(72) 발명자 구태원 경기도화성시봉담읍동화길 동 1003 호 ( 동화리, 휴먼시아 6 단지아파트 ) 김미애 경기도수원시권선구당진로 15 번길 동 1401 호 ( 당수동, 한라비발디아파트 ) 유미라 부산광역시사하구하단 1 동

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정난 양
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2016년08월30일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2016년08월23일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 35/64 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2014 년 10 월 06 일 심사청구일자 2014 년 10 월 06 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2016 년 04 월 18 일 (56) 선행기술조사문헌 KR A* * 는심사관에의하여인용된문헌 (73) 특허권자 대한민국 (72) 발명자 윤은영 경기도화성시봉담읍동화길 동 1003 호 ( 동화리, 휴먼시아 6 단지아파트 ) 황재삼 경기도화성시향남읍행정리향남택지지구향남지웰 APT 1205 동 1703 호 ( 행정중앙 1 로 61) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 나동규전체청구항수 : 총 14 항심사관 : 김용원 (54) 발명의명칭갈색거저리유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는당뇨예방또는치료용조성물 (57) 요약 본발명은갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는당뇨예방또는치료용조성물에관한것이다. 본발명의당뇨예방및치료용약학적조성물또는당뇨예방및개선용식품조성물은갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물을유효성분으로함유하는것이특징이다. 본발명에의해산화적스트레스를억제하여췌장베타세포의생존율을증가시키며더불어인슐린의분비를증가시켜혈당수치감소효과를나타내는갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는당뇨예방또는치료용조성물이제공된다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 구태원 경기도화성시봉담읍동화길 동 1003 호 ( 동화리, 휴먼시아 6 단지아파트 ) 김미애 경기도수원시권선구당진로 15 번길 동 1401 호 ( 당수동, 한라비발디아파트 ) 유미라 부산광역시사하구하단 1 동 ( 낙동대로 451 번안길 5) 윤영일 경기도수원시팔달구덕영대로 735 번길 동 603 호 ( 화서동, 화서한진현대아파트 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 PJ 부처명 농촌진흥청 연구관리전문기관 국립농업과학원 연구사업명 갈색거저리조리법및다양한체형의제품개발 연구과제명 조리법및식품개발을위한갈색거저리원료제조및특성분석 기여율 1/1 주관기관 국립농업과학원 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는, 당뇨예방또는치료용약학적조성물. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기당뇨는제 2 형당뇨임을특징으로하는, 당뇨예방또는치료용약학적조성물. 청구항 3 제 1항에있어서, 상기추출물은 70부피 % 에탄올로추출된것을특징으로하는, 당뇨예방또는치료용약학적조성물. 청구항 4 제 1항에있어서, 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은췌장베타세포에서산화적스트레스를억제하는것을특징으로하는, 당뇨예방또는치료용약학적조성물. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은인슐린분비능을활성화시켜혈당수치를감소시키는것을특징으로하는, 당뇨예방또는치료용약학적조성물. 청구항 6 제 1항에있어서, 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은인슐린작용경로와관련된유전자인인슐린수용체 (IR), 인슐린수용체물질-1(IRS-1), 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소 (PI3K) 및포도당수송체타입4(GLUT4) 중어느하나이상의발현을활성화시키는것을특징으로하는, 당뇨예방또는치료용약학적조성물

4 청구항 7 제 1항에있어서, 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은상기조성물 1ml를기준으로 100μg ~5000μg으로포함되는것이특징인, 당뇨예방또는치료용약학적조성물. 청구항 8 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는, 당뇨예방또는개선용식품조성물. 청구항 9 제 8항에있어서, 상기추출물은 70부피 % 에탄올로추출된것을특징으로하는, 당뇨예방또는개선용식품조성물. 청구항 10 제 8항에있어서, 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은췌장베타세포에서산화적스트레스를억제하는것을특징으로하는, 당뇨예방또는개선용식품조성물. 청구항 11 제 8항에있어서, 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은인슐린분비능을활성화시켜혈당수치를감소하는것을특징으로하는, 당뇨예방또는개선용식품조성물. 청구항 12 제 8항에있어서, 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은인슐린분비능과관련된유전자인인슐린수용체 (IR), 인슐린수용체물질-1(IRS-1), 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소 (PI3K) 및포도당수송체타입4(GLUT4) 중어느하나이상의발현을활성화시키는것을특징으로하는, 당뇨예방또는개선용식품조성물. 청구항 13 제 8 항에있어서, - 4 -

