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1 J Koren So Foo Si Nutr 한국식품영양과학회지 46(), ~9(7) RAW 64.7 대식세포와염증유도동물모델에서산겨릅나무추출물의항산화및항염증효과 이초은 정현희 조진아 이선영 충남대학교식품영양학과 In Vitro n In Vivo Anti-Oxitive n Anti-Inflmmtory Ativities of Extrts ho-eun Lee, Hyeon-Hee Jeong, Jin-Ah ho, n Sun Yung Ly Deprtment of Foo n Nutrition, hungnm Ntionl University ABSTRAT (ATM) is known s tritionl meiine for tretment of hepti isorers suh s heptitis, relte-inflmmtory isese, n hepti ner. In this stuy, we evlute the ntioxint n nti-inflmmtory effets of ATM extrte with 8 wter or 9% ethnol. Antioxint tivities of ATM extrts were mesure se on DPPH n ABTS ril svenging tivities, totl polyphenoli ompoun ontents, n ferri reuing ntioxint power. The nti-inflmmtory effets of ATM extrt were ssye on relese of nitri oxie, tumor nerosis ftor (TNF)-α, n interferon (IFN)-γ from lipopolyshrie ()-inue mrophges. In these experiments, 9% ethnol extrt of ATM showe stronger ntioxint n nti-inflmmtory effets thn wter extrt. Therefore, we etermine the effets of ATM ethnol extrt on n niml moel of sepsis. Seven ys orl gvge of ATM ethnol extrt followe y stimultion reue the protein levels of TNF-α n IFN-γ in serum s well s mrna levels of TNF-α n interleukin-6 in intestinl epithelil ells. In ition, ATM ethnol extrt reue DNA mge in mouse lymphoytes. These results inite tht ATM extrt hs strong ntioxint n nti-inflmmtory in vitro n in vivo effets n my e evelope s potentil foo mteril for prevention of inflmmtory iseses. Key wors:, ntioxint tivity, nti-inflmmtory tivity, niml moel of sepsis 서 인간을비롯한모든생물체에서는생체내정상세포의생화학반응이나여러환경오염및화학물질에노출되어생성된산화적스트레스요인인 superoxie ril, hyroxyl ril, peroxyl ril, hyrogen peroxie 등과같은활성산소종 (retive oxygen speies, ROS) 이생성된다. 이러한 ROS는세포막손상, 단백질분해등을일으켜세포손상을초래할뿐아니라염증반응과연결되어있으므로만성염증반응이유도되어심장병, 당뇨병, 관절염, 알츠하이머, 파킨슨병등과같은다양한질환의원인이되기도하며, DNA 손상에따른발암과정에도깊은관련이있는것으로보고되고있다 (,). 염증반응은생체내로유입된바이러스, 박테리아등외부항원의자극에의해손상을입었을때그손상에대해재생하려는조직반응 (3) 이지만그정도가과도하거나장기화 Reeive Septemer 6; Aepte 8 Otoer 6 orresponing uthor: Sun Yung Ly, Deprtment of Foo n Nutrition, hungnm Ntionl University, Dejeon 3434, Kore E-mil: sunly@nu..kr, Phone: 론 되면각종질환을유도하기때문에생명현상유지를위해서염증반응의조절은매우중요하다. 염증반응에서대식세포는중요한역할을하는데, 대식세포는모든조직에분포하면서병원체와암세포에대해방어능력을가질뿐만아니라, 염증유발물질이세포내로유입될때대식세포가빠르게활성화되어 nitri oxie(no), tumor nerosis ftor(tnf)- α, interleukin(il)-β, IL-6와같은다양한염증유발 ytokine과생리활성물질을분비하여면역반응을극대화시킨다 (4-6). 이후여러선행연구에서는천연항산화물질이나일부식물추출물들이염증반응유발물질인 lipopolyshrie() 를처리한 RAW 64.7 세포에서 OX- 나 inos의발현을억제함으로써 NO의생성을감소시켰으며, 동시에 TNF-α, IL-6 등의염증성매개물질들의합성을억제시키는효과를보였다고하였다 (7,8). 산겨릅나무 () 는단풍나무과 (Aeree) 의낙엽활엽소교목으로서참겨릅나무, 벌나무, 산청목, 봉목, 청해척으로알려져있으며국내중부이북의고산지대와만주, 우수리강유역의일부산지에만분포하고있다 (9). 이식물에서추출해낸추출물의주성분인 slirosie는위의손상과통증을억제하는성분으로보고되었

