韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2014;2(2): pissn / eissn psba-trnh DNA 바코드분석을통한후박및토후박감별 문병철 * 한국한의학연구원한약자원그룹 Molecular Aut

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보람 홍
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1 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2014;2(2): pissn / eissn psba-trnh DNA 바코드분석을통한후박및토후박감별 문병철 * 한국한의학연구원한약자원그룹 Molecular Authentication of Magnoliae Cortex and Its Adulterant Machilus Cortex based on psba-trnh DNA Barcode Moon Byeongcheol * Herbal Medicine Resources Group, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, , Republic of Korea Abstract The original plant species of Magnoliae Cortex (Hu-Bak in Korean and Hòu-Pò in Chinese) is prescribed as the stem bark of Magnolia officinalis Rehder & E.H.Wilson, Magnolia officinalis var. biloba Rehder & E.H.Wilson, and Magnolia ovobata Thunb. However, the stem bark of Machilus thunbergii Siebold & Zucc. also has been used as a domestic Magnoliae Cortex, To-Hu-Bak. To prevent the distribution of inauthentic Machilus Cortex, we introduced psba-trnh DNA barcode analysis and established a reliable method for distinguishing between Manoliae Cortex and Machilus Cortex. In comparative analysis of the psba-trnh sequences using 18 samples of four species, thus, we obtained distinct nucleotide sequences, such as distinct indels (insertions and deletions of nucleotide) and substitutions, enough to differentiate these two herbal materials and evaluated the phylogenetic relationship of these species. The sequence differences at the corresponding alignment positions are useful marker nucleotides to authenticate official Magnoliae Cortex from closely related adulterant of Machilus thunbergii. These marker nucleotides would be useful to standardize the Magnoliae Cortex by the providing of specific genetic information that can distinguish official herbal medicine from inauthentic adulterants for Hu-Bak. Keywords: DNA barcode, psba-trnh, Magnoliae Cortex, Machilus Cortex, Marker Nucleotide * Correspondence: 문병철 (Moon Byeongcheol. Tel: Fax: bcmoon@kiom.re.kr) Received , accepted

2 문병철. psba-trn H DNA 바코드분석을통한후박및토후박감별 서론 후박은 신농본초경 에중품약으로수재되어있으며, 곽란, 복통등에진정및진통작용이있고, 경련성복통과같은신경성위장병의치료약으로최근에는파킨슨병치료약으로사용한다는보고도 있다 1). 후박의기원은 대한민국약전 과 일본약국방 에서는목련과(Magnoliaceae) 에속하는 낙엽성교목인후박 (Magnolia officinalis Rehder & E.H.Wilson) 와요엽후박 (Magnolia officinalis var. bilova Rehder & E.H.Wilson) 및일본목련 (Magnolia obovata Thunb.) 의수피를건조한약재로 정의하고있으며, 중국약전 에서는일본목련을제외한후박과요엽후박의줄기, 뿌리및가지껍질 을말린것으로정의하고있다 2). 하지만국내에서는녹나무과 (Lauraceae) 에속하는상록교목인후박 나무 (Machilus thunbdrgii Siebold & Zucc.) 의수피가약재명후박과국내에서통용되는식물명 후박 나무 의이름에서발생하는혼동으로인해한약재후박으로사용이가능하다는잘못된인식으로인하 여국내산대체한약재인토후박( 土厚朴 ) 으로무분별하게유통되고있어사용에주의가필요할뿐만 아니라기원식물에대한구별기준과약재에대한정확한감별법개발이요구되고있는실정이다 3-5). 3,4) 후박의감별에대한연구는내부형태를중심으로후박, 일본목련, 후박나무에대한분류학적연구 와주성분인 magnolol 과 honokiol 을이용한지표물질기준의분류학적연구 3,5) 가진행되었으나객관 적으로정확하게후박과토후박을감별하기에는부족함이있다. 근래에들어분자생물학의발달과 염기서열분석의자동화로식물분류체계확립과객관적인한약재감별을위해 DNA 바코드분석과 genomic DNA profile 분석을통한분자감별법개발이활발하게진행되고있다 분석은빠르게진화하고모든식물종에잘보존되어있으며 용이하여시호 7), 당귀, 천궁, 오미자 보고되고있다. 8) 9) 10), 반하 11) 6). 특히 DNA 바코드 PCR 을통해증폭이쉽고염기서열분석이, 대계 12) 등다양한약재의감별및종동정기법으로 본연구에서는대한민국약전을기준으로본초학적측면에서후박의기원종인후박, 요엽후박, 일본목 련과약전에수재되지않은후박나무를대상으로정품의한약재와대체품의구별을목적으로 DNA 바코드염기서열비교를통해이들종간의유연관계를분석하고객관성높은분자생물학적인감별법 에활용가능한 를제공하고자하였다. marker nucleotide 를제시하여후박의혼 오용방지와분자마커로활용하기위한자료 본론 1. 재료및방법 1) 실험재료 유전자분석에사용한후박 (M. officinalis ), 요엽후박 (M. officinalis var. biloba ), 일본목련 (M. ovobata) 및후박나무 (Machilus thunbergii ) 시료는국내 외서로다른자생지에서 2008 년부터 2011 년에 걸쳐수집하여액체질소에급냉시켜 70 초저온냉동고에보관하여이용하였다 (Table 1). 수집한 시료는본초학, 생약학, 식물분류학등의전문가로구성된분류 동정자문회의의동정을거쳐그종을 최종확증하였으며, 각시료의기원식물은압착석엽표본을제작하여한국한의학연구원한약표준표본 관에표본번호를부여하여보관하였다. 68