5 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은상기조성물 1 ml를기준으로 100 μg ~5000 μg으로포 함되는것이특징인, 당뇨예방또는개선용식품조성물. 청구항 14 동결건조된갈색거저리유충을분쇄시키는제1단계 ; 상기제1단계에서제조된갈색거저리유충분말과에탄올을혼합하여갈색거저리혼합액을제조하는제2단계 ; 상기제2단계에서제조된갈색거저리혼합액을초음파분쇄기로미세화시키는제3단계및, 상기제3단계에서미세화된갈색거저리혼합액을원심분리시킨후, 상층액을회수하고이를여과한후건조시켜, 항당뇨효과를갖는갈색거저리유충추출물을제조하는제4단계를포함하는방법으로제조된갈색거저리유충추출물을유효성분으로포함하여, 항당뇨효과를갖는것이특징인, 항당뇨제. 청구항 15 삭제 발명의설명 [0001] 기술분야본발명은갈색거저리유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는당뇨예방또는치료용조성물에관한것으로서, 보다상세하게는산화적스트레스로부터췌장세포를보호하고손상을억제하며, 인슐린분비능을증가시키는효과를갖는갈색거저리유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는당뇨예방또는치료용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술우리나라에는약 420만명이당뇨병환자로전인구의약 10% 에이르며, 세계적으로도 10% 정도가당뇨병에걸린것으로알려져있다. 당뇨병은원인에관한수많은연구가있었음에도불구하고원인이다양하기때문에당뇨병의근본적인원인을찾지못하여적당한치료를하지못하고있다. 당뇨병의요인은유전적요인과환경적요인이있으며제1형당뇨병 ( 인슐린의존형 ) 은주로면역학적기전에의해췌장베타세포가파괴되어인슐린분비가일어나지않는병이고, 제2형당뇨병 ( 인슐린비의존형 ) 은체내에서인슐린이생산되지만인슐린저항성이증가하는병으로당뇨환자의 90% 95% 를차지한다. 제2형당뇨병의대표적인원인으로는췌장베타세포기능저하에따른인슐린분비능저하가예상되고있다. 현재까지췌장베타세포의기능저하의요인으로여러가지가알려져있으나, 고혈당에의한당독성, 지방산에의한지방독성및활성산소종 (Reactive oxygen species, ROS) 의증강에의한산화스트레스등이알려져있다. 특히, 산화스트레스가중요한손상요인으로제기되고있으며, 그이유로는췌장베타세포가다른세포들에비해항산화효소가매우적어산화스트레스에매우취약하기때문이다. 또한, 산화적스트레스가당뇨합병증에관여하므로당뇨합병증의예방방안으로산화적스트레스의억제, 제거및지질대사개선을주장하는연구들이보고되고있다. 당뇨에걸렸을때위험한것은높은혈당수치이며, 혈당수치를감소시키기위해서는인슐린작용경로가활성화되어야한다. 인슐린작용경로는인슐린의시그널을 GLUT4에게전하는경로이다. 혈당을세포내로유입시키는 GLUT4를발견한 E. 제임스박사에의하면인슐린은혈액을타고세포의표면에있는인슐린수용체와결합하고세포막하의인슐린수용체하부가활성화해서 ATP를끌어당겨인산화가되고시그널전달인자인 IRS-1가활성화되고 PI3K를활성화한다

6 [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] 이처럼인슐린시그널이릴레이되어 GLUT4에전달되어활성화하여세포표면으로이동해세포막과일체가되고혈당을세포내로유입한다. 하지만통상적인당뇨약의경우에는복용했을때췌장에서인슐린이강제로분비되도록하기때문에장기간복용할경우췌장의기능이약화되고손상되어인슐린분비가원활하게이뤄지지않아결국에는인슐린주사를맞게된다. 또한, 인슐린주사를맞기시작하면평생주사를통해당뇨를관리해야하며인슐린주사를오랜기간맞은경우일부지방조직이파괴되거나인슐린과민성반응, 저혈당쇼크등의부작용이생길수도있다. 따라서, 상기와같은부작용없이당뇨병의예방과치료를위한천연물질을찾으려는연구들이진행되고있으며, 관련선행기술로는한국공개특허 ( 당뇨병예방및치료용생약조성물 ) 과한국등록특허 ( 식물혼합추출물을함유하는항당뇨용조성물 ) 에관한것이공개되어있다. 한편, 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 는절지동물문곤충강딱정벌레목곡물거저리속에속하고갈색거저리유충은한의학에서양충이라하여토혈, 질타손상 [ 跌打損傷 ], 심기위통 [ 心氣胃痛 ] 등의치료에응용및항균효과가보고되어있다. 육류와갈색거저리의비교시단백질함량이비슷하나, 지방의함량은상당히높은편이여서적은양으로도충분한에너지원으로이용할수있으며, 지방중 70~80% 이상이불포화지방산이여서인체에유익할것으로판단된다. 현재까지갈색거저리는한의학등에서인용되어과거부터많은질병에이용되어왔으나이에대한과학적인분석은미진한실정이다. 발명의내용 [0012] [0013] 해결하려는과제본발명의목적은갈색거저리유충또는이의추출물을유효성분으로포함하여산화적스트레스를억제함으로서췌장베타세포를보호하고인슐린의분비능을증가시켜혈당수치를감소시키는당뇨예방또는치료용조성물을제공하는데있다. 본발명이이루고자하는기술적과제들은이상에서언급한기술적과제들로제한되지않으며, 언급되지않은다른기술적과제들은아래의기재로부터본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자에게명확하게이해될수있을것이다. [0014] [0015] [0016] [0017] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명의당뇨예방및치료용약학적조성물또는당뇨예방및개선용식품조성물은갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물을유효성분으로함유하는것이특징이다. 상기추출물은 70부피 % 에탄올로추출된것이특징이다. 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충은췌장베타세포에서산화적스트레스를억제하며, 인슐린분비능을활성화시켜혈당수치를감소하며, 인슐린분비와관련된유전자인인슐린수용체 (IR), 인슐린수용체물질-1(IRS- 1), 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소 (PI3K) 및포도당수송체타입4(GLUT4) 중어느하나이상의발현을활성화시키는것이특징이다. 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충또는이의추출물은상기조성물 1ml를기준으로 100μg ~5000μg으로포함되는것이특징이다. [0018] 발명의효과본발명에의해, 산화적스트레스를억제하여췌장베타세포의생존율을증가시키며더불어인슐린의분비를증가시켜혈당수치감소효과를나타내는갈색거저리유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는당뇨예방또는치료용조성물이제공된다

