본초학표지

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서화 금
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1 大韓本草學會誌제 29 권제 5 호 (2014 년 9 월 ) Kor. J. Herbology 2014;29(5):83-90 ISSN (Print), ISSN (Online) 黃連추출물의항염효능에관한연구 이전우 1#, 한효상 2, 이영종 1* 1 : 가천대학교한의과대학본초학교실, 2 : 중부대학교보건행정학과 Anti-inflammatory Effect of Coptidis Rhizoma Extract Jeon-Woo Lee 1#, Hyo-Sang Han 2, Young-Jong Lee 1* 1 : Department of Herbology, College of Oriental Medicine, Gachon University Seongnam , Korea 2 : Department of Health Administration, College of Social Sciences, Joongbu University Geumsan , Korea ABSTRACT Objectives : This research has been done to investigate the anti-inflammatory effect of Coptidis Rhizoma extracts. Method : Coptidis Rhizoma was extracted by 100 water. The extract (CC : Extract of Coptis chinensis rhizome) was used to examine its effects on the cell viability of mouse macrophage Raw cell line. Also the production of nitric oxide (NO), the c-jun N-terminalkinase (JNK) activation and the production of cytokines such as (IL)-5 were evaluated in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated Raw cells. After the CC and LPS were applied to Raw cells which were cultured for 24 hours, the MTT assay was performed. Result : The CC extracts didn't affect the viability of macrophage cells. However, the extracts inhibited the NO production and the JNK activation significantly in LPS-stimulated macrophage cells treated with 100 and 200 μg /ml concentrations. The CC extract, also, impeded the production of inflammation-related factors and cytokines such as KC, VEGF, MCP-1, GM-CSF, IL-1α, IL-5, IL-6, and IL-12p40 in LPS-stimulated macrophage cells at the concentration higher than 25 μg /ml. The production of basic-fgf concentration of 50 and 100 μg /ml, the production of IP-10 at 100 μg /ml, and the production of IFN-γat 25 μg /ml, respectively. Conclusion : The CC prepared using 100 water showed the significant anti-inflammatory effect such as the inhibition not only on the production of NO, KC, VEGF, MCP-1, GM-CSF, IL-1α, IL-5, IL-6, and IL-12p40 in LPS-stimulated macrophage cells at or higher than the concentration of 25 μg /ml, but also on the JNK activation at 100 and 200 μg /ml. Key words : Coptidis Rhizoma, macrophage cells, cytokine, nitric oxide, JNK 서론 1) 黃連은 神農本草經 1) 에 " 黃連味苦寒. 主熱氣, 目痛, 眦傷, 泣出, 明目, 腸澼, 腹痛, 下利, 婦人陰中腫痛. 久服, 令人不忘. 一名王連. 生川谷." 이라처음收載된이래한의학임상에서瀉火, 燥濕, 解毒, 殺蟲 2) 의효능이있어서心經實熱, 卒熱心痛, 肝火爲痛, 熱毒血痢, 冷熱諸痢, 小兒疳熱, 陽毒發狂, 骨節積熱, 消渴尿多, 下痢腹痛, 臟毒下血, 酒痔下血, 吐血部止, 眼目諸病, 口舌生瘡등을치료하는처방에사용되고있다 3). 황련의기원으로 대한약전 4) 에는미나리아재비과 (Ranunculaceae) 에속한황련 ( 日黃連 ) Coptis japonica Makino, 중국황련 ( 中國黃連 ) Coptis chinensis Franchet, 삼각엽황련 ( 三角葉黃連 ) Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao 또는운련 ( 雲連 ) Coptis teeta Wallich 으로되어있다. *Corresponding author : Young-Jong Lee. Department of Herbology, College of Oriental Medicine, Gachon University Seongnam , Korea Tel : garak@gachon.ac.kr #First author : Jeon-Woo Lee. Department of Herbology, College of Oriental Medicine, Gachon University Seongnam , Korea Tel : ondal7@hanafos.com Received:18 August 2014 Revised:13 September 2014 Accepted:15 September 2014

