대한병리학회지 : 제 37 권제 5 호 2003 The Korean Journal of Pathology. 2003; 37: 성숙 Gerbil의일과성전뇌허혈모델에서해마의지연성신경세포손상에대한 Calcitriol의영향 박혜진 구혜수 한운섭 최경규 1 이화여자

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1 대한병리학회지 : 제 37 권제 5 호 2003 The Korean Journal of Pathology. 2003; 37: 성숙 Gerbil의일과성전뇌허혈모델에서해마의지연성신경세포손상에대한 Calcitriol의영향 박혜진 구혜수 한운섭 최경규 1 이화여자대학교의과대학병리학교실 1 신경과 접수 : 2003년 6월 30일게재승인 : 2003년 10월 6일 책임저자 : 구혜수우 서울시양천구목 6 동 이화여자대학교의과대학병리학교실전화 : Fax: heasoo@ewha.ac.kr * 이연구결과는 2002 년미국신경과학학회 (Society for Neuroscience) 제 32 차회의에서발표하였음. Effects of Calcitriol on Delayed Neuronal Damage of Hippocampus in Transient Global Ischemia Model of Mature Gerbil Hye-Jin Park, Heasoo Koo, Woon Sup Han and Kyung Kyu Choi 1 Departments of Pathology and 1 Neurology, Ewha Womans University College of Medicine, Seoul, Korea Background : It is well documented that calcium ions perform a major role in neuronal degeneration in cerebrovascular disease and the other degenerative diseases, and that 1,25- dihydroxyvitamin D3 (D3) has the dose-dependent protective effects. This study was performed to examine the effects of different D3 dosages against delayed neuronal damage of the hippocampus. Methods : Mature mongolian gerbils were injected with either 0.8 g/kg/day (group 2) for 5 days or 1.0 g/kg/day for 8 days (group 3) prior to the 10 min ligation of the bilateral common carotid arteries. Immunohistochemical expression for the glial cell linederived neurotrophic factor (GDNF), the basic fibroblast growth factor (bfgf) and the plateletderived neurotrophic factor (PDNF) was observed in the D3-injected (0.8 g/kg/day for 5 days) group. Results : Group 2 showed a highly significant attenuation of delayed neuronal damage in the lateral CA1 region at 7 days after reperfusion. Group 3 showed unilateral or bilateral hemispheric infarcts 24 h after the onset of reperfusion. The D3-injected group showed a markedly increased bfgf expression level. Conclusion : The dose-dependent effect of D3 suggests the importance of determining the appropriate D3 dose for clinical applications. Although the mechanism(s) of neuroprotection by D3 remains unclear, D3 may facilitate a reduction in ischemia-induced oxidative stress via the activation of the neurotrophic factors, including bfgf and GDNF. Key Words : Calcitriol-Cerebrovascular Disorders-Hypoxic-Ischemic Brain Injury 허혈성뇌손상은심각한마비증상이나사망을초래하는비가역적이고치명적인질환으로, 2000년통계청발표에의하면사망원인 103항목중 1위로 14.1% 를차지하였다. 허혈성뇌손상은혈관이막혀서발생하는국소병변과중추신경계로가는혈류가전반적으로감소되어발생하는전뇌허혈성병변으로구분한다. 허혈성뇌손상에서발생하는세포손상은허혈의정도와다른여러가지요소에따라서선택적인신경세포괴사 (selective neuronal necrosis) 혹은모든조직의괴사인경색 (infarct) 의형태로나타난다. 신경세포는한번파괴되면재생이불가능한영구세포이므로, 신경세포의손상을억제하는것은허혈성뇌손상에따른후유증을예방하는데매우중요한의미를갖는다. 따라서허혈성뇌병변에서신경세포의손상이발생하는기전을 밝혀내어그발생과정을억제함으로써신경세포손상을방지하기위한시도가계속되고있다. 허혈성뇌병변에서세포손상에관여하는기전은병변의발생기전및병변발생부위에따라차이가있다. Gerbil 의해마에서볼수있는지연성신경세포손상 (delayed neuronal damage 혹은 maturation phenomenon) 은 5분내지 10분간의일과성전뇌허혈후재관류시키는경우에수시간에서수일에걸쳐서서히진행되는선택적신경세포괴사소견으로, 치서류의해마에서처음관찰되었다. 해마의 subicumum-ca1 부위의추체세포는선택적취약성과지연성신경세포손상이가장먼저발생하고가장심한변화를보이는부위이다. 1-3 사람의허혈성뇌병변에서도비슷한현상이관찰되므로지연성신경세포손상에관여하는요소를정확하게파악하는 307

