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1 Journal of Life Science 2016 Vol. 26. No ~1073 ISSN (Print) ISSN (Online) DOI : Effects of Fermented Dandelion (Taraxacum coreanum) Extract on Male Climacteric Syndrome Hak Su Lee, Yeon Su Baek, Ye Seul Kim and Hyun Pyo Kim* Department of Biomedical Science, Jungwon University, Chungbuk , Korea Received June 21, 2016 /Revised August 9, 2016 /Accepted August 17, 2016 Male climacteric syndrome, andropause, or testosterone deficiency syndrome (TDS) is one of the new health issues in elderly men. It is a natural phenomenon that happens with age in men, which is clinically characterized by a decline in levels of serum testosterone resulting in a significantly decreasing of physical and mental activities. The aim of this study was to investigate the putative alleviative effects of dandelion extract on the symptoms of TDS by increasing serum testosterone levels and compare the efficacy between dandelion extract (DE) and fermented dandelion extract (FDE). After daily intake of DE and FDE for 4 weeks, serum testosterone levels, muscles of vastus lateralis, forced swimming time, total sperm counts, and motile sperm counts were significantly increased in older rats (22 weeks). Additionally, SHBG, epididymal fat pad, total serum cholesterol and triglyceride were significantly decreased in DE and FDE fed groups. However, PSA levels were not different among all groups. Furthermore, DE and FDE enhanced the expression of genes related to testosterone biosynthesis in TM3 Leydig cells. Overall, these positive effects on andropause were greater in FDE compared to DE. These results suggest the potential of FDE as a safe and efficacious natural material for recovering testosterone levels and reducing andropause symptoms. Key words : Dandelion, male climacteric syndrome, Taraxacum coreanum, testosterone, testosterone deficiency syndrome 서 현대사회의급속한경제성장과의학발달은인간의평균 수명을증가시키는데큰도움을주었고, 인구의고령화에따 라노인건강에많은관심을가지게되었다. 그에따라최근 건강을위협하는질병에대한치료뿐만아니라삶의가치를 높이는것은중요한의미를가지고있다. 삶의가치를높여준 다 라고하는것은노후에활력있는건강상태를유지혹은 노화를지연시키는것인데, 고령화사회가됨에따라젊은세 대의사람들도이러한문제에많은관심을가지고있다. 그 중노화로인하여대부분의남녀들이공통적으로겪게되는 대표적인증상중에갱년기를들수있다 [2, 7, 42]. 일반적으로 사람들은갱년기를여성들이폐경기가오면여성호르몬이감 소하여발생하는여성만의증상이라고생각하는데남성들도 남성호르몬의감소로인해나타나는여성갱년기와유사한여 러임상적증상들이있으며, 천천히진행되는특징으로인해 이를인식하지못하는경우가많다. 대부분남성들은갱년기 *Corresponding author *Tel : , Fax : * khpsss@jwu.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 론 증상을스트레스나잠깐의통증이라생각하고넘어가는사람들이많지만갱년기이후에는몸이급격히쇠약해지고노화가촉진되는단계이기때문에중요한의미를가진다 [20]. 테스토스테론결핍증후군 (testosterone deficiency syndrome, TDS) 이라고도불리는남성갱년기의주된증상으로는피로를쉽게느끼게되고, 기억력저하, 우울증같은증상이흔하게나타나며, 근력저하와체지방증가, 뼈가약해지는등여러문제가생긴다. 또한발기부전이일어나고, 성욕또한저하되는등여러가지신체적변화와정신적증상과함께뇌와고환이노화되어남성호르몬인 testosterone의농도저하또한나타난다 [10, 43]. 그렇기에본실험에서는일반사람들이잘알지못하는남성갱년기를중요히다루어인체에해가되지않는천연추출물을사용하여남성갱년기의증상완화에도움을주고자하였다. 민들레는이른봄부터늦가을까지우리나라곳곳에서피어나흔히볼수있는식물중하나로국화과의풀이며세계적으로분포되어있고, 국내의한방쪽에서는포공영이라고불리며한약재로많이사용되고알려져있기도하다. 민들레의뿌리, 잎, 꽃, 꽃줄기등포공영의전체를동양쪽에서는오랫동안약으로사용하여왔는데, 지상부를건조한것은완하제, 강장제등의약제로사용되었고, 뿌리부위를건조한것은해열, 이뇨, 해독제로사용되고있다. 열로인한종창, 인후염, 맹장염, 유방염, 황달, 급성간염, 복막염등에효과가있으며, 열로인해서소변을못누는증세에도사용한다 [21]. 현재우리