7 [0019] 도면의간단한설명 도 1 은알록산 (Alloxan) 처리후세포반수치사농도를 MTS assay 로측정한그래프이다. 도 2A는누에추출물 (BME) 을대상으로췌장베타세포 (HIT-T15) 에서세포생존율 (Cell viability) 을측정한그래프이다. 도 2B는뽕잎추출물 (MAE) 을대상으로췌장베타세포 (HIT-T15) 에서세포생존율 (Cell viability) 을측정한그래프이다. 도 2C는본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물 (TME) 을대상으로췌장베타세포 (HIT-T15) 에서세포생존율 (Cell viability) 을측정한그래프이다. 도 3A는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서일산화질소 (NO) 의활성을측정한그래프이다. TME : 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군도 3B는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서글루타티온 S-전달효소 (GST) 의활성을측정한그래프이다. TME : 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군도 4A는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 의세포생존율 (Cell survival rate) 을나타낸그래프이다. TME: 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군 MAE : 뽕잎추출물처리군도 4B는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서글루코스 (Glucose) 의분비량을나타낸그래프이다. TME: 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군 MAE : 뽕잎추출물처리군도 4C는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서인슐린 (Insulin) 의분비량을나타낸그래프이다. TME: 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군 MAE : 뽕잎추출물처리군도 5A는당뇨가유발된동물모델에서신장의무게 (Kidney weight) 를측정한그래프이다. TM: 본발명인실시예 2의갈색거저리유충시료처리군 BM : 누에시료처리군도 5B는당뇨가유발된동물모델에서췌장의면역조직화학적염색을실시한도면이다. TM: 본발명인실시예2의갈색거저리유충시료처리군 BM: 누에시료처리군도 5C는당뇨가유발된동물모델에서췌장의인슐린양성세포 (Insulin-producing cells) 를카운트하여나타낸그래프이다. TM : 본발명인실시예2의갈색거저리유충시료처리군 - 7 -

8 BM : 누에시료처리군도 6A는당뇨가유발된동물모델에서혈당수치를나타낸그래프이다. TM : 본발명인실시예2의갈색거저리유충시료처리군 BM : 누에시료처리군도 6B는당뇨가유발된동물모델에서인슐린수치를나타낸그래프이다. TM : 본발명인실시예2의갈색거저리유충시료처리군 BM : 누에시료처리군도 6C는당뇨가유발된동물모델에서인슐린저항성과관련된 FFA(Free fatty acid) 의수치를나타낸그래프이다. TM : 본발명인실시예2의갈색거저리유충시료처리군 BM : 누에시료처리군도 6D는당뇨가유발된동물모델에서 ALT( 알라닌아미노전이효소 ) 의수치를나타낸그래프이다. TM : 본발명인실시예2의갈색거저리유충시료처리군 BM : 누에시료처리군도 6E는당뇨가유발된동물모델에서 AST( 아스파라진산아미노전이효소 ) 의수치를나타낸그래프이다. TM : 본발명인실시예2의갈색거저리유충시료처리군 BM : 누에시료처리군도 7A는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서인슐린수용체 (IR, Insulin receptor) 의발현양을나타낸그래프이다. TME : 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군도 7B는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서 IRS-1(insulin receptor substrate-1) 의발현양을나타낸그래프이다. TME : 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군도 7C는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서포스파티딜이노시톨 3-인산화효소 (PI3K) 의발현양을나타낸그래프이다. TME : 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군도 7D는당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서포도당수용체타입4(GLUT4) 의발현양을나타낸그래프이다. TME : 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군도 8은당뇨가유발된췌장베타세포 (HIT-T15) 에서포도당수용체타입4(GLUT4) 의발현양을웨스턴블럿을통해나타낸도면이다. TME : 본발명인실시예1의갈색거저리유충추출물처리군 BME : 누에추출물처리군 발명을실시하기위한구체적인내용 - 8 -