2 이초은 정현희 조진아 이선영 다. 산겨릅나무는 queretin, tehin 등과같은페놀계화합물을포함하고있어 (), 간보호 (,), 항염증 (3), 항산화 (4) 의효능이일부보고되어있다. 그러나대부분의연구는간보호효과에대한것으로그치며, 특히산겨릅나무추출물의항염증효과에대한연구는아직부족한실정이다. 따라서본연구는산겨릅나무열수및에탄올추출물의항산화활성과 RAW 64.7 세포에서의항염증효과를비교한후효능이더뛰어난추출물을이용하여 로염증을유도한동물모델에서항염증및 DNA 손상감소효과를검토하고자하였다. 더나아가동물의장점막세포를취하여염증성사이토카인발현억제효과를통해산겨릅나무추출물이장면역력강화에긍정적인영향을미치는지를확인함으로써산겨릅나무추출물의세포보호의기능적소재로서활용가능성을제시하고자하였다. 재료및방법산겨릅나무시료및추출본연구에사용한산겨릅나무는강원도홍천에서수거된산겨릅나무의가지로서, 분쇄 (Super Griner JL-, Joy Life o., Busn, Kore) 하여동결건조 (SFDSM-6Hz, Smwon Freezing Engineering o., Seoul, Kore) 한후사용하였다. 시료의에탄올추출물을얻기위해 9% 에탄올을가하여상온에서일주일간교반추출하였다. 추출액은여과지 (Avnte No., Toyo Roshi Kish, Lt., Tokyo, Jpn) 를사용하여여과한후 rotry vuum evportor (EYELA A-S, Tokyo Rikkiki o., Tokyo, Jpn) 로 에서감압농축하여 - 에서냉동보관하면서실험에사용하였다. 시료의열수추출물은산겨릅나무건조분말시료에증류수를가하여 8 에서 시간동안 3회반복추출한후여과하였다. 여액을모아 rotry vuum evportor(eyela A-S, Tokyo Rikkiki o.) 로 에서감압농축한후 - 에서냉동보관하면서실험에사용하였다. DPPH 라디칼제거능및 ABTS 라디칼제거능측정산겨릅나무열수및에탄올추출물을시료로 Blois법 () 으로 DPPH(,-iphenyl--pirylhyrzyl, Sigm- Alrih o., St. Louis, MO, USA) 에대한전자공여능을측정하였다. 6.,.,, µg/ml의농도별로희석한시료 ml에. mm DPPH 용액 ml를넣어교반하여암실에방치후, 7 nm에서흡광도를측정하였다. ABTS 라디칼제거능측정은 Pellegrini 등 (6) 의방법으로측정하였다. 7 mm ABTS[, -zinois(3-ethylenzothizoline- 6-sulfonte), Sigm-Alrih o.] 와 mm K S O 8 (Sigm-Alrih o.) 용액을잘혼합하여 solute ethnol과 :88 비율로섞은 ABTS solution 용액을사용하였다. 농도별로희석한시료 µl에 ABTS solution ml를 혼합하여암소에서반응시킨후 734 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼제거능과 ABTS 라디칼제거능을농도별로산출하여 I 값을구하였다. 양성대조시료로는 sori i를사용하였다. FRAP(ferri reuing ntioxint power) 및총폴리페놀함량측정추출물의 FRAP에의한환원력실험은 Benzie와 Strin 법 (7) 으로측정하였다. Soium ette uffer(ph 3., 3 mm) 와 mm TPTZ(,4,6-tris(-pyriyl)-s-trizine), mm Fel 3 6H O를각각 ::(v/v/v) 의비율로잘섞어 FRAP regent를제조하였다. 농도별로희석한시료와 FRAP regent 9 µl를혼합하여 37 에서 분간반응시킨후 93 nm에서흡광도를측정하였다. 양성대조시료로는 sori i를사용하였고,,.6,.,.,., mm의농도로제조한표준물질 FeSO 4 7H O 의검량곡선에따라 FRAP vlue를얻었다. 총폴리페놀함량은 Folin-Denis법 (8) 으로측정하였다. N Folin-iolteu s phenol regent(sigm-alrih o.) 시약과증류수를섞은혼합액과시료를 :로섞어암실에서방치한후, % soium ronte(n O 3, Junsei hemil o., Lt., huo-ku, Jpn) 3 ml를가해반응시킨후 76 nm에서흡광도를측정하였다. 이때페놀성화합물의함량은 glli i(sigm-alrih o.) 를표준물질로사용하여작성한표준검량곡선에대입하여산출하였다. 세포주및세포배양 RAW 64.7 세포 (mouse mrophge) 는한국세포주은행 (Koren ell Line Bnk, Seoul, Kore) 에서분양받아 % peniillin-streptomyin(sigm-alrih o.) 과 % fetl ovine serum(fbs; Gio, Grn Isln, NY, USA) 을포함하는 Duleo s moifie Egle s meium(dmem; Gio) 배지를사용하여 37, % O 조건의배양기 (BB, Thermo Fisher Sientifi In., Wlthm, MA, USA) 에서배양하였다. RAW 64.7 세포의 WST ssy 96 well plte에 RAW 64.7 세포를 4 ells/ml의농도로 µl씩분주하여 37, % O 배양기에서 4시간동안배양한후, 6.,.,,, µg/ml 농도의시료를 4시간처리하였다. 배양후 EZ-ytox WST ssy regent(deil L Servie o., Lt., Seoul, Kore) 를 μl씩첨가한후, 시간뒤에 ELISA reer(miroplte Asorne Spetrophotometer, Bio-R, Herules, A, USA) 를이용하여 4 nm에서흡광도를측정하였다. 산겨릅나무열수및에탄올추출물이처리된세포의생존정도는대조구의생존정도대비 % 로나타내었다.