2 1064 생명과학회지 2016, Vol. 26. No. 9 나라에있는민들레는서양민들레 (Taraxacum officinale), 좀민들레 (Taraxacum hallaisnese), 산민들레 (Taraxacum ohwianum), 토종민들레 (Taraxacum mongolicum), 흰민들레 (Taraxacum coreanum) 로구별된다. 많은민들레중국내에서대표적인민들레종으로는서양민들레와흰민들레가있다. 서양민들레는유럽이원산지로국내에서거의다수차지하는데혹한기를제외하고연중 14회개화하고번식능력이매우뛰어난식물이다. 흰민들레는토종민들레와유사하지만꽃이흰색이고연중 1 회개화하고타가수정으로만종자를번식하고증식률이낮다 [1, 24]. 민들레의성분은이전의다른연구에의하면고미물질인 taraxacin과 inulin이풍부하고 taraxanthin, carotenoids, taraxaol, taraxasterol 등의 phytosterol 및 caffeic acid 등페놀화합물을함유하고있다. 또한 chlorogenic acid, chicoric acid 등의폴리페놀과 luteolin과 quercetin 등의플라보노이드유도체가함유되어있다 [27, 31, 50]. 민들레는식용으로도많이사용되어오고있는데, 서양에서는이미다양한가공식품과건강보조식품을제조및판매하고있다 [6, 24]. 우리나라에서는일부민들레를생즙으로먹거나나물또는쌈으로도섭취하여점차이용이증가되고있는추세이나상품화된가공식품은미비한실정이다 [23]. 본연구에서는이미여러효능이알려져있지만더욱개발할가능성이많은민들레의남성갱년기개선효과를알아보기위해, 민들레추출물 (dandelion extract, DE) 과이를유산균으로발효한민들레발효추출물 (fermented dandelion extract, FDE) 을실험동물에게투여하고이를통해남성갱년기증상개선에대한효능의여부와그수준을비교분석하였다. 실험은투여후실험동물의혈중 testosterone, sex hormone binding globulin (SHBG), prostate specific antigen (PSA), 체지방및근육량, 운동수행능력, 정자수, 혈중지질등체내에미치는변화를확인하였고, testosterone 증가에영향을주는기작을알아보기위해 mouse Leydig 세포주를이용하여 testosterone 양과 testosterone 합성과정에관여하는효소들의유전자발현량을측정하였다. 재료및방법민들레추출물및발효추출물제조본실험에사용된흰민들레는경북청송에서마른건초를구입하여사용하였다. 건조민들레의열수추출물은물 1,000 ml와파쇄된민들레 100 g을 75~80 의가열맨틀상에서 24시간추출한후 filter paper (Whatman No. 1) 로여과하여여과된여액을감압농축한다음동결건조하여얻어진분말을 4 냉장고에보관하며사용하였다. 민들레발효추출물은건조민들레 100 g 당유산균 (Lactobacillus plantarium) 약 개를혼합하고물 1,000 ml를첨가하였다. 이혼합물을 96시간동안 30 에서발효한다음, 이후에는열수추출물과같은과정을 거쳐발효추출물을얻었다. 실험에서는이추출물을식용수에용해하여사용하였다. 실험동물의사육본연구에서는 12주령된 Sprague-Dawley계수컷흰쥐를대한바이오링크 (Eumseong, Korea) 에서구입하여사용하였으며본실험은중원대학교동물실험윤리위원회의승인하에표준작업지침에따라수행되었다 (JWU ). 실험시작전 10주동안대한바이오링크사의일반고형사료로적응시킨뒤 22주령까지사육하여실험을진행하였고강제유영운동이다른생화학적지표에영향을줄것을고려하여강제유영운동군과혈액, 체지방, 근육및정자수측정군으로분류하였으며각각 40마리씩총 80마리로실험하였다. 실험쥐들은몸무게가약 420 g의것을군당 8마리씩임의로분류하였다. 실험쥐들은온도 24, 상대습도 50±10%, 환기회수 10-20회 / 시간, 조명시간 12시간 ( 점등 08:00-소등 20:00) 으로설정된환경에서 cage당두마리씩배치하여관리하였다. 실험군은 DE, FDE 두군으로나뉘어 oral zonde를사용하여 4주간매일일정시간에규칙적으로경구투여를시행하였다. 채혈및혈장채취혈중 testosterone치를측정하기위해매주같은요일 16:00-18:00시에 ether로마취한후꼬리정맥에서약 μl 정도혈액을채취하였다. 다른실험항목을측정하기위해실험종료날에는심장에서직접혈액을채취하였다. 채취한혈액은얼음에꽂아신속하게 13,000 rpm, 4 에서 10분간원심분리를진행한뒤혈장만을분리하여사용하였다. 대퇴근및내장지방적출실험쥐들의배를열어심장채혈을한후대퇴부를절개하여대퇴사두근중많은비율을가지는외측광근 (vastus lateralis) 을분리하여무게를재었고, 내장지방중부고환지방조직 (epididymal fat pad, EFP) 의무게를재어각각의변화를확인하였다. 혈중 testosterone 측정혈중 testosterone치를측정하기위해 testosterone 측정용키트 (Enzo life sciences, Plymouth Meeting, Montomery County, PA, USA) 를이용하여실험하였다. Diethyl ether로전처리한샘플을goat anti-mouse IgG microtiter plate에혈장과표준희석액을넣은뒤 testosterone 항체를혼합하여 plate shaker에서 500 rpm으로 1시간동안 incubation한후, 기질용액을넣어 37 암조건하에서 1시간동안 incubation하였다. 이후반응정지액을넣고혼합해 405 nm에서즉시흡광도를측정하였다.

