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주호 제갈
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1 Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 17, No. 10 pp , ISSN / eissn 정민주 1, 정경아 2* 1 조선대학교생명과학과, 2 동신대학교작업치료학과 Effects of Lespedeza Caneata ethanol extract on the liver of alcohol administered Mice Min-Ju Cheong 1, Kyoung-A Chung 2* 1 Dept. of life science, Chosun University 2 Dept. of Occupational Therapy, Dongshin University 요약본연구는야관문추출물이알코올투여된생쥐의간장에미치는영향을알아보고자시행하였다. 대조군 (Con), 알코올투여군 (AL) 알코올 - 야관문 200 mg /kg 투여군 (AL-LC 200 군 ), 알코올 - 야관문 400 mg /kg 투여군 (AL-LC 400 군 ) 으로나누어구분하였다. 대조군과알코올투여군은 1 차증류수를알코올 - 야관문투여군은야관문을각각 200 mg /kg 과 400 mg /kg 농도로 10 일간경구투여하였다. 모든실험군은경구투여 7 일후 12 시간절식시킨다음대조군은 1 차증류수, 알코올투여군과알코올 - 야관문투여군은 50% ethanol (MERCK, USA) 을 10 g/kg 농도로 12 시간간격으로 5 회경구투여하였다. 혈액의 AST, ALT 효소활성과간장의조직학적실험을하여다음과같은결론을얻었다. AST, ALT 은 AL 군보다알코올 - 야관문복합투여군에서수치가감소하였다. 특히 AST 활성은 AL 군에대하여 AL-LC 200 군과 AL-LC 400 군모두활성이유의적으로감소하였다. 조직학적결과는간장에서 AL 군은대부분에서괴사와변형이일어났고중심정맥주변간세포내에지방방울이축적되었다. AL-LC 200 군에서는중심정맥의일부가부풀어진모습을보였고간세포의팽창과작은지방방울이축적되었다. AL-LC 400 군에서는중심정맥은정상적인모습을보이며일부간세포내의작은지방방울이축적되었고대부분은정상적인모습을보였다. 이상의연구결과로보아야관문추출물이알코올투여한생쥐의간장손상에대한보호효과가있어기능성건강소재로서의활성용도가높을것으로사료된다. Abstract This study was conducted to investigate the effects of Lespedeza caneata extract on the livers of alcohol-administered mice. The study subjects were divided into a control (Con), alcohol administration (AL), alcohol and Lespedeza Caneata extract 200 mg /kg administration (AL-LC 200), and alcohol and Lespedeza caneata extract400 mg /kg administration (AL-LC 400) group. Distilled water was administrated orally to control and alcohol groups for ten days, while Lespedeza caneata extract was administered orally to alcohol and Lespedeza caneata extract groups for ten days. All experimental groups were fasted for twelve hours seven days after the oral administration, after which distilled water was administered orally to Con five times at twelve-hour intervals. At the same time, 50% ethanol (MERCK, USA) at 10 g/kg concentration was administered orally to AL and AL-LC groups five times at 12-hour intervals. The AST, ALT enzyme activation in blood and histology of the liver were then evaluated. AST and ALT in AL-LC groups were lower than in the AL group. Particularly, the AL-LC 200 and AL-LC 400 groups had significantly lower AST activation than the AL group. Histological results showed that most of the subjects in the AL group had necrosis