2 84 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 5, 2014 성분으로日黃連 C. japonica Makino 의뿌리줄기에는 berberine 5.56%-7.25%, coptisine, epiberberine, berberrubine, palmatine, jatrorrhizine, worenine, magnoflorine, ferulic acid, obakunone, obakulactone 등이함유되어있고, 三角葉黃連 C. deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao 뿌리줄기에는 epiberberine, berberine, coptisine, palmatine, worenine, jatrorrhizine, magnoflorine 이있으며, 雲連 C. teeta Wallich 의뿌리줄기에는 berberine, palmatine, jatrorrhizine, worenine, magnoflorine, coptisine 등이함유되어있다 5). 전체적으로황련의주요성분으로는 berberine 5.20%-7.69%, coptisine, worenine, palmatine, jatrorrhizine, columbamine 등과 epiberberine, magnoflorine, ferulic acid 등이있으며이외에도상당수의미량원소인 Fe, Cu, Zn, Mn 등이보고되어있다 6). 약리작용으로抗菌作用 7) 과心血管系統의作用 8), 肝解毒作用 9), 氣管支平滑筋에미치는영향 10), 抗腹瀉作用 11), 中樞神經系統作用 12), 抗癌作用 13), 및抗炎作用 14) 등이보고되었는데, 특히抗炎作用과관련하여, 최근에윤등 15) 은黃連 EtOH추출물이 lipopolysaccharide (LPS) 로유발된마우스대식세포의 interleukin(il)-1β, IL-6, TNF-α생성증가를억제함에대하여보고한바있고, Kim 등 16) 도黃連 EtOH추출물이 LPS 로유발된마우스대식세포의 IL-1α, IL-6, GM-CSF, NO 생성증가를억제함에대하여보고한바있다. 그러나아직까지黃連을열수추출하여제조한시료를대상으로 LPS로유발된대식세포의 IL-5, VEGF, KC, MCP-1 등의생성증가에대한작용을보고한연구는없었다. 본연구에서는黃連을열수추출하여제조한시료 (CC = Rhizome of C. chinensis) 를대상으로 mouse macrophage Raw cells 의 cell viability 와 LPS 로유발된 Raw cells의 nitric oxide (NO) 생성증가, c-jun N-terminal kinase (JNK) activation, 그리고 IL-5, IL-6, granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), keratinocyte-derived chemokine (KC) 등의면역단백질생성증가에미치는영향을측정하여유의한항염활성결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법 1. 재료 1) 약재실험에사용된黃連 (CC ; Rhizome of C. chinensis Franchet) 은중국에서생산된수입품으로 2008년 2월에구입하였으며가천대학교한의과대학본초학교실에서기원을감정하고표본을보관하였다 (NO; ). 모든약재는실험전에초음파세척기 (Branson, USA) 를이용하여불순물을제거하고실험에사용하였다. 2) Cell line 실험에사용된대식세포는 mouse macrophage (Raw cells) 이며한국세포주은행 (KCLB, Korea) 에서구입하였다. 3) 시약및기기 (1) 시약본실험을위해서 ethyl alcohol (Samchun Chemical, Korea), DMSO (Sigma, USA), DMEM (Sigma, USA), 1 PBS (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), MTT (Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), trypsin-edta (Sigma, USA), Bio-Plex Cytokine assay kit (Bio-Rad, USA), Procarta Cytokine assay kit (Panomics, USA), Bio-Plex phosphoprotein and total target assay kit (Panomics, USA), Bio-Plex cell lysis kit (Panomics, USA) 등이사용되었다. (2) 기기본실험에사용된기기는 air compressor (Tamiya, Japan), CO 2 incubator (Nuaire, USA), homogenizer (Omni, USA), high-speed microcentrifuge (Zyrogrn, Korea), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), research microscope (Becton dickinson, USA), refrigerated centrifuge (Hanil, Korea), personal microcentrifuge (Mylab, Korea), fume hood (Hanil, Korea), clean bench (Jeio-tech, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader 680 (Bio-Rad, USA), vortex mixer (Vision Scientific Co, Korea), multi-channel pipette (Bio-Rad, USA), water bath (Saehan Co, Korea), ice-maker (Vision Scientific Co, Korea), bio-plex 200 (Bio-Rad, USA), vacuum filtration system (Millipore, USA), micromixer mx2 (Finepcr, Korea), thermo Micromixer (Finepcr, Korea), thermo bath (Finepcr, Korea), liquid nitrogen tank (Chart/mve, USA), deep freezer (Ilshin Lab Co, Korea), vacuum freezing drier (Eyela, Japan) 등이다. 2. 방법 1) 黃連추출물제조黃連 50 g을정확하게측정한뒤환류추출기에 1 차증류수 2,000 ml와함께넣은뒤탕액이끓는시점으로부터 2 시간동안가열하여추출한다음추출액을 filter paper (Advantec No.2, Japan) 를사용하여감압여과한여과액을 rotary vacuum evaporator 를이용하여농축액을얻었다. 이농축액을동결건조기를이용하여건조시켜서얻은분말을시료로사용하였다. 동결건조추출물은 12.6 g을얻었으며, 수율은 25.2% 였다. 2) 세포배양 Raw cells은 37, 5% CO 2 조건에서 10% FBS, penicillin(100 μg /ml), streptomycin(100 μg /ml) 이첨가된 DMEM 배지로배양되었다. Cells은 75 cm2 flask (Falcon, USA) 에서충분히증식된후배양 3 일간격으로배양세포표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로씻어준후 50 ml flask 당 1 ml의 0.25% trypsin-edta 용액을넣고실온에서 1 분간처리한다음 trypsin 용액을버리고 37 에서 5 분간보관하여세포를탈착하여계대배양하였다. 탈