3 Journal of Life Science 2016, Vol. 26. No 혈중 PSA 측정혈중 PSA함량은 PSA 측정용키트 (CUSABIO, Wuhan, China) 를이용하여 pre-coated microplate 에혈장시료와표준용액을넣어주고밀봉하여 37 에서 2시간동안 incubation시켰다. 용액을제거한뒤 biotin 항체를넣고 37 에서 1시간동안 incubation시킨다음 wash buffer로 washing 하였다. 이후용액을제거한뒤 HRP-avidin을넣고 37 에서 30분동안 incubation시켰다. 이를 washing 한후용액을제거하고기질용액을넣어 37 에서 20분간암조건하에서 incubation시킨후, 반응정지액을첨가하여 450 nm에서흡광도를즉시측정하였다. 혈중 SHBG 측정혈중 SHBG함량은 SHBG 측정용키트 (Cloud-clone Corp, Houston, TX, USA.) 를사용하여측정하였다. 혈장시료와표준용액을 pre-coated microplate에넣은뒤밀봉하여 37 에서 2시간동안 incubation시켰다. 그후용액을제거한뒤 detection reagent A를넣고밀봉하여 37 에서 1시간동안 incubation한뒤 wash buffer로 washing했다. 용액을제거한뒤 detection reagent B를넣은후 37 에서 30분동안 incubation 시켰다. 이를 washing한후용액을제거하고기질용액을첨가하여 37 에서 20분동안암조건하에서 incubation시켰다. 이후반응정지액을넣어 450 nm에서즉시흡광도를확인하였다. 을진행하였고, 유영중쥐들의코가물아래로 2초이상빠지는횟수가 5번이상일때를탈진으로간주하여그때까지의시간을측정하였다. 간독성측정간기능의지표인혈중 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 의함량은혈장 AST, ALT 측정용 kit (ASAN pharmaceutical co Ltd.) 를사용하여분석한후파장 505 nm에서흡광도를측정하였다. TM3 cell의 testosterone 농도측정 TM3 cell의 testosterone 농도측정은 testosterone 측정용키트 (Enzo life sciences) 를이용하여실험하였다. 세포실험에사용된 TM3 세포주는한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank [KCLB], Seoul, Korea) 에서분양받아사용하였다. 60 mm culture dish (SPL life science, Gyeonggi-do, Korea) 에 10% FBS 가첨가된 DMEM/F-12 medium (Gibco-BRL, Life Technologies Inc., Grand island, NY, USA) 과 개의세포를넣어주어 37, 5% CO 2 조건하에서 24시간동안균일하게배양하였다. 이후 PBS로 wash한뒤배지를갈아주었고민들레추출물및발효추출물을각농도에맞게처리한배지에서 48시간동안배양하였다. 배양후, 배지를취하여사용된키트의 product manual에따라처리하고측정하였다. 혈장지질분석혈중총콜레스테롤, 중성지방, high-density lipoprotein (HDL) 콜레스테롤함량은각각의측정용키트 (ASAN pharmaceutical Co. Ltd., Seoul, Korea) 를사용하여측정하였다. 정자수및운동성측정실험쥐의부고환을적출하여수술용가위로잘게자르고이를 0.5% BSA를포함하는 M199 media 에넣어준후 37 로 10분간 incubation하여정자를채취하였다. 채취된정자를체내와유사한환경으로유지하기위해 32 의 M199 media로 1차희석하였다. 희석액에서 100 μl를취하고 media 900 μl을넣어 2차희석을해주었다. 이후 2차희석액에서 10 μl를취하여 hemocytometer에서 counting하였다. 정자의운동성은위에서처럼 counting한것에서, 활동하는정자수의비율을측정하여계산하였다. 강제유영운동강제유영을위해플라스틱통 (50 W 40 D 60 H cm) 에약 40 cm 높이만큼멸균수를채우고수중히터 (Aquarium Heater, EIEIM GmbH&Co. KG., Deizisau, Germany) 를사용하여수온을 25±2 로유지시켜주었다. 각각의군별로 8마리씩최대유영능 (exhaustive swimming) 을확인하기위해실험 Real-time qpcr 을통한 mrna 비교분석 Testosterone 생합성에관여하는효소들의유전자발현량을비교하기위해 TM3 cell로부터 Trizol Reagent (Gibco BRL) 를이용해 RNA를추출하였다. 추출한 RNA를 ThermoScript RT-PCR System (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 을이용해 cdna를합성한뒤 real-time PCR (Exicycler 96 Real-Time Quantitative Thermal Block, Bioneer, Daejeon, Korea) 로측정하였다. 