2 308 박혜진 구혜수 한운섭외 1 인 것이환자의치료와예후의판정에중요한역할을할것으로생각한다. 또한신경세포의변성이이와같이천천히진행되는것은허혈후일정기간동안신경세포의괴사가진행되지않는것을의미하므로, 그기간을 therapeutic window 로사용하여지연성신경세포손상을억제할수있는가능성이있다. 이런지연성신경세포손상기전에는허혈후신경세포의활동및예민성증가, 미토콘드리아에있는호흡효소의손상, 칼슘과글루탐산의증가, 세포내산화질소와자유라디칼의증가, 세포자멸사의증가등이관여하는것으로알려졌다 허혈및저산소성병변에서다양한종류의성장인자와신경향성물질이증가되는것이보고되었고, 이들이신경세포손상을억제시키는보호효과가있는것으로알려짐에따라이런물질을이용하여국소허혈혹은전뇌허혈성병변을감소시키려는노력이활발하게진행되어왔다 지연성신경세포손상을일으킨실험동물모델에서도 nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), acidic and basic fibroblast growth factors (FGF), ciliary neurotrophic factors, platelet-derived growth factor (PDGF) 등의물질이신경세포손상을감소시킨다고보고되었다 그러나이런물질은대부분분자량이크고뇌혈관장벽을통과하지못하므로국소투여하든지조직이식을해야하는어려움이있었다. 1,25-dihydroxy-vitamin D3 (1,25(OH)2D3) ( 이하 D3) 는비타민 D가생물학적으로활성화된대사산물이며, 말초조직에서칼슘이온을포함한무기질의조절, 세포의성장과분화, 호르몬의분비에관여하는스테로이드호르몬이다. 23,24 또한 D3는세포내의비타민 D 수용체와결합하여 ligand-activated 전사인자로작용한다. 25 중추신경계에서 D3는미세교세포 (microglia) 에서합성되며, D3 수용체는소뇌, 간뇌, 대뇌피질, 척수, 변연계 (limbic system) 와같은부위에광범위하게분포한다. 25,26 D3를장기간피하투여하면해마 CA1 부위에서노화에의한세포손상이억제되는것이보고되었고, 파킨슨병에서 D3의양이감소되고, 비타민 D로치료하면환자의증상이없어진다는보고가있으며, 해마와중뇌신경세포배양에서 D3가글루탐산과반응성산소족에의한신경세포의손상을억제하는것도알려졌다. 27 또한 D3는아교세포 (glial cell) 에작용하여 glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), NGF, transforming growth factor (TGF)- 2, neurotrophin (NT)3/NT4 등의각종신경향성물질의분비를강력하게유도한다. 28,29 Wang 등 29 은 D3를복강내로투여하는경우대뇌에서 GDNF의발현이현저히증가하며, 중대뇌동맥의결찰에의해발생한경색이감소하는것을보고하였다. 본연구는복강내로투여된 D3가해마의추체세포에서발생하는지연성신경세포손상의진행에서어떤변화를일으키는지를보기위하여시행되었다. 또한 D3에의한혈중칼슘의농도변화를측정하였고, 뇌조직에서 GDNF, bfgf, PDGF 발현의변화를면역조직화학염색을이용하여관찰하였다. 연구대상 재료와방법 본연구에서는 57마리의 mongolian gerbil (Meriones Unguiculaus) 을생후 80일에서 100일사이에 ( 체중 : gm) 암수구분없이사용하였고, 사육기간중음식과물은자유롭게섭취할수있도록하였다. 총 57마리중 44마리는양측총경동맥결찰실험군으로사용하였고, 13마리는혈중칼슘농도측정실험군으로사용하였다. 연구방법 실험동물분류일과성허혈을유발시킨실험동물을세군으로나누었다 (Table 1). 제1군 (n=18) 은대조군으로 5일간연속하여식염수 (154 mm NaCl, Sigma, 1 ml/kg/day) 를복강내로주사하였다. 제5일에양측총경동맥을 10분간결찰한후재관류시켰고, 재관류시작후제1일, 제3일, 제7일에조직검사를시행하였다. 제2군 (n=19) 은양측총경동맥결찰 4일전부터시작하여 5일간연속하여 D3 (Calcitriol, Abbott lab) 를 0.8 g/kg/day (2 g/ ml 0.4 ml/kg/day) 의농도로복강내주사투여를하였고, 제5일에양측총경동맥을 10분간결찰한후재관류시켰다. 제2 군역시재관류시작후제1 일, 제3일, 제7 일에조직검사를시행하였다. 제3군 (n=7) 은 D3를동맥결찰 7일전부터 8일간연속하여복강내로주사하였는데, 주입된 D3의양은 1.0 g/kg/day (2 g/ml 0.5 ml/kg/day) 이었다. 제8일에양측총경동맥을 10분간결찰한후재관류시켰고, 재관류시작후 24시간째에조직검사를시행하였다. 말초혈액채취와혈중칼슘농도측정법혈중칼슘농도는 D3 0.8 g/kg/day (2 g/ml 0.4 ml/ kg/day) 를 5일간복강내로투여한실험군 (n=6) 과식염수를 5일간투여한대조군 (n=7) 에서측정하였다. 관류고정전에심장천자를통하여혈액을채취하였다. 채취한혈액을원심분리기 Table 1. Number of animals used in experimental ischemic groups group treatment days following bilateral CCA ligation (n=18) saline (1 ml/kg/day) days 2 (n=19) D3 (0.8 g/kg/day) days 3 (n=7) D3 (1.0 g/kg/day) 7 8 days CCA, common carotid artery.

