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한선 강
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1 ISSN (PRINT) ISSN (ONLINE) 약학회지제 62 권제 2 호 77~82 (2018) Yakhak Hoeji Vol. 62, No. 2 DOI /psk 종설 Short Report Caffeic acid phenethyl ester 의 cytochrome P450 저해활성평가 류창선 박지은 김상겸 * 충남대학교약학대학 (Received February 12, 2018; Revised March 28, 2018; Accepted April 4, 2018) In vitro assessment of cytochrome P450 inhibition by caffeic acid phenethyl ester Chang Seon Ryu, Ji-Eun Park, and Sang Kyum Kim* College of Pharmacy, Chungnam National University, Daejeon, , Korea Abstract Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) is one of the major active components of propolis showing inhibitory activity against cytochrome P450 (CYP). The purpose of this study was to determine CYP inhibitory potential and metabolic stability of CAPE using human liver microsomes (HLM) for characterization of its metabolic properties. Among CYP isoforms including CYP1A2, 2A6, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 and 3A4, CAPE exhibited strong inhibitory potential against CYP1A2 and 2C9, moderate against CYP2E1, 2B6, 2C8, 2C19 and 3A4, and weak against CYP 2D6 and 2A6, based on the IC 50 values. The inhibition of CYP1A2 but not CYP2C9 was increased by preincubation with CAPE and NADPH, suggesting that the CAPE-induced CYP1A2 inhibition may be metabolism-dependent. In metabolic stability study using HLM, CAPE was rapidly hydrolyzed to caffeic acid in a NADPH-independent manner. Caffeic acid exhibited week CYP inhibitory activity, relative to CAPE. These results raise the possibility that CAPE plays a role in propolis-mediated CYP inhibition. Keywords cytochrome p450, drug-drug interaction, caffeic acid phenethyl ester, propolis 벌집을구성하고유지하는성분에서유래한프로폴리스 (propolis) 는꿀벌에의해침엽수, 식물의새싹등과같은물질로부터만들어진다. 프로폴리스는가장널리사용되는기능성식품의하나로 2016년건강기능식품의품목매출액기준으로 103.1억원을차지하고있다. 1) 프로폴리스의항산화활성을포함한생리활성은플라보노이드, 페놀릭산, 에스터, 알데하이드, 알코올및케톤과퀴논, 쿠마린, 세스퀴테르펜등유효성분과관련이있다. 2) 프로폴리스의구성성분과구성비율은벌의종과벌집을만들때사용된식물등에따라달라진다. 3,4) 카페익산페네칠에스테르 (caffeic acid phenethyl ester; CAPE) 는프로폴리스의가장중요한생리활성물질의하나로적혈구의지질과산화, 세포가닥파손및단백질의단편화등에 # Corresponding Author Sang Kyum Kim College of Pharmacy, Chungnam National University, Daejeon, , Korea Tel.: Fax.: sangkim@cnu.ac.kr 대한보호기능 5), 인슐린저항성의경감기능등이보고되었다. 6) Cytochrome P450 (CYP) 은약물대사효소중가장중요한효소계로인간에서 57개의기능적동형단백질 (isoform) 로존재하며주로간에발현된다. 7) CYP는다양한내인성및외인성물질에의해발현과활성이조절되며약물의병용투여시 CYP 저해와유도는임상약물치료에서약물-약물상호작용 (drug-drug interaction) 을유발하는대표기전이다. 8) 최근, 브라질산녹색프로폴리스에탄올추출물 9), 프로폴리스건조분말추출물 10) 등이 CYP 활성을저해하는것으로보고되었다. 또한주요구성성분인폴리페놀 11), apigenin과 genistein 에의한 12) CYP 활성변화에대한연구가보고되었다. 본연구에서는프로폴리스의유효성분인 CAPE에의한 CYP의직접적억제효과및기전을연구하였다. 선행연구에서확립된실험계를 13,14) 바탕으로인간간세포로부터분리된 microsomes (HLM) 을활용하여 9개 CYP isoform에대한저해효과를 10개의기질을이용하여액체크로마토그래피-사중극자질량분석기로분석하는방법을이용하였다. 또한 CAPE의대사적안정성과대사체분석을수행하여이물질의대사적특성을규명하였다. 77