사용된 primer로 17β-HSD3는 forward 5 -GTTCTCGCAGCACCTTTTTC-3, reverse 5 -CA GCTTCCAGTGGTCCTCTC-3, 3β-HSD4는 forward 5 -CTC CACAGCCAACCCAGTAT-3, reverse 5 -ACAGTATGGGC ACAGGAAGG-3, 17, 20-Desmolase는 forward 5 -CCTGCT GGAAGGTGTAGCTC-3, reverse 5 -CCTGCTGGAAGGTG TAGCTC-3 로사용했고대조유전자인 GAPDH의경우 forward 5 -AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3, reverse 5 -CAC ATTGGGGGTAGGAACAC-3 로사용하였다. 통계처리모든분석자료는평균 ± 표준오차 (mean±se) 로나타냈으며실험결과분석은 Graph pad Prism 5.0 프로그램 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) 을통해진행하였다. 이번실험에서얻은결과에대해분산분석 (ANOVA) 을실시하였으

4 1066 생명과학회지 2016, Vol. 26. No. 9 며, 2-sample Student s t-test를이용하여대조군과실험군간의유의성을 p<0.05 수준에서사후확인하였다. 결과및고찰민들레추출물및발효추출물투여후혈중 testosterone 의변화 Testosterone은남성생식기능을조절하는대표적인스테로이드성호르몬으로유리된형태로존재하거나성호르몬결합글로불린, 혈중단백질, 및알부민과결합하여존재한다 [40]. Testosterone은시상하부-뇌하수체의지배하에고환의 Leydig cell에서생성되고사춘기이후의이차성징과남성화, 성기능유지에중요하며, 근육을형성하는작용을하고, 인지기능, 혈관의유연성, 지질대사등에폭넓게관여하고있다 [48]. 남성호르몬의감소는집중력및의욕저하, 기억력감퇴, 근력및근육량감소, 체지방증가, 비뇨기능및남성기능쇠약등의남성갱년기증상과연관성이있다 [19]. 그에따라임상에서는이러한남성갱년기의치료를위해 testosterone의보충요법이시행되고있는실정이다. 심혈관계질환증가, 전립선암발생및악화, 폐쇄성수면무호흡증, 적혈구증가증등의부작용발생가능성도알려져있어보다안전한남성갱년기개선치료법의필요성이요구된다 [35]. 본연구에서는민들레추출물의처리가 testosterone의분비에어떤영향을주게되는지를확인하기위해, 4주간흰쥐에투여한후혈중 testosterone level의변화를매주측정하였다 (Fig. 1). 투여전 (0주) testosterone level의경우대조군과실험군을비교하였을때각각 243± pg/ml과 ±27.69 pg/ml으로비슷한수준을보였다. 4주동안매주 DE 및 FDE 투여후 testosterone의혈중농도 를측정한결과, 약 3주째부터투여군의혈중 testosterone 농도가상승하기시작하여 4주째에는대조군의경우 ± pg/ml로투여전과별다른차이를보이지않았으나, 투여군들은증가하여 DE 30과 DE 60의경우각각 ±47.34 pg/ml, ±41.24로투여전보다약 13.7%, 25.1% 상승하였다. FDE 투여군은통계적으로유의하게증가하여 FDE 30에서 ±45.18 pg/ml로약 38.4% 의증가를나타내었으며 FDE 60에서는 ±38.26 pg/ml로약 50.8% 의증가를보였다. 이는 testosterone 생성에있어 FDE 투여가 DE 보다더효과적임을의미하며발효과정에서민들레의생리활성물질이증가한결과로사료된다. 이러한결과는 4주간진행된민들레추출물의투여가 Leydig cell의 testosterone 생성능력을증가시킨점에서 testosterone의감소로인해나타날수있는남성갱년기증상에있어긍정적인효과를보여줄수있을것으로사료된다. 민들레는 sesquiterpenes, saponins, phenolic compounds, flavonoids 그리고 sugars 등을여러성분들을함유하고있는데 [34], 이들중몇가지성분들은 testosterone과연관되어있다. saponin은혈중 testosterone 농도를증가시킨다는연구결과가있고 [49], flavonoid는미성숙한수컷흰쥐의정소, 부고환의발달을촉진하며, rat의 testosterone 및 LH 분비를자극하여생식과내분비기능에활력을준다는보고도있다 [11]. 또한 phenolic compounds는부고환의정자농도와정자의운동성증가와비정상적인정자를감소시켰다는보고가있다 [15]. 다른연구에의하면민들레발효추출물은민들레추출물보다유산균발효를통해 α-amylase, protease 그리고혈전용해효소가높게활성화되고, 이들이민들레조직에화학적인영향을주어생리활성성분이늘어남으로써총 phenolic compounds가더많이생성된다 [26]. 따라서, 선행연구결과들에근거하여민들레도 testosterone에효과가있을것이라고여겨지며, 전반적인결과가민들레추출물보다민들레발효추출물에서더좋은효과를나타낸것으로판단된다. 또한추후연구에서민들레추출물성분에대한탐색이더필요할것으로여겨진다. Fig. 1. The increase of serum testosterone levels after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student s t-test. *p<0.05; **p<0.01. 민들레추출물및발효추출물투여에따른혈중 PSA 의변화 PSA는전립선이외의조직에서는거의발현되지않고전립선의상피세포에서만합성되는단백분해효소로전립선암의선별에유용한종양표지자로사용되나, 전립선염, 전립선비대증, 전립선경색에서도증가할수있다 [5, 28]. Testosterone 보충요법에서유의해야할부분은전립선암발생의증가또는잠재적전립선암의악화에대한것이다 [8]. 남성갱년기의치료에있어남성호르몬보충요법과전립선암또는전립선비대증의발생위험성에대한관계는수십년동안논란의대상이되고있다. 하지만, 이두질환모두남성호르몬의존적이며남성호르몬박탈요법이효과적임은잘알려진사실임을고려할때주의를기울여야하는것은사실이다. 전립선암이나전

