(52) CPC 특허분류 A61Q 19/02 ( ) A61Q 19/08 ( ) A61K 2236/30 ( ) (72) 발명자 강세미 대구광역시달서구성서서로 316 ( 이곡동, 대백창신한라 301 동 802 호 ) 김동희 경상북도경산시진량

Transcription

1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2016년10월19일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/85 ( ) A61K 8/97 ( ) A61Q 19/02 ( ) A61Q 19/08 ( ) (52) CPC 특허분류 A61K 36/85 ( ) A61K 8/97 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2015 년 04 월 10 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 8 항 2015 년 04 월 10 일 (71) 출원인 재단법인한국한방산업진흥원 경상북도경산시화랑로 94 ( 갑제동 ) (72) 발명자 손준호 대구광역시수성구청수로 551 (103 동 205 호, 만촌동, 만촌우방팔레스 ) 박태순 대구광역시수성구동대구로 59 ( 대우트럼프월드수성 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 신동인 (54) 발명의명칭만형자추출물을유효성분으로함유하는피부미백및피부노화방지용조성물 (57) 요약 본발명은만형자추출물을유효성분으로함유하는미백및피부노화의치료및예방용조성물에관한것으로, 구체적으로본발명의추출물은 DPPH 자유라디칼소거활성, ABTS 라디칼양이온소거능저해활성, 크산틴옥시다제 (Xanthine oxidase) 저해활성등의항산화효과 ; 높은세포생존률 ; 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내티로시나제 (Cellular tyrosinase) 저해활성, 멜라닌 (melanin) 생합성저해활성, 미백과관계되어진티로시나제 (tyrosinase) 단백질발현억제등의미백활성 ; 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아세포의생존율증가, 프로 - 콜라게나제 (pro-collagenase) 저해활성,, 세포내항노화관련단백질발현억제실험등을통한주름개선효과등을확인하여미백및피부노화치료및예방용조성물로유용하게이용될수있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (52) CPC 특허분류 A61Q 19/02 ( ) A61Q 19/08 ( ) A61K 2236/30 ( ) (72) 발명자 강세미 대구광역시달서구성서서로 316 ( 이곡동, 대백창신한라 301 동 802 호 ) 김동희 경상북도경산시진량읍황제 1 길 ( 창신황제타운 106 동 801 호 ) 이미경 대구광역시달서구대명천로 101 ( 본리동, 롯데캐슬 102 동 705 호 ) 유재묘 경상북도경산시삼풍로 4 길 17-1 ( 삼풍동, 대경마을 302 호 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 R 부처명 산업통산자원부 연구관리전문기관 한국산업기술진흥원 연구사업명 지역연고산업육성사업 연구과제명 경북화장품산업육성사업 기여율 1/1 주관기관 재단법인한국한방산업진흥원 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 만형자추출물을유효성분으로함유하는미백및피부노화의치료및예방용피부외용약학조성물. 청구항 2 제 1항에있어서, 상기추출물은만형자의조추출물, 극성용매가용추출물또는비극성용매가용추출물임을특징으로하는피부외용약학조성물. 청구항 3 제 2항에있어서, 상기조추출물은물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 주정, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로구성된그룹으로부터선택된하나이상의용매가용추출물임을특징으로하는피부외용약학조성물. 청구항 4 제 2항에있어서, 상기비극성용매가용추출분획물은본원의조추출물로부터헥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 또는에틸아세테이트에가용한추출분획물임을특징으로하는피부외용약학조성물. 청구항 5 제 2항에있어서, 상기극성용매가용추출물은상기조추출물로부터비극성용매가용분획물들을제거하고남은물, 메탄올, 부탄올또는이들의혼합용매로부터선택되어진용매에가용한추출분획물임을특징으로하는피부외용약학조성물. 청구항 6 제 1항에있어서, 상기피부노화는주름살, 기미, 주근깨, 자외선에의한피부손상, 또는피부암임을특징으로하는피부외용약학조성물. 청구항 7 만형자추출물을유효성분으로함유하는미백및피부노화의개선및예방용화장료조성물. 청구항 8 제 7항에있어서상기화장료조성물은화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩의제형인것을특징으로하는화장료조성물. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은만형자추출물을유효성분으로함유하는피부미백및피부노화방지용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술 [ 문헌 1] Voegeli, R Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, [ 문헌 2] Aroca, P., et al Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, [ 문헌 3] Chin, J. E., et al Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene - 3 -

4 expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [ 문헌 4] Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M., Connective tissue alterations in skin exposed to natural and therapeutic UV-radiation. Photodermatol. 2(1), pp.15-26, Review, 1985 [ 문헌 5] Hirobe T., Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Res. 18(1), pp Review, 2005; [ 문헌 6] McKay IA, Leigh IM., Epidermal cytokines and their roles in cutaneous wound healing. Br J Dermatol. 124(6), pp.513-8, Review, 1991 [ 문헌 7] Kim HH, Cho S, Lee S, Kim KH, Cho KH, Eun HC, Chung JH., Photoprotective and anti-skin-aging effects of eicosapentaenoic acid in human skin in vivo. J Lipid Res. 47(5),pp , 2006; [ 문헌 8] Medina A, Ghaffari A, Kilani RT, Ghahary A., The role of stratifin in fibroblastkeratinocyte interaction. Mol Cell Biochem. 305(1-2), pp , Review, 2007 [ 문헌 9] Wang XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y, Li AG., Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 11(1), pp.112-7, Review, 2006; [ 문헌 10] Traidl-Hoffmann C, MI, Ring J, Behrendt H., Impact of desloratadine and loratadine on the crosstalk between human keratinocytes and leukocytes: Implications for anti-inflammatory activity of antihistamines. Int Arch Allergy Immunol. 140(4), pp , 2006 [ 문헌 11] Cannon JG, Tatro JB, Reichlin S, Dinarello CA., Alpha melanocyte stimulating hormone inhibits immunostimulatory and inflammatory actions of interleukin 1. J Immunol. 137(7), pp , 1986 [ 문헌 12] Yamamoto T, Eckes B, Mauch C, Hartmann K, Krieg T., Monocyte chemoattractant protein-1 enhances gene expression and synthesis of matrix metalloproteinase-1 in human fibroblasts by an autocrine IL-1 alpha loop. J Immunol. 164(12), pp , 2000; [ 문헌 13] Dai G, Freudenberger T, Zipper P, Melchior A, Grether-Beck S, Rabausch B, de Groot J, Twarock S, Hanenberg H, Homey B, Krutmann J, Reifenberger J, Fischer JW., Chronic ultraviolet B irradiation causes loss of hyaluronic acid from mouse dermis because of down-regulation of hyaluronic acid synthases. Am J Pathol. 171(5), pp , [ 문헌 14] Jimenez-Cervantes C., et al A new enzymatic function in the melanogenic pathway. J. Biol Chem 269, ; [ 문헌 15] Paval, S Dynamics of melanogenesis intermediates. J. Invest Dermatology 100, [ 문헌 16] Gilchrest BA (1990) Skin aging and photoaging. Dermatol Nurs, 2, 79-82; [ 문헌 17] Ha TY (2006) Development of functional food materials for healthy life. Korean J Crop Sci, 51, [ 문헌 18] Brenneisen P, Sies H and Scharffetter-Kochanek K (2002)Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases:from induction via signaling to initial events. Ann N Y Acad Sci 973: [ 문헌 19] Philips N, Keller T, Hendrix C, Hamilton S, Arena R, Tuason M and Gonzalez S (2007) Regulation of the extracellular matrix remodeling by lutein in dermal fibroblasts, melanoma cells, and ultraviolet radiation exposed fibroblasts. Arch Dermatol Res 299: [ 문헌 20] Emerit I (1992) Free radicals and aging of the skin. In Free Radicals and Aging. Emerit I,Chance B, eds. Experientia Supplementum, Birkhauser Basel, Basel, Switzerland. Vol 62, p [ 문헌 21] Maeda K, Fukada M (1991) In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J Soc Cosmet Chem 42: [ 문헌 22] Park JH and Lee CK (2000) The Encyclopedia of Medicinal Plants. Shinilbooks. 183~184, 248~