3 RAW 64.7 대식세포와염증유도동물모델에서산겨릅나무추출물의항산화및항염증효과 3 RAW 64.7 세포의 nitri oxie(no) 및 ytokines(tnfα, IFN-γ) 분비량측정 RAW 64.7 세포현탁액을 4 ells/ml의농도로 48 well plte에 µl씩분주하여 37, % O 배양기에서 4시간동안배양한후 µg/ml 농도의 (from Esherihi oli :-4, ; Sigm-Alrih o.) 와산겨릅나무추출물을, 6.,.,,, µg/ml의농도로처리하여 4시간배양하였다. 세포로부터생성된 NO의함량은 Griess regent(sigm-alrih o.) 시약을이용하여측정하였다. 표준물질로는 NNO (soium nitrite, Sigm-Alrih o.) 를사용하였다. TNF-α 생성량측정은추출물을처리한세포의배양액에서 TNF-α ELISA kit(t No. 834, BD Biosienes, Sn Jose, A, USA) 을사용하여측정하였다. INF-γ 생성량측정역시추출물과의배양후상층액을얻어 INF-γ ELISA kit(t No. 38, BD Biosienes) 을사용하여측정하였다. TNFα 및 INF-γ 모두흡광도는 4 nm에서측정하였다. 실험동물설계및시료수집 RAW 64.7 세포를대상으로 in vitro 실험에서확인한항염증효능을 투여염증 moel mouse에서확인하고자동물실험을수행하였다. 본실험에사용한동물은평균체중이 4.±3.99 g인 IR계의수컷 mouse(smtko o., Osn, Kore) 로서사육환경은온도 4±, 습도 ±%, 명암은 시간간격, 조도는 ~3 lux로유지하였다. 사육기간동안일반고형사료와물을충분히공급하였으며동물실험의모든과정은충남대학교동물실험윤리위원회의연구계획서승인 (NU-74) 을받고수행하였다. 실험동물은군당 3마리씩 군으로나누어대조군과실험군으로하였다. 실험전에같은조건의 IR mouse에 를투여하여혈중 TNF-α와 IFN-γ가증가하는것을확인하였다. 대조군에는멸균 PBS μl/mouse를, 실험군에는 9% 산겨릅나무에탄올추출물을 mg/kg oy weight 의용량으로 PBS에녹여매일같은시간에 7일간경구투여하였다. 대조군은 (ontrol) 로, 실험군은 ATE(Aer tegmentosum Mxim ethnol extrt) 로명명하였다. 마지막경구투여후 시간절식시킨동물에 를. mg/kg B.W 용량으로복강투여하였다. 투여 8시간후에미정맥에서혈액을채혈한후소장을적출하였다. 혈액일부는헤파린처리된튜브 (Heprinize pillry Tues; t No., Kimle hse Life Siene n Reserh Prouts LL., Rokwoo, TN, USA) 를이용하여전혈상태로 omet ssy에사용하였고, 나머지혈액은 4,, rpm에서 분간원심분리하여혈청을분리한후 - 에서보관하여실험에사용하였다. 적출한소장은잘라펼치고 Pyer s pth를제거한후 3 m 정도의크기로잘라 Duleo s phosphte uffere sline(pbs; Gio) 으로 3회세척하였다. 소장절편을 mm ithiothreitol (DTT; Bio-R) 와혼합하여실온에서 분간처리하여점액질을제거한후 37 Shking wter th(any-3d-s, Seoulin Biosiene o., Seongnm, Kore) 에 Dispse Ⅱ (DISPASE Ⅱ, Goo Shusei o., Lt., Tokyo, Jpn) 로 3분간처리하여점막세포를분리하였다. 분리된점막세포를수거하여 µm ell striner(bd Biosienes) 에여과한후, rpm에서 분간원심분리하여 ell pellet을얻어 RNA 추출에사용하였다. 림프구 DNA frgmenttion 분석 (single-ell eletrophoresis ssy: omet ssy) 실험동물들의림프구 DNA 손상을측정하기위해 omet ssy를실시하였으며그방법은선행연구인 Tie 등 (9) 의방법을참고하여수행하였다. 간략하면시료로전혈 µl를취해.% norml melting grose(nma) 가도포된 slie 위에분주하고 over glss로덮어굳힌후 lkli lysis uffer(. M Nl, mm N EDTA, mm Tris) 를처리하여 DNA의이중나선을풀어주었다.Lysis 가끝난 DNA 시료에대하여 분간전기영동을실시하여 DNA를 unwining 시켰다.omet 분석을위해 µg/ml ethiium romie로형광염색한후광학현미경 (light mirosope DM, Lei Mirosystems, Wetzlr, Germny) 으로관찰하였으며, Komet. imge nlyzing system(anor, Nottinghm, UK) 으로분석하여손상된 DNA 분절이핵으로부터이동해서생긴꼬리부분의 DNA 비율 (til DNA), til length(tl), 그리고 til DNA와 til length로부터산출된 til moment(tm) 로나타내었다. 혈청 ytokines(tnf-α, IFN-γ) 분비량측정혈청의염증관련 ytokine으로 TNF-α 및 INF-γ 생성량을측정하였다. TNF-α는혈청을.배희석한후 TNFα ELISA kit(t No. 834, BD Biosienes) 을이용해상기한방법대로측정하였다. IFN-γ는혈청을 배희석한후 IFN-γ ELISA kit(t No. 38, BD Biosienes) 을이용해상기한방법대로측정하였다. Totl RNA 추출및 DNA 합성장점막세포 (intestinl epithelil ell) 용액에 Tri-regent(BioFAT o., Dejeon, Kore) 3 µl를넣고 분간정치한후, hloroform 6 µl를넣고 분간정치하여원심분리하여얻은상층액을 isopropnol µl와혼합하였다. 분간실온에정치한후, g에서 8분간원심분리하여 RNA pellet을얻었다. RNA pellet에 7% 에탄올을 3 µl 넣어잘섞은후, g에서 분간원심분리하여상층액을제거한다음실온에서 ~3분간건조시켰다. RNse free wter를 7 µl 넣어잘섞은후 의 wter th 에서 분간방치시켰다. RNA 정량은 NnoDrop (NnoDrop ONE, Thermo Fisher Sientifi In.) 을이용