黃連추출물의항염효능에관한연구 85 착된세포를 10% FBS가첨가된 DMEM 배양액 10 ml에부유시킨다음새로운배양용기 (50 ml culture flask) 에옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기 (37, 5% CO 2) 에서배양하였다. 3) 세포독성검사준비된시료가 LPS와함께처리되었을때 Raw 264.

3 黃連추출물의항염효능에관한연구 85 착된세포를 10% FBS가첨가된 DMEM 배양액 10 ml에부유시킨다음새로운배양용기 (50 ml culture flask) 에옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO 2 배양기 (37, 5% CO 2) 에서배양하였다. 3) 세포독성검사준비된시료가 LPS와함께처리되었을때 Raw cells 의세포생존율에미치는영향을알아보기위하여 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) assay 17) 를실시하였다. 96 well plate에 cells/well의 cell을 100 μl씩넣고 37, 5% CO 2 incubator 에서 24 시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 phosphate buffered saline(1 PBS) 용액으로씻어주었다. 다음 LPS를단독처리 (1 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료 (25, 50, 100, 200 μg /ml) 와함께배지에담아각 well에처리하고 24 시간동안 37, 5% CO 2 incubator 에서배양하였다. 배양이끝난후배양액을모두버리고 PBS에녹인 1 mg /ml MTT (Sigma, USA) 를 100 μl씩각 well에처리하여알루미늄호일로차광시킨후 2 시간동안같은조건에서배양하였다. 배양액을모두제거한후 DMSO를 100 μl처리하고 37 에서 2 시간방치후 microplate reader (Molecular Devices, USA) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 4) Nitric oxide 생성측정 Weissman 등 18) 의방법을참조하여다음과같이실험하였다. LPS를단독처리 (1 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료 (25, 50, 100 μg /ml) 와함께배지에담아각 well에처리하고 24 시간동안 37, 5% CO 2 incubator 에서배양한후세포배양상등액 100 μl를채취하여여기에그리스시약 100 μl를혼합하여 15 분동안반응시킨후 Microplate Reader (Bio-Rad, USA) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 5) Phosphoprotein 발현측정 Johnson 등 19) 을참조하여 6 well plate에 cells/well 의농도로 cell을분주한후 37, 5% CO 2 incubator에서 24 시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 1 PBS 용액으로씻어준뒤각 well에 LPS를단독처리 (1 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료 (50, 100, 200 μg /ml) 와함께배지에담아처리하고 24 시간동안배양하였다. 배양이끝난후 1 PBS 용액으로 2 회씻어준뒤, Bio-Plex cell lysis kit (Bio-Rad, USA) 를이용하여단백질을추출, cell lysate을만들었다. 새로운 96 well plate에특정항체와결합된비드 (bead) 를분주하고, washing buffer 로세척하였다. 세척한후준비된 cell lysate를각 well에분주하고 15~18 시간동안배양하고나서 washing buffer로세척하였다. 세척후탐지항체 (Biotin-labeled detection antibody) 를각 well에분주하고 30 분간배양한뒤 washing buffer 로세척하고나서형광발색체 (Fluorescently labeled streptavidin reporter) 를각 well에분주해서 10 분간배양후세척한뒤, reading buffer 를첨가하고 Bio-Plex array reader(bio-plex 200) 를이용, JNK의인산화정도를조사, 비교하였다. 6) Cytokine 생성측정면역단백질분비와관련된시료의영향을알아보기위해 Lee 등 20) 의방법을참조하여다음과같이실험을시행하였다. 96 well plate에 cells/well의 cell을 100 μl씩넣고 37, 5% CO 2 incubator 에서 24 시간동안배양한후배지를버리고배양세포표면을 1 PBS 용액으로씻어준뒤각 well에 LPS를단독처리 (1 μg /ml) 하거나혹은다양한농도의시료 (0, 25, 50, 100 μg /ml) 와함께배지에담아처리하고 24 시간동안배양하였다. 배양이끝나고상등액 (cell culture supernatant) 을채취하여 filter plate(96 well type) 에미리준비되어있던 antibody-conjugated capture beads와결합시켰다. 결합된 capture beads 가담긴 filter plate의각 well 을 150 μl의 wash buffer로세척하였다. 세척이끝난뒤각 well에 detection antibody 를추가한후 30 분간배양하였다. 배양이끝난후 wash buffer 로 3 회세척한뒤각 well에 streptavidin-pe 를분주하고상온에서 300~500 rpm의조건으로 30 분간진동배양 (shaking) 한후 wash buffer 로 3 회세척한뒤각 well에 120 μl의 reading buffer를분주하고상온에서 300~500 rpm의조건으로 5 분간진동배양 (shaking) 한후 Bio-Plex array reader (Bio-Plex 200) 을이용, 측정하고자하는 cytokine의양을조사 비교하였다. 3. 통계처리 본실험에서얻은결과는평균치 ± 표준오차 (mean ± SEM) 로나타내었으며, SPSS 11.0의 ANOVA test 및 Student's t-test로분석하여 P < 0.05 수준에서유의성을검정하였다. 1. 세포생존율 결과 CC가대식세포의세포생존율에미치는영향을비교하였다. 황련추출물을 LPS(1 μg /ml) 와함께 24 시간동안 Raw Cells에처리한결과 25 μg /ml이상의모든농도에서유의한변화는나타나지않았다 (Fig. 1). Fig. 1. Effect of CC on cell viability in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three independent experiments. Control : Treated with LPS (1 μg /ml) only. 2. NO 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 NO 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에