5 [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [ 문헌 23] Kang SS and Kim SJ (1994) Phytochemical Analysis of Viticis Fructus. Korean J. Pharmaco gn. 98: 214~220; [ 문헌 24] Ono M, Sawamura H, Ito Y and Mizuki K (2000) Diterpenoids from the fruits of Vitex trifolia. Phytochemistry. 55(8): [ 문헌 25] Blois MS. (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. 26, [ 문헌 26] Roterta, R., P. Nicoletta, P. Anna, P. Ananth, Y. Min and R.E. Catherine Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS Radical Cation Decolorization Assay. Radic. Biol. Med. 26, [ 문헌 27] Stirpe F and Della Corte E. (1969) The regulation of rat liver xanthine oxidase. Conversion in vitro of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) to oxidase (type O). J. Biol. Chem. 244(14), [ 문헌 28] Carmichael, J., W. G. DeGraff, A. F. Gazdar, J. D. Minna, and J. B. Mitchell Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemyagi A, Kanbara T and Morinobu N. (1986) The effect of tyrosinase inhibition for aloe. Planta Media. 3981, [ 문헌 29] Akiu S, Suzuki Y, Asahara T, Fujinuma Y and Fukuda M. (1991) Inhibitory effect of arbutin on melanogenesis-biochemical study using cultured B16 melanoma cells. Nippon Hifuka Gakkai Zasshi. 101(6), [ 문헌 30] Hosoi J. Abe E, Suda T and Kuroki T. (1985) Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res. 45(4), [ 문헌 31] Yamamura T, Onishi J and Nishiyama T. (2002) Antimelanogenic activity of hydrocoumarins in cultured normal human melanocytes by stimulating intracellular glutathione synthesis. Arch. Dermatol. Res. 294(8), [ 문헌 32] Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM and Walker JM. (1988) Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta Media. 54(1), [ 문헌 33] Kim JE. (2003) Effect of epigallocagechin-3-gallate on heat-modulated type Ⅰprocollagen, MMP-1, and TIMP-1 expression in cultured human dermal fibroblasts. Korea University. Seoul, Korea [ 문헌 34] WE and Heindrich HG. (1963) Zur quantitativen bestimmung der collagenase. Hoppe-Seyler's. Physiol. Chem. 333: [ 문헌 35] So SH, Lee SK, Hwang EI, Koo BS, Han GH, Lee MJ, Chung JH and Kim NM. (2008) Mechanisma of korean red ginseng herb extracts(ktng0345) for anti-wrinkle antivity. J. Ginseng Res. 32(1), 발명의내용 [0037] 해결하려는과제현대인들은자외선, 스트레스등의여러가지내외적인요인에의해각종피부트러블유발로기미, 주근깨, 피부색소침착등의피부노화현상을촉진한다 (1. Voegeli, R Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, ). 피부의색소침착은멜라닌색소의생합성에서 tyrosinase 효소를비롯하여 DHICA oxidase(trp-1) 등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine) 으로 DOPA에서 DOPA quinone으로초기반응을조절하는것으로알려져있다 (2. Aroca, P., et al Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, ). 이를바탕으로티로시나제 (tyrosinase) 효소의활성을저해하여멜라닌생합성의억제에영향을미칠수있는천연물탐색에대한연구가활발히진행되고있다. 그결과어성초추출물을이용하여티로시나제 (tyrosinase) 유전자발현억제효과 (3. Chin, J. E., et al Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene - 5 -

6 expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, ) 등천연물을활용한연구가활발히이뤄지고있다. 그외현재알려져있는항산화및미백원료는아르부틴 (Arbutin), 코지산 (Kojic acid), 아스코르브산 (Ascorbic acid) 등의물질이대표적이고상백피, 닥나무, 감초등의식물추출물이널리알려져있다. [0038] 환경의파괴로인한자외선증가및각종산화성물질의증가는피부손상과단백질의합성능저하를유발할수있다. 이러한피부세포의손상이나기능저하는피부탄력의감소, 피부주름살의증가, 기미와주근깨생성등피부미용에치명적인현상들을유발한다. 피부탄력성은진피조직의콜라겐 (collagen), 엘라스틴 (elastin), 히알루론산 (hyaluronic acid) 등에의해유지되며, 콜라겐 (collagen) 을합성하는섬유아세포 (fibroblast) 는핵심적인역할을한다 (Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M., Connective tissue alterations in skin exposed to natural and therapeutic UV-radiation. Photodermatol. 2(1), pp.15-26, Review, ). 섬유아세포기능은각종성장인자 (growth factor) 뿐만아니라케라티노사이트 (keratinocyte) 나멜라노사이트 (melanocyte) 와같은피부세포들에서분비되는싸이토카인 (cytokine) 에의해서도조절된다 (Hirobe T., Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Res. 18(1), pp Review, 2005;McKay IA, Leigh IM., Epidermal cytokines and their roles in cutaneous wound healing. Br J Dermatol. 124(6), pp.513-8, Review, ). 정상적인상태에서유리되는케라티노사이트의 TGF-β, TβRII, SGad3는피부섬유아세포 (dermal fibroblast) 로부터프로콜라겐 (procollagen), 피브릴린 (fibrillin-1), tropoelastin의발현을증가시켜콜라겐생성을증가시키며, MMPs의발현을억제하여콜라겐분해를억제하는것으로보고되었다 (Kim HH, Cho S, Lee S, Kim KH, Cho KH, Eun HC, Chung JH., Photoprotective and anti-skin-aging effects of eicosapentaenoic acid in human skin in vivo. J Lipid Res. 47(5),pp , 2006; Medina A, Ghaffari A, Kilani RT, Ghahary A., The role of stratifin in fibroblast-keratinocyte interaction. Mol Cell Biochem. 305(1-2), pp , Review, 2007)UV에의해케라티노사이트가손상되면 TGF-β(transforming growth factor) 외에도 TNF-α(tumor necrosis factor), PGE 2 (prostaglandin E 2 ), α-msh(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등의유리가유발한다 ( 문헌 6] Wang XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y, Li AG., Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 11(1), pp.112-7, Review, 2006; Traidl-Hoffmann C, MI, Ring J, Behrendt H., Impact of desloratadine and loratadine on the crosstalk between human keratinocytes and leukocytes: Implications for anti-inflammatory activity of antihistamines. Int Arch Allergy Immunol. 140(4), pp , 2006.). 이중 α-msh와 PGE 2 는멜라노사이트를자극하여멜라닌생성을촉진하여, 이멜라닌은피부세포의항산화작용을증강시켜피부세포가자외선으로인해손상되는것을방어하게한다 (Cannon JG, Tatro JB, Reichlin S, Dinarello CA., Alpha melanocyte stimulating hormone inhibits immunostimulatory and inflammatory actions of interleukin 1. J Immunol. 137(7), pp , 1986.). IL-1, TNF-α(tumor necrosis factor) 등은 fibroblast에작용하여 procollagen 발현을억제하며, MMP-1 (martrix metalloproteinase-1), MMP-2, MMP-3, 히알루로니다아제 (hyaluronidase) 등의활성을증가시켜콜라겐분해를촉진하게된다 ( Yamamoto T, Eckes B, Mauch C, Hartmann K, Krieg T., Monocyte chemoattractant protein-1 enhances gene expression and synthesis of matrix metalloproteinase- 1 in human fibroblasts by an autocrine IL-1 alpha loop. J Immunol. 164(12), pp , 2000;Dai G, Freudenberger T, Zipper P, Melchior A, Grether-Beck S, Rabausch B, de Groot J, Twarock S, Hanenberg H, Homey B, Krutmann J, Reifenberger J, Fischer JW., Chronic ultraviolet B irradiation causes loss of hyaluronic acid from mouse dermis because of down-regulation of hyaluronic acid synthases. Am J Pathol. 171(5), pp , ). 또한, UV에의해직접적으로섬유아세포 (fibroblast) 가상해를받는경우에도콜라겐관련유전자는억제되고분해에관련되는 MMPs류발현은촉진되어주름살은증가하게된다. 따라서, 진피섬유아세포 (dermal fibroblast) 의증식과콜라겐합성을증가시키거나, MMPs을억제하는것은주름살의생성을억제하는수단이될수있다. [0039] 최근들어, 미백, 노화방지, 피부개선, 항암및항균등복합기능성을가진화장료로써한약재는제품유형과제형에관계없이다양하게이용되어지고있으며, 화장품에천연물을직접이용한것은 1973년아모레퍼시픽이인삼을주원료로한진생상미라는제품을선보인것이원조라할수있고이후산삼, 홍삼, 감초, 녹두, 흑두한란, 단풍잎, 대나무, 닥나무, 주목 ( 朱木 ), 귤나무, 오가피, 야자수, 생강, 영지버섯, 녹차, 우엉, 뽕나무등다양한식물자원으로부터효능성분을추출하여화장품개발에적극적으로활용하고있으며, 소재개발로이루어 - 6 -