3 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2014;2(2): pissn / eissn Table 1. List and information of plant materials for Magnoliae Cortex used in this study. Herbal Name Scientific Name Location of Collection Sample Name Enshi, Hubei, China H1 Magnolia officinalis Enshi, Hubei, China H2 Ya'an, Sichuan, China H3 Ya'an, Sichuan, China H4 Changde, Hunan, China Y1 Magnoliae Pingzhou, Sichuan, China Y2 Magnolia officinalis var. biloba Cortex Pingzhou, Sichuan, China Y3 Ya'an, Sichuan, China Y4 Deokjin, Jeonju, Jeonbuk J1 Magnolia ovobata Banpo, Gongju, Chungnam J2 Samnye, Wanju, Jeonbuk J3 Samnye, Wanju, Jeonbuk J4 Ara, Jeju, Jeju N1 Yokji, Tongyeong, Gyeongnam N2 Machilus Heuksan, Sinan, Jeonnam N3 Machilus thunbergii Cortex Geunheung, Taean, Chungnam N4 Gogun, Jindo, Jeonnam N5 Gogun, Jindo, Jeonnam N6 2) DNA 추출 국내자생지에서수집하여 -70 에보관중인기원식물생체시료, 종자, 유통되거나제품원료로이용 되는약재시료를액체질소로급랭시켜막자사발을이용하여분말상태가되도록마쇄한후, DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, CA, USA) 을이용하여제작자가제공한 protocol 을일부변형하여추출정제 하였다. 정제된 DNA의순도와질을확인하기위하여 1.5% agarose gel 을이용하여전기영동후, Ethidium Bromide(EtBr) 로염색하여 UV light 상에서 DNA band 를확인하였으며, UV spectropho- tometer(nanodrop ND-1000, Nanodrop, DE, USA) 를이용하여 260nm 와 280nm 에서흡광도를측 정하여최종 20ng/ μl로희석하여분석에이용하였다. 3) DNA 바코드부위 PCR 증폭 psba-trn H 부위 PCR 증폭을위하여약 5~20ng 의 genomic DNA와각 20pmole 의정방향의 psba3(5'-gtt ATG CAT GAA CGT AAT GCT C) 와역방향 primer trnh05(5'-cgc GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC-3') 13) 를각각이용하였다. 1 unit의 DNA polymerase 를 50μl의 1 반응용 액 [75mM Tris-HCl(pH 8.8), 20mM (NH 4 ) 2 SO 4, 0.1%(v/v) Tween 20, 20μM dntp, 200μM MgCl 2 ] 에각각첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler(MJ Research, MN, USA) 를이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95 에서 5분간 predenaturation 한후 95 에서 30초 denaturation, 55 에 서 40초 annealing, 72 에서 1분 extension 을 35회수행하고마지막으로 72 에서 10분간 ex- tension 시켜증폭하였다. 4) 염기서열분석 DNA 바코드부위증폭산물의 DNA 염기서열분석을위하여각각의 total 증폭산물을 1.5% agarose gel상에서 100bp DNA ladder(solgent, Daejeon, Korea) 와함께전기영동하고 EtBr로염색하여관 69