86 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 5, 2014 서 LPS 에의한 NO 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 2). 2) KC 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 KC 생성에미치는 CC의영향을비교하였다.

CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs.

Con : Treated with LPS (1 μg /ml) only. 3. JNK activation 에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 JNK activation에미치는 CC의영향을비교하였다.

CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated 3) VEGF 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 VEGF 생성에미치는 CC의영향을비교하였다.

Con : Treated with LPS (1 μg /ml) only. 4. Cytokine 생성에대한영향 1) IP-10 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IP-10 생성에미치는 CC 의영향을비교하였다.

Con : Control group treated with LPS (1 μg /ml) only. 4) IFN-γ 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IFN-γ생성에미치는 CC의영향을비교하였다.

4 86 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 5, 2014 서 LPS 에의한 NO 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 2). 2) KC 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 KC 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 KC 생성을유의하게억제시켰다 ( Fig. 5). Fig. 2. Effect of CC on NO production in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three independent experiments. Nor : Not treated with CC. Con : Treated with LPS (1 μg /ml) only. 3. JNK activation 에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 JNK activation에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 100, 200 μg /ml의농도에서 LPS에의한 JNK activation 을유의하게억제시켰다 (Fig. 3). Fig. 5. Effect of CC on KC production in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated 3) VEGF 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 VEGF 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 VEGF 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 6). Fig. 3. Effect of CC on JNK activation in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three independent experiments. Nor : Not treated with CC. Con : Treated with LPS (1 μg /ml) only. 4. Cytokine 생성에대한영향 1) IP-10 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IP-10 생성에미치는 CC 의영향을비교하였다. 그결과 100 μg /ml의농도에서 LPS 에의한 IP-10 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 4). Fig. 6. Effect of CC on VEGF production in Raw cells. CC CC. Con : Control group treated with LPS (1 μg /ml) only. 4) IFN-γ 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IFN-γ생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml의농도에서 LPS에의한 IFN-γ생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 7). Fig. 4. Effect of CC on IP-10 production in Raw cells. CC for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three Fig. 7. Effect of CC on IFN-γ production in Raw cells. CC