7 지고있으며, 현재세계화장품시장규모 05년약 2,500억불에서매년 10% 성장세를보이고있으며, 단순미용에서질병치료개념으로진화, 고기능다기능성으로확대, 한방화장품시대로변화고있는상황이며, 천연기능성소재의세계시장규모는연간판매액 150억달러에달하며최근매년평균 10% 이상의성장률을보이고있다. 피부천연물소재의개발시세계적으로연간 1조원~2조원의매출과매출의 20 ~ 50% 의순이익창출이가능할것으로예상됩니다. [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 특히, 주름개선화장품의원료개발에있어한방에대한연구는우리전통의학에기반을둔원료개발이라는점과우리나라소비자들의화장품선호도와맞물려국내화장품개발의주력분야가되고있으며, 우리가경쟁력을확보할수있는부분이므로지속적인개발이필요하며, 기능성화장품은고기능성에다기능성이추가되는방향으로기술개발이이루어지고있으며, 이러한기능성소재와관련기술의개발이활발해질것으로예상됨. 피부재생및보호효과가우수한한방재료를이용한제품화로미용성형및필링후민감한피부를효과적으로방어할뿐만아니라, 탁월한피부재생효과로인한기능성화장품또는의약외품으로서의가치를지님으로서상품화의가치가크고피부신약개발은임상초기에개발의성공여부를신속하게판단할수있어서임상후기단계의신약실패에따른위험이감소한다. 또한피부질환은신약개발에대한소요기간이상대적으로짧아서개발성과의조기가시화및빠른투자회수가가능하므로신약개발의새로운패러다임창출이가능할것이다. 현대인들은자외선, 스트레스등의여러가지내외적인요인에의해각종피부트러블유발로기미, 주근깨, 피부색소침착등의피부노화현상을촉진한다 (Voegeli, R Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, ). 피부의색소침착은멜라닌색소의생합성에서 tyrosinase 효소를비롯하여 DHICA oxidase(trp-1) 등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine) 으로 DOPA에서 DOPA quinone으로초기반응을조절하는것으로알려져있다 (Aroca, P., et al Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, ; Jimenez- Cervantes C., et al A new enzymatic function in the melanogenic pathway. J. Biol Chem 269, ; Paval, S Dynamics of melanogenesis intermediates. J. Invest Dermatology 100, ). 피부는시간이지남에따라호르몬분비가감소하고, 면역세포의기능활성이저하되어생체구성단백질들의생합성이줄어들게되어생기는내인성노화와외적으로오염된공기와약물, 자외선에의한광노화로나눠진다 (Gilchrest BA (1990) Skin aging and photoaging. Dermatol Nurs, 2, 79-82;Ha TY (2006) Development of functional food materials for healthy life. Korean J Crop Sci, 51, 26-39). 노화가진행될수록피부를구성하는물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등구조단백질을생성하는능력이감소하고 type-1 collagenase의생합성이증가하여 matrix metalloproteinase (MMPs) 의발현이증가되면진피내교원섬유, 탄력섬유, fibronectin 및 laminin과같은기질단백질분해를유도하여피부탄력을떨어뜨리고피부주름생성을야기한다 (Brenneisen P, Sies H and Scharffetter-Kochanek K (2002)Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases:from induction via signaling to initial events. Ann N Y Acad Sci 973: ). 최근연구에의하면 elastase가피부탄력성섬유의 3차원적뒤틀림에중요한역할을한다고보고되어있다 (Philips N, Keller T, Hendrix C, Hamilton S, Arena R, Tuason M and Gonzalez S (2007) Regulation of the extracellular matrix remodeling by lutein in dermal fibroblasts, melanoma cells, and ultraviolet radiation exposed fibroblasts. Arch Dermatol Res 299: ). Elastase의활성증가는피부탄력섬유를감소시켜피부주름형성에기여한다고알려져있으며산화적스트레스는피부노화를더촉진하게된다 (Emerit I (1992) Free radicals and aging of the skin. In Free Radicals and Aging. Emerit I,Chance B, eds. Experientia Supplementum, Birkhauser Basel, Basel, Switzerland. Vol 62, p ). 피부주름개선효과가있는다양한소재연구가활발하게진행되고있으며, 주름개선으로쓰이고있는물질로는 retinol, retinyl palmitate, adenosine, epigallocatechin gallate이있다 (Maeda K, Fukada M (1991) In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J Soc Cosmet Chem 42: ). 만형자 (Vitex trifolia L.) 는마편초과의순비기나무의열매이다. 만형자의기원식물인순비기나무는독특하면서강한향기를가지고있어예전부터잎과가지는목욕용재료나실내의습기를제거하기위한흡습제및방매제로사용하였으며, 종자인만형자는두통을완화시키는효과가있다고하여민간에서는베갯속으로사용하였다. 또한우리나라를포함한중국과일본등동양의학에서만형자는성질이차고맛은쓰면서맵고독이없어강장, 진정, 진통, 소염작용이있어감기, 만성중이염, 이명, 난청, 시력장애, 두통, 신경통, 습진및다양한염증과알러지성질환의치료에사용하고있다 (Park JH and Lee CK (2000) The Encyclopedia of Medicinal - 7 -