and deformation in their livers, while fat droplets were accumulated in hepatic cells around the central vein. AL-LC 200 group revealed that a portion of the central vein was swollen, liver cells were expanded, and small fat droplets were accumulated. In the AL-CL 400 group, the central vein was normal and small fat droplets were accumulated in some liver cells. However, most of the liver cells appeared normal in the AL-CL 400 group. These results suggest that the extracts of Lespedeza caneata prevented alcohol induced liver damage in mice and have great potential for use as natural health products. Keywords : ALT, AST, alcohol, Lespedeza Caneata extract, liver * Corresponding Author : Kyoung-A Chung (Dongshin Univ.) Tel: jka0414@dsu.ac.kr Received September 1, 2016 Accepted October 7, 2016 Revised (1st September 9, 2016, 2nd September 20, 2016) Published October 31,

2 1. 서론현대사회의복잡성과계속적인스트레스로말미암아알코올의소비가증가되는추세에있다. 알코올은 ethyl alcohol 과 methyl alcohol로대별되며 methyl alcohol은 formic acid 및유기산생성으로인해산증유발, 망막손상및중추신경손상으로인하여 ethyl alcohol만이음료나의약품으로사용되고있다 [1]. 세계보건기구 (WHO) 가발표한 술과건강에대한세계현황보고서 2014 에따르면우리나라 1인당연간알코올소비량이세계 190 개국중 15위, 아시아에선 1위로나타났다 [2]. 또한우리나라는도수가높은증류주로만보면세계 1위로나타났을뿐만아니라 1인당한국인의알코올소비량도감소하지않으며오히려늘어나고있는추세이다 [3]. 알코올의섭취는소화관점막을손상시켜영양학적인문제를일으킬뿐만아니라소화기계통, 순환기계통, 신경계통등전신에유해한손상을일으킨다 [4, 5, 6]. 흡수된알코올의대부분이간장에서대사되기때문에다른기관에비하여많은영향을받는다. 간장은우리몸에서가장큰샘으로문맥으로운반된영양분의저장과분해, 혈당조절, 3대영양소대사작용, 쓸개즙생산, 혈액량조절, 혈액응고인자생산, 방어, 재생및해독작용등여러기능을하는것으로알려져있다 [7]. 섭취된알코올은간내에서 alcohol dehydrogenase (ADH) 에의해 Hydrogen 과 acetaldehyde로산화되고 Hydrogen 증가는 lactate생산을증가시켜간내에 collagen 생산을증가시키고 acetaldehyde는단백질축적과지질과산화촉진등유독작용을일으킨다 [1]. 알코올로인하여간고유의기능을상실하면간세포의변성및괴사, 지방축적, 간효소의누출등의간손상을유도하여지방간, 간염, 간경화증, 간암과같은간질환이발생하게된다 [8, 9,10]. 우리나라사람들은서양인에비하여알코올분해효소의활성이낮아많은양의알코올섭취는건강상의문제일으킬수있다 [11]. 이러한이유로우리나라에서는알코올로인한질병이나유해작용을해소시키고해독을도와주거나숙취를경감시키기위한연구가활발하게진행되고있다 [3,8,12]. 특히식품분야에서는염증반응성을감소시키거나무력화할수있는약물의발굴과활용에커다란관심을가지고우리주변에서볼수있는으름열매 [13], 헛개나무 [14], 머위 [15], 모링가 [16], 오미자 [17], 산겨릅 [18] 등과같은천연물질에관한연구가진 행되고있다. 야관문 (Lespedeza Caneata) 은콩과싸리속에속한여러해살이식물로우리나라와일본, 중국을비롯한인도등지에분포하며비수리, 삼엽초로불리워지고있다 [19]. 예로부터민간에서는발기부전, 조루, 정액루, 기침, 천식등의치료에효능이있는약재로사용되었으며, 야관문의생리활성물질로는 pinitol, flavonoid, phenol성분, tannin 및 β-sitosterol을함유하며, flavonoid 중에서도 quercetin, kaempferol, vitexin, orientin등을함유하는것으로보고되고있다 [20-23]. 주요약리작용으로간과콩팥을보호해주고폐기능강화와혈액순환에효능이있으며, 창상 [24], 항염 [25], 항산화 [23], 및미백 [26], 해독 [27] 의효과가있다고보고되고있다. 따라서본연구에서는알코올의섭취후에나타나는증상에대하여예방할수있는천연물질에대한관심이높아져여러가지생리활성물질을가지고있으나숙취해소능및간세포보호효과에대한연구는상대적으로미흡한실정인야관문추출물을이용하여급성알코올성간손상된생쥐에서의간보호효능을확인하고자시도되었다 2. 