9 [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 이하, 본발명을상세하게설명하며, 본발명의요지를불필요하게흐릴수있는공지기능및구성에대한상세한설명은생략한다. 당뇨병은췌장베타세포가파괴되어인슐린분비가일어나지않아체내의혈당수치가증가되어발생하거나, 산화적스트레스로인한췌장베타세포의손상으로발생되는질병으로알려져있다. 따라서, 현재는체내의혈당수치를감소시키고인슐린분비를증가시키는것뿐만아니라산화적스트레스를억제하여췌장베타세포를보호하는것이당뇨병연구의주요요소로부각되고있다. 이에본발명의발명자들은산화적스트레스를억제하고더불어체내의혈당수치감소와인슐린분비증가효과를나타내는천연물에대해여러차례연구한바, 여러천연물중갈색거저리유충또는이의추출물이산화적스트레스를억제하여췌장베타세포의세포생존율을증가시키며, 또한혈당수치를감소시키고인슐린분비는증가시키는효과를확인하였다. 구체적으로설명하면, 본발명의갈색거저리유충 ( 이하, 'TM' 이라명명함 ) 또는이의추출물 ( 이하, 'TME' 라명명함 ) 은췌장베타세포인 HIT-T15 세포와당뇨유발동물모델을이용하여갈색거저리추출물 (TME) 의 alloxan에의한산화스트레스로부터의세포보호, 인슐린분비능및항산화효소활성을평가하였다. 그결과, TME은 HIT-T15 cell에서최고농도인 5000 μg / ml로 96시간처리시에도독성이전혀없었으므로 TME의췌장세포에대한독성은없음을확인할수있었고, alloxan 10 mm의농도에서약 50% 의세포독성을확인후산화적스트레스와관련있는항산화실험을한결과 NO의경우 alloxan만처리한세포에비해 TME 1000 μg / ml처리시약 20% 정도감소함을확인하였다또한, alloxan만처리한세포의 GST 활성은포도당이들어있지않는세포에비해다소감소하는경향을보였으나, TME의처리농도가증가할수록유의적으로 GST 활성이증가함을확인하였다. 또한, Alloxan을처리후 TME를농도별로처리하여 24, 48, 72시간경과시세포생존률확인한결과 alloxan만처리한경우에비해 TME 처리농도에의존적으로세포생존률이증가되었고 5000 μg / ml처리시거의정상과유사한수준으로회복되었으며, glucose 양도 alloxan 처리시보다 TME 5000 μg / ml처리후 72시간경과시 24% 감소하여거의정상수준이었으며, insulin도 TME 처리후동시간대대비약 10% 정도유의성있게증가되어 alloxan에의해유발된산화스트레스로부터세포를보호하여세포생존율을증가시킴을확인하였다. 또한, Insulin pathway에관여하는인자인 IR과 IRS-1, PI3K, GLUT4의발현정도를실시간 (real-time) PCR을통해확인해본결과 IR과 IRS-1, PI3K, GLUT4의발현량이당뇨유발세포에비해크게증가하였고 GLUT4의단백질양도크게증가하는것을확인할수있었다. 또한, 당뇨유발동물모델에서 TM의혈당과인슐린을분석한결과, TM을 5주간처리한동물군이당뇨동물군에비해약 40% 정도감소되었다. 혈액내인슐린농도의경우정상군에비하여당뇨군이크게감소하였고, TM과누에시료 ( 이하, 'BM' 이라명명함 ) 는당뇨군에비하여큰차이가없었다. 또한, 유리지방산 (Free fatty acid, 이하 'FFA' 라명명함 ) 의경우당뇨가유발이되면 FFA가증가하나 TM을경구투여한경우 FFA가 TM은 32% 정도감소하였다. 간은당분을저장하는곳으로서우리몸에에너지가필요할때에당분을방출하는곳이다. 당뇨병으로당대사에이상이생기면간이영향을받아지방이축적되면비대해지면서지방간이된다. 이를확인하기위해본간수치의경우 ALT, AST 둘다정상군에비해당뇨군에서약 50% 크게증가하였으나 ALT, AST가 TM 처리군에서감소하는것을확인할수있었다. 조직학적분석에서는신장은 TM 처리를하여도커진신장의무게는감소하지않았으나췌장섬의 insulin 분비세포가 TM에서개선된것을확인할수있었다. 이상과같은본발명의항당뇨효능을가지는본발명의갈색거저리유충추출물은혈당강하효능이우수하여당뇨예방에탁월한효과가있을뿐만아니라 alloxan의세포손상에대하여세포손상회복효능까지있는등지금까지갈색거저리에서알려지지않았던당뇨병에대한예방, 치료효과를알수있었다. 아울러이러한효능을일반인들에서보다쉽고도용이하게접할수있도록각종식품, 음료, 차, 주류등에도항당뇨기능성제품제조에응용하는것이가장바람직할것으로본다. [0033] 이에, 본발명인항당뇨효과를갖는갈색거저리유충추출물제조방법을구체적으로설명하면다음과같다