5 Journal of Life Science 2016, Vol. 26. No 립선비대증과같은전립선질환이 testosterone 보충요법으로인해발생하거나악화되는지에대한구체적이고명확한연구결과는없으나, 일부연구에서는 testosterone 보충요법이 PSA의증가및전립선암발생의증가에영향이있는것으로보고하고있으므로임상에서남성호르몬보충요법전후에세밀한추적관찰을시행하고있다 [9]. 그러므로본실험에서는민들레추출물의투여가전립선에부정적인영향을미치게되는지확인하기위하여 4주간추출물투여후혈중 PSA의변화를측정하였다 (Fig. 2). 실험결과에서대조군과실험군간의유의적차이는보이지않았다. 이러한결과로봤을때, DE 및 FDE의투여는전립선에있어특별한부작용을나타내지는않는것으로사료된다. 민들레추출물및발효추출물투여에따른혈중 SHBG 의변화 SHBG는간에서생성되는호르몬특이적결합단백질로 testosterone의경우약 40-60% 가 SHBG와결합하여체내에서불활성화상태로존재하며, SHBG에결합된 testosterone은호르몬의활성을잃는반면, 분리된 free testosterone은호르몬으로서생물학적활성을나타낸다 [47]. 따라서 SHBG는 testosterone의생체내작용을조절하는역할을한다 [39]. 남성이나이가들수록 SHBG의농도가증가하므로 free testosterone 농도를낮추는작용을하며이는남성갱년기와대사장애등을유발하는원인이되는것으로알려져있다 [44]. 또한, 이전연구들에서남성의나이가증가할수록 SHBG가증가하는것으로보고하였다 [18, 25, 32]. DE와 FDE의투여가 SHBG 수준의변화에미치는영향을알아보기위하여 4주간추출물투여를진행한투여군과대조군간의혈장내 SHBG값의변화를측정하였다 (Fig. 3). 대조군 (187.24±25.23 ng/ml) 과비교해봤을때, Fig. 3. The decrease of serum SHBG levels after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student s t-test. *p<0.05; **p<0.01. DE 30은 ±31.23 ng/ml로약 10% 감소함을보여유의미한차이는나타나지않았으나, DE 60은 ±24.78 ng/ml로약 22% 감소함을나타내었다. FDE의경우 FDE 30에서 ±27.54 ng/ml로약 18% 감소, FDE 60에서 ±32.51 ng/ ml로약 36% 감소한것으로나타났다. 따라서이결과에서도같은용량을투여한경우 FDE 투여가 DE 보다 SHBG 감소효과가더높음을보여주었고, 대조군과비교하였을때체내에활성화된형태인 free testosterone의농도를더높게유지시킬수있을것으로사료된다. 아직이러한결과에대한기작은알려지지않았으며, 추후 FDE가 SHBG를어떻게감소시키는지에관한추가연구가필요할것으로사료된다. Fig. 2. No difference of serum PSA levels after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). 민들레추출물및발효추출물투여에의한혈중지질의변화중년이후남성에서흔히나타나는비만, 지질대사이상, 내당능이상, 고혈압, 뇌심혈관계질환등대사증후군은 testosterone의감소로인해나타날수있다 [45]. 여러조사결과들에서건강한남성의비만증상과혈청 testosterone의감소는밀접한연관이있다는점이알려졌으며, 2형당뇨병과대사증후군도감소된 testosterone 수치와연관성이있다고하였다 [14, 37]. 혈중지질의이상은심혈관관련질환의위험성을높게만든다. 다른여러연구결과에서 testosterone의저하상태에서혈중 HDL 콜레스테롤의감소와중성지방의증가가보고된바있다 [29, 41]. 본실험에서는민들레추출물의처리를통해혈중지질대사이상이개선될수있는지확인하기위해 4주간추출물을투여후혈중총콜레스테롤, 중성지방, HDL 콜레스테롤등의변화를확인하였다. 혈중총콜레스테롤의경우대조군이 69.1±6.7mg/dl인것에반해, 투여군에서는전체적인감소를보였다. 특히 DE 60과 FDE 60에서각각 56.7±8.6

6 1068 생명과학회지 2016, Vol. 26. No. 9 mg/dl, 48.9±10.4 mg/dl로통계적으로유의한감소효과를나타내었다 (Fig. 4A). 중성지방의경우에도투여군모두에서다소감소하였으나 FDE 60에서 98.9±28.5 mg/dl로대조군의 146.1± 30.2 mg/dl와비교했을때약 48% 유의적으로감소함을보였다 (Fig. 4B). HDL 콜레스테롤의결과에서는대조군의값인 15.0±3.6 mg/dl과비교하였을때 DE 30에서 15.7±3.2 mg/dl로특별한차이를보이지않았다. DE 60과 FDE 30에서도각각 18.2±2.9 mg/dl, 18.7±4.6 mg/dl로다소증가하였으나유의적인차이는관찰되지않았다. 반면, FDE 60 투여군에서는 23.7±5.0 mg/dl로대조군에비해약 58% 유의적인증가 A B C Fig. 4. The effect of dandelion extract on total cholesterol (A), triglyceride (B), and HDL cholesterol (C) after 4-week administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student s t-test. *p<0.05. 