2 78 류창선 박지은 김상겸 재료및실험방법 (Experimental Methods) 시약 Phenacetin, acetaminophen, bupropion, coumarin, 7- hydroxycoumarin, caffeic acid, tolbutamide, 4-hydroxytolbutamide, dextromethorphan, chlorzoxazone, 6-hydroxychlorzoxazone, testosterone, fluvoxamine, furafylline, ketoconazole, carbamazepine, CAPE 및환원된 β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) 는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였다. Hydroxybupropion, 4'-hydroxymephenytoin, 1'- hydroxymidazolam 및 6β-hydroxytestosterone은 BD Gentest Co. (Woburn, MA, USA) 로부터구입하였다. Midazolam은부광약품 ( 서울, 대한민국 ) 에서구입하였다. Pooled human liver microsomes (BD UltraPool HLM 150, lot 38289) 은 BD Gentest Co. (Woburn, MA, USA) 로부터구입하였다. 모든시약은분석용또는구입가능한가장높은등급을사용하였다. CYP 저해평가 CAPE와 caffeic acid의 CYP 직접저해와대사의존적저해방법은이미보고된실험방법을바탕으로수행되었다. 13,14) CAPE 와 caffeic acid를각각 DMSO에 100 mg/ml 그리고 3차증류수에 10 mg/ml 농도로녹이고 3을공비로하여계열희석하였다 rack (1.2 ml; VWR, Emeryville, CA, USA) 에 8-well tube strips을반응에이용하여, 최종농도 1mg/mL 인간마이크로좀단백질분획, 0.1 M phosphate buffer (ph 7.4), 1 mm NADPH와다양한 CYP isoform의 CYP isoform-specific 개별기질의혼합액의 2개의부분으로 (A set: phenacetin, coumarin, amodiaquine, S-mephenytoin, dextromethorphan, and midazolam; B set: bupropion, tolbutamide, chlorzoxazone, and testosterone) 나누어의해최종부피 200 μl로구성되었다. 기질은각각의 Michaelis-Menten constant (K m ) 값에맞게다음과같이농도를설정하였다 : phenacetin 50 μm, coumarin 5 μm, bupropion 50 μm, tolbutamide 100 μm, S-mephenytoin 100 μm, dextromethorphan 5 μm, chlorzoxazone 50 μm, midazolam 5 μm, 및 testosterone 50 μm. 모든실험에사용된기질은 acetonitrile 또는 DMSO에녹여희석하였다유기용매의조성이최종부피의 (v/v) 1.0% 이하가되도록설정하였다. 반응시간은 37 o C에서 5분간의미리가열한반응액에, NADPH용액을가하여 10분간 37 C 진탕배양기를이용하여 incubation하였다. 반응종결은 200 μl 부피의 ice-cold acetonitrile( 내부표준물질로 50 nm carbamazepine을포함 ) 을가하여이루어졌다. 각부분반응액 (A, B set) 을 4 o C, 3,000 rpm, 20분간원심분리한후, 각부분반응액을 1:1로 96 well plate에서희석하였다. 대사의존적 CYP 저해평가는대사체의생성을위하여 CYP의 기질없이 HLM과 CAPE를 NADPH의존재유무에따라 30분간반응시켜진행하였다. 13) 반응후 7개의농도구간으로 ( 최종농도 0에서 100 μg/ml) 전반응시킨반응액을희석시키고 1mM NADPH와 CYP1A2 (phenacetin 50 μm) 과 CYP2C9 (tolbutamide 100 μm) 의기질을가하고 5분간추가로반응하였다. NADPH를가한군과가하지않은군의 IC 50 의차이를통하여대사의존적 CYP 억제활성을평가하였다. 13) 반응액을 Shimadzu LC-20A prominence 고성능액체크로마토그래피 (Shimadzu Corp. Tokyo, Japan) 와 Turbo IonSpray source (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 가장착된 API3200 Q-trap LC-MS/MS (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 로구성된분석시스템을통해미리확립된분석조건을이용하여분석하였다. 14) 샘플의분석은 positive와 negative (6-hydroxychlorzoxazone) multiple reaction monitoring (MRM) mode를이용하여각각형성된대사체와내부표준물질의 peak 넓이를통해계산하였다. 분석의 dwell 시간은각채널별로 0.08 초로설정하였다. 분석된값들은 Analyst 소프트웨어 (version 1.5.2, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를통해처리하였다. 마이크로좀대사안정성평가및대사체분석 CAPE과 caffeic acid의인간마이크로좀에서의 NADPH 의존적대사안정성평가를위해 1mg/mL 인간마이크로좀단백질분획을 0.1 M phosphate buffer (ph 7.4) 에서 4 mm MgCl 2, 1 mm nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 5 mm glucose-6- phosphate 와 1 unit/ml glucose-6-phosphate dehydrogenase 를포함한 NADPH-generating system과함께진탕배양하였다. 