10 [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] 1. 제 1단계 ; 갈색거저리유충분쇄우선, 본단계에서는갈색거저리 (Tenebrio molitor) 를준비한다. 상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 는절지동물문곤충강딱정벌레목곡물거저리속에속하는것으로써, 이러한상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 는항당뇨활성을나타내는유효성분이최대로함유되어있는갈색거저리유충을사용하는것이좋다. 이렇게준비된상기갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충은건조한다음분쇄하여분말형태로제조한다. 그다음, 다량의수분이함유되어있기때문에수분이완전히없는상태로만들기위해서는건조과정을거쳐야한다. 이때, 상기갈색거저리가함유하고있는유효성분들의변화를최소화시키기위해동결건조를통해건조를하는것이좋다. 그다음하기추출의용이성을위해상기건조된갈색거저리유충은분쇄기를이용하여분말형태로제조된다. [0040] [0041] [0042] [0043] 2. 제 2단계 ; 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 혼합액제조본단계에서는상기제조한갈색거저리 (Tenebrio molitor) 분말을에탄올과혼합하여갈색거저리혼합액을제조한다. 이때, 에탄올과분쇄된갈색거저리분말의혼합비율은특별히제한되지않으나, 상기에탄올 1l당상기분쇄된갈색거저리분말 1 3g로혼합하는것이바람직하다. 상기범위를벗어날경우, 번거로운농축이나희석과정을거쳐적정농도로조절하는추가과정을수행해야하는문제점이있을수있다. 또한상기사용된에탄올로는어떠한에탄올을사용하여도무관하나, 갈색거저리내에함유된유효성분을가장적절히추출할수있도록 70~80% 의에탄올을사용하는것이좋다. [0044] [0045] [0046] 3. 제 3단계 ; 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 혼합액을미세화시키는단계본단계에서는상기갈색거저리혼합액으로부터항당뇨효과를가지는유효성분을추출하기위한단계로써, 통상적으로알려진초음파분쇄기를이용하여특별한제한없이미세화시킬수있으나, 초음파분쇄기를장수풍뎅이혼합액에 200~300jule의에너지로 10~30초간작동시키는것이바람직하다. 상기초음파분쇄기적용조건이상기범위를벗어날경우, 목적하는유효성분의추출이이루어지지않거나, 유효성분이파괴되거나변성되는문제가발생될수있다. [0047] [0048] [0049] 4. 제 4단계 ; 갈색거저리 (Tenebrio molitor) 유충추출물제조단계본단계에서는상기미세화된갈색거저리혼합액을원심분리시킨후, 상층액을회수하고이를여과한다음건조시켜제조하는단계로써, 최종적으로파골세포분화억제를통해항당뇨효과를갖는갈색거저리유충추출물이제조되는것이다. 이때, 상기원심분리는 4000~5000rpm에서 5~20분동안이루어지는것을특징으로, 상기원심분리적용조건이상기범위를벗어날경우, 목적하는유효성분이파괴되거나변성되는문제가발생될수있다. [0050] [0051] 본발명의또다른관점에서는갈색거저리유충또는이의추출물을유효성분으로포함하는당뇨예방및치료용약학적조성물또는, 당뇨예방및개선용식품조성물을제공하게된다. 특히, 상기조성물중상기갈색거저리유충또는이의추출물은상기조성물 1ml를기준으로 100μg내지 5000 μg로포함되는것이특징이다. 이는하기실험예에뒷받침되는것으로써, 상기갈색거저리유충또는이의추출물의함량이 100μg미만으로함유될경우에는인슐린분비능이떨어져본발명이목적하는항당뇨제로사용하기적합하지않으며, 5000μg초과로함유될경우에는함유대비보다상승된효과를나타내지않아경제적으로적합하지않다

11 [0052] [0053] [0054] 이러한상기본발명의약학조성물은당뇨예방및치료를목적으로항당뇨효과를갖는천연물의약품에함유될수있다. 이때당해발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자가용이하게실시할수있는방법에따라, 약학적으로허용되는담체또는부형제를이용하여제제화함으로써단위용량형태로제조되거나또는다용량용기내에내입시켜제조될수있다. 이때제형은정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환중어느하나의형태로구성되며, 분산제또는안정화제를추가적으로포함할수도있다. 즉, 이는사용목적에따라서당업자가어려움없이선정하여이루어질수있으며, 그첨가량은본발명의목적및효과를손상시키지않는범위내에서선택될수있음을의미한다. 상기약학적으로허용되는담체로는제제할시에통상적으로이용되는것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산마그네슘및미네랄오일등을포함하며, 또한, 약학적으로허용되는부형제로는윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을포함하나, 이에한정되는것은아니다. [0055] [0056] [0057] 또한, 상기본발명의식품조성물에서는그유효성분으로상기갈색거저리유충또는이의추출물을사용할경우, 상기그대로사용하거나다른통상의식품조성물의성분과함께사용될수있고, 통상적인방법에따라적절하게사용될수있다. 이러한상기식품조성물은당뇨예방및개선을위한목적으로건강식품에함유될수있으며그종류에는특별한제한은없다. 상기물질을첨가할수있는식품의예로는육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함한낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료및비타민복합제등이있으며, 통상적인의미에서의건강식품을모두포함한다. 상기외에본발명의상기식품조성물은여러가지영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의식품조성물은천연과일쥬스, 과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육으로함유할수도있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은크게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] 이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하고자한다. 이들실시예는오로지본발명을예시하기위한것으로, 본발명의범위가이들실시예에의해제한되는것으로해석되지않는것은당업계에서통상의지식을가진자에게있어서자명할것이다. < 실시예 1> 갈색거저리유충추출물제조동결건조된갈색거저리유충분말을월드웨이에서구매한후이를갈색거저리유충추출물제조에사용하였다. 갈색거저리유충분말은 3g은 70부피 % 에탄올 1l에넣고혼합액을제조한후, 상기혼합액을초음파파쇄기로 230 jule의세기로 10초동안 2번나누어서파쇄하여미세화시켰다. 상기미세화시킨갈색거저리유충혼합액은 4500rpm에서 10분동안원심분리한후, 상층액을회수하고상기상층액은 0.25μm주사기필터로여과하여본발명의갈색거저리유충추출물 (TME) 을제조하였다. [0063] [0064] < 실시예 2> 경구투여용갈색거저리유충시료제조 실시예 1 에서사용된동결건조된갈색거저리유충분말을증류수와섞어본발명의경구투여용갈색거저리유 충시료 (TM) 를제조하였다. [0065] [0066] < 실험예 1> 본발명의갈색거저리유충추출물을대상으로항당뇨활성확인 1. 실험방법

