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광도 사
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1 Appl. Chem. Eng., Vol. 25, No. 6, December 2014, Original article 이연정 이윤섭 진병석 동덕여자대학교자연과학대학응용화학과, 미원상사 ( 주 ) (2014 년 8 월 1 일접수, 2014 년 9 월 22 일심사, 2014 년 10 월 1 일채택 ) Antimicrobial Activities of Ethosome-Encapsulated Palmitoyl Tripeptide Yeon-jung Lee, Yun Sub Lee, and Byung Suk Jin Department of Applied Chemistry, Dongduk Women s University, Seoul , Korea Miwon Commercial Co., Ltd., Gyeonggi , Korea (Received August 1, 2014; Revised September 22, 2014; Accepted October 1, 2014) Palmitoyl tripeptide (M330) 는최소저해농도 (MIC) 결정실험에서기존화장품방부제인메칠파라벤, 페녹시에탄올보다적은농도로도높은항균활성을나타냈다. 하지만화장품제형에 M330 을혼합하면점증제인 carbopol (carboxy vinyl polymer) 과의정전기적인력결합으로침전이생기면서점도가떨어지고항균효과도크게떨어지는현상이일어났다. 따라서화장품제형에서 M330 의항균효과를회복시키고제형의침전을방지하기위하여 ethosome 베시클로 M330 의캡슐화를시도하였다. M330 을 ethosome 에캡슐화하여화장품제형에첨가한결과침전이형성되지않았고캡슐화되지않은 M330 을첨가했을때보다점도의감소폭이적었다. 챌린지테스트를시행한결과, M330 을캡슐화하여첨가했을때 E. coli 나 P. aeruginosa 등의그람음성균에서는항균활성이더욱향상되었지만그람양성균인 S. aureus 와진균인 C. albicans 에서는캡슐화에의한효과가없었고, 특히 C. albicans 에서는 1 주일동안생균수의감소가전혀없었다. M330 에 EDTA 를혼합하여실시한챌린지테스트결과 C. albicans 에대한항균활성이크게증가함을확인하였고, 두성분을함께캡슐화했을때는더욱빠른속도로균이사멸하였다. Abstract Palmitoyl tripeptide (M330) showed higher antimicrobial activities than methyl paraben or phenoxy ethanol through minimum inhibitory concentration (MIC) test. However, when the M330 was added into cosmetic formulation, white precipitates formed due to the electrostatic interaction between M330 and carbopol (carboxy vinyl polymer) as a thickener in cosmetics, and the viscosity of cosmetics decreased sharply. Also, the antimicrobial activities of M330 in cosmetics became lower than those of methyl paraben or phenoxy ethanol. Thus, the encapsulation of M330 in ethosome vesicle was attempted in order to recover the declined antimicrobial activities of M330 in cosmetics and prevent the precipitates from forming. When ethosome-encapsulated M330 was added into cosmetics, the precipitates did not form, and the decrease in the viscosity of cosmetics was not large compared to the addition of unencapsulated M330. Challenge tests showed that antimicrobial activities against gram negative bacteria were improved by the encapsulation of M330, but the encapsulation was not effective against gram positive bacteria and fungus. A combination of M330 with EDTA showed synergistic inhibitory potential against C. albicans. After coencapsulation of M330 and EDTA in ethosome, antimicrobial activities proved to be higher than those of unencapsulated M330 and EDTA. Keywords: palmitoyl tripeptide, M330, antimicrobial activity, ethosome, challenge test 1. 서론 1) 화장품은물과더불어미생물의영양이되는각종유기영양성분을함유하고있고, 장기간사용하면서사용할때마다뚜껑을여닫으 Corresponding Author: Dongduk Women s University, Department of Applied Chemistry, 23-1 Wolgok-dong, Sungbuk-ku, Seoul , Korea Tel: bsjin@dongduk.ac.kr pissn: eissn: 2014 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 면서공기, 사람손등에접촉하기때문에세균, 곰팡이등의미생물이번식하면서부패하는일이발생하게된다. 화장품이미생물에오염되면향취이상, 색상, 질감및점도변화, 곰팡이발생등의품질저하현상이나타나기때문에미생물이일으키는변패, 변취등으로부터화장품을장기간보호하기위해서방부제를첨가할필요가있다. 방부제는외부로부터유입된미생물의증식을억제하고사멸시켜제품의질저하를방지하는목적으로사용되지만이들은피부자극유발의원인이될수있고 [1], 기본적으로세포독성을갖고있어대량사용시인체에유해한영향을미치게되므로제품의안전성안정성을고려하여최소의유효량으로배합할필요가있다.