재료및방법 2.1 야관문추출액제조야관문잎과줄기는전남생약농업협동조합 ( 전남화순 ) 에서구입하여이물질을제거하고식물체파쇄기 ( 우주과학, 한국 ) 를이용하여파쇄하였다. 시료는 Kim & Hong[28] 의최적추출조건방법을변용하여야관문 50 g에 10배량의 60% ethanol을가하여 83 의 heating mantle (EAM , M-top, 한국 ) 상에서 6시간추출하였다. 추출액을 Wathman NO.2 여과지를이용하여여과한후감압증류장치 (EYELA N-1000, Tokyo, Japan) 로농축하고, 동결건조기 (FD8508, Ilshin, Dongducheon, Korea) 를이용하여건조하여총 5 g의분말을얻어약 10% 의수득율을얻었다. 2.2 실험동물및식이본실험에사용한실험동물은 7주령된수컷 ICR 마우스 (30 g) 로오리엔탈로부터공급받아사료와물은충 433

3 한국산학기술학회논문지제 17 권제 10 호, 2016 분히공급하고온도 22±2, 습도 55±15%, 12시간-12 시간 (light-dark cycle) 의환경이조절되는실험동물센터에서 1주일적응시킨후실험에사용하였다. 이동물실험은조선대학교동물실험윤리위원회의승인 ( 승인번호 : CIACUC2016-A0006) 을받아동물윤리준칙에의거하여실험하였다. 실험군은대조군 (Con군), 알코올투여군 (AL군), 알코올-야관문 200 mg /kg 투여군 (AL-LC 200군 ), 알코올- 야관문 400 mg /kg투여군 (AL-LC 400군 ) 으로각군에 5 마리씩무작위로나누었다. 정상군과알코올투여군은 1 차증류수를알코올- 야관문투여군은야관문을각각 200 mg /kg과 400 mg /kg 농도로 10 일간경구투여하였다. 모든실험군은경구투여 7일후 12시간절식시킨다음대조군은 1차증류수, 알코올투여군과알코올-야관문투여군은 50% ethanol (MERCK, USA) 을 10 g/kg농도로 12 시간간격으로 5회경구투여하였다. 최종투여 3시간후혈액과조직을채취하였다. 2.3 혈액내효소활성도측정실험종료후 24시간절식시킨다음 ether로마취한상태에서심장천자법을이용하여채혈한다음혈액을 40분간상온에서굳힌후 3000 rpm에서 15분간원심분리하여혈청을분리한후혈액자동분석기 (Roche cobas c 702) 를이용하여 (1) AST (Aspartate aminotransferase) 활성측정은실험관에혈청 20 μl과 AST kit R μl과 AST kit R 2 50 μl를혼합하여파장 340 nm에서흡광도를측정하였다. (2) ALT (Alanin aminotransferase) 활성측정은실험관에혈청 20 μl과 ALT kit R μl과 ALT kit R 2 50 μl를혼합하여파장 340 nm에서흡광도를측정하였다. 2.4 조직학적관찰간장조직을떼어내어 10% 중성포르말린에 72시간고정시킨후 24시간동안흐르는물에수세하고, 저농도 (70%) 부터고농도 (100%) alcohol 단계를거쳐탈수과정을거친후 xylene으로투명화하고, paraffin으로포매하였다. 블록을마이크로톰 (820, american optical, USA) 을이용하여 6 μm의두께로절편을만들었다. 슬라이드는 xylene으로 paraffin을제거후고농도 (100%) 부 터저농도 (70%) alcohol을거쳐함수시킨후증류수에수세하였다. hematoxylin- eosin(h&e) 염색을실시하였다. 2.5 통계처리 실험성적은평균값과표준편차 (mean±stand) 로표시하였고, 각시료군간의통계적분석은본실험에서얻은결과는 independent t-test를이용하여서각그룹간통계적유의성을검정하였다. 각군의유의성은 p<0.05 수준으로검정하였다. 3. 결과 3.1 AST 에미치는영향 대조군 (Con 군 ) 은 49.67±4.73 U/L, 알코올단독투여군 (AL군) 은 ±1.15 U/L, 알코올-야관문200 mg /Kg투여군 (AL-LC 200군 ) 은 77.33±13.43 U/L, 알코올-야관문 400 mg /Kg투여군(AL-LC 400군 ) 은 61.00±6.56 U/L로나타났다. 모든실험군은대조군에비하여활성이증가하였다. 특히 AL군과 AL-LC 400군은유의적으로변화하였다. AL군에대하여 AL-LC 200군과 AL-LC 400군은활성이유의적으로감소하였다 (Fig. 1. Table 1). Fig. 1. The actives of AST in mice treated 50% ethanol a nd/or Lespedeza Caneata extract Control : Alcoh ol no treatment, Alcohol: Alcohol treatment, AL- LC 200: Alcohol and Lespedeza Caneata extract tr eatment (200 mg /Kg), AL-LC 400: Alcohol and Lespedeza Caneata extract treatment (400 mg /Kg). values are mean±sd (n=5). Significant differences were compared with control at *p<0.05 Significant differences were compared with alcohol at **p<