를나타냈다 (Fig. 4C). 이러한민들레추출물의혈중지질개선효과는 Liu 등의연구와 Davaatserene 등의연구에서민들레추출물이지질대사에관여하는 adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) 의활성을증가시켜지방연소촉진, 콜레스테롤및중성지방합성저해, 조직내지방축적방지등의효과를보였다는결과 [12, 33] 와일치한다. 따라서, 이러한결과로민들레추출물의투여가남성갱년기에서나타날수있는혈중지질대사이상의개선에긍정적인효과를줄것으로사료된다. 민들레추출물및발효추출물투여에따른지방및근육의변화남성갱년기에서나타나는근육량감소와체지방증가는근력약화와무력감을동반한다 [3]. 따라서각추출물의투여가체지방과근육량에미치는영향을알아보기위해대퇴부근육량과부고환지방조직을측정하였다. DH 및 FDH를 4주동안투여후확인한결과부고환지방조직 / 몸무게의비율은대조군의경우 0.018±0.004이었고, DE 30와 FDE 30에서각각 0.017±0.002, 0.016±0.003으로감소한것을확인했고유의적차이는나타나지않았다. 그에반해 DE 60와 FDE 60에서는각각 0.015±0.003와 0.012±0.004로저용량군에비해감소하였으며, 특히 FDE 60는통계적으로유의한감소를보였다 (Fig. 5A). 또한대퇴부근육량 / 몸무게비율은대조군에서 0.020±0.005이었고, DE 30과 FDE 30에서는각각 0.021±0.006과 0.022±0.007 로약간증가하였으나유의적인차이를보이진않았다. 반면상대적으로고용량을투여한군들에서는 DE 60에서 0.024± 0001, FDE 60에서 0.028±0.003로각각나타났으며모두통계적으로유의하게증가되었다 (Fig. 5B). 이들결과로 DE 및 FDE 의투여가체지방을감소시키며근육량은증가시키는데도움을준것으로사료된다. Liu 등의연구에서민들레추출물은지방대사에관여하는 AMP-activated protein kinase 활성을조절하여지방의축적을감소시킨다고보고하였고 [33], González-Castejón 등은민들레추출물이지방대사와합성에관여하는유전자발현을조절하여이를방지하므로비만치료제로서의가능성을제시하였는데 [17], 이는본연구의결과와일치하는것이다. 또한, 근육량과민들레추출물과의연관성은아직정확하게밝혀진바는없지만민들레추출물투여로인한 testosterone의증가가근육량에영향을준것으로생각된다. 따라서민들레추출물이남성갱년기에서흔히나타나는체지방증가와근육량감소를지연시킬수있을것으로사료된다. 민들레추출물및발효추출물투여에따른정자수의변화고환의 Leydig 세포에서분비되는 testosterone은정자가형성되는세정관을구성하는 Sertoli 세포에작용하여정원세포로부터정자로발달되는과정에깊이관여하며, 정자의생성및운동성에중요한영향을미친다고알려져있다 [38]. 따라

7 Journal of Life Science 2016, Vol. 26. No A A B B Fig. 5. The change of EFP (A) and vastus lateralis muscle (B) after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student s t-test. * p<0.05; ** p<0.01. Fig. 6. The change of total sperm (A) and motile sperm (B) counts after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/ kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student s t-test. * p<0.05; **p<0.01. 서민들레추출물의투여로증가된 testosterone의결과 (Fig. 1) 를바탕으로추출물의투여가정자수와운동성에어떠한영향을미치는지측정하였다. 총정자수에서대조군은 5.55± 의정자수를가졌고, DE 투여군인 DE 30과 DE 60에서는각각 5.61± 과 5.75± 로약간증가하였으나통계적으로유의하지는않았다. 반면 FDE 투여군인 FDE 30에서 6.25± 로다소증가하였고, FDE 60에서는 6.95± 의총정자수를가져약 25% 가유의적으로증가하는양상을보였다 (Fig. 6A). 그중운동성을지닌정자수에대한측정결과에서대조군은 2.68± , DE 30은 2.96± , FDE 30은 3.33± 으로유의한변화는나타나지않았지만다소증가하는모습을보였다. 반면에, DE 60과 FDE 60에서는각각 3.40± , 4.33± 로유의한증가를보였다 (Fig. 6B). 이같은결과는민들레추출물의투여가정자의형성과운동성을향상시키는것임을보여주며, testosterone 분비가촉진되고 SHBG는감소하여생체내활성화된 testosterone의작용이증가했기때문으로사료된다. 민들레추출물및발효추출물투여에따른운동수행능력의변화앞선실험과같은근육량의증가가운동수행능력의변화에어떤영향을줄수있는지를확인하기위하여 4주간 DE 및 FDE를투여하였으며, 매주강제수영능력을평가하였다 (Fig. 7). 약 3주차부터대조군과실험군과의차이가나타나기시작하였다. 특히 4주차에서비교한결과최대수영시간이대조군은 74±22초에그쳤으나, 민들레추출물투여군들은모두증가하여 DE 30은 100±37초, DE 60은 124±45초, FDE 30은 157±31 초, FDE 60은 188±28초로각각측정되었다. DE 투여군에서는대조군과비교하였을때유의적으로큰차이를보이지않았으나 FDE 투여군과의비교에서는유의적차이를확인할수있었다. 이결과는민들레추출물의투여가실험동물의운동능력향상에도움을주었음을나타낸것으로특히 FDE 투여군에서더높은효과를볼수있었다. 이는민들레추출물의투여가육체적피로도를감소시켰다는 Jinchun 등과 Lee 등의결과와일치하는결과이다 [22, 30]. 또한 testosterone과같은남성호르몬이근력, 근육량및운동수행능력의향상에영향을미친다는연구 [13, 16] 와노년남성의 testosterone 보충이운동능