2 화장품에쓰이는대표적인방부제인파라옥시안식향산에스텔, 일명파라벤 (paraben) 은여러세균및진균에대해효과적이며냄새가없고변색, 경화, 혼탁등을일으키지않고독성이비교적낮다. 비용또한저렴하며넓은 ph 영역과고온에서도화학적안정성을갖고, 메칠파라벤과에칠파라벤, 부칠파라벤등을혼합사용하면적은양으로도효과적인방부효과를올릴수있는등여러장점으로인하여화장품에널리이용되어왔다 [2-3]. 하지만파라벤성분은알러지반응을일으키거나호르몬변화를가져오는것은물론체내에쌓여장기적으로암을유발할수있기때문에그안전성에대한논란이계속되고있다. 근래의연구결과에의하면파라벤은여성호르몬인에스트로겐과유사한구조를가지고있어내분비계를교란할가능성이있고 [4], 남성의경우정자수가감소하는등생식기능에이상이생길수있으며 [5], 피부에자극을주고피부염이있는환자에게접촉성알러지를발생시키는등의부작용도일으킬수있다는것이보고되었다 [6-7]. 또한파라벤이인체에흡수되면여성의유방암을발생시키는잠재적인원인이될수있으며실제유방암환자들의종양조직세포에서파라벤성분이공통적으로검출되었다고보고되었다 [8]. 파라벤류방부제를대체하여사용하는이소프로필알콜역시점막에자극을주고피부알러지를유발할수있고이외에도이미다졸리디닐우레아, 디아졸리디닐우레아, 페녹시에탄올등기존방부제들에대해서도여러부작용이보고되고있다 [9-12]. 이러한여러부작용에도불구하고화장품의장기간사용에따른안전성문제로인하여방부제를안넣을수는없기때문에상대적으로안전하고자극이적은대체방부제로서펩타이드의항균활성에대한관심이증가하고있다. 항균펩타이드는적용범위가넓고환경친화적이며잔류독성이없고병원균에대한내성의문제가없다고알려져왔다. Poly cationic 펩타이드화합물은원핵및진핵미생물에항균활성을보였고 [13-14], 성장인자로부터유래된펩타이드는곰팡이뿐만아니라그람음성및양성세균에도항균효과가있었다 [15]. 벌의독으로부터분리된멜리틴 (Melittin) 은우수한항균활성을가짐에도불구하고인간의적혈구를비롯한다양한세포에대해서독성을가지기때문에이항균펩타이드를방부제로적용하는데있어서많은제약이있다 [16]. 본연구에서는펩타이드항균제를화장품방부제로활용가능성을살펴본것으로미원상사 ( 주 )( 안산, 경기도 ) 에서새롭게합성개발한펩타이드인 palmitoyl tripeptide (M330) 를사용하여연구를진행하였다. M330은기존의화장품방부제인메칠파라벤, 페녹시에탄올보다항균력이우수하지만화장품에적용할경우방부효과가저하되고침전이생기며점도가떨어지는등제품의질을떨어뜨리는문제가있다. 이러한문제점을해결하기위해수용성물질인 M330을 ethosome 베시클에포집시켜캡슐화를시도하였다. 다양한조성으로 M330을캡슐화하는과정을통해최적조성의베시클을만들고이를화장품에적용했을때방부효과를챌린지테스트 (Challenge test) 를통해확인해보았다. 또한킬레이트제인 EDTA를 M330과함께 ethosome에포집시켜캡슐화를했을때화장품제형에서의항균효과도살펴보았다. 2. 실험 2.1. 재료본연구에서사용한 palmitoyl tripeptide (M330) 항균펩타이드는미원상사에서새롭게합성개발한제품으로합성하는방법은간략하게설명하면다음과같다. 고체상반응을위하여 Rink amide resin에 N-말단이 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 (Fmoc) 로그리고측쇄가 부틸옥시카르보닐 (Boc) 로보호된첫번째아미노산 (lysine) 을 N,N -디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 와첨가보조제인 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 을사용하여커플링하였으며 N-말단의보호기를피페리딘 (piperidine) 을이용하여제거한후같은방법으로두번째, 세번째 lysine과커플링하였다. 이어서같은방법으로 palmitic acid를커플링한후트리플루오로아세트산 (TFA) 를포함하는절단용액을이용하여고체수지로부터분리한후디에칠에테르 (diethyl ether) 를이용하여석출분리하여 M330을얻었다 [17]. 인지질은 soybean 에서추출한지질을수소첨가반응시켜불포화성분을없앤레시틴 (lecithin) 으로 PC (Phosphatidyl Choline) 성분이 95% 이상인 Emulmetik950 (Lucas Meyer사 ) 을사용하였으며편의상명칭을 HPC (Hydrogenated Phosphatidyl Choline) 로나타내었다. 콜레스테롤 (Chol.) 은 Sigma, 에탄올은대정화학제품을사용하였다. 이밖에도화장품제조에필요한유성원료, 보습제, 계면활성제, 점증제등은화장품용으로허가된원료들을사용하였다. MIC 및 Challenge Test에사용된균은진균에 C. albicans ( 효모균, ATCC 10231), 세균으로그람음성균에 P. aeruginosa ( 녹농균, ATCC 27853) 와 E. coli ( 대장균, ATCC 8739), 그람양성균에 S. aureus ( 황색포도상균, ATCC 6538p) 등으로모두미생물자원센터 (KCTC) 에서분양받았다. 균배양에쓰인배지는세균에는 PCA (plate count agar), 진균에는 PDA (plate dextrose agar) 를사용하였고액체배지는 MHB (Mueller Hinton broth) 를사용하였으며모두 Becton, Dickinson and Company 제품이다 M330을포집한 ethosome 제조 M330의농도별, HPC와콜레스테롤의혼합비율을달리하여여러 ethosome을다음과같이제조하였다. HPC와콜레스테롤혼합물 1 g 과에탄올 0.8 g을둥근바닥플라스크에넣고 60 로고정된항온조에서용해시켜투명한용액상태로만든다. 여기에 M330 ( 또는 M330 과 EDTA의혼합 ) 을녹인수용액을 1 g을넣은뒤 5 min 정도자석교반시키면용액은겔상태로변하면서백색의수화액정상 (hydrated liquid crystalline phase) 이형성된다. 다음은수화액정상의분산단계로교반기를가동한상태에서정량송액펌프를이용하여총량이 10 g이되도록증류수를서서히첨가하면수화액정상은베시클형태의입자로물속에분산되는데이베시클입자가 M330을포집한 ethosome이된다. 완성된 ethosome 을계속교반시키면서상온에서서서히식힌다 화장품제조화장품은에센스와로션두가지제형으로만들었고각각의처방을 Tables 1과 2에나타내었다. 에센스제조는다음과같이진행되었다. 수상물질인글리세린 (glycerine), 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 히아루론산 (sodium hyaluronate, 1%), carbopol 940 (carboxy vinyl polymer, 점증제 2%), 증류수등을비이커에넣고 70 의온도에서잘섞고다른비이커에는유상물질인실리콘오일 (silicone oil), Tween 80 (polyoxy ethylene sorbitan monooleate) 등을에탄올과함께넣고 60 의온도에서모두녹인다. 두상이모두투명한상태에서수상물질의비이커에유상물질을서서히첨가하면서아지믹서로균일하게교반시켜가용화를시킨다음, 트리에탄올아민 (triethanolamine, TEA) 을넣고 10 min간더교반을한후상온에서서서히식힌다. 로션제형은다음과같이제조되었다. 수상물질인글리세린, 부칠렌글리콜 (butylene glycol), 히아루론산 (1%), carbopol 940 (2%), 증류 Appl. Chem. Eng., Vol. 25, No. 6, 2014