黃連추출물의항염효능에관한연구 87 5) MCP-1 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 MCP-1 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 MCP-1 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 8).

CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three Fig. 11. Effect of CC on IL-5 production in Raw 264.

9) IL-6 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-6 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 IL-6 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 12). Fig. 9. Effect of CC on GM-CSF production in Raw 264.7 cells.

Nor : Normal group not treated with Fig. 12. Effect of CC on IL-6 production in Raw 264.7 cells. CC 7) IL-1α생성에대한영향 LPS 로유발된마우스대식세포의 IL-1α 생성에미치는 CC의영향을비교하였다.

13). Fig. 10. Effect of CC on IL-1α production in Raw 264.7 cells. Nor : Normal group not treated with

5 黃連추출물의항염효능에관한연구 87 5) MCP-1 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 MCP-1 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 MCP-1 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 8). 8) IL-5 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-5 생성에미치는 CC 의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-5 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 11). Fig. 8. Effect of CC on MCP-1 production in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three Fig. 11. Effect of CC on IL-5 production in Raw cells. CC 6) GM-CSF 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 GM-CSF 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 GM-CSF 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 9). 9) IL-6 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-6 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS 에의한 IL-6 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 12). Fig. 9. Effect of CC on GM-CSF production in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three independent experiments. Nor : Normal group not treated with Fig. 12. Effect of CC on IL-6 production in Raw cells. CC 7) IL-1α생성에대한영향 LPS 로유발된마우스대식세포의 IL-1α 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-1α생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 10). 10) IL-12p40 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-12p40 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-12p40 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 13). Fig. 10. Effect of CC on IL-1α production in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three independent experiments. Nor : Normal group not treated with Fig. 13. Effect of CC on IL-12p40 production in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three independent experiments. Nor : Normal group not treated with

88 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 5, 2014 11) basic-fgf 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 basic-fgf 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 50 μg /ml, 100 μg /ml의농도에서 LPS에의한 basic-fgf 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 14)

