본초학표지

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준면 여
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1 大韓本草學會誌제 29 권제 2 호 (2014 년 3 월 ) Kor. J. Herbology 2014;29(2):15-21 ISSN (Print), ISSN (Online) 증자둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화억제및지질강하효과 강병태 1#, 최원경 1, 박동철 2, 김종국 3, 박모라 3, 김성옥 4, 김미려 4,5* 1 : 김천대학교식품영양학과 2 : 김천대학교호텔조리외식경영학과 3 : 경북대학교과학기술대학식품외식산업학과 4 : 한의치료기술과학화사업팀 (BK 21 Plus) & 대구한의대학교한의과대학본초약리학교실 5 : ( 재 ) 대구TP한방산업지원센터 Effects of steamed Polygonatum odoratum extract on inhibition of adipocyte differentiation and lowing lipid in 3T3-L1 adipocytes Byung Tae Kang 1#, Won Kyung Choe 1, Dong Cheol Park 2, Jong Kuk Kim 3, Mora Park 3, Sung Ok Kim 4, Mi Ryeo Kim 4,5* 1 : Dept. of Food Nutrition, Gimcheon University, Gimcheon, Republic of Korea 2 : Dept. of Hotel Cuisine & Food Service Management, Gimcheon University, Gimcheon, Republic of Korea 3 : Dept. of Food and Food -Service Industry, Kyungpook National University, Sangju, Republic of Korea 4 : Team for Scientification of Korean Medical Intervention (BK21 Plus) & Dept. of Herbal Pharmacology, Coll. of Oriental Medicine, Daegu Haany Univ. Daegu, Republic of Korea 5 : Oriental Medical Industry Support Center, Daegu Technopark, Daegu, Republic of Korea ABSTRACT 1) Objectives : The purpose of this study was to investigate inhibitory effects of steamed Polygonatum odoratum extract (POE) on differentiation and adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. Methods : Polygonatum odoratum (P. odoratum) extract was extracted with ethyl acetate. Total phenolic and flavonoid contents in POE were measured for antioxidant activity. The spectrophotometric method was used to determine the DPPH and ABTS radical scavenging activity and ferric-reducing antioxidant potential (FRAP). MTT assay was examined for cell toxicity, oil red O staining was performed for intracelluar adipogenesis in differentiated 3T3-L1 adipocytes. Western blot analysis for measurement of CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα), peroxisome proliferator-activated receptorγ (PPARγ) and AMP-activated protein kinase (AMPK) expressions were performed. Results : The results revealed that POE has antioxidant activities. Contents of total polyphenolics and flavonoids were 50.83±1.52 GAE mg/100g dry weight of POE and 17.05±2.47 RE mg/100g dry weight of POE, respectively. DPPH radical scavenging activity, and FRAP in 10 mg/ml concentration were 92.1±0.6%, 244.8±9.0 µm Fe(II) and ABTS inhibition in 5 mg/ml concentration was 84.8±4.1%. Treatment of POE in adipocytes inhibited the