이연정 이윤섭 진병석 Table 1. Composition of Essence Ingredient contents (g) glycerine 8.5 propylene glycol 7.5 sodium hyaluronate (1%) 8.0 triethanolamine 0.12 carbopol 940 (2%) 6.

Composition of Lotion Ingredient contents(g) glycerine 3.0 butylene glycol 2.0 sodium hyaluronate (1%) 1.0 triethanolamine 0.1 carbopol 940 (2%) 5.0 stearic acid 1.

유상물질인스테아린산 (stearic acid), 올리브오일 (olive oil), 세토스테아릴알콜 (cetostearyl alcohol), 세칠에칠헥사노이트 (cetyl ethylhexanoate, CEH), Arlacel 60 (sorbitan monostearate), Tween 80 역시비커에넣고 70

각균들을액체배지에접종하여각각적당한온도와일정시간동안배양한후, 균액농도가 2 10 6 CFU/mL가되도록희석하였다. 96-well plate의모든열에 50 µl씩액체배지를넣은후, 8% 농도로항균제가녹아있는용액을 96-well plate 의제1열에 50 µl를넣고잘혼합한다.

96-well plate를 37 인큐베이터에서하루동안보관배양하고 ELISA reader (Synergy HT, Bio-Tek) 을이용하여 540 nm의파장에서흡광도를측정하여각균주의 MIC 값을결정하였다. 챌린지테스트 (challenge test) 는식약청의 미생물한도기준및시 Figure 2.

일정한시간간격마다보관된로션중 100 µl를 E-tube에덜어서 10배수의증류수로잘분산시킨뒤, 그중 100 ul를멸균된고체배지에도말한후 35 의인큐베이터에서하루동안배양하였다. 자라난 colony의수를희석배수로환산하여 CFU/mL 단위로표시하였다.