4 3.2 ALT에미치는영향 Con군은 38.33±1.53 U/L, AL군은57.00±21.63 U/L, AL-LC 200군은30.33±8.08 U/L, AL-LC 400군은 29.67±6.35 U/L로나타났다. AL군은 Con군에비하여활성이즈높았다. 야관문을투여한 AL-LC 200군과 AL-LC 400군은 Con군에비하여활성이낮았다. 특히 AL-LC 400 군은유의적으로감소하였다 (Fig. 2, Table 1). 3.3 조직학적결과 Con군은중심정맥을중심으로하여방사선모양으로동모양혈관이배열되고주변으로간세포가관찰되었다 (Fig. 3-A). AL군에서는중심정맥은내막층분리되거나절단되고위축되는불규칙적인모양을보였다. 중심정맥주변의간세포들은팽창되고소엽주변세포에서는일부핵은응축되어괴사가진행되었다. 또한중심정맥주변간세포내에지방방울이축적되었다 (Fig. 3-B). AL-LC 200군에서는중심정맥의일부가부풀어진모습을보였고간세포의팽창과작은지방방울이축적되었다 (Fig. 3-C). AL-LC 400군에서는중심정맥은정상적인모습을보이며일부간세포내의작은지방방울이축적되었고대부분은정상적인모습을보였다 (Fig. 3-D). 4. 고찰및결론 Fig. 2. The actives of ALT in mice treated 50% ethanol a nd/or Lespedeza Caneata extract. Control : Alcoh ol no treatment, Alcohol: Alcohol treatment, AL-L C 200: Alcohol and Lespedeza Caneata extract tre atment (200 mg /Kg), AL-LC 400: Alcohol and Lesp edeza Caneata extract treatment (400 mg /Kg). values are mean±sd (n=5). Significant differences were c ompared with control at *p<0.05 Table 1. Blood Chemistry in mice treated 50% ethanol an d/or Lespedeza Caneata extract Groups AST (U/L) ALT( U/L) Control 49.67± ±1.53 Alcohol ±1.15 * 57.00±21.63 AL-LC ±13.43 ** 30.33±8.08 AL-LC ±6.56 *, ** 29.67±6.35* Control : Alcohol no treatment, Alcohol: Alcohol tre atment, AL-LC 200: Alcohol and Lespedeza Cane ata extract treatment (200 mg /Kg), AL-LC 400: Alc ohol and Lespedeza Caneata extract treatment (400 mg /Kg). values are mean±sd (n=5). Significant differences were compared with control at *p<0.05 Significant differences were compared with alcohol at **p<0.05 알코올성음료의주성분인 ethanol의섭취는혈중알코올농도, 감수성, 섭취조건등에따라생체가영향을받아기능이일시적으로장애되는상태가나타난다 [6]. 그중에서간장에심각한상해를일으키며전체간질환의 50-60% 가알코올성질환과관련있다고보고되어지며국내 1인당알코올소비수준이점차적으로증가함에따라알코올섭취후체내에남아있는알코올은간효소작용에의해해독되어지거나간기능의손상이나장애가나타나간병변으로진행되어진다 [29-31]. AST, ALT 효소활성은정상상태에서는효소의활성이낮지만화학약품의중독, 세균의감염, 종양혹은저산소증으로간세포가손상을받게되면간조직은괴사등여러가지병변이유발되어간세포에서혈액으로유출되어활성이증가된다. 혈청중 AST, ALT은간기능검사를위해임상실험에서널리이용되고있다 [32]. 본연구에서도실험조건에따른간손상을확인하고자간장장애의지표가되는 AST, ALT 활성여부를확인하였다. 본연구에서 AST 활성은대조군에비하여실험군모두활성이높았다. 특히 AL군과 AL-LC 400군은유의적인증가를나타났다. ALT 활성은 AL 군에서활성이증가하였고야관문투여군에서는활성이감소하였다. Kim 등의 [3] 급성알콜성간손상에서정상군에비하여알코올투여군과알코올- 후코이단투여군모두 AST, 435