differentiation and adipogenesis of 3T3-L1 adipocytes compared to those of vehicle control. Additionally, protein expressions of C/EBPαand PPARγ, major transcription factor for the adipogenic genes, were significantly decreased compared to those of vehicle control (p<0.05). Futhermore, phosphorylation of AMPK was increased in 3T3-L1 adipocytes treated with POE compared to that of vehicle control (p<0.05). Conclusions : we demonstrate that steamed P. odoratum extract (POE) has potentiating antioxidant activities, * 교신저자 : 김미려, 대구시수성구상동 165. 한의치료기술과학화사업팀 (BK 21 Plus) & 대구한의대학교한의과대학본초약리학교실 Tel : FAX : mrkim@dhu.ac.kr # 제 1 저자 : 강병태, 경북김천시대학로 214 김천대학교식품영양학과 Tel : FAX : btkang@gimcheon.ac.kr 접수 :2014 년 2 월 21 일 수정 :2014 년 3 월 10 일 채택 :2014 년 3 월 13 일

2 16 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 2, 2014 inhibits differentiation and lipid accumulation and also induces energy expenditure in adipocytes, which may contribute to antiobesity property. Key words : Polygonatum odoratum extract, antioxidant activity, C/EBPα, PPARγ, 3T3-L1 cells 서론 WHO에의하면전세계 68억인구가운데과체중또는비만으로고통을받고있는사람은약 16억명이며 1), 우리나라성인의비만율은남자 36.3%, 여자 24.8% 로서, 남성의비만율이높게나타났을뿐만아니라지난 10년동안지속적인증가추세를보이고있다 2). 비만은과다한영양섭취, 신체활동부족등의잘못된생활습관으로야기되며, 제2형당뇨병및지방대사이상, 고혈압등의대사성질환의주요원인이된다. 우리나라비만환자의 44.4% 가당뇨로보고되고있어 3) 비만에따른당뇨병유병률이심각하게증가하고있다. 미분화 3T3-L1 지방세포 (preadipocyte) 가분화되어완전성숙한 3T3-L1 지방세포 (matured adipocyte) 로분화되는과정은세포의형태, 유전자및단백질의발현, 호르몬민감성의변화등을수반 4) 하며, CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBPs) 과 peroxisome proliferator activated receptor-γ(ppar γ) 를중심으로 adipogenesis 를조절하면서분화가진행된다 5). 이러한지방세포의분화를저해하기위하여운동요법, 식이요법, 약물요법및외과적수술등의다양한방법들이이용되고있다. 이들비만조절요법중약물치료제인 sibutramine (Reductil), orlistat (Xenical) 과같은제제의부작용 ( 복통, 변비, 불면, 혈압의상승등 ) 이보고되면서안전성과유효성이입증된치료제개발의필요성이절실한실정이다 6). 따라서안전성이확보된천연물로부터항비만을포함한항당뇨효능을보유한소재발굴과그에대한연구가많이진행되고있다. 본연구에사용한둥굴레 (P. odoratum) 는백합과 (pluriflorum) 에속하는다년생초본으로전국에널리자생하며, 인공재배가능식용식물이다. 같은속에속하는식물로는각시둥글레, 용둥글레, 진황정, 시베리아둥글레, 큰둥글레등이있으며, 뿌리줄기를건조시켜약초로이용할때에는황정또는옥죽이라고불린다. 둥굴레는점액질이풍부하고전분질, 탄수화물, 아미노산, 알카로이드등의성분이많이함유된것으로보고되고있다 7,8). 한방과민간에서는둥굴레근경이소갈, 자양, 강장, 허약증상보강에많이이용된다. 또한영양불량, 폐결핵, 강심작용, 혈압저하, 혈당저하, 말기암의보조치료제등에효능이있다고전래되고있다 9). 따라서둥굴레에내재하는생리활성기능이비만을포함한각종성인병에효과를나타낼수있는가능성을시사해준다고생각된다. 또한식물에포함되어있는총페놀함량은항산화효과와밀접한관계가있는것으로알려져있다 10). 최근, 둥굴레에대한건강기능성식품으로활용도를높이기위하여여러가지가공공정이개발됨과더불어둥굴레성분의생리적효능을밝히기위한생화학적인연구가진행되고있다. 즉, 둥굴레증자및볶음조건에따른추출물의항산화성및아질산염소거능분석 11), alloxan 처리당뇨쥐에서둥굴레유래 flavonoid 의혈당강하효과 12), 둥굴레에서추출한식 용섬유의조성과생리적특성 13) 등이있다고보고하였다. 그러나 3T3-L1 지방세포에둥굴레추출물의처리에따른항산화효과가지방세포분화, 지질축적억제및체내에너지항상성관련단백질의인산화에미치는영향에대한연구는보고된바없다. 따라서본연구에서는둥굴레추출물의항산화물함량과항산화능을측정하고, 3T3-L1 지방세포에서둥굴레추출물이지방축적과에너지항상성에미치는영향과항산화와항비만효과를실험하였다. 