4 4 이초은 정현희 조진아 이선영 하였다. DNA 합성은 RT-Kit(M-MLV, RNse H - (Bio FAT o., Dejeon, Kore) 을이용하여제시된방법대로하였으며, 역전사에의한 DNA synthesis는 에서 6 분간, RTse intivtion은 9 에서 분간처리하였다. TNF-α와 IL-6 mrna 발현측정장점막세포의 TNF-α와 IL-6 mrna의발현정도의측정은 iq SYBR R Green Supermix(Bio-R) 를이용하여 AriMx Rel-Time PR System(Agilent Tehnologies, Snt lr, A, USA) 에서진행하였다. Initil enturtion은 9 에서 분간, enturing은 9 에서 초간, nneling 및 extension은 8 에서 3초간진행하여총증폭주기는 yle을실행하였다. 측정결과는 AriMX P Softwre. Instller(Agilent Tehnologies) 를사용하여분석하였다. 실험에사용한 primer는 Tle 과같다. 통계처리실험결과의통계처리는 SPSS/Winows version. (IBM orportion, New York, NY, USA) 을사용하여실시하였으며, 결과는평균 ± 표준편차 (men±sd) 로나타내었다. 두군간평균값의차이에대한유의성검증은 Stuent s t-test로실시하였으며, 그외의실험에서는일원배치분산분석 (one-wy ANOVA) 후 Dunn s multiple rnge test 로변인간의차이를검증하였다. 모든통계적인유의성은 α=. 수준에서검증하였다. 결과및고찰산겨릅나무추출물의항산화활성산겨릅나무열수추출물및에탄올추출물의수율은각각.3%,.7% 로열수추출물이에탄올추출물보다높은수율을나타내었다 ( 데이터미제시 ). 산겨릅나무열수및에탄올추출물과 sori i의 DPPH 및 ABTS 라디칼제거능을측정한결과는 Tle 와같다. DPPH 라디칼제거능을측정한결과산겨릅나무열수및에탄올추출물모두농도의존적으로라디칼제거능이증가하는경향을보였으며, μg/ml의농도에서각각 48.74±.79%, 69.3±.3% 의제거능을나타내었다. ho 등 () 의연구결과에서산겨릅나무열수추출물 μg/ml 농도에서약 43% 의라디칼제거능을나타낸것으로보아본연구결과의열수추출물이약.3배, 에탄올추출물이약.6배높은항산화능을나타내었다. 산겨릅나무열수및에탄올추출물의 I 값은각각.74±.83 μg/ml, 33. ±.73 μg/ml로나타나에탄올추출물은열수추출물보다높은항산화능을보였다 (P<.). 산겨릅나무열수및에탄올추출물의 ABTS 라디칼제거능을측정한결과는 µg/ml의농도에서각각 8.9±.6%, 4.4±8.% 였으며, I 값은 4.74±9.4 µg/ml, 6.3±.3 µg/ml였 Tle. PR primer sequenes Gene Primer Sequene ) β-atin TNF-α IL-6 ) Primers re shown 3. Forwr Reverse Forwr Reverse Forwr Reverse GG TGT ATT T AT G A GTT GGT AA AAT G ATG T AT TT T AAA ATT GA GTG AA A TGG GAG TAG AA AGG TA AA TG AA GAG AT T AT AG AGT GGT ATA GA AGG TT GTT GG Tle. DPPH n ABTS ril svenging tivity of extrts DPPH ril svenging tivity ABTS ril svenging tivity Smples onentrtion (μg/ml) Svenging tivity (%) I (μg/ml) ) wter extrts 48.74±.79 ).74±.83 9% ethnol extrts 69.3±.3 33.±.73 Asori i 36.69± ±.8 wter extrts 9% ethnol extrts 8.9± ± ±8. 6.3±.3 Asori i.±.3.9±.6 ) The onentrtion in μg/ml require for % reution of DPPH n ABTS ril. ) Men±SD (n=3). *** P<., ** P<.. t-vlue *** 7.84 **

5 RAW 64.7 대식세포와염증유도동물모델에서산겨릅나무추출물의항산화및항염증효과 Tle 3. FRAP vlue n totl polyphenol ontents of Aer tegmentosum Mxim extrts Smple FRAP vlue (mm) Polyphenol ontents (μg/mg GAE) ) wter extrts.9±. ) 8.9±.8 9% ethnol extrts.4±. 96.9±.3 t-vlue *** *** ) GAE: glli i equivlents. ) Men±SD (n=3). *** P<.. 다. 