3 해마의지연성신경세포손상에대한 Calcitriol 의영향 309 를사용하여 3,000 rpm의속도로 10분간두번돌려서혈청을분리하였다. 분류한혈청은 -20 냉장고에냉동보관하였다. 혈청칼슘농도는화학분석기를사용하여측정하였다. 칼슘이온과 ortho-cresolphthalein complex one의반응에의한생성물의흡수도를 Hitachi 7150 (Japan) 으로판독하여칼슘치를측정하였다. 혈청내자유칼슘이온은 ion selective electrode (Easylyte Calcium, Medica, USA) 및 Na/K/Ca/PH analyzer solution pack (Medica, USA) 을사용하였다. 각실험결과를 Wilcoxon 2-sample test로통계처리하였다. 전뇌허혈의유도 Gerbil의마취는 ketamine (10 mg/ml) 을복강내 (0.09 mg/ kg) 로주입하였고, 뇌세포의허혈성변성에영향을미칠수있는체온을보정하기위하여마취직후부터시술후깨어날때까지 30분이상온도계소식자 (Fruke 52K/J thermocouple, Fruke Inc., USA) 를직장내에삽입하고온열전등 (heat lamp) 으로심부체온을 사이로유지시켰다. 양측전뇌허혈을유도하기위하여 gerbil 을앙와위로고정시키고경부정중선을따라수직으로 1.5 cm 정도피부를절개하였다. 양측총경동맥에서주변의결체조직과미주신경을박리한후동맥류용클립 (Surgita aneurysmal clip, temporary STD type, Mizuko Ikakoryo Inc., Japan) 을사용하여혈류를동시에 10분간차단하였다. 10분후클립을제거하고, 재관류로인한혈관박동이일어나는것을확인하였다. 조직소견관찰방법예정된시간에 ketamine을복강내로주입하여마취시킨후앞가슴을열고심장을거쳐상행대동맥에 24게이지케뉼러를삽입한후결찰하였다. 먼저 0.1% heparin을포함한생리식염수를 2분간관류시켜뇌혈관계에서혈액을제거한후, 고정액 (0.1 M phosphate buffered, 4% paraformaldehyde solution) 을 130 cmh2o의압력으로 30분간관류시켜뇌를고정하였다. 관류고정이끝난 gerbil 을단두하여두개골을제거하고뇌를꺼내어 4% 중성포르마린에하루이상고정시킨후 2 mm 두께로관상절단하였으며, 이들조직절편에서제3뇌실과해마의원하는부위가포함되었는지를육안으로확인하였다. 이후통상적인조직처리과정을거쳐 5 m 내지 6 m의두께로연속절단표본을제작하고, 헤마톡실린-에오진염색으로해마추체세포의변화를관찰하였다. 신경향성물질에대한면역조직검사혈중칼슘농도를측정하기위해서 D3 0.8 g/kg/day (2 g/ ml 0.4 ml/kg/day) 를 5일간투여한실험군 (n=6) 과식염수를 5일간투여한대조군 (n=7) 에서면역조직화학검사를시행하였다. 신경향성물질중에서 GDNF, bfgf, PDNF에대한항체를사용하여 D3의복강내투여가뇌조직의신경향성물질 의발현에변화를일으키는지를관찰하였다. 면역조직화학검사는 Hsu 및 Raine (1984) 의방법을변형한 peroxidase-antiperoxidase법을사용하였다. 간단히기술하면탈파라핀한 5 m 절편을일차항체인 GDNF (1:50; polyclonal, sc-328, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), bfgf (1:80; polyclonal, Santa Cruz Biotechnology), PDGF (1:50; polyclonal, Santa Cruz Biotechnology) 와 90분간반응시킨후 LSAB kit (DAKO, Santa Barbara, CA, USA) 를사용하여 peroxidase-antiperoxidase complex와반응시켰다. Peroxidase 반응은연결항체와 streptavidin으로각각 20분보온한후 AEC (3-aminoethyl 9-carbasol) 와보온하였다. 세포의핵을보기위하여 Meyer 헤마톡실린으로염색하였다. 일차항체를비면역화혈청으로대치하여음성대조군으로사용하였다. 신경세포손상평가재관류제1일과제3일에는해마의 CA1 중에서 subiculum- CA1 부위및 CA2-3 부위에서신경세포의변성을광학현미경으로측정하였다. 제7일에는해마의 CA1과 CA2-3 부위에서신경세포의변성을측정하였는데, CA1 부위를 subiculum-ca1 과 lateral CA1로구분하였다. 이때관찰자를달리하여각절편을검사하였다. 각부위에서변성을보이는세포와정상세포의비를구하였고신경세포손상정도를다음과같이평가하였다. 손상이관찰되지않는경우를변화없음 (0), 각부위에서호산성신경세포변성이나세포괴사혹은세포자멸사가전체신경세포의 25% 미만에서관찰되는경우를경도 (1+), 25% 에서 50% 미만에서관찰되는경우를중등도 (2+), 50% 이상의신경세포가변성을보이는경우를중증 (3+) 으로분류했다. 각실험군에서얻은결과를 Mantel-Haenszel chi-square test를이용하여분석하였다. 결과 Calcitriol에의한체중및혈중칼슘치변화 5일간 D3을복강내주사한실험군은식염수를주사한대조군에비해현저하게높은총칼슘치를보였다 (D3 투여군, 15.3± 1.4 mg/dl, n=6; 대조군, 10.2±0.7 mg/dl, n=7, Wilcoxon 2-sample test, t-test approx. significance=0.0125). 자유칼슘치 (Ca 2+ ) 역시실험군이대조군에비해현저하게높았다 (D3 투여군, 1.6±0.2 mmol/l, n=6; 대조군, 1.2±0.2 mmol/l, n=7, Wilcoxon 2-sample test, t-test approx. significance= ). 체중의변화는실험군과대조군사이에의미있는차이가없었다.