5분간의예비배양후에반응 NADPH-generating system를가하여반응을시작하였고내부표준물질인 200 nm 농도의 4-methyl umbelliferone를포함하는 ice-cold acetonitrile 가하여반응을종결시켰다. 반응액은원심분리기에서 4 o C에서 3000 g로 20분간원심분리하여상등액을질량분석기에연결된 HPLC에주입하였다. 반응액은 CYP 저해실험계와동일한질량분석시스템을활용하여 Waters Xterra MS C18 column (2.1 mm 50 mm, 입자경 3.5 μm; Waters, Milford, MA, USA) 과 SecurityGuard C18 guard column (2.0 mm 4.0 mm; Phenomenex, Torrance, CA, USA) 을이용하여분리하고 negative MRM mode에서검출하였다. CAPE와 caffeic acid의 MRM transition은 282.9>135.1과 178.9>135.1을이용하였다. 자료분석 CYP의활성은대조군의백분율로환산하였다. 대사안정성평가는 0시간을대조군의백분율로환산하였다. 모든결과는평균 ± 표준편차로나타내었다. 비선형회귀분석은 GraphPad Prism, Vol. 62, No. 2, 2018

3 CAPE 의 CYP 저해활성 79 version 5.0. (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 을이용하여, IC 50 과 95% 신뢰구간으로나타내었다. 실험군사이의차이는 Student s t-test를이용하여검증하였다. 결과및고찰 (Results and Discussion) 특정 CYP isoform에대한 inhibition 양상을확인하고실제약물의투여시발생할수있는약물상호작용을평가하기위해서 CYP probe 기질의 cocktail을이용한 assay를실시하였다. CYP3A4 저해제인 ketoconazol을양성대조군으로사용하여, 기존문헌의 IC 50 값과비교하여본실험계가잘구축되었음을확인하였다 (data not shown). CAPE의 CYP 개별 isoform에대한 IC 50 값 (95% 신뢰구간 ) 은 CYP1A2에서 (6.87~22.94) μg/ml, CYP2B6에서 (28.80~44.54) μg/ml, CYP2C8에서40.49 (28.96~55.78) μg/ml, CYP2C9에서 (15.05~22.66) μg/ml, CYP2C19에서 (34.58~58.51) μg/ml, CYP2D6에서 (73.46~111.1) μg/ ml, CYP2E1에서 (20.59~29.64) μg/ml, midazolam을기질로할때 CYP3A4에서 (44.87~81.97) μg/ml, testosterone 을기질로한 CYP3A4에서 (26.41~48.43) μg/ml으로관찰되었다. CYP2A6에서는유의적저해가일어나지않았다 (Fig. 1). 계산된 IC 50 값에근거하여 CAPE가 CYP1A2와 CYP2C9에대해강한억제, CYP2E1, 2B6, 2C8, 2C19와 3A4에중간정도억제그리고 CYP2D6와 2A6에약한억제효과를나타내었다. 이결과는 CAPE가프로폴리스의 CYP 억제에기여함을시사한다. CAPE의 CYP 억제효과가 CAPE자체보다 CYP 매개성대사체에기인할가능성을확인하기위해 CAPE에의해가장큰억제효과를보인 CYP1A2와 CYP2C9를대상으로추가실험을수행하였다. CAPE로부터대사체가생성될수있도록 HLM과 NADPH를가하고반응시킨후얻은 CYP의 IC 50 과 NADPH 없 Fig. 1 Effect of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) on activities of CYP1A2 (A), CYP2A6 (B), CYP2B6 (C), CYP2C8(D), CYP2C9 (E), CYP2C19 (F), CYP2D6 (G), CYP2E1 (H), CYP3A4 (midazolam as a substrate) (I), and CYP3A4 (testosterone as a substrate) (J) in pooled human liver microsomes (HLM). Each data point represents the mean±sd of three independent samples. J. Pharm. Soc. Korea

4 80 류창선 박지은 김상겸 Fig. 3 Metabolic stability of CAPE (A) and its metabolite identification (B) in HLM incubated with or without NADPH. Each data point represents the mean±sd of three independent samples. **,***Significantly different from the control at P<0.01 or P<0.001 (Student s t-test). Fig. 2 Evaluation of the metabolism dependence of the inhibitory effects of CAPE on CYP1A2 (A) and CYP2C9 (B) in HLM. CAPE was pre-incubated in pooled human liver microsomes with (black circle) or without (white circle) NADPH for 30 min. Each data point represents the mean±sd of three independent samples. *,**,***Significantly different between two groups at P<0.05, P<0.01 or P<0.001, respectively (Student s t-test). 