4 문병철. psba-trn H DNA 바코드분석을통한후박및토후박감별 찰한후, 정확하게증폭된 psba-trn H 유전자 PCR 증폭산물을 agarose gel로부터회수하여 Gel Extraction Kit(QIAGEN, CA, USA) 를이용하여정제한뒤 pgem-teasy Vector Systems (Promega, WI, USA) 에삽입하였다. 삽입된증폭산물은 XL1-Blue MRF' competent cell (Stratagene, CA, USA) 에형질전환한뒤 ampicillin 과 X-gal/IPTG 가첨가된 LB agar 배지에도말하 여약 20 시간배양하였다. 각시료별로선별된 3개의 white colony를액체배양하고 Plasmid mini preparation kit(solgent, Daejeon, Korea) 를이용하여 plasmid DNA 를분리한후, T7과 SP6 pri- mer를이용하여 ABI3730 automatic DNA sequencer(applied Biosystems, CA, USA) 에서염기서 열을분석하고각시료별로분석된 3개 colony 의염기서열을비교하여최종확정하였다. 5) 종판별용 marker nucleotide 탐색및종간유연관계분석 최종확증된각종별시료 18 개체의 psba-trn H 유전자염기서열을 DNA 바코드종류별로 BioEdit program(version 7.0.9) 14) 의 ClustalW 방법으로 multiple alignment 를수행하여종내개체및종별 염기서열을정렬하였다. 정렬된 psba-trn H 염기서열의종내개체별비교와종별비교를통해종특이 성을갖는염기의삽입(insertion), 결실(deletion) 및치환(substitution) 을위치별로분석하여정리하 였다. 전체분석대상시료의유연관계분석은 18개체의 DNA 바코드부위전체염기서열을각각 CLC main workbench ver. 6.0 program(insilicogen, Suwon, Korea) 을이용하여 UPGMA 방법으로 phylogenetic tree 를작성하고군집의형성유무와군집간의근연관계를비교 분석하였다. 2. 결과및고찰 1) psba-trn H 부위증폭및특성분석 국내 외각기다른자생지와재배지에서수집한 4 개시료의후박, 요엽후박, 일본목련과 6개시료의 후박나무잎으로부터추출한게놈유전자와기보고된 psba3와 trnh05 primer 로 PCR 증폭하여약 500bp 크기의단일절편 DNA 증폭산물을확보하였으며, 이를각시료의 psba-trn H 로정의하였다. 각시료로부터증폭된 psba-trn H 염기서열을분석한결과, 후박은 517bp, 요엽후박은 518~520bp, 일본목련은 518~519bp, 그리고후박나무는 505bp 의염기로구성되어있었다. 증폭산물의 G+C의 염기조성은전체적으로 34.06~35.78% 로나타났으며, 후박과요엽후박은약 35.4% 로나머지두종과 약간의차이를보였으나 4종모두바코드부위 DNA 구조와물리적특성은큰차이를보이지않고 비슷한것으로확인되었다 (data not shown). 종별삽입/ 결실(indel) 과치환(substitution) 을분석한 결과, 대한민국약전기원종인후박, 요엽후박및일본목련과대체품인후박나무는증폭산물의크기뿐 만아니라염기서열의비교에서도큰차이를확인할수있었고, 종내염기서열의차이가일부위치에서 확인되었다 (Fig. 1). 2) psba-trn H 염기서열분석및종감별용 marker nucleotide 발굴 우리나라와중국약전의후박기원식물의차이와국내대체품인토후박의혼 오용방지를위한유전 자마커개발을위해본연구에서분석한후박류 4종 18개시료로부터증폭한 psba-trn H 염기서열의 종내비교와종간비교하여종특이적인염기서열을분석하였다. 약전기원종인후박, 요엽후박, 일본목 련의종특이적삽입/ 결실과치환을토대로 marker nucleotide 를분석한결과, 341번째염기에서 후박특이적인염기의결실이확인되었다 (Fig. 1). 하지만후박에서의 341번째염기의결실은요엽후 70

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2014;2(2):67-75.

5 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2014;2(2): pissn / eissn Fig. 1. Comparison of psba-trnh Sequences. Dots ( ) indicate the identical sequences with M. officinalis H1 and dashes (-) represent gaps that were introduced to maximize alignment. The marker nucleotides indicated with asterisk (*) under the sequences. 71

문병철. psba-trn H DNA 바코드분석을통한후박및토후박감별 박과일본목련의종내에서도삽입/ 결실이확인되고주변의염기서열을고려하여비교한결과, polya 염기서열부위가존재하고요엽후박과일본목련에서종내시료간염기의삽입/ 결실이확인되는것으 로보아후박특이적결실의가능성보다 polya 염기서열의 sequencing 과정에서발생된분석오류로 판단된다 (Fig. 1).

