe Val Ala Glu Tyr Glu Gly Gln Ser Ala Val Lys Thr Ala Lys Thr Ile Asp Gln Ala Leu Gly Gly Val Leu Phe Ile Asp Glu Ala Tyr Ala Leu Val Gln Glu Arg Asp Gly Arg Thr Asp Pro Phe Gly Gln Glu Ala Leu Asp Thr Leu Leu Ala Arg Met Glu Asn Asp Arg Asp Arg Leu Val Val Ile Ile Ala Gly Tyr Ser Ser Asp Ile Asp Arg Leu Leu Glu

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