재료및방법 1. 추출물의조제및시약김천산둥굴레뿌리를세척하고껍질을제거한다음, 수증기로 1시간증자하고 55~60 범위에서열풍건조기로 6시간건조하였다. 이과정을 5회반복실시하여추출용시료로사용하였다. 생리활성물질의추출은먼저건조한둥굴레시료 200 g을블랜드로분쇄한후, 실온에서 90% methanol( 3 용량 ) 로 12시간동안진탕 (120rpm) 하여추출하였으며상기과정을 3회수행하여 methanol 추출액 ( 수율 50.6%) 을모았다. 이를여과지로 1회거른후, 45 수조에서감압농축건조시켜 1차추출물을얻고이를증류수에용해하였다. 1차추출물을 chloroform과 ethyl acetate로단계적으로분배추출하고, 감압농축건조하여 chloroform 분획 ( 수율 1.09%) 과 ethyl acetate 분획 ( 수율 0.58%) 을얻었다. 본실험에서는 ethyl acetate 분획시료를동결건조하여시료를얻은후, methanol에용해하여실험에사용하였다. 본실험에사용시약으로 bovine calf serum (BCS), fetal bovine serum (FBS), high-glucose Dulbeco s modified Eagle s medium (DMEM), penicillin streptomycin (P/S), enhanced chemiluminescence (ECL) 은 Thermo Scientific 사 (Rockford, IL, USA) 에서구입하였으며, dexametasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 3-[4,5-dimethylthiazolyl]-2,5 di phenyltetrazolium bromide (MTT), dimethylsulfoxide (DMSO), insulin, oil-red O 시약은 Sigma Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. AMP-activated protein kinase (AMPK), pampk, 항체는 cell signaling technology 사 (USA) 에서구입하였고, proliferater acti vated receptor-γ (PPAR γ), CCAAT/ enhancer binding protein α(c/ebpα), β-actin 1차항체및 2차항체는 Santa Cruz 사 (USA) 에서구입하였다. polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane은 Roche (Mannheim, Germany) 에서구입하였고, 그외언급하지않은시약들은 reagent-grade 로구입하여본실험에사용하였다. 2. 총폴리페놀및플라보노이드함량측정

3 증자둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화억제및지질강하효과 17 총페놀화합물의함량은 folin-ciocalteu 방법으로다음과같이실시하였다 14). 즉, 증류수 3.9 ml에추출물분획을 5~10 mg/ml 농도로희석한용액 100 ul 첨가하고 0.2N folin-ciocalteu 시약 500 ul을혼합하여실온에서 5분간반응한다음, 포화탄산나트륨 500 ul을가하고 30분간더반응시켰다. 725 nm 파장에서흡광도를측정한후, 총페놀함량을 gallic acid equivalent (GAE) mg/100 g dry weight 로표시하였다. 총 flavonoid 함량은 Zhishen 변형비색법으로다음과같이실시하였다 15). 즉, 추출물분획 500 ul에증류수 2 ml과 5% 질산나트륨용액 150 ul를혼합하고실온에서 6분경과후, 10% 염화알루미늄용액 150 ul를첨가하고, 다시 6분후, 4% NaOH 2 ml을가한다음, 증류수로채워 5 ml로희석하였다. 상기용액을완전히섞은후, 실온에서 15분간방치한다음, 510 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 총 flavonoid 함량은 rutin equivalent(re) mg/100 g dry weight 로표시하였다. 3. DPPH 라디칼소거능측정 DPPH 라디칼소거능은 Blois 방법 16) 에따라측정하였다. 추출물분획 100 ul에 0.1mM 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) 3.9 ml을가하고강하게혼합한후, 실온에서 60분간반응하고흡광도를 517 nm 파장에서측정하였다. 대조군은시료대신 ethanol 을동량첨가하여실험하였고, 라디칼소거능은시료첨가구와무첨가구의흡광도를구하여다음과같이백분율로표시하였다. 라디칼소거능 (%) = [( 대조군의흡광도 - 실험군의흡광도 )/100] * 대조군의흡광도 4. ABTS 라디칼소거능측정 ABTS 라디칼양이온소거능은 Kenneth 방법에따라다음과같이실시하였다 17). 즉, 7 mm ABTS와 2.45 mm potassium persulfate 를최종농도로혼합하여실온에서 24시간동안암소에방치하여 ABTS 라디칼양이온을형성시켰다. 이를 734 nm 파장에서흡광도값이 0.70±0.02 범위가되도록 ethanol 로희석하여반응에사용하였다. 