3 이연정 이윤섭 진병석 Table 1. Composition of Essence Ingredient contents (g) glycerine 8.5 propylene glycol 7.5 sodium hyaluronate (1%) 8.0 triethanolamine 0.12 carbopol 940 (2%) 6.0 ethanol 8.0 silicone oil 0.1 Tween D.W. up to 100 Figure 1. MIC of methyl paraben, phenoxy ethanol and M330. Table 2. Composition of Lotion Ingredient contents(g) glycerine 3.0 butylene glycol 2.0 sodium hyaluronate (1%) 1.0 triethanolamine 0.1 carbopol 940 (2%) 5.0 stearic acid 1.0 cetostearyl alcohol 1.9 cetyl ethylhexanoate 7.0 olive oil 2.0 Arlacel Tween D.W. up to 100 수등을비이커에넣고 70 의온도에서잘섞는다. 유상물질인스테아린산 (stearic acid), 올리브오일 (olive oil), 세토스테아릴알콜 (cetostearyl alcohol), 세칠에칠헥사노이트 (cetyl ethylhexanoate, CEH), Arlacel 60 (sorbitan monostearate), Tween 80 역시비커에넣고 70 의온도에서모두녹인다. 두상모두투명한상태의용액이되면수상물질을호모믹서로잘섞어주며유상물질을서서히첨가하여유화시킨후 TEA를넣어중화시킨다 MIC 및챌린지테스트최소저해농도 (MIC) 의결정은 2배-연속희석법 (two-fold serial dilution method) 으로진행되었다. 각균들을액체배지에접종하여각각적당한온도와일정시간동안배양한후, 균액농도가 CFU/mL가되도록희석하였다. 96-well plate의모든열에 50 µl씩액체배지를넣은후, 8% 농도로항균제가녹아있는용액을 96-well plate 의제1열에 50 µl를넣고잘혼합한다. 혼합후제1열에서 50 µl를취해그다음 2열에넣고혼합하는방식으로같은과정을계속반복해서모든열에대해 1/2배씩희석과정을거치고난후, 액체배지에서배양된균액을 50 µl씩모든열에첨가한다. 96-well plate를 37 인큐베이터에서하루동안보관배양하고 ELISA reader (Synergy HT, Bio-Tek) 을이용하여 540 nm의파장에서흡광도를측정하여각균주의 MIC 값을결정하였다. 챌린지테스트 (challenge test) 는식약청의 미생물한도기준및시 Figure 2. Change in appearance of essence after addition of M330 before after. 험방법가이드라인 을참고하여시행하였다. 항균제가들어있는화장품로션제형에실험할균의농도가대략 CFU/mL가되도록균액일정량을첨가하여잘혼합한후 35 인큐베이터에보관하였다. 일정한시간간격마다보관된로션중 100 µl를 E-tube에덜어서 10배수의증류수로잘분산시킨뒤, 그중 100 ul를멸균된고체배지에도말한후 35 의인큐베이터에서하루동안배양하였다. 자라난 colony의수를희석배수로환산하여 CFU/mL 단위로표시하였다. 시간이경과에따른접종균의사멸정도를비교하는방법으로방부력을확인하였으며 1주일내처음균의 99.9% 가사멸하면방부효과가있는것으로판단하였다. 3. 결과및고찰 3.1. M330 의화장품적용및캡슐화 Figure 1은펩타이드방부제인 M330과기존에화장품에쓰이던방부제인메칠파라벤, 페녹시에탄올과의항균효과를비교한것으로 C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus 등 3가지균에대한최소저해농도 (MIC) 결정실험결과들이다. M330은기존화장품방부제에비해적은농도에서도 3가지균모두를더잘억제할수있는강력한항균특성이있음을알수가있다. 특히 M330은 P. aeruginosa, S. aureus와같은세균을억제하는데필요한최소저해농도가수 ppm 정도로, 메칠파라벤, 페녹시에탄올의수천 ppm에비해서대략 1000배가까이적은농도로도세균증식을억제하는강력한항균효과를보여주었다. 이와같이 M330은뛰어난항균특성을보유하고있어화장품방부제로적극활용을기대했지만화장품제형에적용했을때여러문제가발생하였다. 그 공업화학, 제 25 권제 6 호, 2014

Figure 3. Changes in viscosity after addition of M330 or water into essence. Figure 5.

Figure 4. Variations of the particle size of ethosome vesicle as a function of M330 concentration and HPC/Cholesterol ratio. 중하나가 Figure 2와같이투명한화장품에센스제형 에 M330을첨가한결과외관상 와같은하얀침전물형성을확인할수가있었다.

이는에센스제형에서점도를높여주던 carbopol 이 M330 첨가에의해점증제로서의기능을잃고침전되었기때문이다.

따라서에센스에 M330을첨가하면에센스속 carbopol의음전하와 M330의양전하간정전기적결합에의해침전이발생하고이로인해 carbopol의유체역학적부피가축소되면서에센스의점도가크게감소하는것이다. M330 첨가에따른화장품내침전을방지하고자수화액정형베시클인 ethosome으로 M330 캡슐화를시도하였다.