이반응시킨후얻은 CYP의 IC 50 를비교하였다. NADPH로 CAPE를반응시켰을때얻은 IC 50 값으로반응시키지않고얻은 IC 50 값을나누었을때 CYP1A2는 2.0 그리고 CYP2C9에서 1.1 로 CAPE에의한 CYP1A2의저해가대사의존적일가능성을시사한다 (Fig. 2). CAPE는혈액및간을포함한다양한 esterase에의해 caffeic acid로대사된다. 15) HLM에서 CAPE의대사적인특성을분석하기위해 1μM CAPE를기질로하여대사적안정성과 caffeic acid 의생성을조효소인 NADPH의유무에따라서평가하였다. 안정성평가에서 CAPE는 NADPH의유무와관련없이반감기가 3 분이내로매우신속하게제거되었다 (Fig. 3A). 반면 HLM이없이반응시켰을때에는반응 30분까지안정적으로농도가유지되었다. 이결과는 CAPE의대사가 HLM에존재하는효소에의존적이나 NADPH에비의존적인반응에의해제거됨을시사한다. CAPE를 HLM과반응시키고 caffeic acid의생성을측정하였다. CAPE로부터 caffeic acid의생성은 NADPH의존재유무와무관하게매우신속하게생성되었다 (Fig. 3B). HLM에 1μM CAPE 를가하고반응후 caffeic acid의최대생성량은 NADPH가없는조건과있는조건에서각각 864±11 μm과 655±31 μm로대부분이 caffeic acid로전환되었다. Caffeic acid의생성량은 NADPH가있는조건에비하여 NADPH가없는조건에서반응후 10분과 20분에유의적으로증가하였다. 이결과는일부 CAPE 가 caffeic acid가아닌다른물질로 CYP에의존적인대사를받았을가능성을시사한다. Caffeic acid가 HLM에서 CAPE의주대사체로평가되었기때문에 caffeic acid가 CYP의활성에미치는영향을평가하였다. Caffeic acid의 CYP 개별 isoform에대한 IC 50 값은 CYP2E1에서 (9.078~16.41) μg/ml 이고다른 isoform에서는최고농도에서 50% 미만의저해가관찰되어 IC 50 를구할수없었다 (Fig. 4). 이결과는 HLM에서 CYP의억제가대사체인 caffeic acid가아닌 CAPE 자체나다른대사체에기인할가능성을시사한다. CAPE의대사적안정성을평가한연구는랫드혈장에서 CAPE 는빠른속도로분해되었으나 16) 인간혈장에서는상대적으로안정적인것으로보고되었다. 15) 본실험은간마이크로좀에서 CAPE가 NADPH에비의존적으로빠르게분해되는것으로확인하였다. 이는간에존재하는 esterase의활성에의해서 CAPE가 caffeic acid로전환됨을시사한다. Caffeic acid는 CAPE의대사체로서 CYP의억제에기여하지않으나 CYP2E1의경우 CAPE 에비하여 caffeic acid의억제효과가우세하였다. Vol. 62, No. 2, 2018

5 CAPE 의 CYP 저해활성 81 Fig. 4 Effect of caffeic acid on activities of CYP1A2 (A), CYP2A6 (B), CYP2B6 (C), CYP2C8(D), CYP2C9 (E), CYP2C19 (F), CYP2D6 (G), CYP2E1 (H), CYP3A4 (midazolam as a substrate) (I), and CYP3A4 (testosterone as a substrate) (J) in pooled HLM. Each data point represents the mean±sd of three independent samples. CAPE의 CYP1A2에대한저해는이미보고된바있다. 17) 또한 CAPE는랫드에서 CYP1A2와 CYP2B1/2의발현을감소시키는것으로보고되었다. 18) 또한 CAPE는 hypoxia-inducible factor-1를유도함으로써 3-methylcholanthrene에의해유도된 CYP1A1에대해저해효과를나타내었다. 19) 본연구는 CAPE가 CYP1A2를대사의존적으로억제하여 CYP1A2의억제에 CAPE 의대사체가관여함을보이고있다. 또한 CYP1A2 외에도 CYP2C9을비롯하여다양한 CYP가 CAPE에의해억제되었다. 을보였다. HLM에서 CAPE는 NADPH에비의존적으로매우신속하게 caffeic acid로전환되어 esterase가 CAPE의대사에관여할가능성을시사하였다. 결론적으로 CAPE는프로폴리스의 CYP 억제에기여할가능성을시사한다. 감사의말씀 (Acknowledgment) 이연구는충남대학교학술연구비에의해지원되었음 결 론 (Conclusion) References 본연구에서대표적인건강기능식품인프로폴리스의지표성분중하나인 CAPE가 9개의대표적인 CYP 동형단백질의활성에미치는영향을 HLM 과 LC-MS/MS를이용하여평가하였다. 실험결과 CAPE는 CYP1A2와 CYP2C9에대해강한억제능 1) Korea Agency of HACCP Association and Services, 2016 Korean market analysis of functional foods (2017). 2) Sobocanec S., Sverko V., Balog T., Sarić A., Rusak G., Likić S., Kusić B., Katalinić V., Radić S. and Marotti T.: Oxidant/ J. Pharm. Soc. Korea

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Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,