310 박혜진 구혜수 한운섭외 1 인 A B Fig. 1. Neuronal changes seen in 10-min bilateral global ischemia with reperfusion for 24 hour in D3 injected experimental group.

Number of animals with histological grading of the damage in hippocampal neurons at 1 day following bilateral common carotid artery ligation Sub-CA1: subiculum-ca1. *: p=0.065, **: p=0.074.

4 310 박혜진 구혜수 한운섭외 1 인 A B Fig. 1. Neuronal changes seen in 10-min bilateral global ischemia with reperfusion for 24 hour in D3 injected experimental group. (A) Neurons in subiculum-ca1 show fragmentation, clumping, and pyknosis of nucleus. (B) Neurons in CA2-3 show eosinophilic inclusion bodies (arrows). Table 2. Number of animals with histological grading of the damage in hippocampal neurons at 1 day following bilateral common carotid artery ligation Sub-CA1: subiculum-ca1. *: p=0.065, **: p= 조직소견 None (0) Mild (1+) Moderate (2+) Severe (3+) Saline (n=5) Sub-CA1* CA2-3** D3 (n=6) Sub-CA1* CA2-3** 대조군 ( 제 1 군 ) 과 5 일간 D3 를주사한실험군 ( 제 2 군 ) 재관류제1일에 subiculum-ca1 부위의추체세포가호산성세포변화나분절과응집과같은변성을보이거나호산성봉입체를갖고있었고, CA2-3 부위의신경세포에서는호산성봉입체가관찰되었다 (Fig. 1). Subiculum-CA1 부위의신경세포손상과 CA2-3 부위에서호산성봉입체를보이는세포의빈도는 D3을 5일간주사한실험군과 5일간식염수를주사한대조군사이에유의한차이가없었다 (Table 2). 재관류제3일에실험군과대조군에서신경세포괴사및세포자멸사가 subiculum-ca1 및 CA2-3 부위에서관찰되었고, lateral CA1 부위에는변성된세포가드물게보였지만비교적잘보존되었다 (Fig. 2). Subiculum-CA1 및 CA2-3 부위의신경세포변화는실험군과대조군사이에유의한차이가없었다 Table 3. Number of animals with histological grading of damage in hippocampal neurons at 3 days following bilateral common carotid artery ligation Sub-CA1: subiculum-ca1. *: p=0.102, **: p= None (0) Mild (1+) Moderate (2+) Severe (3+) Saline (n=5) Sub-CA1* CA2-3** D3 (n=6) Sub-CA1* CA2-3** (Table 3). 재관류제7일에 CA1 부위에서점차진행되는지연성신경세포괴사가대조군 8마리중 5마리에서관찰된반면 (Fig. 3), 실험군에서는지연성신경세포괴사가 7마리모두에서관찰되지않았다 (p=0.013). 신경세포의변성을해마의부위별로따로비교했을때, lateral CA1 부위의신경세포의손상은대조군에비해실험군에서유의하게감소된반면, subiculum-ca1 및 CA2-3 부위의신경세포손상의빈도는대조군과실험군사이에유의한차이가없었다 (Table 4). 8일간 D3 주사한실험군 ( 제3군 ) 제3군은제1군이나제2군과다르게재관류후 24시간에심한허혈성경색을보였다. 전체 7마리중세마리에서좌측대뇌반구전부위경색과함께우측대뇌반구의부분경색이발생했고, 한마리에서양측대뇌반구를광범위하게침범하는경색이발생