희석된 ABTS 시약 2 ml에추출물분획 50 ul를혼합하고실온에서 5분간반응한후, 734 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 라디칼저해능 (inhibition) 은시료첨가구와무첨가구의흡광도를구하여다음과같이백분율로표시하였다. 라디칼소거능 (%) = [( 대조군의흡광도 - 실험군의흡광도 )/100] * 대조군의흡광도 5. FRAP 활성측정총항산화활성평가는 Benzie 등의 FRAP 방법으로평가하였다 18). 즉, 300 mm acetate 완충액 (ph 3.6), 10 mm TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine)/40 mm HCl, 20 mm ferric chloride 을 10: 1: 1의비율로혼합하여 TPTZ 시약 을제조하였다. TPTZ 시약 1.8 ml에추출물분획 200 ul을혼합하고 5분경과후, 594 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 총항산화활성은 Fe(Ⅱ) 표준품 (FeSO 4 ㆍ7H 2O) 으로표준곡선을작성한후, 시료의흡광도를 FRAP value (µm Fe(II)) 로계산하였다. 6. 세포배양본실험에사용한세포주는 American type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA) 에서구입한마우스전지방세포 3T3-L1을사용하였다. 세포는 DMEM 배지 (10% BCS, 1% P/S 포함 ) 를처리하여 37 C, 5% CO 2 배양기 (MCO-15AC, SANYO, Japan) 에서 75% confluence 가되도록배양한후, 배양액을분화유도배양액 (0.5 mm IBMX, 2 µμ DEX, 2 µg/ml insulin / 10% FBS) 으로바꾸어 POE 약물을처리하고 2일간배양하였다. 2일후 2 µg/ml insulin / 10% FBSㆍDMEM배지로교환하며, 약물을이틀에한번씩 5번처리하여 10일동안지방세를분화배양하였다. 7. MTT 염색 3T3-L1 세포를 96well plate에 cells/ml 로분주하여안정화시킨후 POE 추출물을농도별로처리하여 24시간배양한후배지를제거하고 MTT 시약을 0.5 mg/ml 농도로첨가하여반응시켜생성된불용성결정을 DMSO로완전히녹인다음, microplate reader (TECAN Austria Gmbh, Austria) 를이용하여 570 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 8. Oil-Red O 염색세포배양액제거하고 D-PBS 로세척후 10% formaldehyde 가포함된 cacodylate buffer로 4 에서 2 시간고정하였다. 다시증류수로세척하여 oil-red O 염색시약으로염색하고, 세척하여염색된세포를현미경 (CK2, Olympus, Tokyo, Japan) 으로관찰하였으며염색된지방세포의지방함량측정을위해 100% isopropyl alcohol 로지방을추출하여분광광도계 (Lambda UV/VIS, Perkin Elmer, USA) 로 510 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 9. Western blot 적정양의단백질을 10~12% sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE에분리한후, PVDF membrane으로전이시켰다. 단백질전이된 membrane을 5% skim milk를처리하여비특이적인단백질에대한 blocking 을실시하고, C/EBPα, PPARγ, pampk/ampk, β-actin 단백질항체를 4 에서하룻밤각각반응처리하였다. TBS-T로세척한후에각각의단백질항제에알맞은 2차항체로반응하여 ECL 시약을처리하여 X-ray film에감광시켜타겟단백질발현량을관찰하였다.

18 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 2, 2014 10. 통계방법통계처리 (Student s t-test) 는 GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) 을사용하였고, 대조세포에대한유의성검증은 p<0.05 수준에서실시하였다.

둥굴레추출물의총폴리페놀및플라보노이드함량과항산화효과폴리페놀은 reactive free radical 에수소원자를제공하여안정한 non-radical 을만들어항산화작용을나타내며항암및콜레스테롤저하효과등의다양한생리활성을가지는것으로알려져있다. 또한플라보노이드는항균, 항암및항염증활성등이있다 19).

항산화효과는 DPPH 라디칼및 ABTS 라디칼소거능분석으로, 총항산화능은 FRAP분석으로측정하였다. DPPH 분석의경우, 추출물 10 mg/ml 농도에서 92.1±0.6% 의라디칼소거능을나타내었으며, ABTS 분석의경우, 추출물농도 5 mg/ml 에서 84.8±4.1% 의라디칼양이온소거활성을나타내었다.

그결과, 지방세포에처리농도에서세포독성을나타내지않았다. 따라서본실험에서는세포생존율에영향을미치지않는농도인 0.2 mg/ml 농도에서이후실험들을진행하였다 (Fig. 2). Fig. 2. Effect of POE on cell viabilities in 3T3-L1 cells. The data were expressed as the mean ± SD.