8 Plants. Shinilbooks. 183~184, 248~249). 만형자에관한연구로는 monoterpene류를포함한약 76종의정유성분과골수성백혈병저해효과를나타내는 flavonoids 와식물생장을조절하는 phenol 화합물등이분리동정된바있다 (Kang SS and Kim SJ (1994) Phytochemical Analysis of Viticis Fructus. Korean J. Pharmaco gn. 98: 214~220; Ono M, Sawamura H, Ito Y and Mizuki K (2000) Diterpenoids from the fruits of Vitex trifolia. Phytochemistry. 55(8): ). [0045] 이에본발명자들은만형자추출물에대하여 DPPH 자유라디칼소거활성, ABTS 라디칼양이온소거능저해활성, 크산틴옥시다제 (Xanthine oxidase) 저해활성등의항산화효과 ; 높은세포생존률 ; 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내티로시나제 (Cellular tyrosinase) 저해활성, 멜라닌 (melanin) 생합성저해활성, 미백과관계되어진티로시나제 (tyrosinase) 단백질발현억제등의미백활성 ; 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아세포의생존율증가, 프로-콜라게나제 (pro-collagenase) 저해활성, 세포내항노화관련단백질발현억제실험등을통한주름개선효과등을확인하여미백및피부노화치료및예방용조성물로유용함을확인함으로써본발명을완성하였다. [0046] [0047] [0048] [0049] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은만형자추출물을유효성분으로함유하는미백및피부노화의치료및예방용피부외용약학조성물을제공한다. 또한, 본발명은만형자추출물을유효성분으로함유하는미백및피부노화의개선및예방용화장료조성물을제공한다. 본원에서정의되는만형자추출물은만형자의조추출물, 극성용매가용추출물또는비극성용매가용추출물임을특징으로한다. 본원에서정의되는조추출물은물, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 주정, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 함수부틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수글리세린으로구성된그룹으로부터선택된하나이상의용매, 바람직하게는물또는물및에탄올혼합용매, 가장바람직하게는 60% 내지 80% 에탄올가용추출물임을특징으로한다. [0050] 본원에서정의되는비극성용매가용추출분획물은본원의조추출물로부터헥산, 메틸렌클로라이드, 클로로포 름, 또는에틸아세테이트, 바람직하게는헥산, 또는클로로포름용매에가용한추출물만을정제한비극성용매 에가용한추출분획물들을포함한다. [0051] 본원에서정의되는극성용매가용추출물은상기조추출물로부터비극성용매가용분획물들을제거하고남은물, 메탄올, 부탄올또는이들의혼합용매로부터선택되어진용매, 바람직하게는물또는부탄올, 보다바람직하게 는부탄올에가용한추출분획물을포함한다. [0052] [0053] 본원에서정의되는 " 피부노화 " 는주름살, 기미, 주근깨, 자외선에의한피부손상, 피부암, 바람직하게는, 주름살또는기미를포함한다. 상기복합생약추출물은피부외용약학조성물은총중량에대하여 0.1 내지 50 중량 % 으로포함함을특징으로한다. [0054] [0055] 이하, 본발명을더욱상세히설명한다. 본발명의추출물들은하기와같은제조방법으로수득될수있다

9 [0056] 예를들어, 이하, 본발명을상세히설명한다. [0057] [0058] 본발명의만형자추출물은하기와같이제조될수있다. 건조된만형자를세척및세절후정제수를포함한물, 메탄올, 에탄올, 부탄올등의탄소수 1 내지 4의저급알코올, 주정또는이들의혼합용매로부터선택된용매, 바람직하게는주정또는물및에탄올혼합용매, 보다바람직하게는주정를수회섞은다음에 30 내지 150, 바람직하게는실온에서 12시간내지 30일, 바람직하게는 1일내지 7일동안초음파추출법, 열수추출법, 상온추출법또는환류추출법, 바람직하게는상온추출법을약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회반복수행하여얻은추출액을여과, 감압농축, 및건조하여본발명의조추출물을얻을수있다. 또한, 본발명의극성용매또는비극성용매가용추출물은상기에서얻은조추출물, 바람직하게는 30 내지 90% 에탄올조추출물중량의약 내지 5배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배부피 (v/w%) 의물을가한후, n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트및부탄올을이용한통상적인분획과정을수행하여 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트등의비극성용매에가용한비극성용매가용추출분획물 ; 및부탄올, 물등의극성용매에가용한극성용매가용추출분획물을수득할수있다. [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] 상기목적을달성하기위하여, 본발명은만형자추출물을유효성분으로함유하는항산화, 미백, 및주름억제효과를갖는화장료조성물을제공한다. 본발명은상기제조방법에서얻어지는만형자추출물을유효성분으로함유하는항산화, 미백, 주름억제효과를갖는화장료조성물을제공한다. 상기약학조성물은크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제또는카타플라스마제제형을포함한다. 또한, 상기화장료조성물은화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩의제형을포함한다. 본발명자들은본발명의추출물에대하여 DPPH 자유라디칼소거활성, ABTS 라디칼양이온소거능저해활성, 크산틴옥시다제 (Xanthine oxidase) 저해활성등의항산화효과 ( 실험예 1); 높은세포생존률 ( 실험예 2); 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내티로시나제 (Cellular tyrosinase) 저해활성멜라닌 (melanin) 생합성저해활성, 미백과관계되어진티로시나제 (tyrosinase) 단백질발현억제등의미백활성 ( 실험예 3); 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아세포의생존율증가, 프로-콜라게나제 (pro-collagenase) 저해활성, 세포내항노화관련단백질발현억제를통한주름개선효과 ( 실험예 4) 등을확인하여미백및피부노화치료및예방용조성물로유용함을확인하였다. 또한, 본발명의시료들은오랫동안생약및식용으로사용되어오던약재로서이들로부터추출된본발명의추출물역시독성및부작용등의문제가없으며, 피부첩포시험에서무자극시료임이입증되었으므로장기간사용시에도안심하고사용할수있다. 본발명의추출물을함유하는피부외용약학조성물은크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제또는카타플라스마제의피부외용제형태의약학조성물로제조하여사용할수있으나, 이에한정하는것은아니다. 본발명의추출물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. 그러나바람직한효과를위해서, 본발명의복합생약추출물은 1일 내지 100 mg / kg으로, 바람직하게는 내지 10 mg / kg으로투여하는것이좋다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수도있다. 상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니다. 본발명의추출물은미백효과를갖는화장품및세안제등에다양하게이용될수있다. 본조성물을첨가할수있는제품으로는, 예를들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩등과같은화장품류와클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액등이있다. 본발명의화장료는수용성비타민, 유용성비타민, 고분자펩티드, 고분자다당, 스핑고지질및해초엑기스 - 9 -