해마의지연성신경세포손상에대한 Calcitriol 의영향 311 A B Fig. 2. Neuronal changes seen in 10-min bilateral global ischemia with reperfusion for 3 days in D3 injected experimental group.

Number of animals with histological grading of damage in hippocampal neurons at 7 days following bilateral common carotid artery ligation None (0) Mild (1+) Moderate (2+) Severe (3+) Saline (n=8)

5 해마의지연성신경세포손상에대한 Calcitriol 의영향 311 A B Fig. 2. Neuronal changes seen in 10-min bilateral global ischemia with reperfusion for 3 days in D3 injected experimental group. Neurons in subiculum CA1 (A) and CA2-3 (B) show pyknosis and karyorrhexis of nuclei. Table 4. Number of animals with histological grading of damage in hippocampal neurons at 7 days following bilateral common carotid artery ligation None (0) Mild (1+) Moderate (2+) Severe (3+) Saline (n=8) Sub-CA1* Lateral CA1** CA2-3*** D3 (n=7) Sub-CA1* Lateral CA1** CA2-3*** Sub-CA1: subiculum-ca1. *: p=0.405, **: p=0.011, ***: p= 하였다. 두마리에서좌측대뇌반구에국한된경색이발생했다. 나머지한마리는특기할뇌병변이없었다. 신경향성물질에대한면역조직화학검사소견대조군에비하여 D3 투여군에서 bfgf 발현이전부위에서심하게증가되었다. 별세포의세포질과신경망이강한 bfgf 양성반응을보였다 (Fig. 4). GDNF와 PDGF의발현은 D3 투여군과대조군사이에의미있는차이가없었다. 고찰 허혈성뇌병변에서발생하는신경세포손상의기전을밝히기 위해실험동물을이용한다양한연구가시도되어왔는데, gerbil 은경동맥과후대뇌동맥을연결하는후교통동맥이발달되어있지않기때문에전신저혈압의유발이나추골동맥폐쇄술등의복잡한시술없이양측총경동맥의결찰에의해전뇌허혈성병변을만들수있다. 본연구의대조군과같이생리식염수를주사한 gerbil 에서 10분간양측총경동맥을결찰후재관류시키면해마의추체세포가점점진행되는지연성신경세포손상을보였다. 해마의 subiculum-ca1에있는추체세포는재관류 6시간에이미분절화, 응집과같은소견을보이면서파괴되기시작하고재관류후 3일에는대부분의추체세포가없어지는반면, lateral CA1 부위에서는추체세포가비교적잘유지되었다. 3 그러나, 재관류후 5일이후에는 CA1에있는모든추체세포가파괴되고반응성별세포가증식하였으므로, subiculum-ca1 부위에있는추체세포가비교적빨리파괴되는반면, lateral CA1 부위의추체세포는천천히파괴되어특징적인지연성세포손상을보이는것을알수있었다. 본연구에서제2실험군과대조군에서발생하는해마의신경세포손상을비교하였을때재관류후제1 일및제3 일에는비슷한정도의신경세포변성을보였다. 제7일에는대조군이 CA1 전부위를침범하는전형적인지연성신경세포변성을보인반면, D3를투여한제2실험군의경우 7일에도 lateral CA1 부위에있는추체세포는전형적인지연성신경세포변성을보이지않았다. 해마의각부위에서발생하는신경세포의변성을부위별로비교했을때, subiculum-ca1 부위와 CA2-3 부위의변화는 1일, 3일, 7일에모두실험군과대조군사이에차이가없었고, lateral CA1 부위에있는신경세포의변성은 7일에실험군

D3 injected experimental group (C, D). (A) Control group shows diffuse degeneration of neurons in CA1.