4 18 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 2, 통계방법통계처리 (Student s t-test) 는 GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) 을사용하였고, 대조세포에대한유의성검증은 p<0.05 수준에서실시하였다. 밴드의강도은 L process and multi gauge software (Version 2.01, Fujifilm) 을사용하여분석정량하였다. 결과 1. 둥굴레추출물의총폴리페놀및플라보노이드함량과항산화효과폴리페놀은 reactive free radical 에수소원자를제공하여안정한 non-radical 을만들어항산화작용을나타내며항암및콜레스테롤저하효과등의다양한생리활성을가지는것으로알려져있다. 또한플라보노이드는항균, 항암및항염증활성등이있다 19). 본실험에서사용한둥굴레추출물의총폴리페놀및플라보노이드함량과항산화활성측정결과는 Fig. 1-(A), (B) 와같다. 증자둥굴레의 ethyl acetate 추출물의총폴리페놀함량은 50.83±1.52 GAE mg/100g dry weight, 플라보노이드함량은 17.05±2.47 RE mg/100 g dry weight 으로각각나타났다. 항산화효과는 DPPH 라디칼및 ABTS 라디칼소거능분석으로, 총항산화능은 FRAP분석으로측정하였다. DPPH 분석의경우, 추출물 10 mg/ml 농도에서 92.1±0.6% 의라디칼소거능을나타내었으며, ABTS 분석의경우, 추출물농도 5 mg/ml 에서 84.8±4.1% 의라디칼양이온소거활성을나타내었다. 추출물농도 10 mg/ml 에서페놀화합물의총항산화능은 244.8±9.0 µm Fe(II) 로나타났다. (A) 2. 둥굴레추출물의세포생존율에미치는영향 둥굴레추출물 (POE) 처리가 3T3-L1 지방세포에미치는독성영향을알아보기위해 3T3-L1세포에 0.05~1 mg/ml 농도의 POE를각각처리하고 MTT 염색법을이용하여세포생존율을측정하였다. 그결과, 지방세포에처리농도에서세포독성을나타내지않았다. 따라서본실험에서는세포생존율에영향을미치지않는농도인 0.2 mg/ml 농도에서이후실험들을진행하였다 (Fig. 2). Fig. 2. Effect of POE on cell viabilities in 3T3-L1 cells. The data were expressed as the mean ± SD. (n=3) from three independent experiments. NS, no significance. 3. 둥굴레추출물 (POE) 이 3T3-L1 세포의지방 축적에미치는영향 POE 처리로지방분화및지방축적에미치는영향을조사하기위해서 oil-red O 염색법으로세포내지방입자의크기를관찰한결과, 0.2 mg/ml 의농도에서둥굴레추출물의지방축적억제정도는둥굴레추출물을처리하지않고용매만처리한대조세포에비하여유의적수준 (p<0.05) 의억제효과를나타냈다 (Fig. 3). (B) Fig. 1. Contents of polyphenol compounds and antioxidant activities in ethyl acetate extracts of P. odoratum on the condition for steaming. (A) Total flavonoids and phenolics contents were measured by folin-ciocalteu method and Davis method. (B) DPPH radical scavenging activity, ABTS inhibition and FRAP were measured using the Lambda 35 UV visible spectrophotometer, respectively. Date are presented as mean ± SD. (n=3) from three independent experiments. Fig. 3. Effect of POE on lipid accumulation in 3T3-L1 cells. 3T3-L1 cells were treated with 0.2 mg/ml POE. At 10 th day after differentiation, cells were fixed and stained with oil red O dye. Images of representative cells captured with a microscope, scanned, and quantified by the lipid accumulation using spectrophotometer. The extent of lipid accumulation was expressed as the percentage of control. The data were expressed as the mean ± SD. (n=3) from three independent experiments. * p<0.05, significant between the vehicle control and POE treated cells

증자둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화억제및지질강하효과 19 4. 둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화전 사인자및에너지항상성단백질발현에미치는영향 POE 처리가 3T3-L1세포에서비만관련지표인초기분화전사인자 C/EBPα, PPARγ 발현과세포내에너지항상성조절인자인 AMPK 인산화에대한영향을확인하기위해 western blot을수행하였다.

. Fig. 4. Effects of POE on C/EBPα, PPARγand phosphorylation of AMPK protein expressions in 3T3-L1 cells treated with/without 0.2 mg/ml of POE.