10 로이루어진군에서선택된조성물을포함한다. [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] 수용성비타민으로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을들수있으며, 그들의염 ( 티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염등 ) 이나유도체 ( 아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염등 ) 도본발명에서사용할수있는수용성비타민에포함된다. 수용성비타민은미생물변환법, 미생물의배양물로부터의정제법, 효소법또는화학합성법등의통상의방법에의해수득할수있다. 유용성비타민으로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (d1-알파토코페롤, d-알파토코페롤, d-알파토코페롤 ) 등을들수있으며, 그들의유도체 ( 팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파토코페롤, 니코틴산 dl-알파토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르등 ) 등도본발명에서사용되는유용성비타민에포함된다. 유용성비타민은미생물변환법, 미생물의배양물로부터의정제법, 효소또는화학합성법등의통상의방법에의해취득할수있다. 고분자펩티드로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는콜라겐, 가수분해콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수분해엘라스틴, 케라틴등을들수있다. 고분자펩티드는미생물의배양액으로부터의정제법, 효소법또는화학합성법등의통상의방법에의해정제취득할수있으며, 또는통상돼지나소등의진피, 누에의견섬유등의천연물로부터정제하여사용할수있다. 고분자다당으로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴황산또는그염 ( 나트륨염등 ) 등을들수있다. 예를들어, 콘드로이틴황산또는그염등은통상포유동물이나어류로부터정제하여사용할수있다. 스핑고지질로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질등을들수있다. 스핑고지질은통상포유류, 어류, 패류, 효모또는식물등으로부터통상의방법에의해정제하거나화학합성법에의해취득할수있다. 해초엑기스로는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는갈조엑기스, 홍조엑기스, 녹조엑기스등을들수있으며, 또, 이들의해초엑기스로부터정제된칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨등도본발명에서사용되는해초엑기스에포함된다. 해초엑기스는해초로부터통상의방법에의해정제하여취득할수있다. 본발명의화장료에는상기필수성분과더불어필요에따라통상화장료에배합되는다른성분을배합해도된다. 이외에첨가해도되는배합성분으로서는유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기및무기안료, 유기분체, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 식물추출물, ph 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행촉진제, 냉감제, 제한 ( 制汗 ) 제, 정제수등을들수있다. 유지성분으로서는에스테르계유지, 탄화수소계유지, 실리콘계유지, 불소계유지, 동물유지, 식물유지등을들수있다. 에스테르계유지로서는트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리 ( 카프릴, 카프린산 ) 글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라 2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디 ( 카프릴, 카프린산 ) 프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소

11 스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴등의에스테르계등을들수있다. [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] 탄화수소계유지로서는스쿠알렌, 유동파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린등의탄화수소계유지등을들수있다. 실리콘계유지로서는폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산공중합체, 알킬변성실리콘유, 아미노변성실리콘유등을들수있다. 불소계유지로서는퍼플루오로폴리에테르등을들수있다. 동물또는식물유지로서는아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인 ( 杏仁 ) 유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지 ( 牛脂 ), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상라놀린, 경화피마자유등의동물또는식물유지를들수있다. 보습제로서는수용성저분자보습제, 지용성분자보습제, 수용성고분자, 지용성고분자등을들수있다. 수용성저분자보습제로서는세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B( 중합도 n = 2 이상 ), 폴리프로필렌글리콜 ( 중합도 n = 2 이상 ), 폴리글리세린B( 중합도 n = 2 이상 ), 락트산, 락트산염등을들수있다. 지용성저분자보습제로서는콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르등을들수있다. 수용성고분자로서는카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성키틴, 키토산, 덱스트린등을들수있다. 지용성고분자로서는폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자실리콘등을들수있다. 에몰리엔트제로서는장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르등을들수있다. 계면활성제로서는비이온성계면활성제, 음이온성계면활성제, 양이온성계면활성제, 양성계면활성제등을들수있다. 비이온성계면활성제로서는자기유화형모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE ( 폴리옥시에틸렌 ) 솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP ( 폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌 ) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질등을들수있다. 음이온성계면활성제로서는지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화가수분해콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르등을들수있다. 양이온성계면활성제로서는염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤

12 닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라 놀린유도체제 4 급암모늄염등을들수있다. [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] 양성계면활성제로서는카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린유도체형, 아미드아민형등의양성계면활성제등을들수있다. 유기및무기안료로서는규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민및이들의복합체등의무기안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지등의유기안료및이들의무기안료와유기안료의복합안료등을들수있다. 유기분체로서는스테아르산칼슘등의금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘등의알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘등의아실아미노산다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘등의아미드술폰산다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산등의알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌공중합체, 사불화에틸렌등을들수있다. 자외선흡수제로서는파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노 -2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산및그염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-( 카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시 )-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐 ) 벤조트리아졸등을들수있다. 살균제로서는히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산등을들수있다. 산화방지제로서는부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산등을들수있다. ph 조정제로서는시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨등을들수있다. 알코올로서는세틸알코올등의고급알코올을들수있다. 또한, 이외에첨가해도되는배합성분은이에한정되는것은아니며, 또, 상기어느성분도본발명의목적및효과를손상시키지않는범위내에서배합가능하지만, 총중량에대하여바람직하게는 % 중량, 보다바람직하게는 % 중량으로배합된다. 본발명의화장료는용액, 유화물, 점성형혼합물등의형상을취할수있다. 본발명의화장료조성물에포함되는성분은유효성분으로서상기복합생약추출물이외에화장료조성물에통상적으로이용되는성분들을포함할수있으며, 예를들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료및향료와같은통상적인보조제및담체를포함한다. 본발명의화장료조성물은당업계에서통상적으로제조되는어떠한제형으로도제조될수있으며, 예를들어유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료등을들수있다. 구체적으로, 본발명의화장료조성물은스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩,

13 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션및바디클린저의제형을포함한다. [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] 본발명의제형이페이스트, 크림또는겔인경우에는담체성분으로서동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크또는산화아연등이이용될수있다. 본발명의제형이파우더또는스프레이인경우에는담체성분으로서락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘실리케이트또는폴리아미드파우더가이용될수있고, 특히스프레이인경우에는추가적으로클로로플루오로히드로카본, 프로판 / 부탄또는디메틸에테르와같은추진체를포함할수있다. 본발명의제형이용액또는유탁액의경우에는담체성분으로서용매, 용매화제또는유탁화제가이용되고, 예컨대물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤지방족에스테르, 폴리에틸렌글리콜또는소르비탄의지방산에스테르가있다. 본발명의제형이현탁액인경우에는담체성분으로서물, 에탄올또는프로필렌글리콜과같은액상희석제, 에톡실화이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르및폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와같은현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄메타히드록시드, 벤토나이트, 아가또는트라칸트등이이용될수있다. 본발명의제형이계면-활성제함유클린징인경우에는담체성분으로서지방족알코올설페이트, 지방족알코올에테르설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드에테르설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린유도체또는에톡실화글리세롤지방산에스테르등이이용될수있다. [0112] 발명의효과본발명의추출물은 DPPH 자유라디칼소거활성, ABTS 라디칼양이온소거능저해활성, 크산틴옥시다제 (Xanthine oxidase) 저해활성등의항산화효과 ; 높은세포생존률 ; 티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성, 세포내티로시나제 (Cellular tyrosinase) 저해활성, 멜라닌 (melanin) 생합성저해활성, 미백과관계되어진티로시나제 (tyrosinase) 단백질발현억제등의미백활성 ; 엘라스타제 (Elastase) 저해활성, 섬유아세포의생존율증가, 프로-콜라게나제 (pro-collagenase) 저해활성, 세포내항노화관련단백질발현억제실험등을통한주름개선효과등을확인하여미백및피부노화치료및예방용조성물로유용하게이용될수있다. [0113] 도면의간단한설명 도 1 는본발명의시료의전자공여능실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3 중치평균 (means) ± S. D. 로나타냄 ); 도 2는본발명의시료의 ABTS 라디칼소거활성실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 3는본발명의시료의크산틴-옥시다제에대한수퍼옥시드음이온라디칼소거활성실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 4는본발명의시료의멜라노마 (B16F10) 세포에대한세포생존율에미치는영향을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 5는본발명의시료의티로시나제에대한억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 6는본발명의시료의멜라노마 (B16F10) 세포에대한티로시나제합성억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 7는본발명의시료의멜라노마 (B16F10) 세포에대한멜라닌합성억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 8는본발명의시료 (VR-EA) 의