12 [0067] [0068] 1) 세포및실험동물 HIT-T15 cell(atcc, MD, USA) 은페니실린 - 스트렙토마이신 (Penicillin-Streptomycin_ 100 unit/ml 과 10% FBS 이 함유된 RPMI-1640 배지를사용하여 37, 5% CO 2 인큐베이터 (incubator) 에서배양하였으며, 2 일에한번씩계대 배양을실시하였다. [0069] [0070] [0071] 실험동물의경우중앙실험동물로부터공급받은체중 30 g 이상의 ICR계수컷쥐를 24±2 조건하에서고형사료 (research diet, New Brunswick, USA) 와물을충분히공급하면서실험실환경에 1주일이상적응시킨후사용하였다. 당뇨유발은실험동물을 16시간절식시킨후 alloxan(50 mg/kg, 0.05 M sodium citrate buffer) 을복강에주사하여당뇨를유발시켰다. alloxan을주사한지 3일후에실험동물의꼬리에서혈액을채취하여혈당측정기를이용하여혈당을측정하였다. 포도당농도가 300 mg/dl 이상인것을당뇨가유발된것으로판정하고실험에사용하였다. [0072] [0073] 2) 항산화활성측정 HIT-T15 세포를 24 well plate 에 /well 가되도록분주하여 24 시간동안 37, 5% CO 2 incubator 에서배양 한후각 well 당 10 mm alloxan(sigma-aldrich, MO, USA) 과시료를농도별로처리한후 1 시간동안배양하였 다. [0074] [0075] 배양종료후 alloxan이들어있는배지를제거하고새로운배지에시료를농도별로처리하여 23시간동안배양하였다. 세포를수거하여 Nitric Oxide detection kit(intron, korea) Glutathione S-Transferase Assay kit(cayman chemical, MI, USA) 를 (NO 추가 ) 사용하여항산화를측정하였다 [0076] [0077] [0078] 3) 세포생존율측정세포생존율측정하기위해 HIT-T15 세포를 96 well plate에 /well가되도록분주하여각군별로시료를농도별 (1000, 2000, 3000, 4000, 5000 μg / ml ) 로첨가하여 72시간동안배양한후, CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation assay(promega, Wisconsin, USA) 를수행하였다. MTS reagent (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 를최종 0.5 mg/ml 농도로처리하여 37 에서 4시간추가배양한후생성된 formazan의양을 microplate reader (Beckman coulter, California, USA) 를이용하여 515 nm에서측정하였다. 세포생존율은대조군의평균흡광도값에대한백분율로나타내었다. [0079] [0080] 4) 인슐린분비능측정 HIT-T15 세포를 96 well plate에 /well가되도록분주하여각 well 당 10 mm alloxan과시료를농도별 (1000, 2000, 3000, 4000, 5000 μg / ml ) 로처리한후 1시간동안배양하였다. 배양종료후 alloxan이들어있는배지를제거하고새로운 RPMI-1640 배지에시료를농도별로처리하여 23시간동안배양하였다. 배양종료후 cell culture supernatant를수거하여 Rat/Mouse Insulin kit(millipore, MA, USA) 를사용하여측정하였다. [0081] [0082] 5) 동물채혈및조직분석시료의채취실험물질투여군은각군 5마리씩으로 5그룹으로나누었으며, 정상군, 음성대조군, 양성대조군, 실시예 2의갈색거저리유충시료 (TM) 저농도군, 실시예 2의갈색거저리유충시료 (TM) 고농도군으로나누어당뇨대조군에는생리식염수 10 ml/kg, 누에대조군은 3000 mg/kg의용량으로갈색거저리실험군에는 300, 3000 mg/kg 용량으로 5주동안 24시간마다경구투여하였다