(C, D) D3 injected experimental group shows well preserved neurons in CA1 and CA2-3 area. 에서유의하게감소되었다.

8 g/kg/day의농도로 5일간전처치한경우에혈중칼슘과칼슘이온의농도는대조군에비해의미있게증가되었다. 예비실험에서 Wang 등 29 이사용했던같은농도 (1.

6 312 박혜진 구혜수 한운섭외 1 인 A B C D Fig. 3. Neuronal changes seen in 10-min bilateral global ischemia with reperfusion for 7 days in control group (A, B) and D3 injected experimental group (C, D). (A) Control group shows diffuse degeneration of neurons in CA1. (B) Higher magnification shows necrotic or apoptotic neurons. (C, D) D3 injected experimental group shows well preserved neurons in CA1 and CA2-3 area. 에서유의하게감소되었다. 이런소견은해마에서발생하는허혈성신경세포의변성에서 D3에의한신경세포의보호기전이 3일이후에진행되는 lateral CA1 부위에있는추체세포의손상을억제하는데주로작용하는것을의미한다. 본연구에서 D3를 0.8 g/kg/day의농도로 5일간전처치한경우에혈중칼슘과칼슘이온의농도는대조군에비해의미있게증가되었다. 예비실험에서 Wang 등 29 이사용했던같은농도 (1.0 g/kg/day, 본연구의제3군에해당 ) 로 8일간 D3를주입한결과대부분의 gerbil 이심한증상을보였고, 재관류후 24시 간에시행한조직검사에서한마리를제외한나머지 6마리가한쪽혹은양쪽대뇌반구를광범위하게침범하는경색의소견을보였다. 이와같이동량의 D3를투여했을때결과가다른것은사용한동물의종류와실험방법이다르기때문으로해석하였다. 제3 군에서는혈중칼슘농도를측정하지않아서정확한수치는알수없지만제2군보다는많이올라갔을것으로추정할수있다. 이와같이 D3 투여량에따라서신경세포의변성이억제되거나오히려더심한세포손상을초래하므로, D3에의한신경세포보호효과는 D3 투여량에따라다르게나타나는것을알

이와같은연구결과는 Brewer 등 9 이흰쥐해마신경세포의배양에서 1-100 nm의낮은농도의비타민 D가 NMDA 와글루탐산에의한신경흥분성손상 (excitotoxic insults) 에서신경세포를보호하는반면, 500-1,000 nm의높은농도의비타민 D는보호작용이없는것을관찰하여비타민 D의보호효과가농도에따라달라지는것을보고한바와같았다.