14 멜라노마 (B16F10) 세포에서 MITF 단백질발현억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 세포는 5, 10, 25, 50 μg/ml 시료농도를함유한배지와같이배양하고, 개개시료에서 MITF 단백질수준은 β-액틴 (actin) 양으로정상화하였고동일한열에서상이한윗첨자를갖는평균수치는유의적으로상이함 p 0.05); 도 9는본발명의시료 (VR-EA) 의멜라노마 (B16F10) 세포에서티로시나제단백질발현억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 세포는 5, 10, 25, 50 μg/ml 시료농도를함유한배지와같이배양하고, 개개시료에서티로시나제단백질수준은 β-액틴 (actin) 양으로정상화하였고동일한열에서상이한윗첨자를갖는평균수치는유의적으로상이함 p 0.05); 도 10는본발명의시료의엘라스타제에대한억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 11는본발명의시료의섬유아세포 (CCD-986sk) 에대한세포생존율에미치는영향을나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 12는본발명의시료의콜라게나아제에대한억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이며 ( 여기에서, 결과는 3중치평균 (means) ± S.D. 로나타냄 ); 도 13는본발명의시료 (VR-EA) 의섬유아세포 (CCD-986sk) 에서 MMP-1 단백질발현억제활성을나타낸실험결과를나타낸도이다 ( 여기에서, 세포는 5, 10, 25 μg/ml 시료농도를함유한배지와같이배양하고, 개개시료에서 MMP-1 단백질수준은 β-액틴 (actin) 양으로정상화하였고동일한열에서상이한윗첨자를갖는평균수치는유의적으로상이함 p 0.05). [0114] [0115] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명을하기의실시예및실험예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예및실험예에의해한정되는것은아니다. [0116] 실시예 1: : 만형자추출물및용매분획물의제조 [0117] [0118] 1-1. 조추출물. 본실험에사용한만형자는 ( 주 ) 휴먼허브에서직접구입하였다. 건조한만형자 3.0kg을잘게파쇄한후 70% 에탄올 5L를가하여, 상온에서 24시간동안 3회반복추출하고, 추출상층액을여과한후에감압농축및동결건조하여건조상태의만형자추출물 72.4g (VRE, 수율 2.4%) 을얻었다. [0119] [0120] 1-2. 유기용매분획물상기만형자조추출물 72.4g을물 1L에녹인후, 헥산 2L, 에틸아세테이트 2L, 부탄올 2L로순차적으로분획하였다. 각분획물을농축및동결건조하여최종적으로헥산분획물 6.5g (VR-H), 에틸아세테이트분획물 (VR-EA) 12.1g, 부탄올분획물 (VR-B) 15.6g, 물분획물 10.2g (VR-W) 을수득하였다. 모든건조추출물및분획물들은 -4 에보관하고필요한농도로녹여사용하였다. [0121] 실험예 1. 항산화효과확인 [0122] [0123] 1-1. 전자공여능 (electron donating ability) 측정상기실시예시료의전자공여능을확인하기위하여문헌에기재된 Blois의방법을변형하여하기와같이실험을수행하였다 (Blois MS. (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. 26, )

15 [0124] [0125] 각시료용액 2ml에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 1ml 넣고교반한후 30분간방치한다음 517nm에서흡광도를측정하였다. 전자공여능은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. 전자공여능측정에사용된 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 는자체가매우안정한 free radical로서 517nm에서특징적인광흡수를나타내는보라색화합물이다. 자유라디칼은인체내에서지질또는단백질등과결합하여노화를일으키기쉬운데페놀성화합물의경우자유라디칼을환원시키거나상쇄시키는능력이강해인체 내에서자유라디칼에의한노화를억제하는척도로이용할수있다. DPPH는알코올등의유기용매에매우안정하며항산화기작중단백질라디칼소거제 (proton radical scavenger) 에의하여탈색되기때문에항산화활성을육안으로쉽게관찰할수있는장점이있어다양한천연소재로항산화물질을검색하는데많이이용되고있다. [0126] 본실험결과, 만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물 10, 100, 1000μg/ml 농도에서 DPPH free radical 소거활성을도 1 에서나타내었다. 만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물의 DPPH free radical 소거활성의 RC 50 값을표 1 에나타내었다. 만형자분획물의 RC 50 값은에틸아세테이트 (22.66μg/ml) 부탄 올 (147.93μg/ml) 물 (219.50μg/ml) 헥산 ( μg/ml) 으로만형자에틸아세테이트에서 DPPH free radical 소거율이높게나타났다. 이는에틸아세테이트분획물성분중에 free radical 소거활성이있는유용성분이함 유되어있는것으로생각된다. [0127] 표 1 DPPH free radical 소거활성 Sample DPPH RC 50 (μg/ml) Vitamin C 3.52±047 Hexane fraction (VR-H) ±3.30 EtOAc fraction (VR-EA) 22.66±3.87 BuOH fraction (VR-B) ±1.01 Water fraction (VR-W) ±1.52 [0128] [0129] 1-2. ABTS 라디칼양이온소거능저해활성측정상기실시예시료의 ABTS 라디칼양이온탈색화 (radical cation decolorization) 법에의한항산화효능을시험하기위하여문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (Roterta, R., P. Nicoletta, P. Anna, P. Ananth, Y. Min and R.E. Catherine Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS Radical Cation Decolorization Assay. Radic. Biol. Med. 26, ) [0130] [0131] ABTS 라디칼소거능은추출물들의상대적인항산화효과측정인 hydrogen-donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를측정할수있다. 또한수상 (aqueous phase) 모두에적용이가능하며표준물질사용으로추출물의상대비교가가능하도록 potassium persulfate와의반응에의해생성된 ABTS+ free radical이추출물속의항산화물질에의해제거되어 radical 특유의색인청록색이탈색되는것을이용한다. ABTS + radical cation decolorization의측정은 Pellegrin 등의방법에따라측정하였다. [0132] 7mM ABTS {2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)} + 5mL 와 2.4mM K 2 S 2 O 8 5mL 를혼합하여실 온에서 24시간동안방치하여 ABTS+ 를형성시킨후, ethanol과약 1:6 비율로섞어 734nm에서대조구의흡광도값이 0.7±0.002가되도록조절한 ABTS + solution을사용하였다. 각시료용액 100 μl에희석한 ABTS+ 용액 100 μl를가하여 5분동안방치한후 734 nm에서흡광도를측정하였다. [0133] ABTS radical cation 소거능은 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(abts) 와 potassium persulfate 와의반응으로 ABTS+radical 이생성되면특유의색인청록색을띄게되며 hydrogen danating antioxidant 와 chain breaking antioxidant 모두를측정할수있다