6 88 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 5, ) basic-fgf 생성에대한영향 LPS로유발된마우스대식세포의 basic-fgf 생성에미치는 CC의영향을비교하였다. 그결과 50 μg /ml, 100 μg /ml의농도에서 LPS에의한 basic-fgf 생성을유의하게억제시켰다 (Fig. 14). Fig. 14. Effect of CC on basic-fgf production in Raw cells. CC : Water extract of Coptis chinensis rhizome. Cells were incubated for 24 hrs. Results are represented as mean ± SEM of the three independent experiments. Nor : Normal group not treated with 고찰 黃連은 神農本草經 1) 에 " 黃連味苦寒. 主熱氣, 目痛, 眦傷, 泣出, 明目, 腸澼, 腹痛, 下利, 婦人陰中腫痛. 久服, 令人不忘. 一名王連. 生川谷." 이라처음收載되었다. 황련의기원으로 대한약전 4) 에는미나리아재비과 (Ranunculaceae) 에속하는황련 Coptis japonica Makino, 중국황련 ( 中國黃連 ) C. chinensis Franchet, 삼각엽황련 ( 三角葉黃連 ) C. deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao 또는운련 ( 雲連 ) C. teeta Wallich 으로되어있다. 약리학적으로는黃連의주성분은 isoquinoline 계열 alkaloid 인 berberine이며기타 coptisine, epiberberlin, feluric acid, magnoflorine, palmatine, worenine 등의성분을함유하고있는데, 특히黃連의 berberine 성분은곤충이나유척추생물에독소가있으며박테리아나진균그리고바이러스의활동을저해하는효과가있고 21), 抗炎症, 止血, 血壓下降作用, 抗癌作用등이있는것으로알려져있고, 中樞神經抑制作用이나腎臟炎治療및氣管支平滑筋擴張에효과가있는것으로보고되고있다 7-14). 이에저자는黃連을熱水抽出하여제조한試料 (CC) 를대상으로 mouse macrophage Raw cells 의 cell viability와 LPS 로유발된 Raw cells 의 NO 생성, JNK activation, 그리고 IL-5, IL-6, GM-CSF, KC 등의 cytokine 생성에미치는영향을측정, 조사하였다. CC가대식세포의세포생존율에미치는영향을비교하기위해 LPS (1 μg /ml) 와함께 24 시간동안처리한결과 25, 50, 100, 200 μg /ml의농도에서는유의한생존율감소는나타나지않았으며, 이들의농도에서는 CC가세포의생존율에영향을미치지않는다는것을의미한다. 그래서다음단계의염증매개인자발현실험을 25~200 μg /ml의농도로진행하였다. CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 NO 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 NO 생성을유의 하게억제시켰으며, CC가마우스대식세포의 NO 생성에미치는영향을비교하기위해 CC만을 24 시간동안처리한결과에서도 25 μg /ml 이상의모든농도에서 NO 생성을유의하게억제시켰다. 이와같이 CC에의해서 LPS에의해유발된 macrophage 의 NO 생성을억제한다는것은 CC가 NO 과잉에의한염증악화를억제할수있는효능이있음을의미한다. CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 JNK activation 에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과 100, 200 μg /ml의농도에서 LPS에의한 JNK activation 을유의하게억제시켰다. 이는 JNK activation 에의해서유발되는대식세포의 proinflammatory mediator의생성을 CC가억제할수있음을나타낸다. JNK는세포의증식 22), 분화 23) 에관여하는것으로알려져있다. CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 IP-10 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과 100 μg /ml의농도에서 LPS에의한 IP-10 생성을유의하게억제시켰다. IP-10은호흡기염증반응에서호중구와단핵구의화학주성에직접적으로관여하는것으로알려져있다 24). CC가 LPS로유발된마우스대식세포의급성염증반응의매개자인 KC 25) 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 KC 생성을유의하게억제시켰다. CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 VEGF 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IP-10 생성을유의하게억제시켰다. VEGF는주요한성장인자로서혈관내피세포에서발현되는매우특이한유사분열촉진인자이다 26). CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 IFN-γ생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml의농도에서 LPS에의한 IFN-γ생성을유의하게억제시켰다. CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 MCP-1 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 MCP-1 생성을유의하게억제시켰다. MCP-1은외상이나감염조직으로 monocyte, memory cell, dendritic cell을모으는역할을한다 27). CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 GM-CSF 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 GM-CSF 생성을유의하게억제시켰다. GM-CSF는백혈구의성장과감염부위에 macrophage 가집락화되도록자극하는역할등을하는것으로알려져있다 28,29). CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-1α생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-1α생성을유의하게억제시켰다. IL-1α는 T, B cell 등의증식과분화에관계되며, IL-1β는 IL-2 유도, 뼈의재흡수, 조직의분해대사의작용이있다 30,31). CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-5 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-5 생성을유의하게억제시켰다. IL-5가강력한 eosinophil active