8 1070 생명과학회지 2016, Vol. 26. No. 9 A Fig. 7. The effect of dandelion extract on endurance capacity for swimming after 4-week administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW). Asterisk indicates statistically significant difference by Student s t-test. * p<0.05; ** p<0.01 B 력을향상시켰다는보고 [4] 를고려할때, 민들레추출물의투여에의해증가한 testosterone이운동수행능력의향상에영향을준것으로사료된다. 민들레추출물및발효추출물의간독성평가 AST와 ALT는생체내아미노기전이반응을촉매하는효소로서간에많은양이존재하며, 간독성으로인한간세포의괴사또는간조직이파괴되었을때세포밖으로유출되고혈중농도가증가하게되어임상에서간손상의지표로많이사용되는효소이다 [46]. 천연물추출물투여의경우예상치않은간기능이상이있는경우가있으므로, 본실험에서는민들레추출물및발효추출물의안전성확보를위해사용된민들레추출물및발효추출물을실험동물에장기간섭취시킬때간기능에영향이있는지알아보고자 4주간투여후혈중 AST, ALT 수치를측정하였다 (Fig. 8). 대조군과투여군을비교했을때 AST, ALT 모두에서별다른차이를보이지않았으며, 이는 4주간의추출물투여가간독성을나타내지않았고간기능에특별히부정적인변화를일으키지않은것으로생각된다. 민들레추출물및발효추출물투여가 TM3 cell 의 testosterone 분비와 testosterone 합성관련유전자발현에미치는영향동물실험에서나타난 DE의 testosterone 분비증가와그기작을알아보기위해서 mouse Leydig cell인 TM3 세포주를이용하여그효과를조사하였다 [36]. TM3 세포주에 DE 및 FDE를각각 20 μg/ml과 40 μg/ml로처리하고 48시간후에배양액의 testosterone 농도를측정한결과대조군에서는 42.07±14.26 pg/ml이었고 DE 20, DE 40, FDE 20 군에서는 Fig. 8. Serum levels of AST and ALT after 4-week dandelion extract administration. Control; no administration of dandelion extract, DE 30; dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), FDE 30; fermented dandelion extract treated group (30 mg/kg BW), DE 60; dandelion extract treated group (60 mg/kg BW), and FDE 60; fermented dandelion extract treated group (60 mg/kg BW) ±12.56~49.40±13.49 pg/ml 수준으로다소증가하였으나통계적으로유의하진않았다. 반면에 FDE 40군에서는 60.53± pg/ml로유의한증가를나타냈다 (Fig. 9A). 또한민들레추출물이 TM3 세포에서 testosterone 합성을어떻게증가시키는지알아보기위해 testosterone 합성과정에관여하는효소의유전자발현량을 real-time qpcr로측정하였다. Testosterone 생합성과정에서 androstenedione을 testosterone으로변환하는 17β-HSD3는민들레추출물을처리하였을때대조군에비해 DE 20, DE 40, FDE 20 군에서약 1.2~1.5 배증가하였으나통계적으로유의하진않았다. FDE 40 군에서는약 2.1배의유의적인증가를나타냈다 (Fig. 9B). Testosterone 생합성과정중에 pregnenolone과 androstenediol을 progesterone과 testosterone으로변환시키는 3β-HSD4도민들레추출물처리군에서전반적으로증가하였고, 특히 FDE 20에서대조군에비해약 1.4배, FDE 40에서약 1.7배의증가를보여통계적으로유의하였다 (Fig. 9C). progesterone으로부터생성된 17-OH progesterone을 dehydroepiandrosterone (DHEA) 과 androstenedione로변환시키는 17, 20-desmolase의경우도처리군전체적으로발현량이증가하여 DE 20, DE 40, FDE 20 군에서대조군과비교하여약 1.2~1.4배증가하였고, FDE 40 군에서는약