16 [0134] 상기실험결과, 만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물의 ABTS radical cation 소거활성의 RC 50 값을 표 2에나타내었다. 만형자분획물의 RC 50 값은에틸아세테이트 (13.69μg/ml) 부탄올(219.47μg/ml) 물( μg/ml) 헥산( μg/ml) 으로만형자에틸아세테이트에서 ABTS radical cation 소거율이높게나타났다 ( 도 2). 이는에틸아세테이트분획물성분중에 free radical 소거활성이있는유용성분이함유되어있는것으로생각된다. [0135] 표 2 ABTS radical cation 소거활성 Sample ABTS RC 50 (μg/ml) Vitamin C 9.87±1.23 Hexane fraction (VR-H) ±1.91 EtOAc fraction (VR-EA) 13.69±2.47 BuOH fraction (VR-B) ±0.90 Water fraction (VR-W) ±3.47 [0136] [0137] 1-3. 수퍼옥시드음이온라디칼 (superoxide anion radical) 저해활성측정상기실시예시료의수퍼옥시드음이온라디칼 (superoxide anion radical) 저해활성을확인하기위하여문헌에기재된방법을변형하여하기와같이실험을수행하였다 (Stirpe F and Della Corte E. (1969) The regulation of rat liver xanthine oxidase. Conversion in vitro of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) to oxidase (type O). J. Biol. Chem. 244(14), ) [0138] [0139] [0140] 각시료용액 0.1ml와 0.1M potassium phosphate buffer(ph 7.5) 0.6ml에 xanthine(2mm) 을녹인기질액 0.2ml를첨가하고 xanthine oxidase(0.2u/ml) 0.1ml를가하여 37 에서 15분간반응시킨후 1N HCl 1ml를가하여반응을종료시킨다음에, 반응액중에생성된 uric acid의양을 292nm에서흡광도를측정하였다. Xanthine oxidase 저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. 수퍼옥시드음이온라디칼소거능측정은크산틴옥시다제 (xanthine oxidase) 가크산틴 (xanthine) 을기질로하여우릭산 (uric acid) 를생성하는과정에서생성되는수퍼옥시드음이온라디칼 (superoxide anion radical) 을추출물과반응시켜소거능을확인하는방법이다. 본실험결과, 만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물 10, 100, 1000μg/ml농도에서수퍼옥시드음이온라디칼소거능을측정하였다 ( 도 3). 만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물의수퍼옥시드음이온라디칼소거활성의 IC 50 값을표 3에나타내었다. 만형자분획물의 IC 50 값은에틸아세테이트 (197.20μg/ml) 부탄올 (346.70μg/ml) 헥산(756.30μg/ml) 물( μg/ml) 으로만형자에틸아세테이트에서수퍼옥시드음이온라디칼소거율이높게나타났다. 만형자분획물의항산화능측정결과, 에틸아세테이트분획물이대조물질인 vit. c 와비슷한활성을지니는것을확인하였으며, 이와같은결과로만형자에틸아세테이트분획물이가장우수한항산화능을가지는것을확인할수있었다. [0141] 표 3 수퍼옥시드음이온라디칼소거능 Sample Vitamin C 7.30±0.92 Hexane fraction (VR-H) ±1.30 EtOAc fraction (VR-EA) ±3.87 BuOH fraction (VR-B) ±5.90 Water fraction (VR-W) ±3.41 Superoxide anion radical IC 50 (μg/ml) [0142] 실험예 2. MTT assay 에의한세포생존능력측정

17 [0143] 상기실시예시료의세포생존능을확인하기위하여세포생존률측정은 Carmichael 등의방법에따라측정하였다 (Carmichael, J., W. G. DeGraff, A. F. Gazdar, J. D. Minna, and J. B. Mitchell Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosen- sitivity testing. Cancer Res. 47, ) [0144] [0145] 2-1. 세포배양 B16F10 melanoma 세포는 Michikawa [Michikawa, M., K.T. Lim, J. G. McLarnon and S. U. Kim Oxygen radical-induced neurotoxicity in spinal cord neuron cultures. J. Neurosci Res. 37, 등의방법에따라 10% fetal bovine serum(fbs) 과 1% penicillin/ streptomycin (100U/ml) 을첨가한 dulbeco's modified eagle s medium(dmem) 배지를사용하였으며, 37, 5% CO 2 incubator에적응시켜계대배양하였다. [0146] [0147] 2.2. 적정접종세포수결정 세포생존율을확인하기위하여 96well plate 에 cells/well 이되게 0.18ml 분주한후세포밀도를 1/2 로 희석하면서접종한후 37, 5% CO 2 incubator 에서 4 일간배양하였다. 여기에 5mg/ml 의농도로제조한 MTT (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide) 용액 0.02ml 를첨가하여 4 시간배양한후배양 액을제거하고, 각 well 당 DMSO 용액 0.15ml 를가하여 30 분간교반한뒤 ELISA reader 로 540nm 에서흡광도를측 정하였다. [0148] [0149] 2-3. 실험과정 각세포주 [melanoma(b16f10), fibroblast(ccd-986sk) cell] 을 96 well plate 에 cells/well 이되게 0.18ml 분주하고, 시료를농도별로조제하여 0.02ml 첨가한후 37, 5% CO 2 incubator 에서 24 시간 배양하였다. 대조군은시료와동량의증류수를첨가하여동일한조건으로배양하였다. 여기에 5mg/ml 농도로제조한 MTT 용액 0.02ml를첨가하여 4시간배양한후배양액을제거하고각 well당 DMSO 0.15ml를가하여실온에서 10분간반응시킨뒤 ELISA reader로 540nm에서흡광도를측정하였다. 세포생존율측정은시료용액의첨가군와무첨가군의흡광도감소율로나타내었다. 세포독성측정은하기수학식 1과같이시료용액의첨가군와무첨가군의흡광도감소율로나타내었다. 수학식 1 [0150] [0151] [0152] 세포생존율을확인하기위한 MTT 검색법은 96 well plate를사용하였으며, 검사결과를 ELISA reader(multiwell microplate reader) 를이용하여많은시료를간단하게판독할수있어세포독성및세포증식검색법으로서널리사용되고있는방법중의한방법이다. 암세포의경우대사과정에서미토콘드리아의탈수소효소작용에의해노란색수용성 MTT tetrazolium을자주색을띠는비수용성의 MTT formazan으로환원시킨다. MTT formazan의흡광도는 550nm 근처파장에서최대가되며, 이는대사적으로왕성한세포의농도를반영하는것이다. 본실험결과, 만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물에의한 melanoma 세포의생존율을확인한결과도 4와같이대조군에비해 5, 10, 25, 50μg/ml 농도에서모두 80% 이상의생존율이나타났다. 이는만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물모두세포독성이없는것으로사료된다