8 g으로고정하고 M330 농도와지질중콜레스테롤의혼합비율을각각달리하여 ethosome을제조하였을때형성된베시클입자의크기를입도분석기 (PSS, Nicomp 380) 로측정하여 Figure 4에나타내었다. 그림에서는나타내지않았지만콜레스테롤없이 HPC 단독으로베시클을만들경우겔 (gel) 상태가되거나입자크기가수 µm가넘는불안정한상태의베시클이만들어진다.

4 Figure 3. Changes in viscosity after addition of M330 or water into essence. Figure 5. Comparison of appearance when ethosomes with different M330 concentration were added into essence 2% M330 5% M330. Figure 6. Effect of ethosome encapsulation on the viscosity of essence (M330 2%). Figure 4. Variations of the particle size of ethosome vesicle as a function of M330 concentration and HPC/Cholesterol ratio. 중하나가 Figure 2와같이투명한화장품에센스제형 에 M330을첨가한결과외관상 와같은하얀침전물형성을확인할수가있었다. M330을첨가했을때제형에서나타나는또다른현상은점도의감소이다. Figure 3에서와같이에센스에증류수를 3% 비율로혼합했을때는점도변화는거의없지만 M330 수용액 (2% 농도 ) 을 3% 비율로혼합했을때는점도는크게떨어지고 shear thinning 특성도아주작은전단속도영역에서만약간보일뿐점도값이거의일정한뉴톤유체 (newtonian fluid) 의특성을보였다. 이는에센스제형에서점도를높여주던 carbopol 이 M330 첨가에의해점증제로서의기능을잃고침전되었기때문이다. 화장품에쓰이는대표적점증제인 carbopol은폴리아크릴산 (polyacrylic acid) 성분이기때문에중성상태의물에서는카르복실산기에서수소이온이떨어져나와음전하를띠면서물에용해되고유체역학적부피 (hydrodynamic volume) 가크게확장되면서제형의점도가증가하게된다. M330은펩타이드구조상에 lysine 성분의아미노기가존재하기때문에물에서양전하를띤다. 따라서에센스에 M330을첨가하면에센스속 carbopol의음전하와 M330의양전하간정전기적결합에의해침전이발생하고이로인해 carbopol의유체역학적부피가축소되면서에센스의점도가크게감소하는것이다. M330 첨가에따른화장품내침전을방지하고자수화액정형베시클인 ethosome으로 M330 캡슐화를시도하였다. 먼저최적의 etho some 베시클을만들기위하여구성성분의비율을달리하면서 ethosome 입자크기변화를살펴보았다. 베시클막을구성하는지질의함량은 1 g, 에탄올은 0.8 g으로고정하고 M330 농도와지질중콜레스테롤의혼합비율을각각달리하여 ethosome을제조하였을때형성된베시클입자의크기를입도분석기 (PSS, Nicomp 380) 로측정하여 Figure 4에나타내었다. 그림에서는나타내지않았지만콜레스테롤없이 HPC 단독으로베시클을만들경우겔 (gel) 상태가되거나입자크기가수 µm가넘는불안정한상태의베시클이만들어진다. M330을 2% 의농도로 ethosome을제조하는경우콜레스테롤혼합비율 10%, 20% 에상관없이 200 nm 이하의안정한베시클이만들어졌다. 그러나 M330 3% 이상의농도에서는콜레스테롤을 10% 혼합했을때는수백나노크기의비교적안정된크기의베시클이만들어지지만 20% 을혼합하면베시클입자크기가마이크로사이즈로급격하게커진다. 10% 정도의콜레스테롤혼합은 HPC에약간의소수성을부가하면서안정한베시클막형성에도움을주지만혼합비율이어느정도이상이되면 HPC와의얽혀진구조를형성하면서 HPC의액정배열에방해가되므로콜레스테롤혼합비율은 10% 정도가적당하다. M330의농도가 5% 이상이되면구성성분간혼화성 (miscibility) 이급격히떨어지면서베시클이제대로형성되지않았다. Figure 5는 M330을포집시킨 ethosome 용액을에센스에혼합했을때외관사진인데 M330을직접첨가한경우와는달리 ethosome으로캡슐화하여에센스에첨가한경우에는침전이관측되지않았다. 하지만 M330 농도를높여 5% 로만든 ethosome 수용액을혼합했을때는침전이많이생기는것을볼수있다. M330을 5% 농도로만들경우베시클이제대로만들어 Appl. Chem. Eng., Vol. 25, No. 6, 2014