9 Journal of Life Science 2016, Vol. 26. No A B C D Fig. 9. The increase of testosterone secretion (A) and the gene expressions of 17β-HSD3 (B), 3β-HSD4 (C), and 17, 20-desmolase (D) in dandelion extract treated TM3 cell line. Control; no treatment of dandelion extract, DE 20; dandelion extract treated group (20 μg/ml), FDE 20; fermented dandelion extract treated group (20 μg/ml), DE 40; dandelion extract treated group (40 μg/ml), and FDE 40; fermented dandelion extract treated group (40 μg/ml). Asterisk indicates statistically significant difference by Student s t-test. *p<0.05; **p< 배증가하여유의적인차이를나타냈다 (Fig. 9D). 이러한결과로민들레추출물은 testosterone을분비하는고환의 Leydig cell에직접작용하여전사단계에서 testosterone 합성에관여하는효소들의발현을증가시키는것으로나타났다. 특히 FDE 40는모두통계적으로유의한값을보여가장효과가좋은것으로나타났다. 추후에적정용량과나타날수있는부작용에관한연구가필요할것으로사료된다. References 1. Akashi, T., Furuno, T., Takahashi, T. and Ayabe, S. I Biosynthesis of triterpenoids in cultured cells, and regenerated and wild plant organs of Taraxacum officinale. Phytochemistry 36, Araujo, A. B., Esche, G. R., Kupelian, V., O'Donnell, A. B., Travison, T. G., Williams, R. E., Clark, R. V. and McKinlay, J. B Prevalence of symptomatic androgen deficiency in men. J. Clin. Endocr. Metab. 92, Aversa, A. and Morgentaler, A The practical management of testosterone deficiency in men. Nat. Rev. Urol. 12, Borst, S. E. and Yarrow, J. F Injection of testosterone may be safer and more effective than transdermal administration for combating loss of muscle and bone in older men. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 308, E Bratt, O. and Lilja, H Serum markers in prostate cancer detection. Curr. Opin. Urol. 25, Budzianowski, J Coumarins, caffeoyltartaric acids and their artifactual methyl esters from Taraxacum officinale leaves. Planta Med. 63, Buvat, J., Maggi, M., Gooren, L., Guay, A. T., Kaufman, J., Morgentaler, A., Schulman, C., Tan, H. M., Torres, L. O., Yassin, A. and Zitzmann, M Endocrine aspects of male sexual dysfunctions. J. Sex. Med. 7, Castillo, O. A., López-Fontana, G., Vidal-Mora, I. and López Laur, J. D Testosterone replacement therapy and prostate cancer: the downfall of a paradigm? Medwave 15, e Crawford, E. D Testosterone substitution and the prostate. Eur. Urol. Suppl. 4, Cunningham, G. R Andropause or male menopause? Rationale for testosterone replacement therapy in older men with low testosterone levels. Endocr. Pract. 19, Da-Nian, Q., She, B. R., She, Y. C. and Wang, J. H Effects of flavonoids from Semen cuscutae on the reproductive system in male rats. Asian J. Androl. 2, Davaatseren, M., Hur, H. J., Yang, H. J., Hwang, J. T., Park,

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