앞에서보고된 DPPH 라디칼제거능에서보인결과와마찬가지로산겨릅나무열수추출물보다에탄올추출물의항산화효과가더높은것으로나타났다 (P<.). ABTS 라디칼제거능보다 DPPH 라디칼제거능이모든추출물에서높게나왔는데이차이는 DPPH 는자유라디칼이고, ABTS 는양이온자유라디칼이므로항산화성분의화학적특성에따라각라디칼과결합하는활성에차이가있기때문 () 이라고보고있다. FRAP와총페놀함량을측정한결과는 Tle 3에나타내었다. DPPH 라디칼제거능이나 ABTS 라디칼제거능과는달리 FRAP는환원제에의해산성 ph에서 ferri tripyriyltrizine(fe 3+ -TPTZ) 복합체가 ferrous tripyriyltrizine(fe + -TPTZ) 으로전환되는과정을이용하여시료의항산화활성을평가하게된다 (,3). 산겨릅나무열수및에탄올추출물의 FRAP vlue는각각.9±. mm,.4±. mm로산겨릅나무에탄올추출물의 FRAP vlue가열수추출물보다높았다 (P<.). Glli i equivlents(gae) 로표시한산겨릅나무열수및에탄올추출물의총폴리페놀함량은각각 8.9±.8 μg/mg, 96.9±.3 μg/mg이었다. 본연구에서산겨릅나무에탄올추출물이열수추출물보다총폴리페놀함량및 FRAP vlue가더높게나왔는데, 이는 Sánhez-González 등 (4) 이총폴리페놀함량과 FRAP vlue가높은상관관계가있다고보고한것과일치한다. hoi 등 () 의연구에서는산겨릅나무열수추출물및에탄올의총폴리페놀함량이각각 7.93±. μg/mg,.69 ±. μg/mg으로나타났으나본연구에서는에탄올추출물의총폴리페놀함량이더높게나타났다. 이는 hoi 등 () 의연구에서는산겨릅나무에탄올추출물은 7% 에탄올로 4시간동안추출했지만, 본연구에서는 9% 에탄올로일주일간추출하는등에탄올의농도및추출시간이다르기때문으로판단된다. 산겨릅나무와마찬가지로단풍나무과인신나무의추출물및분획물을대상으로항산화실험을시행한 Hn 등 (6) 의선행연구결과와비교하여볼때전반적으로산겨릅나무추출물이더강한활성을나타내었다. RAW 64.7 세포에서세포독성평가산겨릅나무열수및에탄올추출물의세포독성실험은 WST ssy를통해측정하였으며결과는 Fig. 에나타내었다. 대조군에비하여세포생존율이 9% 이상인시료농도를무독성안전농도로간주하는데, 산겨릅나무열수추출물은모든농도에서 % 이상의생존율을보여독성은없는것으로확인되었다. 산겨릅나무 9% 에탄올추출물은 μg/ml의농도를제외한모든농도에서 % 이상의생존율을보여독성이없었으나 μg/ml의농도에서는세포생존율이 87.6% 로약간낮게나타났다. 그러나본연구에서는산겨릅나무열수및에탄올추출물의농도범위 ~ μg/ml에서시료로사용하였다. RAW 64.7 세포에서산겨릅나무추출물의항염증효과산겨릅나무열수및에탄올의항염증측정결과는 Fig. 에나타내었다. NO는반응성이강한이원자자유라디칼로, NO를형성하는 inos들은 L-rginine을 L-itrulline으로전환하면서 NO를생성하는데, 이것은인체에서중요한생리적혹은병적인반응에관여한다 (7). 는그람음성세균의세포벽물질로서산화적스트레스를유발하며면역세포등을자극하여 NO 생성을증가시킨다고알려져있다 A ell viility (%). 8 6 B ell viility (%). 8 6 N 6.. onentrtion (μg/ml) N 6.. onentrtion (μg/ml) Fig.. Effet of the (A) wter (lose r) n (B) 9% ethnol (hthe r) extrts of on RAW 64.7 ell viility. RAW 64.7 mrophges were trete with wter n 9% ethnol extrts of (6.,.,,, μg/ml) for 4 h. Trete ells were estimte y the WST ssy. Eh r represents the men±sd. Mens with ifferent letters (-) ove the rs re signifintly ifferent y Dunn s multiple rnge test t α=.. N: norml.

6 6 이초은 정현희 조진아 이선영 A NO proution (μm) NO Proution (μm) N 6.. onentrtion (μg/ml) N 6.. onentrtion (μg/ml) B TNF-α (ng/ml) TNF-α (ng/ml) N 6.. onentrtion (μg/ml) N 6.. onentrtion (μg/ml) 3 e 3 IFN-γ (ng/ml). 3 IFN-γ (ng/ml). 3 N 6.. onentrtion (μg/ml) N 6.. onentrtion (μg/ml) Fig.. Effet of the wter (lose r) n 9% ethnol (hthe r) extrts of on (A) NO proution y -stimulte RAW 64.7 mrophges, (B) TNF-α proution y -stimulte RAW 64.7 mrophges, () IFN-γ proution y -stimulte RAW 64.7 mrophges. RAW 64.7 mrophges were trete with wter n 9% ethnol extrts of (, 6.,.,,, μg/ml) n ( µg/ml) for 4 h. Eh r represents the men±sd. Mens with ifferent letters (-e) ove the rs re signifintly ifferent y Dunn s multiple rnge test t α=.. N: norml. (8). 따라서본연구에서는 를처리하여 RAW 64.7 세포에염증을유도하여 NO를과생성하는조건을형성한후, 산겨릅나무열수및에탄올추출물을처리하여 NO 생성억제에미치는영향을측정하였다. 만단독적으로처리한대조군에서생성된 NO 농도는 4.7±.9 μm로 를처리하지않은정상대조군.±.69 μm보다.3배이상높아 (P<.) 에의해염증반응이충분히유도되었음을확인하였다. 와산겨릅나무열수추출물로함께처리한군에서는 μg/ml의농도에서만 단독처리군보다 NO 생성이유의하게억제되었으나, 산겨릅나무 9% 에탄올추출물처리군에서는,, μg/ml의농도에서 단독처리군보다 NO 생성이유의하게억제되었다. TNF-α 측정결과 만단독적으로처리한음성대조군에서 9.9±. ng/ml로높은 TNF-α 분비량을보였으며산겨릅나무추출물처리시 TNF-α 분비는음성대조군에비하여두추출물의모든농도에서유의하게감소했다 (P<.). 산겨릅나무열수및에탄올추출물을 μg/ml의농도로처리하였을때 7.7±.4 ng/ml, 7.7±.6 ng/ ml의분비를보여음성대조군대비각각 4%, % 의억제효과를보였다. Yu 등 (3) 은 RAW 64.7 세포는 처리로 TNF-α의 mrna 수준이증가하였으나, 산겨릅나무 7% 에탄올추출물을처리함에따라 TNF-α의 mrna 수준이