이러한결과는다른식물 DNA 바코드부위로알려져있는 nrdna-its 를증폭하여염기서 열을분석한결과에서도종별특이성은보이지않은반면종내개체비교에는몇몇위치에서관찰되었 으며, 이러한결과는서식지의기후, 토양등의생태적요인에의해발생하는개체의유전적변이로 해석된다 (data not shown).

6 문병철. psba-trn H DNA 바코드분석을통한후박및토후박감별 박과일본목련의종내에서도삽입/ 결실이확인되고주변의염기서열을고려하여비교한결과, polya 염기서열부위가존재하고요엽후박과일본목련에서종내시료간염기의삽입/ 결실이확인되는것으 로보아후박특이적결실의가능성보다 polya 염기서열의 sequencing 과정에서발생된분석오류로 판단된다 (Fig. 1). 또한 285번염기에서나타나는요엽후박특이적인염기치환은 89번째염기와 197 번째염기에서관찰되는것과같이후박, 요엽후박및일본목련에서특이성없이나타나는것으로 판단된다. 이러한결과는다른식물 DNA 바코드부위로알려져있는 nrdna-its 를증폭하여염기서 열을분석한결과에서도종별특이성은보이지않은반면종내개체비교에는몇몇위치에서관찰되었 으며, 이러한결과는서식지의기후, 토양등의생태적요인에의해발생하는개체의유전적변이로 해석된다 (data not shown). 약전기원종인후박, 요엽후박, 일본목련과대체품으로사용되고있는후박나무의염기서열을비교한 결과, 후박나무종특이적인염기의삽입이 3 개의위치, 결실이 7 개의위치에서확인되었으며, 치환은 91개염기에서확인되어 psba-trn H 유전자염기서열분석을통해대체품인토후박을감별할수있음 을알수있었다 (Fig. 1, Table 2). 약전기원종인후박류 3종의종간특이적염기서열이확인되지않는 반면, 대체품인후박나무에서종특이적염기서열이많이확인되는것은후박나무가목련과가아니고 녹나무과인것에서기인하는것으로판단되지만 nrdna-its 바코드부위에대한추가염기서열분석 결과에서는 4 종모두차이가나지않는결과를보이는것으로보아혼 오용한약재분자마커개발 및종감별을위한 DNA 바코드분석을위해서는한개의 DNA 바코드유전자부위를분석하는것보다 psba-trnh, nrdna-its, matk, rbcl rpoc1 등의다양한바코드부위를분석할필요가있을것으로 판단된다 15). Table 2. Summary of Marker Nucleotides from the Comparison of psba-trnh Sequences among 4 Species and 18 Samples for Magnoliae Cortex. Hyphens (-) denote deletion of nucleotide for maximized alignment and dots ( ) indicate sequence identity with M. officinalis. Nuceotide positions indicate the aligned position starting from the 5 end of the psba-trnh gene. 72

7 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2014;2(2): pissn / eissn ) 후박류종간유연관계분석 국내 외자생지와재배지에서수집된한약재후박기원식물인후박, 요엽후박, 일본목련및후박나무 4종의유전다양성과종간유연관계분석을위해 psba-trnh 염기서열을토대로 Bioedit program 의 DNADist Neighbor Phyogenetic tree 를작성하였다. 4종 18 개체의유연관계를분석한결과, 토후박 인후박나무는다른 3 종의후박류와구별되게유집을형성하였으나, Magnolia 속의 3종은종단위로 유집되지않고전체적으로하나의그룹을형성하는결과를보였다(Fig. 2). 이러한결과는염기서열 분석을통한 marker nucleotide 분석에서후박과토후박의감별이가능한것과마찬가지로동일한 부위의염기서열을이용한유연관계분석을통해후박의각기원종을구별하기는어렵지만후박과 토후박의구별은가능함을알수있었다. Fig. 2. Phylogenetic analysis of four medicinal plant species for the Magnoliae Cortex assembled by the ClustalW method. 이상의결과를정리하면본연구에서는 psba-trn H DNA 바코드부위염기서열분석을통해후박나 무특이 marker nucleotide 를이용하여약전에기록되어있는 3종의 Magnolia 속후박으로부터혼 오 용될가능성이있는토후박의구별이가능한유전자마커를개발하였다. 이러한결과는식물이가지고 있는고유의유전자정보를이용하여약전에수재되지않은토후박감별을통해정품후박의이용뿐만 아니라, 기보고된주성분분석, 이화학패턴분석연구결과등과연계하여후박의약물동등성확보와 품질관리를통한한약표준화에기여할것으로사료된다. 73