13 [0083] [0084] 매주한번혈당을측정하였고최종경구투여후 24시간경과시에테르 (ether) 로마취시키고복부정중선을절개하여췌장을적출한후레퍼런스바이오랩에조직염색을의뢰하여 insulin staining을통해조직을관찰하였고, 심장에서채혈하여혈액을모아 3,000 rpm에서 15분간원심분리하여혈장을취하여분석용시료로사용하였다. 원심분리한혈장은분석할때까지 -70 에서급속냉동시켜보관하였다. FFA, 간수치를확인하기위해혈장을녹십자에분석의뢰하였고혈장에서인슐린수치를측정하였다. [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] 6) Real-time PCR 분석항당뇨효능을분석하기위해인슐린경로 (insulin pathway) 와관련유전자인 insulin receptor(ir), insulin receptor substrate-1(irs-1), phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K), Glucose transporter type 4(GLUT4) 의발현양을 Real-time PCR을통해확인하였다. Alloxan을처리한세포에갈색거저리유충추출물을처리하여 24시간배양한후세포의배지를제거하고 Trizol reagent를처리한후 cell scraper를이용해세포를수집하였다. 수집된세포에클로로포름 (chloroform) 을넣고 12,000 g에서 15분동안원심분리하여회수한상층액에이소프로파놀 (isopropanol) 을넣어서 RNA를추출하고추출된 total RNA량을측정한후 2 μg / ml로농도를정량하여 cdna를합성하였다. 합성한 cdna와 Power SYBR Green Mixture와제작한 primer를혼합한후 real-time PCR기기 (AB, Milton Keynes, UK) 를통해 insulin signaling pathway 발현수준을조사하였다. 사용된 primer의염기서열은하기표 1에표시하였다. [0090] Name Sequence GAPDH Forward 5'-GCCTCACCCCATTTGATGTT-3 Reverse 5'-GGGAAGCCCATCACCATCT-3' Insulin receptor Forward 5'-GAGAGGATGTGAGACGACGG-3' 표 1 Reverse 5'-GTATAGCCAGACGGGCACTC-3' IRS-1 Forward 5'-AATGTGTGGCTGAGACCTGG-3' Reverse 5'-CTGTTGTTGAGAGGGGCAGT-3' PI3K Forward 5'-CAGTTTGCCCCTCCTGATGT-3' Reverse 5'-GGGCTCTGTAGTTCTTGGGC-3' Gult4 Forward 5'-CTTGGCTCCCTTCAGTTTGG-3' Reverse 5'-CTACCCAGCCACGTTGCATT-3' [0091] [0092] 7) Western blot 분석 Glucose 유입과관련이있는 GLUT4 의발현을확실히확인하기위해서 Western blot 을수행하였다. Alloxan 을처 리한췌장세포에갈색거저리유충추출물을처리하여 24 시간배양한후세포의배지를제거하고세포를 PBS 로 2 회세척후 cell scraper (SPL Life Science, Korea) 로모은다음 Cytobuster TM Protein Extraction Reagent (Novagen, ND, USA) 를이용하여세포를분쇄한후, rpm 에서 15 분간원심분리하여상층액을회수하였다. [0093] [0094] 회수한상층액은 Bio Rad Protein Assay (Bio Rad, CA, USA) 로농도를측정하고 10 μg/ml의농도로맞춘후 10% SDS-PAGE를수행하였다. 전기영동후 PVDF membrane (GE Healthcare, NJ, USA) 에 transfer하고, Blotting Grade Blocker (Bio Rad, CA, USA) 를 TBST에녹여 5% 의농도로만든다음이를이용하여 PVDF membrane을 1시간동안상온에서 blocking시켰다. 1차항체 GLUT4 (calbiochem, CA, USA) 는 1:100으로, tubulin (Sigma, MO, USA) 은 1:10000의비율로희석하여상온에서밤새반응시킨후다음날 TBST로 15분씩 4번세척하였다. 2차항체 HRP-conjugated secondary antibody (Promega, WI, USA) 는 1:3000의비율로 40분동안상온에서반응시킨후다시 TBST로 15분씩 4번세척하였다. Western LightningPlus ECL (Perkin Elmer, MA, USA) 을 PVDF membrane에처리후암실에서 X-ray 필름 (Fujifilm, Japan) 으로감광시켜 GLUT4의단백질발현을확인하였다

14 [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] 2. 실험결과 1) 췌장세포에대한독성평가췌장세포 (HIT-T15 cell) 에누에추출물 (BME) 및뽕잎추출물 ( 이하, 'MAE' 이라함 ) 을각각 0, 10, 100, 500, 800, 1000 μg / ml로처리하고 24, 48, 72시간경과후세포생존율확인하였다. 그결과도 1에나타나있듯이, BME의경우 500 μg / ml에서다소독성이있었고, MAE는 800 μg / ml이상에서독성이있었다. 정상 HIT-T15 cell에서의 TME의세포독성을측정하기위해 2 10 cells/well로분주한췌장세포에 TME를농도별 (1000, 2000, 3000, 4000, 5000 μg / ml ) 로처리하여 24, 48, 72시간경과에따른세포생존률확인결과, 최고농도인 5000 μg / ml로 96시간처리시에도독성이전혀없었으므로 TME의췌장세포에대한독성은없음을확인할수있었다. [0100] [0101] 2) Alloxan 에의해손상된췌장세포에대한 TME 의항산화활성 HIT-T15 cell 에 alloxan 으로당뇨를유발하기위해 alloxan 처리후세포반수치사농도를측정하기위해 cells/well 로분주된췌장세포에 alloxan 을농도별 (0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 mm) 로 1 시간처리하고배지교 체후 23 시간동안배양한다음 MTS assay 수행한결과, 도 2A 내지도 2C 에나타나있듯이 10 mm 의농도에서 약 50% 의세포독성을확인하였고, 추후췌장세포를이용한실험에 10 mm allloxan 을사용하였다. [0102] Alloxan 처리에의해손상된 HIT-T15 cell에대한 TME의항산화효능을확인하기위해 cells/well로분주된췌장세포에 alloxan 1시간처리후 alloxan이들어있는배지를제거하고새로운배지에 TME를농도별 (500, 1000 μg / ml ) 로처리하여 24시간경과시 NO, GST를측정한결과, 도 3A 내지 3B에나타나있듯이 NO의경우 TME 1000 μg / ml처리시약 20% 정도감소함을확인하였고 GST 활성은 TME 처리시유의적으로 GST활성이증가함을확인하였다. [0103] [0104] 3) Alloxan에의해손상된췌장세포에대한 TME의 glucose 감소및 insulin 분비능증가 Alloxan 처리에의해생존률, glucose의세포내유입등이손상된 HIT-T15 cell에대한 TME의효능을확인하기위해 cells/well로분주된췌장세포에 alloxan 1시간처리후 alloxan이들어있는배지를제거하고새로운배지에 TME를농도별 (1000, 2000, 3000, 4000, 5000 μg / ml ) 로처리하여 24, 48, 72시간경과시세포생존률확인결과, 도 4A 내지 4C에나타나있듯이 alloxan만처리한경우에비해 TME 처리농도에의존적으로세포생존률이증가되었고 5000 μg / ml처리시거의정상과유사한수준으로회복되었으며, glucose 양도 alloxan 처리시보다 TME 5000 μg / ml처리후 72시간경과시 24% 감소하여거의정상수준이었으며, insulin도 alloxan 처리후처리농도의존적으로생성량이증가되어 alloxan 처리후동시간대대비약 10% 정도증가되었다. [0105] [0106] [0107] [0108] 4) 당뇨유발동물모델에서 TM 처리에따른조직학적개선효과 Alloxan 처리에의해당뇨가유발된동물모델에대한 TM의효능을확인하기위하여 Alloxan으로당뇨를유발시킨동물모델에 TME을 5주간 3000 mg/kg 농도로경구투여하여신장의무게, 췌장조직을분석한결과소변기능의문제가있는것으로보여신장의무게 (A) 를분석한결과도 5A 내지도 5C에나타나있듯이, 신장이정상군에비해커졌으나 TM에서무게가감소하지않았고췌장조직에경우인슐린에대한면역조직화학적염색에서 Control개체를제외하고췌장섬의심한위축이확인되었다. 위축된췌장섬은인슐린분비세포의심한감소를나타내었다. 췌장섬을구성하고있는세포들중인슐린양성세포의수를 count하여그비율을나타내었다. Control개체에서인슐린양성세포의비율이 100% 으로하였을때 Diabetes, BM, TM개체에서각각평균 12.4%, 16.8%, 27.5% 를나타내어 TM에서다소개선된것으로보인다