5 이연정 이윤섭 진병석 (c) (d) Figure 7. Changes in viable cell count with time during challenge test. E. coli P. aeruginosa, (c) S. aureus, (d) C. albicans. 지지않았기때문에베시클에캡슐화되지못한 M330의양이많아져 carbopol과의반응으로침전이형성된것이다. Ethosome 으로캡슐화된 M330과캡슐화되지않은 M330을에센스제형에각각혼합하였을때점도를비교하였다. Figure 6에서보듯이 ethosome으로캡슐화하여혼합하였을때캡슐화하지않고혼합하였을때보다점도값이비교적높게나타났다. M330을캡슐화하면 M330과 carbopol 간의직접적인접촉을제한하여침전형성을억제하기때문에 carbopol의유체역학적부피가유지될수있고따라서점도값들이상대적으로높게나타났다 화장품제형에서의 M330의항균효과화장품제형에서여러미생물에대한 M330의항균력비교를위해챌린지테스트를실시하였다. 화장품은로션제형으로만들고여기에 M330을 3% 의농도로 ethosome 캡슐화형태로만든것과캡슐화없이그냥물에녹인수용액상태를각각만들어화장품총중량대비 3% 비율로첨가하였다. 이경우 M330은화장품총중량대비 0.09% 의비율로첨가된것이고 4가지균에대한항균효과를챌린지테스트를통해생균수변화로살펴보았다 (Figure 7). 그람음성균인 E. coli를접종한로션 에서는 3일안에접종한균의 99.9% 가사멸하였으며, 균이줄어드는과정에서 M330을 ethosome 으로캡슐화했을때균수가약간더빨리감소하였다. P. aeruginosa가접종된로션 에서는하루만에접종한균의 99.9% 가사멸하는결과가나타났고특히 M330을캡슐화했을때에는캡슐화하지않은수용액상태보다균수가눈에띄게줄어들었으며 6 h만에접종한균의 99.9% 가사멸하였다. 그람양성균인 S. aureus가접종된로션의생균수측정결과 (c) 에서는 4일에서 5일사이에접종한균의대부분이사멸하였지만 S. aureus균이줄어드는과정에서는 M330을캡슐화한효과는전혀없었고오히려수용액일때보다캡슐화했을때최대 1000배가까이균수가더많이남아있는경우도있었다. 진균인 C. albicans 경우 (d) 는접종후 7일이지난후에도균이줄어드는것이관찰되지않았고수용액상태에서나베시클로캡슐화했을때나어떤유의적인차이가없었다. 비교를위해화장품에통상처방되는메칠파라벤 0.2% 농도를테스트해보니 6일이경과하면모든균이사멸되는것으로나타났다. 이상의결과를종합해보면 M330은화장품제형내에서도 E. coli, P. aeruginosa, S. aureus 등의세균에대해서는강력한항균효과를나타내지만진균인 C. albicans에대해서는항균효과가없었다. 또한세균중에도그람음성균에대해서는 M330를캡슐화했을때균의사멸속도가더빨라지는등항균력이더높게나타나지만그람양성균에대해서는반대로캡슐화했을때항균효과가더약화되는현상이나타났다. M330의캡슐화에의해항균효과가상승되는원인에대해서는다음과같이설명될수있다. 화장품제형에서 M330은점증제와의강력한상호인력으로인하여항균력을잃게되지만 M330을캡슐화하면외부물질과접촉이차단되므로항균력저하가어느정도방지되고, 또한 ethosome 베시클막과세균세포의외벽은같은인지질로구성되었기때문에 M330의세균에접근및세포막내침투를도와항균력상승에기여할수있을것으로예측된다. 이와비슷한사례로항균제를리포좀으로캡슐화하여식품에적용했을때항균효과가향상되었다는몇몇의연구결과가발표되었다 [18-21]. 세포외벽이인지질로되어있는그람음성균과는달리양성균의세포벽의두께는 20-80nm정도로펩티도글리칸층이견고하게발달되어있고테이코산 (teichoic acid) 과공유결합을이루면서세포벽의물리적강도가강하기때문에인지질 공업화학, 제 25 권제 6 호, 2014