5 증자둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화억제및지질강하효과 둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화전 사인자및에너지항상성단백질발현에미치는영향 POE 처리가 3T3-L1세포에서비만관련지표인초기분화전사인자 C/EBPα, PPARγ 발현과세포내에너지항상성조절인자인 AMPK 인산화에대한영향을확인하기위해 western blot을수행하였다. 그결과, 3T3-L1 지방세포가분화하는동안 POE 처리세포는둥굴레추출물을처리하지않고용매만처리한대조세포에비하여세포내의에너지상태와관련있는 AMPK 인산화활성뿐만아니라초기지방세포분화및지방합성관련인자인 C/EBPα, PPARγ의발현이유의적인수준 (p<0.05) 으로억제되었다 (Fig. 4). Fig. 4. Effects of POE on C/EBPα, PPARγand phosphorylation of AMPK protein expressions in 3T3-L1 cells treated with/without 0.2 mg/ml of POE. After 5 days, the protein expression levels of C/EBPα, PPARγand AMPK phosphorylation were measured using western blot analysis. Total proteins were isolated and subjected to SDS-polyacrylamide gels, followed by Western blotting using the indicated antibodies and an ECL detection system. β-actin, AMPK was used as an internal control. Densitometry was performed using L Process and Multi Gauge software (Version 2.01, Fujifilm), and represent the average densitometric analyses as compared with β-actin. The data were expressed as the mean ± SD. (n=3) from three independent experiments. * p<0.05, significant between the vehicle control and POE treated cells 고찰 대사성잘환인제2형당뇨병과밀접한관련이있는비만은장기적인치료와관찰을요구하는만성질환이다 20). 비만은에 너지흡입과소비의불균형으로체지방의과잉축적으로체중증가와혈중지방양이증가하며 21), 고혈압, 제2형당뇨병, 비알코올성지방간질환, 다낭성난소증후군, 고지혈증및관상동맥심장질환과같은각종질환의발병에영향을미치는것으로보고되고있다 22). 비만은한의학적인관점에서그원인을주로기허 ( 氣虛 ), 담습 ( 痰濕 ), 다식 ( 多食 ) 등으로보며이는주로인체의오장육부중비장과위장의음식물이나영양물질의이동기능의실조로인한수습 ( 水濕 ) 이나담탁 ( 痰濁 ) 의형성으로인한발생된다고본다. 동의보감에서는 비만이수명을단축시키며, 섭취하는곡기를그사람의원기가온전히감당하지못해서생기기도하고, 담이원인이되어발병한다 고도하였다 23). 비만의치료법으로허증 ( 虛證 ) 은익기 ( 益氣 ), 보신 ( 補腎 ), 건비 ( 建脾 ) 시키며, 실증 ( 實證 ) 은거습 ( 祛濕 ), 화담 ( 化痰 ), 활혈 ( 活血 ), 이수 ( 利水 ) 하는방법을주로활용하였다 24). 증자둥굴레의 ethyl acetate 분획추출물에는폴리페놀과플라보노이드가존재하는것으로나타났다. Gallic acid와 rutin을각각표준물질로사용하였다. 폴리페놀과플라보노이드는식물이갖고있는생리활성물질로항산화활성을포함하는다양한기능을나타낸다. 둥굴레 ethyl acetate 분획추출물의경우에도높은 DPPH 라디칼소거능과 ABTS 라디칼양이온소거능을나타냈으며, FRAP 활성측정결과총항산화력역시높은수치를보였다. 따라서둥글레 ethyl acetate 분획추출물의항산화능이확인된둥굴레추출물이지방세포분화및지방축적억제효과를나타낼것으로예상되어 3T3-L1 지방세포의세포생존율과세포에영향을미치지않는 0.2 mg/ml 농도에서둥굴레추출물 (POE) 을처리하여지방세포의분화정도와지방축적정도를실험하였다. 본실험에서사용한 0.2 mg/ml 처리농도는천연물추출효능검정실험에서통상적으로처리하는농도로전등 25) 의논문을참고하였다. 결과 3T3-L1 지방세포에서대조세포에비해둥굴레처리지방세포에서지방생성및지방축적이억제되었다. 중성지방은영양상태, 또는다양한호르몬 ( 글루코콜티코이드, 에피네프린, 글루카곤등 ) 의자극에의해지방세포내의 HSL (hormone sensitive lipase) 이활성화되어지방산과글리세롤로분해되어분비되는데이때분비되는지방산이나글리세롤의수준으로지방세포내의지방분해정도를알수있다 26). 지방세포분화에관여하는 C/EBPα, PPARγ발현은지방세포분화에중요한역할을하는초기전사인자단백질이로지방세포의비대 (hypertrophy) 와과형성 (hyperplasis) 을유도한다 27). 주로지방조직에발현되는 PPARγ는 glucose 신진대사를조절하고이것의활성은인슐린감도를증가시킨다 28). PPARγ와 C/EBPα는인슐린신호전달과관련된유전자의발현과성숙한지방세포에서포도당과지질대사를조절하여분화를더욱촉진시켜분화과정을완성시킨다 29). 따라서 0.2 mg/ml POE 처리한 3T3-L1 분화지방세포에서이들단백질발현의유의적감소결과는둥굴레추출물이지방세포에서발현을억제하여지방축적및지방분화를억제하는것으로보인다. 이전의한약을이용한연구보고에서 C/EBPα, PPARγ발현억제가지방세포분화능을감소시켜비만억제에효과적이라고보고된바있어본연구와도일치하는결과이다 30,31). 또한, AMPK는세포내에너지항상성을유지 32) 시키고이것의활성화는포도당이용및지방산산화증가와간에서의지방합성및포도