5 한국산학기술학회논문지제 17 권제 10 호, 2016 Fig. 3. Histopathological changes of hepatic cell in mice treated 50% ethanol and/or Lespedeza Caneata extract (H&E stain, X200) ALT 활성도가상승하였고, Kim 등 [33] 의알코올유도간손상실험에서정상군에비해실험군인알코올군과알코올-지구자열수추출물군모두 AST, ALT활성도가증가하여본연구의 AST 활성에서는일치하였다. 본연구에서 AL군에비하여 AL-LC 200군과 AL-LC 400군에서 AST, ALT 활성이감소하였으며, AST 효소활성은유의적인감소를하였다. Kim 등의 [3] 알코올투여군과후코이단투여군비교에서는 AST, ALT 활성이알코올단독투여군에비하여알코올후코이단투여군에서감소하였다. Kim등 [34] 의실험군간의비교에서 AST, ALT 활성이알코올단독군에비하여지구자추출물군이감소하였다. 후코이단을투여한실험 [3] 과지구자열수추출물의실험 [33] 과유사하였다. 알코올성간질환의조직학적초기에는간세포의지방증 (steatosis) 으로작은지방방울에서큰지방방울로진행되면서지방간염 (steatohepatitis), 알코올성간질환의마지막단계인간조직의섬유화에의한간경변증 (steatofibrosis) 으로조직학적변화가일어난다 [34, 35]. 알코올성간손상에서보여주는육안적인특징으로 Koneru등 [36] 의알코올에의한간손상실험에서알코올단독투여군에서부분적인출혈과비후된모습과지방으로축적으로인해서겉표면이황색을나타내며알코올-fistin투여군에서는정상군과유사한모습을보인다고보고하였으나본연구와는실험기간의차이가있어 AL 군이나 AL-LC군모두외견상황색의변화는보이지않아차이가있었다. 본연구에서는 AL군에서중심정맥을중심으로세포내지방방울이형성되었고세포침윤현상과괴사가관찰되었으며, 중심정맥의내막층이분리되거나절단되고위축되는불규칙적인모양을보였다. 알콜성간중독과유사한특징을보이는사염화탄소를이용한실험 [37] 에서사염화탄소단독투여군에서는중심정맥주변으로심한괴사가나타나고괴사주변지방변화를동반한개별적인간세포의퇴화를나타났으며, Kim등의알코올간손상실험 [3] 에서알콜섭취군에서는간조직내에과도한지방축적으로지방방울형성이과도하게일어나세 436

6 포안을차지하고있다고하였고, 죽력량변화에따른간손상실험 [38] 에서증가된고농도의간조직은간세포의팽창과중심정맥의내피가분리, 절단된모습과중심정맥의위축이관찰되어전형적인간손상의모습을보여본실험과유사하였다. 또한 AL- LC 200군에서는 AL군에비하여지방방울축적증상이감소하였고 AL- LC 400군에서는 Con군과유사한모습을보였다. Kim등의 [3] 실험에서알코올군에비하여알코올- 후코이단투여군에서도지방방울의감소현상이관찰되었고, Kim 등 [37] 의사염화탄소-생식투여군에서도개별적인간세포의퇴화가일부에서만나타나사염화탄소단독투여군에비하여간세포손상이완화되었다고보고하였고 Kim 의 [38] 실험에서저농도의죽력량군에서는간세포들의팽창, 혈구들의응집이관찰되어고농도죽력량군에비해간손상이완화되어본연구실험결과들과유사하였다. AST, ALT활성도와간조직학적결과를비교하면 AL군에비하여 AL-LC 200, 400군에서간손상이완화되었다. 따라서야관문추출물은 flavonoid, phenol성분과같은생리활성물질을많이함유하고있어알코올과같은외부자극에간세포의안정화에기여함으로써체내과산화작용에의한염증의유발및이에따른면역체계의활성화조절하여간세포손상을억제하는물질로서알코올중독현상완화에관한임상에서의유용성이기대된다고본다. References [1] H. Y. Yu, C. M. Kim, K. H. Koo, An experimental study on the effect of ginseng saponin upon alcoholic liver injury, J. Hanyang Med. Coll. 2(2), pp , [2] Segye Times [3] M. J. Kim, J. Jeon, S. P. Lee, J. S. Lee, Protective Effects of Fucoidan against Acute Alcohol-induced Liver Injury in Rats kor. J. Food Sci. Technol. 46(2), pp , DOI: [4] A. Szilagyi, Liver diseases in the alcoholic. Can. Fam. Physician. 32, pp , [5] E. H. Lee, J. H. Chyun, Effects of beta-carotene supplementation on lipid peroxide levels and antioxidative enzyme activities in alcoholic fatty liver rats Korean J. Nutr. 38, pp , [6] D. H. Kim, H. K. Kim A study on pruritus of female alcoholics J. Kor. Aca. Indus. coope. Soc. 14(9), pp , [7] Y. T. Chung, K. A. Chung, S. S. Chang, Human Physiology Cheong Gu moonhwasa, Seoul. pp [8] D. H. Youn, W. I. Kim, C. S. Na, "Effects of combination pear extract with Daekumeumjagami medication on hepatic injury induced by alcohol in mice" Kor. J. Herbology 