8 문병철. psba-trn H DNA 바코드분석을통한후박및토후박감별 결론 본연구는혼 오용되고있는후박의감별법개발을위해 DNA 바코드염기서열분석을수행하여 psba-trn H 유전자부위로부터우리나라약전에수재된정품후박과대체품인토후박을식물이가지 는고유한유전자정보를기반으로객관적감별법을개발하고자하였다. 약전수재정품인후박, 요엽 후박, 일본목련 3종과오용품인후박나무의 psba-trn H 바코드부위는 Magnolia 속 3종과 Machilus 속 후박나무가각각 518~520bp 와 505bp 의염기로구성되어있었으며, 4종의염기서열비교에서 10개 위치의염기삽입/ 결실과 91개위치의염기치환확인을통해약전수재정품후박과대체품인토후박의 정확한감별이가능한 하는바이다. marker nucleotide 를발굴하여후박의혼 오용방지를위한유전자마커로제시 감사의글 본연구는한국한의학연구원 한의본초활용기반구축사업 (K1120) 과안정적한약자원확보기술개발 사업의 한약자원국내생산기반기술개발(K14417) 과제의지원에의해수행되었으며, 기원식물 분류동정에 도움을주신분류동정자문위원님들께 감사드립니다. 참고문헌 1. Kim IR, Hwang KH, Joo HJ. 한약재의절단, 수치, 전탕법에관한연구 Ⅲ : 후박. 대한본초학회지. 1999;14(1): 한국한의학연구원. 한약기원사전. [Web-site] Lee GS, Kim JH, Choi G, Kang DH, Hwang SY, Jeong SI, Kim HJ, Ju YS. 후박의외 내부형태 및이화학패턴연구. 대한본초학회지. 2008;23(4): 박종희, 난파항웅. 후박의생약학적연구. 생약학회지. 2010;41(1): 배기환, 김영호, 원도희, 이준성, 강종성. 후박의품질평가. 약학회지. 1997;41(4): Sucher NJ, Carles MC. Genome-based approaches to the authentication of medicinal plants. Planta Medica. 2008;74: 문병철, 추병길, 지윤의, 윤태숙, 이아영, 전명숙, 김보배, 김호경. rdna-its 염기서열분석을통한 시호종감별용유전자마커개발및유연관계분석. 대한본초학회지. 2009;24(3): Choi HY, Choi YJ, Lee JH, Ham I. Sequencing analysis on the ITS region and AFLP analysis to identify dried medicinal Angelica species. Kor J Herbology. 2004;19(2): 송임근, 안보람, 서부일, 박선주. 천궁의기원과식별을위한분자마커. 대한본초학회지. 2009;24 (4): 문병철, 지윤의, 서형석, 이아영, 천진미, 김호경. nrdna-its 분자마커를이용한오미자종감별 및기원분석. 2010;25(4): 이영미, 문병철, 지윤의, 김욱진, 김호경. matk와 rbcl DNA 바코드분석을통한반하및반하 유사한약재유전자감별. 대한본초학회지. 2013;28(6): 문병철, 이영미, 지윤의, 최고야, 천진미, 김호경. DNA 바코드분석을통한소계및대계의기원식 74

9 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2014;2(2): pissn / eissn 물감별과종간유연관계분석. 대한본초학회지. 2013;28(3): Guo X, Wang X, Su W, Zhang G, Ahou R. DNA barcodes for discriminating the medicinal plant Scutellaria baicalensis (Lamiaceae) and its adulterants. Biol. Pharm. Bull. 2011;34: Hall TA. BioEdit: an user-friendly biological sequence alignment editor and analysis progr am for Windows 95/98/NT. Nucl Acid S 1999;41: Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, Shi L, Zhu Y, Ma X, Gao T, Pang X, Luo K, Li Y, Li X, Jia X, Lin Y, Leon C. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifyi ng medicinal plant species. PloS ONE. 2010;5(1):e8613 (doi: /journal.pone ). 75

작약(芍藥) 유전자 감별을 위한 psbA-trnH 부위 염기서열 분석 및 Marker Nucleotide 발굴

작약(芍藥) 유전자 감별을 위한 psbA-trnH 부위 염기서열 분석 및 Marker Nucleotide 발굴 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2015;3(2):73-80. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 작약( 芍藥 ) 유전자감별을위한 psba-trnh 부위염기서열분석및 Marker Nucleotide * 김욱진, 지윤의, 문병철 발굴 한국한의학연구원 K-herb연구단 Identification of Marker