6 20 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 2, 2014 당신생억제그리고췌장에서의인슐린분비를조절하는중요한매개인자로작용 33) 한다. 본실험에서 POE 처리가지방축적을저해할뿐만아니라, 체내에너지항상성조절에대한영향을확인하기위하여지방세포인 3T3-L1 세포에서 western blot을통해지방세포의분화초기전사인자인 C/EBPα, PPARγ의발현억제를통하여지방분화억제에도관여한다고보여진다. AMPK 인산화발현정도를측정한결과, 대조세포에비하여 POE 처리세포에서 AMPK 인산화단백질발현이증가하는것을확인하였다. 이상의결과를종합하여보면, POE 처리가 3T3-L1 지방세포에서중성지방생성및축적을억제시키고, AMPK 인산화수준을증가시킴으로서세포내에너지항상성을유지시키므로혈액내포도당이용의증가를통해혈당강하효과가있음을확인함으로써 POE는비만뿐만아니라제2형당뇨병을효과적으로예방하거나개선시킬수있을소재로활용될수있을것으로사료된다. 그러나앞으로더세부적인기전연구및동물실험등의추가연구가뒷받침되어야할것으로생각된다. 결론 본연구에서증자둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화억제및지질강하효과를관찰하여다음과같은결론을얻었다. 1. 증자둥굴레추출물 (POE) 는총폴리페놀과프라보노이드함량이 50.83±1.52 GAE mg, 17.05±2.47 RE mg을각각포함하고있었다. DPPH와 ABTS 라디칼소거능은 92.1±0.6%, 84.8±4.1% 로각각나타내었다. 페놀화합물의총항산화능은 244.8±9.0 µm Fe(II) 로나타내어 POE의항산화력을관찰하였다. 2. 증자둥굴레추출물는 0.05 mg/ml~0.5 mg/ml 처리농도에서 3T3-L1 세포에독성을나타내지않았다. 3. POE의 Oil-red O 염색결과 0.2 mg/ml 의농도에서지방축적억제정도가대조세포에비하여유의적으로지방축적억제효과를보였다. 4. POE 처리가 3T3-L1 세포에서비만관련지표인초기분화전사인자 C/EBPα, PPARγ 발현이유의적인수준 (p<0.05) 으로억제되었고, 세포내에너지항상성조절인자인 AMPK 인산화수준은 POE 처리세포에서대조세포에비하여유의적인수준 (p<0.05) 으로증가하였다. 이상의결과에서증자둥굴레추출물 (POE) 의우수한항산화력을관찰할수있었을뿐만아니라지방세포 3T3-L1 에서초기지방세포분화관련인자인 PPARγ과 C/EBPα 의발현억제및 AMPK의인산화증가로지방세포의분화억제및 3T3-L1 세포내지방합성억제효과가관찰되어항비만예방및치료에대한후보약물로활용될수있을것으로생각된다. 감사의글 본연구는대구 경북지방중소기업청주관 경북지역바이오중소기업을위한기술개발지원사업의사업비지원에의하여이루어졌으며이에감사드립니다. Referenses 1. World Health Organization (WHO). Obesity and overweight in Media centre Korea Centers for Disease Control and Prevention Korea national health and nutrition and examination survey. Ministry of Health and Welfare Korean Diabetes Association. Diabetes factsheet [9 screens]. Available from : URL : pdf 4. Rosen ED, Spiegelman BM. Molecular regulation of adipogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol ; 16 : Morrison RF, Farmer SR. Hormonal signaling and transcriptional control of adipocyte differentiation. J Nutr ; 130(12) : Park YW. Clinical guidelines of treatment of obesity in adults. J Korean Med Assoc ; 46(4) : Lee CB. Daehan plant handbook. Seoul : Hyangmoonsa. 2985: Rural development administration national crop experiment station. Classification of Korean medicinal plant resources. Korea : Ahn DG. Restorative of Korea. Yeollin Chakdle. Seoul : Korea : Lee JH, Lee SR. Analysis of phenolic substance content in Korean plant foods. Korean J Food Sci ; 26(3) : Kim KT, Kim JO, Lee GD, Kwon JH. Antioxidative and nitrite scavenging activities of polygonatum odoratum root extracts with different steaming and roasting conditions. Korean J Food Preserv ; 12(2) : Shu XS, Lv JH, Tao J, Li GM, Li HD, Ma. Antihyperglycemic effects of total flavonoids from Polygonatum odoratum in STZ and alloxan-induced diabetic rats. J Ethnopharmacol ; 124(3) : Lan G, Chen H, Chen S, Tian J. Chemical composition and physicochemical properties of dietary fiber from Polygonatum odoratum as affected by different processing methods. Food Res Int ; 49(1) : Singleton VL, Rossi JA Jr. Colorimetry of total