7 해마의지연성신경세포손상에대한 Calcitriol 의영향 313 A B Fig. 4. Immunohistochemical findings with bfgf antibody in D3 injected gerbil (A) and the control (B). The bfgf expression was markedly increased in cytoplasm of thalamic astrocytes as well as in background in D3 injected gerbil compared with the control. 수있다. 이와같은연구결과는 Brewer 등 9 이흰쥐해마신경세포의배양에서 nm의낮은농도의비타민 D가 NMDA 와글루탐산에의한신경흥분성손상 (excitotoxic insults) 에서신경세포를보호하는반면, 500-1,000 nm의높은농도의비타민 D는보호작용이없는것을관찰하여비타민 D의보호효과가농도에따라달라지는것을보고한바와같았다. 또한글루탐산에의한세포변성을일으킨중뇌세포배양에서 D3를전처치하는경우에도저농도에서는농도에따라보호효과가증가하지만, 1,000 nm의다량을투여하는경우에는보호효과가감소되었다는연구보고가있었다. 30 이런소견은다량의 D3가보호작용을오히려억제하든지아니면신경독성을일으킨다는것을의미한다. 따라서 D3를사용할때적당한투여량을결정하는것이매우중요하다. D3에의한신경세포보호작용의기전은아직확실하게밝혀지지는않았다. 그러나 D3를투여한후에일정시간이지난후에만보호효과가있는것과단백질합성을방해하는물질인 cycloheximide를같이투여하면 D3의보호효과가억제되는소견으로보아, D3 투여에의해보호효과를갖는어떤종류의단백질이합성되는것으로생각할수있다. 30 D3로전처치하면칼슘 ionophore인 A23187에 10분간노출해서발생한세포독성이나반응성산소족에의한세포독성도억제할수있다. 30 또한해마신경세포배양에서 D3는말초조직에서와마찬가지로 L-type voltage-sensitive Ca 2+ channels (L-VSCCs) 를억제함으로써신경세포를보호하는소견을보였다. 9 L-VSCCs는노화된해마에서증가되며신경세포의취약성과관련이있는것으로알려졌다. 9 그러나이런 D3의보호작용과반대로 D3가세포자멸사를 일으키는단백질을증가시켜서세포자멸사를증가시키는것도보고되었다. 10 허혈및저산소성상태에서세포밖에증가되는글루탐산과다른종류의신경흥분성아미노산은그들의수용체에결합하여세포내에 Ca 2+, Na+, inositol 1,4,5-triphosphate (IP3), diacylglycerol (DAG) 등의물질을증가시켜서세포의손상을일으키게된다. 그중에서칼슘이온은가장많이증가하며세포의변성에서중요한역할을하는것으로잘알려져있다. 실험적으로혈중칼슘이온이증가되면대뇌의허혈-저산소성병변에서세포자멸사가증가되는것이보고된반면, 심장근에서허혈성병변을일으키기전에칼슘이온을투여하는경우에병변이감소되는것도보고되었다. 6-8 이런보호효과는칼슘이온에의한전처치효과 (preconditioning effect) 로해석되었다. D3가신경향성물질을증가시키는기전은아직확실하게알려지지않았다. 칼슘이온에영향을별로주지않는종류의 D3를투여하는경우에도 GDNF 분비가증가하며, 칼슘 ionophore 인 A23187이인간의 U-87 교모세포종세포주에서 GDNF 발현을증가시키지않는소견으로보아, D3 투여에서신경향성물질이증가하는기전에칼슘이온이관여하지않는다른기전이작용하는것을알수있다 근래에 TGF- 와비타민 D 신호전달체계사이에밀접한관계가있는것이밝혀졌다. 28 이와같이 D3 투여는신경세포보호작용을갖는동시에신경세포의손상을일으키는상반된두가지영향을주게된다. 따라서칼슘이온을많이증가시키지않고신경향성물질의분비를촉진하는 D3 혹은다른종류의물질을적당한시간에적당량을사용하는것이중요하다. 또한 D3의기능을선택적으로항진시키는물질을 D3