7 RAW 64.7 대식세포와염증유도동물모델에서산겨릅나무추출물의항산화및항염증효과 7 크게감소하였다고보고하였는데이는본연구결과와유사하였다. 추출물처리가 INF-γ 억제에영향을미치는지확인하기위해실험을수행한결과 만단독적으로처리한음성대조군에서 34.6±.8 ng/ml로높은 IFN-γ 분비량을보였으나 와산겨릅나무열수및에탄올추출물을함께처리한모든농도에서 IFN-γ 분비량이유의하게억제되었으며 (P<.), 에탄올추출물이열수추출물보다억제효과가높았다. 따라서본연구에서의항염증실험결과로보아산겨릅나무열수및에탄올추출물은염증관련사이토카인들을억제함으로써염증질환예방에효과적일것으로판단되며, 산겨릅나무에탄올추출물이열수추출물보다더효과적인것으로나타났다. 염증유도동물모델에서산겨릅나무에탄올추출물의항산화및항염증효과산겨릅나무열수및에탄올추출물의항산화실험과 RAW 64.7 세포에서의실험결과를종합해보았을때산겨릅나무열수추출물보다산겨릅나무에탄올추출물의효과가우수하였으므로산겨릅나무에탄올추출물만을이용하여동물실험을통하여생리활성을확인하였다. omet ssy를이용한산겨릅나무에탄올추출물의 에의한산화적 DNA 손상억제효과에대한결과는 Tle 4에나타내었다. Til DNA의경우대조군과유의한차이를보이진않았지만대조군보다낮은경향을보였다 (P=.6). Til length는산겨릅나무에탄올추출물투여군이대조군보다유의하게짧았으며 (P<.), til moment 역시산겨릅나무에탄올추출물투여군이대조군보다유의하게감소하였다 (P<.). 이상의결과에서산겨릅나무에탄올추출물은산화적스트레스에대한보호효과가있는것으로판단되었다. TNF-α는대식세포에서합성되고감염, 염증에관여하여 Tle 4. Levels of DNA mge expresse s til DNA, til length, n til moment in mouse whole loo trete 9% ethnol extrts of Tretment ) ATE P-vlue Til DNA (%) Til length (μm) Til moment.8±.3 ) 39.4±..4±.8 7.4±.9.38±..68± ) (ontrol): trete with. mg/kg oy weight for 8 h, ATE: trete with 9% ethnol extrts of Aer tegmentosum Mxim ( mg/kg oy weight) for seven ys n. mg/kg oy weight for 8 h. ) Men±SD (n=3). 종양괴사인자로암세포괴사, 조직손상, 다른사이토카인의발현등에역할을하는사이토카인이며 (9,3), INF-γ는내재면역반응에관여하는대식세포를활성화시키는역할을하는사이토카인으로알려져있다 (3). 로염증을유도한실험동물모델의혈청에서 TNF-α 및 IFN-γ의농도를측정한결과는 Fig. 3에나타내었다. TNF-α의생성량은 만투여한대조군보다시료를함께투여한실험군에서대조군의 3% 로유의하게낮게나타났다 (P<.). IFN-γ 생성량은대조군보다실험군에서대조군의약 % 로유의하게낮게나타났다 (P<.). 동물실험결과 주일정도의단기간산겨릅나무에탄올추출물의투여로 TNF-α와 IFNγ와같은염증관련 ytokine의생성이억제되어산겨릅나무에탄올추출물은염증질환예방에효과적인기능성소재로판단된다. Jin 등 (3) 의연구에서 rt의스트레스를높이기위하여강제수영실험을하였는데, 산겨릅나무 7% 에탄올추출물을처리한후강제수영실험을시킨실험군은추출물을처리하지않고강제수영실험만시킨대조군보다 IL-6 및 TNF-α 분비량을유의적으로억제하는효과를보였다. 다만고농도의산겨릅나무에탄올추출물은세포독성을나타낼수있으므로향후안전성에대한연구가더진행되어야할것으로보인다. A 6 B 3 3 TNF-α (pg/ml). 8 6 ** IFN-γ (pg/ml). * Tretment ATE Tretment ATE Fig. 3. Effet of the 9% ethnol extrts of on serum TNF-α proution (A) n IFN-γ proution (B) in -stimulte IR mouse. IR mie were trete with 9% ethnol extrts of ( mg/kg oy weight) for seven ys n (. mg/kg oy weight) for 8 h. Eh r represents the men±sd, n=3 (eh group). Men with n sterisk is signifintly ifferent from ontrol y Stuent s t-test ( * P<., ** P<.). : ontrol (trete with PBS for seven ys n. mg/kg oy weight for 8 h, ATE: trete with 9% ethnol extrts of ( mg/kg oy weight) for seven ys n. mg/kg oy weight for 8 h.