Comparison of antimicrobial activities between unencapsulated and encapsulated

6 Figure 8. Variations of the particle size of ethosome vesicle as a function of M330/EDTA and HPC/Cholesterol ratio. M330 3% EDTA 0.5% 0 day after 7days M330/EDTA unencapsulated M330/EDTA encapsulated Figure 9. Comparison of antimicrobial activities between unencapsulated and encapsulated M330/EDTA (C. albicans). 이중층으로이루어져있는 ethosome 베시클이물리적으로침투하기어렵다. 따라서그람양성균인 S. aureus에대해서는캡슐화한효과가크게나타나지않는것으로보이고오히려베시클막성분인인지질및콜레스테롤이세균이자라는데필요한영양성분이되어오히려항균효과를감소시킬수있는것으로볼수있다. 효모와같은진균인 C. albicans도두껍고견고한섬유질의세포벽을구성하고있으며캡슐화여부에상관없이 M330 자체로는항균력이부족하다. C. albicans에대한 M330의부족한항균력보강을위하여 M330과함께 EDTA의혼합을시도하였다. EDTA는화장품제형에서금속성분의이온활동을봉쇄함으로써화장품의변질, 변색등을막아안정한상을유지하는데도움을주며또한세균의세포막구성성분인 S, P, Mg, Ca, Fe, Mn, Cu, Zn 등의금속염의농도를감소시킴으로써세균의성장과증식에영향을끼치게된다. EDTA의첨가비율을달리하여다양한조성의 ethosome을제조하였는데, 3% 의농도의 M330에 EDTA를각각 0.5, 1, 1.5% 로 M330 양대비 1/6, 1/3, 1/2 비율로첨가 (c) Figure 10. Changes in viable cell count with time during C. albicans challenge test. M330/EDTA 6/1, 3/1, (c) 2/1. 하였다. Figure 8은 M330과 EDTA를모두캡슐화한베시클입자크기를측정한결과로콜레스테롤의첨가량이 10% 였을때에는 EDTA의첨가비율이높아질수록베시클입자가작아지는경향을보였고, 콜레스테롤의첨가량이 20% 였을때는 EDTA 첨가비율에상관없이모두 2 µm를넘는등불안정한입자가형성되었다. M330/EDTA 혼합물을베시클로캡슐화한것과캡슐화하지않고그냥수용액에녹인것을로션제형에각각 3% 비율로첨가하고진균인 C. albicans에대해서만챌린지테스트를실행하였다. Figure 9는 C. albicans를접종한로션으로실시한챌린지테스트결과를비교한사진이다. M330과 EDTA를캡슐화하지않고첨가했을때에는 7일후에도여전히균이남아있지만이혼합물을 ethosome으로캡슐화하여첨가한경우에는균이완전히사멸되어관찰되지않았다. Figure 10은 Appl. Chem. Eng., Vol. 25, No. 6, 2014