30(1), pp , DOI: [9] W. S. Choi, D. Y. Jang, K. M. Cha, C. K. Park Enhanced Activities of Alcohol Methabolism by Extracts from Hericium erinaceum Hypha Cultivated with Artermisia capillaris(heac) j. Kor. Aca. Indus. coope. Soc. 9(1), pp , [10] H. K. An, J. Y. Park, H. J. Yoon Association of among alcohol consumption and blood vitamin D and lead concentrations: Basedon Korea national health and nutrition examination survey JKAIS, 16(1) pp , DOI: [11] S. K. Park, Y. C. Cho, Relationships Between Alcohol Intake and Blood Pressure, Serum Lipids, Liver Function Tests and ObesityIndices in Middle-Aged Male Workers JKAIS, 16,(5), pp , DOI: [12] G. H. Choi, J. G. Kim, S. T. Kwon, "Protective Effects of Food Including Hovenia dulcis on Acute Alcohol Intoxication" J Korean Soc Food Sci Nutr 40(8), pp , DOI: [13] S. H. Lee, Y. S. Song, S. Y. Lee, S. Y. Kim, K. S. Ko Protective Effects of Akebia quinata Fruit Extract on Acute Alcohol-induced Hepatotoxicity in Mice J. Food Sci. Techol. 46(5), pp , DOI: [14] G. H. Choi, J. G. Kim, S. T. Kwon Protective Effects of Food Including Hovenia dulcis on Acute Alcohol Intoxication J Kor. Soc Food Sci. Nutr 40(8), pp , DOI: [15] B. S. Cho, J. J. Lee, M. Y. Lee Effects of Ethanol Extracts from Petasites japonicus S. et Z. Max. on Hepatic Antioxidative Systems in Alcohol Treated Rats J Korean Soc Food Sci. Nutr. 36(3), pp , DOI: [16] Y. J. Choi, K. I. Jung Anti-Diabetic, Alcohol-Metabolizing, and Hepatoprotective Activities of Moringa (Moringa oleifera Lam.) Leaf Extracts J Kor. Soc Food Sci. Nutr. 45(6), pp , [17] C. K. Han, K. S. Seong, K.W. Lee, S. S. Park, J. Y. Jeong, S. S. Kim Effects of Omija (Schizandra chinensis Baillon) Concentrate on BloodAlcohol Clearance and Hepatoprotective Function in Rats Induced by Acute Ethanol Intoxication and Chronic Ethanol Treatment J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 43(8), pp , DOI: [18] E. K. Cho, Kyung Im Jung, Young Ju Choi Anti-Diabetic, Alcohol Metabolizing Enzyme, and Hepatoprotective Activity of Acer tegmentosum Maxim. Stem Extract J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 44(12), pp , DOI: 437

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<32365FC1A4B0E6BEC62DBEDFB0FCB9AE284C A E E6F6C20C3DFC3E2B9B0C0CC2E687770> Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 17, No. 6 pp. 207-214, 2016 http://dx.doi.org/10.5762/kais.2016.17.6.207 ISSN 1975-4701 / eissn 2288-4688 야관문 (Lespedeza Caneata) Ethanol