8 8 이초은 정현희 조진아 이선영 A B Reltive mrna expression. of TNF-α... Reltive mrna expression. of IL-6... Tretment ATE Tretment Fig. 4. Effet of the 9% ethnol extrt of on (A) reltive mrna expression of TNF-α n (B) reltive mrna expression of IL-6 in -stimulte IR mouse intestinl epithelil ells. Effets of ethnol extrt on the ytokine expression n proution of inflmmtory meitors in IR mie. Totl RNA ws prepre from the intestinl epithelil of IR mie were trete with 9% ethnol extrts of ( mg/kg oy weight) for seven ys n (. mg/kg oy weight) for 8 h n qpr ws performe. Eh r represents the men±sd, n=3 (eh group). : ontrol (trete with PBS for seven ys n. mg/kg oy weight for 8 h), ATE: trete with 9% ethnol extrts of ( mg/kg oy weight) for seven ys n. mg/kg oy weight for 8 h. ATE 산겨릅나무에대한간보호효과 (,) 는잘알려져있지만, 인간면역세포의약 7~8% 가밀집되어있는장점막세포에서의면역기능과연관된연구결과는거의없는실정이다. 따라서산겨릅나무에탄올추출물이장점막세포에서염증성사이토카인의발현을억제함으로써염증증상을완화시킬수있는지알아보기위하여장점막세포에서대조군과실험군의 TNF-α와 IL-6의상대적인 mrna 발현량을비교하였으며결과는 Fig. 4와같다. 처리로인해발현이높아진 IR mouse의장점막세포에서 TNF-α와 IL-6의 mrna 발현은산겨릅나무에탄올추출물에의해감소하는경향을보였다. 대조군대비실험군의 TNF-α mrna 발현량은 9%, 대조군및실험군의 IL-6 mrna 발현량은 6% 로산겨릅나무에탄올추출물은 에의해증가한 TNF-α 및 IL-6의 mrna 발현을억제하는경향을보였으며 TNFα보다 IL-6의 mrna 발현이더크게나타났다. 소화기관의점막에분포하는세포중 ~% 는대식세포이며, 이세포가활성화되면 TNF-α와 IL-6 등을분비한다 (33). 대식세포는 처리시 NF-κB를활성화하여 TNF-α와 IL-6, IL-β와같은사이토카인들의발현을유도하는것으로알려져있다 (34). 그러므로산겨릅나무추출물을투여받은 mouse의소장점막세포에서 TNF-α와 IL-6의 mrna 발현량이감소하였다는사실은산겨릅나무에탄올추출물이염증성사이토카인의유전자발현단계를조절하여이들사이토카인의생성을억제할수있음을의미하며, 장의염증증상완화에대한긍정적인영향을확인하기위해서는더욱많은추가연구가수행되어야할것으로생각한다. 요약산겨릅나무 8 열수및 9% 에탄올추출물을제조하여항산화및항염증효과를확인한결과추출물은우수한항산 화효과를나타내었고 RAW 64.7 세포에서도항염증효과를보였으며, 그중 9% 에탄올추출물의효능이더큰것으로나타났다. 따라서효능이더뛰어난산겨릅나무에탄올추출물을이용하여 in vivo 실험에서추출물의세포보호효과및항염증효능을재확인하였다. IR mouse에일주일간 mg/kg B.W 산겨릅나무에탄올추출물을경구투여한후 를처리하여염증반응및산화적스트레스를유도시켜 omet ssy, serum tumor nerosis ftor(tnf)- α와 interferon-γ, 장점막세포에서의 TNF-α와 interleukin-6에대한생성능을측정한결과산겨릅나무에탄올추출물은 DNA 손상을억제하였으며사이토카인생성을유의적으로억제하여항산화와항염증효과를보였다. 따라서본연구에서사용한산겨릅나무의에탄올추출물은산화적스트레스및염증을억제하는효과를나타내는세포보호기능적소재로서가능성이있는것으로생각한다. 감사의글 본연구는충남대학교학술연구비지원에의해수행되었으며, 이에감사드립니다. REFERENES. Vlko M, Leifritz D, Monol J, ronin MT, Mzur M, Telser J. 7. Free rils n ntioxints in norml physiologil funtions n humn isese. Int J Biohem ell Biol 39: Hlliwell B, Gutterige J Free rils in iology n meiine. Oxfor University Press o., New York, NY, USA. р Olefsky JM, Glss K.. Mrophges, inflmmtion, n insulin resistne. Annu Rev Physiol 7: Vlleor AF, oml M, Sntmrí-Bi LF, Lloers J, el A.. Mrophge proinflmmtory tivtion

9 RAW 64.7 대식세포와염증유도동물모델에서산겨릅나무추출물의항산화및항염증효과 9 n etivtion: question of lne. Av Immunol 8: -.. Jung SH, Kim SJ, Jun BG, Lee KT, Hong SP, Oh MS, Jng DS, hoi JH. 3. α-yperone, isolte from the rhizomes of yperus rotunus, inhiits -inue OX- expression n PGE proution through the negtive regultion of NFκB signlling in RAW 64.7 ells. J Ethnophrmol 47: Yu A, Prk HY, Kim YS, H SK, Hong HD, hoi HD.. Immuno-enhning effet of see extrts on RAW 64.7 mrophge ell line. J Koren So Foo Si Nutr 4: Shn J, Fu J, Zho Z, Kong X, Hung H, Luo L, Yin Z. 9. hlorogeni i inhiits lipopolyshrie-inue ylooxygense- expression in RAW64.7 ells through suppressing NF-κB n JNK/AP- tivtion. Int Immunophrmol 9: Lee EJ, Kim, Kim JY, Kim SM, Nm D, Jng HJ, Kim SH, Shim BS, Ahn KS, hoi SH, Jung SH, Ahn KS.. Inhiition of -inue inflmmtory iomrkers y ethyl ette frtion of Ptrini siosefoli through suppression of NF-κB tivtion in RAW 64.7 ells. Immunophrmol Immunotoxiol 34: Kim T The wooy plnts of Kore in olor. Kyo-Hk Pulishing o., Seoul, Kore. p Prk KM, Yng M, Lee KH, Kim KR, hoi SU, Lee KR. 6. ytotoxi phenoli onstituents