7 黃連추출물의항염효능에관한연구 89 cytokine 임이알려지면서알레르기염증반응을이해하는데중요한연구대상이되어왔다 32). CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-6 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-6 생성을유의하게억제시켰다. 감염이나손상등에의한급성반응을보이며면역에관여하는세포의성장과분화에관여한다 33). CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 IL-12p40 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 25 μg /ml 이상의모든농도에서 LPS에의한 IL-12p40 생성을유의하게억제시켰다. CC가 LPS로유발된마우스대식세포의 basic-fgf 생성에미치는영향을비교하기위해 24 시간동안처리한결과에서는 50 μg /ml, 100 μg /ml의농도에서 LPS에의한 basic-fgf 생성을유의하게억제시켰다. 이와같이 CC가 LPS에의해유발된 Macrophage 의각종 cytokine 생성을유의하게억제하는것은 CC가대식세포의 cytokine 과잉생성으로인하여유발될수있는각종의급만성염증성질환발생과염증현상의악화를완화할수있는항염효능이있음을의미하며, 특히대식세포의염증활성능과관련된세포내 JNK activation 을억제하는기전까지포함한항염작용이라고할수있다. 이상의결과, 黃連을열수추출하여제조한시료 CC는대식세포에 LPS 로유발된대식세포의 NO, KC, VEGF, MCP-1, GM-CSF, IL-1α, IL-5, IL-6, IL-12p40의생성을 25 μg /ml 이상의농도에서유의하게억제하고, JNK activation 을 100, 200 μg /ml의농도에서억제하는등유의한항염효능을가지고있는것으로나타났다. 앞으로黃連물추출물을이용한대식세포관련염증질환에대한치료제의개발에매우긍정적인결과이며더욱집중적이고도많은연구를할가치가있을것으로사료된다. 결론 黃連을열수추출하여제조한시료 (CC) 를대상으로 mouse macrophage Raw cells의 cell viability와 LPS로유발된 Raw cells의 NO 생성, JNK activation, 그리고 IL-5 등의 cytokine 생성에미치는영향을측정, 조사하여다음과같은결론을얻었다. 1. 黃連물추출물을 LPS와함께 24 시간동안배양한후 MTT assay를수행한결과黃連물추출물은대식세포의생존율에유의한변화를나타내지않았다. 2. 黃連물추출물은 24 시간의배양에서 LPS로유발된대식세포의 NO 생성을유의하게억제시켰다. 3. 黃連물추출물은 LPS에의해서유발된대식세포의 KC, VEGF, MCP-1, GM-CSF, IL-1α, IL-5, IL-6, IL-12p40의생성을 25 μg /ml 이상의농도에서유의하게억제시켰다. 4. 黃連물추출물은 LPS에의해서유발된대식세포의 basic-fgf의생성을 50, 100 μg /ml의농도에서, IP-10의생성은 100 μg /ml의농도에서, IFN-γ의생성은 25 μg /ml의농도에서유의하게억제시켰다. 5. 黃連물추출물은 LPS에의해서유발된대식세포의 JNK activation 을 100, 200 μg /ml의농도에서유의하게억제하였다. 이상의결과, 黃連을열수추출하여제조한시료 CC는대식세포에 LPS 로유발된대식세포의 NO, KC, VEGF, MCP-1, GM-CSF, IL-1α, IL-5, IL-6, IL-12p40의생성을 25 μg /ml 이상의농도에서유의하게억제하고, JNK activation 을 100, 200 μg /ml의농도에서억제하는등유의한항염효능을가지고있는것으로나타났다. References 1. Wu B. Shennongbencaojing. Beijing : Kexuejishuwenxian publisher : Jiangsuxinyixueyuan. Zhongyaodacidian. Shanghai : Shanghaikexuejishuchubanshe : Li SZ. Bencaogangmu. Seoul : Komoonsa : Korea Food and Drug Administration. The Korean Pharmacopoeia Tenth Edition. Seoul : Korea Food and Drug Administration : State Administration of Traditional chiense medicine of the People's Republic of China. Zhonghuabencao. Vol. 4. Shanghai : Shanghai Scientific and Technical Publishers : Xiao PG. Xinbianzhongyaozhi. Vol 3. Beijing : Huaxuegongye publisher : Doh ES. Antifungal Activity or Coptis japonica Root-stem Extract and Identification of Antifungal Substances. Korean J Plant Resources ; 12(4) : Huang WM, Yan H, Jin JM, Yu C, Zhang H. Beneficial effects of berberine on hemodynamics during acute ischemic left ventricular failure in dogs. Beneficial effects of berberine on hemodynamics during acute ischemic left ventricular failure in dogs. Chin Med J (Engl) ; 105(12) : Yoon SH, Ha H, Seo MJ. Effect of Coptis Rhizoma on Benzo (a) pyrene-induced Hepatotoxicity. Kor J Environ Toxicol ; 8(1-2) : Lee DU, Chang KC. Bronchodilatory Effects of Coptidis Rhizomas in Isolated Rat Trachea. J Pharm Soc Korea ; 41(6) : Yamamoto K, Takase H, Abe K, Saito Y, Suzuki A. Pharmacological studies on antidiarrheal effects of a preparation containing Berberine and Geranii Herba.

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