7 이연정 이윤섭 진병석 C. albicans 챌린지테스트에서 EDTA 첨가비율에따른생균수변화를살펴본결과이다. M330/EDTA (6 : 1) 를캡슐화하지않은수용액의경우 7일째에도균이많이남아있지만, 같은농도의베시클수용액에서는 7일째에접종한균의 99.9% 가사멸하였으며항균효과가더우수하게나타났다. EDTA를더높은농도비율로첨가하면캡슐화하지않은수용액의경우에도 C. albicans균대부분이 7일안에사멸하지만캡슐화를한경우에는 5일만에균대부분이사멸되는등 0.2% 의메칠파라벤 (Figure 7(d)) 보다도더빠른시일내에균이사멸되며우수한항균효과를보였다 (b, c). EDTA 단독자체로는항균력이강하지않기때문에화장품방부제로인정되지않고있지만 EDTA를다른항균제와혼합첨가시 EDTA는세포막을견고하게유지시키는 Ca +2, Mg +2 등의무기염류를포착하여균의세포막구조를약화시키고항균제의균세포막내침투를용이하게만들기때문에항균력의시너지효과가발휘할수있게된다 [22-23]. 4. 결론 새로운항균제인 palmitoyl tripeptide M330은최소저해농도 (MIC) 결정실험에서는기존화장품방부제인메칠파라벤, 페녹시에탄올보다더뛰어난항균활성을보이지만, 이를화장품제형에방부제로적용했을때는침전이발생하면서점도가떨어지고또항균력도크게떨어져화장품방부제로부적합하였다. M330을화장품에적용하기위하여콜레스테롤 10% 가혼합된 ethosome 베시클로캡슐화를시도한결과 2-4% 농도까지 M330을포집할수있었고이를화장품제형에혼합한결과침전을방지할수있었다. 화장품제형에서챌린지테스트를실시한결과그람음성균인 E. coli나 P. aeruginosa에서는캡슐화하지않고수용액상태로첨가했을때보다캡슐화하여첨가했을때 M330의항균특성이더욱향상되었지만그람양성균인 S. aureus, 진균인 C. albicans에서는캡슐화에의한효과가없었다. M330과함께 EDTA를혼합하여화장품제형에서챌린지테스트한결과진균인 C. albicans는 1주일안에대부분의균이사멸하였고, 두성분을함께캡슐화했을때는더욱빠른속도로균이사멸하는등캡슐화에의한항균효과의상승을확인하였다. 감 본연구는미원상사 ( 주 ) 의연구비지원에의해수행되었으며이에감사드립니다. 사 References 1. D. S. Orth and J. J. Kabara, Preservative-free and self-preserving cosmetics and drugs: application of hurdle technology, Cosmet. Toiletr., 113, (1998). 2. D. S. Orth, Use of parabens as cosmetic preservatives, Int. J. Dermatol., 19, (1980). 3. D. Steinberg, Z. Hirschfeld, I. Tayeb, S. Ben-Yosef, A. David, and M. Friedman, The effect of parabens in a mouthwash and incorporated into a sustained release varnish on salivary bacteria, J. Dent., 27, (1999). 4. E. J. Routledge, J. Parker, J. Odum, J. Ashby, and J. P. Sumpter, Some alkyl hydroxy benzoate preservatives (parabens) are estrogenic, Toxicol. Appl. Pharm., 153, (1998). 5. S. Oishi, Effects of propyl paraben on the male reproductive system, Food Chem. Toxicol., 40, (2002). 6. W. F. Schorr, Paraben allergy: A cause of intractable dermatitis, JAMA, 204, (1968). 7. I. L. Schamberg, Allergic contact dermatitis to methyl and propyl paraben, Arch Dermatol., 95, (1967). 8. P. D. Darbre1, A. Aljarrah, W. R. Miller, N. G. Coldham, M. J. Sauer, and G. S. Pope, Concentrations of parabens in human breast tumours, J. Appl. Toxicol., 24, 5-13 (2004). 9. J. García-Gavín, R. Lissens, A. Timmermans, and A. Goossens, Allergic contact dermatitis caused by isopropyl alcohol: a missed allergen?, Contact Dermatitis., 65, (2011). 10. D. Lujan, B. Hernandez-Machin, Y. Penate, and L. Borrego, Contact urticaria due to phenoxy ethanol in an aftershave, Dermatitis., 20, E10 (2009). 11. S. Pfuhler and H. U. Wolf, Effects of the formaldehyde releasing preservatives dimethylol urea and diazolidinyl urea in several short-term genotoxicity tests, Mutation Res., 514, (2002). 12. S. H. Mandy, Contact dermatitis to substituted imidazolidinyl urea-a common preservative in cosmetics, Archs Derm., 110, 463 (1974). 13. A. Giacomettia et al., Antimicrobial activity of polycationic peptides, Peptides., 20, (1999). 14. A. Giacomettia, O. Cirionia, M. S. Del Pretea, F. Barchiesia, A. Mataloni Paggia, E. Petrellib, and G. Scalisea, Comparative activities of polycationic peptides and clinically used antimicrobial agents against multidrug-resistant nosocomial isolates of acinetobacter baumannii, J. Antimicrob. Chemother., 46, (2000). 15. M. Malmsten et al, Antimicrobial peptides derived from growth factors, Growth Factors, 25, (2007). 16. S. Maher and S. McClean, Melittin exhibits necrotic cytotoxicity in gastrointestinal cells which is attenuated by cholesterol, Biochem. Pharmacol., 75, (2008). 17. 이윤섭 and 최혜정, 지방산트리펩타이드염및이를함유하는항균조성물, 특허 (2012). 18. T. M. Taylor, S. Gaysinsky, P. M. Davison, B. D. Bruce, and J. Weiss, Characterization of antimicrobial-bearing liposomes by zeta-potential, vesicle size, and encapsulation efficiency, Food Biophysics, 2, 1-9 (2007). 19. O. Gortzi, S. Lalas, I. Chinou, and J. Tsaknis, Evaluation of the antimicrobial and antioxidant activities of Origanum dictamnus extracts before and after encapsulation in liposomes, Molecules, 12, (2007). 20. P. S. Malheiros, V. Sant Anna, M. S. Barbosa, A. Brandeli, and B. D. G. Melo Franco, Effect of liposome-encapsulated nisin and bacteriocin-like substance P34 on Listeria monocytogenes growth in Minas frescal cheese, Int. J. Food Microbiol., 156, (2012). 21. P. S. Malheiros, D. J. Daroit, and A. Brandeli, Food applications of liposome-encapsulated antimicrobial peptides, Trends in Food Science & Tech., 21, (2010). 22. T. M. Taylor, B. D. Bruce, J. Weiss, and P. M. Davidson, Listeria Monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 inhibition in vitro by liposome encapsulated nisin and ethylene diaminetetraacetic acid, J. Food Safety, 28, (2008). 23. J. K. Branen and P. M. Davison, Enhancement of nisin, lysozyme, and monolaurin antimicrobial activities by ethylene diaminetetraacetic acid and lactoferrin, Int. J. Food Microbiol., 90, (2004). 공업화학, 제 25 권제 6 호, 2014

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보도자료 년 5 월 16 일 ( 목 ) 조간부터보도하여주시기바랍니다. 문의 : 에너지환경표준과최철우과장, 류지영연구사 ( ) 화장품에도국제표준이...? - 화장품도이젠표준선점으로세계시장선도를 - [ 붙임 1 보도자료 http://www.motie.go.kr 2013 년 5 월 16 일 ( 목 ) 조간부터보도하여주시기바랍니다. 문의 : 에너지환경표준과최철우과장, 류지영연구사 (509-7272) 화장품에도국제표준이...? - 화장품도이젠표준선점으로세계시장선도를 - [ 붙임 1 참조 ] [ 붙임 2 참조 ] [ 붙임 3, 4 참조 ] 이보도자료와관련하여보다자세한내용이나취재를원하시면산업통상자원부기술표준원에너지환경표준과류지영연구사