of Aer tegmentosum mxim. Arh Phrm Res 9: Lee S, Moon G.. Effets of mixture with Hoveni ulis Thun n on liver filure inue y D-gltosmine in rts. J Koren Orient Int Me 3: -4.. Lee SB, Woo HJ.. A stuy of the inhiitory effet of Aer tegmentosum Mx. on firogenesis in hepti stellte ell line T6. J Koren Orient Int Me 3: Yu T, Lee J, Lee YG, Byeon SE, Kim MH, Sohn EH, Lee YJ, Lee SG, ho JY.. In vitro n in vivo nti-inflmmtory effets of ethnol extrt from Aer tegmentosum. J Ethnophrmol 8: Tung NH, Ding Y, Kim SK, Be K, Kim YH. 8. Totl peroxyl ril-svenging pity of the hemil omponents from the stems of. J Agri Foo hem 6: -4.. Blois MS. 98. Antioxint etermintions y the use of stle free ril. Nture 8: Pellegrini N, Re R, Yng M, Rie-Evns Sreening of ietry rotenois n rotenoi-rih fruit extrts for ntioxint tivities pplying, -zinois(3-ethyleneenzothizoline-6-sulfoni i ril tion eoloriztion ssy. Methos Enzymol 99: Benzie IF, Strin JJ The ferri reuing ility of plsm (FRAP) s mesure of ntioxint power : the FRAP ssy. Anl Biohem 39: Folin O, Denis W. 9. On phosphotungsti-phosphomolyi ompouns s olor regents. J Biol hem : Tie RR, Agurell E, Anerson D, Burlinson B, Hrtmnn A, Koyshi H, Miyme Y, Rojs E, Ryu J, Sski YF.. Single ell gel/omet ssy: guielines for in vitro n in vivo geneti toxiology testing. Environ Mol Mutgen 3: 6-.. ho EK, Jung KI, hoi YJ.. Anti-ieti, lohol metolizing enzyme n heptoprotetive tivity of Aer tegmentosum Mxim. stem extrts. J Koren So Foo Si Nutr 44: Wng M, Li J, Rngrjn M, Sho Y, LVoie EJ, Hung T, Ho T Antioxitive phenoli ompouns from sge (Slvi offiinlis). J Agri Foo hem 46: Lee HR, Jung BR, Prk JY, Hwng IW, Kim SK, hoi JU, Lee SH, hung SK. 8. Antioxint tivity n totl phenoli ontents of grpe juie prouts in the Koren mrket. Koren J Foo Preserv : Arno MB, no A, Aost M.. The hyrophili n lipophili ontriution to totl ntioxint tivity. Foo hem 73: Sánhez-González I, Jiménez-Esrig A, Sur-lixto F.. In vitro ntioxint tivity of offees rewe using ifferent proeures (Itlin, espresso n filter). Foo hem 9: hoi JH, Lee SH, Prk YH, Lee SG, Jung YT, Lee IS, Prk JH, Kim HJ. 3. Antioxint n lohol egrtion tivities of extrts from.. J Koren So Foo Si Nutr 4: Hn SS, Lo S, hoi YH, Kim MJ, Kwk SS Antioxitive ompouns in extrts of Aer ginnl Mx. J rop Si Biotehnol 7: Lee HJ, Lee W, hoi MS, Son DJ, Hong JT. 6. Effets of estheti essentil oils on -inue nitri oxie genertion in murine mrrophge RAW 64.7 ells. J So osmet Sientists Kore 3: Yoshitke J, Kto K, Yoshiok D, Sueishi Y, Sw T, Akike T, Yoshimur T. 8. Suppression of NO proution n 8-nitrogunosine formtion y phenol-ontining enorineisrupting hemils in -stimulte mrophges: involvement of estrogen reeptor-epenent or -inepenent pthwys. Nitri Oxie 8: Beutler BA, Milsrk IW, ermi A. 98. hetin/tumor nerosis ftor: proution, istriution, n metoli fte in vivo. J Immunol 3: Beutler B, ermi A hetin: more thn tumor nerosis ftor. N Engl J Me 36: Hywr AR, hmur K, osyns M.. Interferon-gmm is require for innte immunity to ryptosporiium prvum in mie. J Infet Dis 8: Jin BM, Lee GH, Hyun KY. 4. Antiepressnt effet of on fore swimming test in the rt. J KAIS : Vne JR, Mithell JA, Appleton I, Tomlinson A, Bishop- Biley D, roxtll J, Willoughy DA Inuile isoforms of ylooxygense n nitri-oxie synthse in inflmmtion. Pro Ntl A Si U S A 9: Ji G, Zhng Y, Yng Q, heng S, Ho J, Zho X, Jing Z.. Genistein suppresses -inue inflmmtory response through inhiiting NF-κB following AMP kinse tivtion in RAW 64.7 mrophges. PLoS ONE 7: e3.

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,