15 [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] 5) 당뇨유발동물모델에서 TM 처리에따른혈액학적개선효과 Alloxan 처리에의해당뇨가유발된동물모델에대한 TM의효능을확인하기위하여 Alloxan으로당뇨를유발시킨동물모델에 TM을 5주간 3000 mg/kg 농도로경구투여하여혈액을분석한결과도 6A 내지 6E에나타나있듯이, 당뇨군이정상군에비해혈당이크게증가하였으나 TM을처리한군은당뇨군에비해약 40% 정도감소되었다. 또한혈액에서 insulin을확인한결과 insulin 분비는정상군에비해당뇨군이크게감소하였고, 당뇨군에비해누에는차이가없으나 TM의경우약 26% 정도증가하였다. 인슐린저항성과관련이있는 FFA(B) 의경우당뇨가유발이되면 FFA가증가하나누에와갈색거저리를경구투여한경우 FFA가누에는 20% 정도갈색거저리는 32% 정도감소하였다. 간은당분을저장하는곳으로서우리몸에에너지가필요할때에당분을방출하는곳이다. 당뇨병으로당대사에이상이생기면간이영향을받아지방이축적되면비대해지면서지방간이된다. 이를확인하기위해본간수치의경우 ALT(C), AST(D) 둘다정상군에비해당뇨군에서약 50% 크게증가하였으나 ALT만누에군과갈색거저리군에서감소하였고 AST는갈색거저리군에서만감소하는것을확인할수있었다. [0114] [0115] 6) TME 처리후 insulin pathway 관련유전자발현증가 Alloxan을처리한 HIT-T15 cell에 TME을 24시간처리하여 Insulin signaling pathway에관여하는인자인 IR과 IRS-1, PI3K, GLUT4의발현정도를실시간 (real-time) PCR을통해확인해본결과, 도 7A 내지 7D에나타나있듯이 Insulin signaling pathway에관여하는인자인 IR과 IRS-1, PI3K, GLUT4의발현양이당뇨유발세포에비해크게증가하여세포내인슐린저항성이감소하고 glucose의세포내유입등이개선됨을확인할수있었다. [0116] [0117] 7) TME의 GLUT4 단백질발현증가세포내 glucose의유입과관련있는 GLUT4의단백질발현을확인하기위해췌장세포에 alloxan 1시간처리후 alloxan이들어있는배지를제거하고새로운배지에 TME를농도별 (500, 1000 μg / ml ) 로처리하여 24시간경과시 GLUT4의단백질발현양을 western blot 분석을통해확인한결과, 도 8에나타나있듯이 TME 1000 μg / ml에서증가하는것을확인하였다. [0118] 이상상기와같이, 본발명를통해 TME에대한췌장베타세포의세포보호, 손상억제및인슐린분비능을검증함으로써 alloxan에의해발생된산화적스트레스로부터췌장베타세포를보호하여당뇨병조절에도움이되는기능성식품소재개발을위한가능성을알아보며, 항당뇨효능을입증하여당뇨병에식약용으로사용되어곤충농가및산업체소득증대를기대할수있음을알수있다. [0119] 이상으로본발명내용의특정한부분을상세히기술하였는바, 당업계의통상의지식을가진자에게있어서이러한구체적기술은단지바람직한실시양태일뿐이며, 이에의해본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백할것이다. 따라서, 본발명의실질적인범위는첨부된청구항들과그것들의등가물에의하여정의된다고할것이다

16 도면 도면 1 도면 2a 도면 2b

17 도면 2c 도면 3a 도면 3b

18 도면 4a 도면 4b 도면 4c

19 도면 5a 도면 5b 도면 5c

20 도면 6a 도면 6b 도면 6c

21 도면 6d 도면 6e 도면 7a

22 도면 7b 도면 7c 도면 7d

23 도면

α α α α α

α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를