8 314 박혜진 구혜수 한운섭외 1 인 와같이투여하면적은양의 D3를투여해도신경세포를보호하는효과를얻을수있으리라생각한다. 본실험에서면역조직화학검사방법으로관찰한 GDNF, bfgf, PDGF 발현에서 D3 투여가 bfgf를전반적으로현저히증가시키는것을알수있었다. bfgf는 superoxide dismutase와 glutathione reductase와같은자유기를제거하는효소의역할을촉진하여반응성산소족이관여하는세포손상을억제한다. GDNF와 PDGF의발현은대조군과차이가없었다. 참고문헌 1. Kirino T. Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia. Brain Res 1982; 239: Nitatori T, Sato N, Waguri S, et al. Delayed neuronal death in the CA1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis. J Neurosci 1995; 15: Koo H. Immunohistochemical expression of phospholipase C in global and focal ischemic encephalopathy in gerbil: Relationship with morphological changes. J Korean Med Sci 1996; 11: Choi DW. Calcium-mediated neurotoxicity: Relationship to specific channel types and role in ischemic damage. Trends Neurosci 1988; 11: Abe K, Aoki M, Kawagoe J, et al. Ischemic delayed neuronal death. A mitochondrial hypothesis. Stroke 1995; 26: Przyklenk K, Hata K, Kloner R. Is calcium a mediator of infarct size reduction with preconditioning in canine myocardium? Circulation 1997; 96: Yang CS, Lin NN, Tsai PJ, Liu L, Kuo JS. In vivo evidence of hydroxyl radical formation induced by elevation of extracellular glutamate after cerebral ischemia in the cortex of anesthetized rats. Free Radic Biol Med 1996; 20: Budd SL. Mechanism of neuronal damage in brain hypoxia/ischemia: focus on the role of mitochondrial calcium accumulation. Pharmacol Ther 1998; 80: Brewer L, Thibault V, Chen K-C, Langub M, Landfield P, Porter N. Vitamin D hormone confers neuroprotection in parallel with downregulation of L-type calcium channel expression in hippocampal neurons. J Neurosci 2001; 21: Baudet C, Chevalier G, Chassevent A, et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 induces programmed cell death in a rat glioma cell line. J Neuroscience Research 1996; 46: Iihara K, Sasahara M, Hashimoto N, Hazama F. Induction of plateletderived growth factor -receptor in focal ischemia of rat brain. J Cereb Blood Flow Metab 1996; 16: Abe K, Hayashi T, Itoyama Y. Amerlioration of brain edema by topical application of glial cell line-derived neurotrophic factor in reperfused rat brain. Neurosci Lett 1997; 231: Wang Y, Lin SZ, Chiou AL, Williams LR, Hoffer BJ. Glial cell linederived neurotrophic factor protects against ischemia-induced injury in the cerebral cortex. J Neurosci 1997; 17: Kitagawa H, Hayashi T, Mitsmoto Y, Koga N, Itoyama Y, Abe K. Reduction of ischemic brain injury by topical application of GDNF after permanent middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke 1998; 29: Verity A, Wyatt T, Lee W, Hajos B, Baecker P, Eglen R. Differential regulation of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) expression in human neuroblastoma and glioblastoma cell lines. J Neurosci Res 1999; 55: Chiang YH, Lin SZ, Borlongan CV, Hoffer BJ, Morales MF, Wang Y. Transplantation of fetal kidney tissue reduces cerebral infarction induced by middle cerebral artery ligation. J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19: Shigeno T, Mima T, Takakura K, et al. Amerioration of delayed neuronal death in the hippocampus by nerve growth factor. J Neurosci 1991; 11: Sasaki K, Oomura Y, Suzuki K, Hanai K, Yagi H. Acidic fibroblast growth factor prevents death of hippocampal CA1 pyramidal cells following ischemia. Neurochem Int 1992; 21: Nakata N, Kato H, Kogure K. Protective effects of basic fibroblast growth factor against hippocampal neuronal damage following cerebral ischemia in the gerbil. Brain Res 1993; 605: Tsukahara T, Yonekawa Y, Tanaka K, et al. The role of brain-derived neurotrophic factor in transient forebrain ischemia in the rat brain. Neurosurgery 1994; 34: Wen TC, Matsuda S, Yoshimura H, Kawabe T, Sakanaka M. Ciliary neurotrophic factor prevents ischemia-induced learning disability and neuronal loss in gerbils. Neurosci Lett 1995; 191: Iihara K, Hashimoto N, Tsukahara T, Sakata M, Yanamoto H, Taniguchi T. Platelet-derived growth factor-bb, but not -AA, prevents delayed neuronal death after forebrain ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metabolism 1997; 17: DeLuca HF, Zierold C. Mechanisms and functions of vitamin D. Nutr Rev 1998; 56: S Brown AJ, Dusso A, Slatopolsky E. Vitamin D. Am J Physiol 1999; 277: F Prufer K, Veenstra TD, Jirikowski GF, Kumar R. Distribution of 1,25(OH)2D3 receptor immunoreactivity in the rat brain and spinal cord. J Chem Neuroanatomy 1999; 16: Veenstra TD, Prufer K, Koenigsberger C, Brimijioin SW, Kumar R. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 receptor in the central nervous system of the rat embryo. Brain Res 1998; 804:

9 해마의지연성신경세포손상에대한 Calcitriol 의영향 Landfield PW, Cadwallader-Neal L. Long-term treatment with calcitriol retards a biomarker of hippocampal aging in rats. Neurobiology of Aging 1998; 19: Yanagisawa J, Yanagi Y, Masuhiro Y, et al. Convergence of transforming growth factor-bata and vitamin D signaling pathways on SMAD transcriptional coactivators. Science 1999; 283: Wang Y, Chiang YH, Su TP, Hayashi T, Morales M, Hoffer BJ, Lin SZ. Vitamin D attenuates cortical infarction induced by middle cerebral arterial ligation in rats. Neuropharmacology 2000; 39: Ibi M, Sawada H, Nakanishi M, et al. Protective effects of 1, 25- (OH)2D3 against the neurotoxicity of glutamate and reactive oxygen species in mesencephalic culture. Neuropharmacology 2001; 40:

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(01) hwp Journal of Life Science 2013 Vol. 23. No. 2. 157~166 ISSN (Print) 1225-9918 ISSN (Online) 2287-3406 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2013.23.2.157 α μ δ κ 158 생명과학회지 2013, Vol. 23. No. 2 Journal of