7 증자둥굴레추출물의 3T3-L1 지방세포에서분화억제및지질강하효과 21 phenollics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic ; 16(1) : Zhishen J, Mengecheng T, Jianming W. The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chem ; 64(12) : Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature ; 25(2) : Beckman KB, Ames BN. The free radical theory of aging matures. Physiol Rev ; 78(2) : Benzie IF, Strain JJ. The ferric reducing ability of pasma (FRAP) as a measure of ''Antioxidant Power'': The FRAP Assay. Anal Biochem ; 239(1) : Cha JY, Kim SY, Jeoung SJ, Cho YS. Effects of hesperetin and naringenin on lipid concentration in oratic acid treated mice. J Life Sci ; 9(4): Korean Society For The Study of Obestity Fact Sheet [5 screens] Available from : URL : http :// 21. Devlin MJ, Yanovski SZ, Wilson GT. Obesity: what mental health professionals need to know. Am J Psychiatry ; 157(6) : Barness LA, Opitz JM, Barness EG. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. Am J Med Genet A ; 143A(24) : Heo J. Donguibogam. Seoul : Bubin publishers : 119, 334, Jo HG, Kim BT. Causes and treatment of obesity and literature review on stage. Korea Inst Sci Technol Inform ; 1 : Jeon SY, Park JY, Kim SO, Lee EL, Koo JS, Kim MR. Water extract of fermented new korean medicinal mixture (F-MAPC) controls intracellula adipogenesis and Glut-4 dependent glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes and L6 myoblasts. Kor J Herbology. 2014;29(1): Slavin BG, Ong JM, Kern PA. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase activity and mrna levels in isolated rat adipocytes. J Lipid Res ; 35(9) : Otto TC, Lane MD. Adipose development: from stem cell to adipocyte. Crit Rev Biochem Mol Biol ; 40(4) : Rangwala SM, Lazar MA. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma in diabetes and metabolism. Trends Pharmacol Sci ; 25(6) : Kwak DH, Lee JH, Kim DG, Kim T, Lee KJ, Ma JY. Inhibitory Effects of Hwangryunhaedok-Tang in 3T3-L1 Adipogenesis by Regulation of Raf/MEK1/ERK1/2 Pathway and PDK1/Akt Phosphorylation. Evid Based Complement Alternat Med ; 2013 : Ikarashi N, Tajima M, Suzuki K, Toda T, Ito K, Ochiai W, Sugiyama K. Inhibition of preadipocyte differentiation and lipid accumulation by Orengedokuto treatment of 3T3-L1 cultures. Phytother Res ; 26(1) : Ntambi JM, Kim YC. Adipocyte differentiation and gene expression. Korean J Nutr ; 130(12) : Guo H, Zhao H, Kanno Y, Li W, Mu Y, Kuang X, Inouye Y, Koike K, Jiang H, Bai H. A dihydrochalcone and several homoisoflavonoids from Polygonatum odoratum are activators of adenosine monophosphate-activated protein kinase. Bioorg Med Chem Lett ; 23 (11): Zhang BB, Zhou G, Li C. AMPK: an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome. Cell Metab ; 9(5) :

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,