18 [0153] 실험예 3. 미백활성실험 [0154] [0155] [0156] 3-1. 티로시나제저해활성실시예에서얻은시료들의티로시나제 (Tyrosinase) 저해활성을시험하기위하여문헌에개시된 Yagi 등의방법을응용하여하기와같이실험하였다 [Yagi A, Kanbara T and Morinobu N. (1986) The effect of tyrosinase inhibition for aloe. Planta Media. 3981, ] 반응구는 0.175M sodium phosphate buffer (ph 6.8) 0.5ml에 10mM L-DOPA를녹인기질액 0.2ml 및시료용액 0.1ml의혼합액에 mushroom tyrosinase (110U/ml) 0.2ml을첨가하여 37 에서 2분간반응시켜반응액중에생성된 DOPA chrome을 475nm에서측정하였다. Tyrosinase 저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. [0157] [0158] 피부의색조를결정하는주요한인자인 melanin은표피기저층의 melanocyte라고불리는색소세포내의 melanosome에서생합성된다. 멜라닌을합성하는데있어서의출발물질은아미노산의일종인 tyrosine이다. Tyrosine은멜라닌세포내에서의 tyrosinase에의해 L-3,4-dihydroxyl phenylalanine(dopa), DOPA quinone으로산화된다. 그후 DOPA quinone이 DOPA chrome, 5,6-dihydroxyindole, indole-5,6-quinone이되고, 이어서 indole-5,6-quinone으로의중합에의해멜라닌 (melanin) 을생성하는것으로알려져있다. 또한 tyrosinase는피부멜라닌생성에있어서매우중요한역할을하고있으며, melanosome 내에서 tyrosine을산화시켜 DOPA를만드는 tyrosine hydoxylase로, DOPA를산화시켜 DOPA quinone을만드는 DOPA 옥시다제 (oxidase) 로서작용하여멜라닌중합체를합성하는데중요한효소로작용하였다. 이렇게피부내에서멜라닌중합체생합성을효과적으로저해할수있는티로시나제 (tyrosinase) 저해활성을측정하기위하여 mushroom유래의 tyrosinase 저해활성측정결과는도 5에나타내었다. 만형자분획물 10, 100, 1000μg/ml의농도에서에틸아세테이트분획물이 40% 의저해율을나타내어가장높은저해능을가지는것을확인할수있었다. 또한만형자분획물의티로시나제저해활성 IC 50 값을표 5에나타난 결과, 에틸아세테이트 ( μg/ml) 부탄올 ( μg/ml) 물 ( μg/ml) 헥산 ( μg/ml) 로만형자에틸아세테이트분획물의티로시나제저해활성이가장뛰어난것을확인하였다. [0159] 표 5 티로시나제저해활성 Sample Tyrosinase IC 50 (μg/ml) Vitamin C 15.64±1.02 Hexane fraction (VR-H) ±1.21 EtOAc fraction (VR-EA) ±1.05 BuOH fraction (VR-B) ±5.90 Water fraction (VR-W) ±4.13 [0160] [0161] 3-2. 세포내티로시나제저해활성실시예에서얻은시료들의세포내티로시나제 (Cellular tyrosinase) 저해활성을시험하기위하여문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험하였다 [Akiu S, Suzuki Y, Asahara T, Fujinuma Y and Fukuda M. (1991) Inhibitory effect of arbutin on melanogenesis-biochemical study using cultured B16 melanoma cells. Nippon Hifuka Gakkai Zasshi. 101(6), ]. [0162] Melanoma(B16F10 ATCC) 세포를각 culture dish에가득배양한후, 배지를제거하고 PBS로세척하였다. Lysis buffer(67mm sodium phosphate buffer, 1% triton X-100, 0.1mM phenylmethyl sulfonyfluoride) 를 100μl 첨가한후얼음에방치하여세포를파괴시키고, 세포를수집하여 ultra sonication 하였다. 10분동안방치한후 13,200rpm에서 20분간원심분리하여얻어진상층액을효소용액으로사용하였다. 이를 67mM phosphate buffer(ph6.8) 에녹인 8.0mM의 L-DOPA 120μl와시료용액 40μl를 96-well plate에넣은후, 67mM phosphate

19 buffer (ph 6.8) 에녹인효소용액 40μl 을첨가하여 37 에서 30 분간배양한후, 생성된 DOPA chrome 의양을 490nm 에서측정하였다. [0163] 본실험결과, 만형자분획물의 melanoma 세포에서의 tyrosinase 저해활성을측정한결과, 도 6 과같이나타 내었다. Tyrosinase는 Cu 2+ 와결합한효소로동식물, 미생물및사람등에널리분포되어있는 polyphenol oxidase로멜라닌합성과정에서속도를제한하는등멜라닌합성의주요한조절적단계를나타내는효소이다. 만형자분획물의경우 50μg/ml의농도에서에틸아세테이트분획물이 38% 의저해효과를나타내었으며, 대조물질인 vit. c 보다도더우수한 tyrosinase 저해활성을가짐을확인할수있었다. [0164] [0165] 3-3. 멜라닌 (melanin) 생합성저해율실시예에서얻은시료들의피부멜라노마세포로부터의멜라닌 (melanin) 생합성저해활성을시험하기위하여 Hosoi 등의문헌에개시된 Melanoma cell(b16f10) 에서의멜라닌 (melanin) 생합성저해율측정방법을응용하여하기와같이실험하였다 [Hosoi J. Abe E, Suda T and Kuroki T. (1985) Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and retinoic acid. Cancer Res. 45(4), ]. [0166] DMEM 배지로배양된멜라노마세포 (Melanoma cell, B16F10) 를 100mm culture dish 에 cell/dish 가되게 분주하고, 24 시간배양후시료를농도별로조제하여 2 ml 첨가하고, 48 시간후에인산완충액 (ph 7.4) 으로세 척하였다. 그다음 0.25M trypsin-edta 용액으로세포를탈착한후수확한세포를 세포당 1ml의 5% TCA 로처리하고, 2,500rpm으로 2회원심분리한후분리된 melanin을인산완충액으로세척한뒤 ether:ethanol (1:3) 1ml를가하여 2회원심분리한후 ether 1ml로세척건조시켰다. Melanin에 1N NaOH를 1ml 가하여 80 에서 1시간반응시킨후분광광도계 405 nm에서흡광도를측정하였다. Melanin 생합성저해는시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. [0167] [0168] 사람의피부색을결정하는가장중요한요인인멜라닌 (melanin) 은피부의광노화나일광각화증을억제할뿐만아니라, 기미, 주근깨, 검버섯등의부분적인 hyperpigmentation을일으키는역할을하고있다. 멜라닌은표피기저층에존재하는 melanocyte 내의소기관인 melanosome에서생합성되며, melanocyte의수지상돌기를통하여주위의 keratinocyte로전달되고, 피부의각질층으로이행하였다. Melanosome 내에서의 melanin 생성과정은 tyrosine이 tyrosinase의작용에의해 DOPA, DOPA quinone으로산화되고, 이들은효소의작용및자동산화반응에의해 DOPA chrome, indole carboxylic acid, indole quinone류등으로대사되어최종적으로 melanin을합성하였다. 상기의색소침착을치유하기위해멜라닌생성을억제하는 hydroquinone, resorcinol 등의페놀유도체나, l-ascorbic acid와그유도체및 kojic acid, arbutin, lactic acid, glucosamine, tunicamycin 등이개발되었으나, 피부저자극성이나안정성에문제가있어극히제한된양만사용되고있다. 본실험결과, 만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물의 melanoma 세포에서의멜라닌생합성을측정한결과, 도 7과같이나타내었다. 대조군에비해만형자에틸아세테이트분획물의경우 50 μg/ml의농도에서 34% 의멜라닌생합성을나타내어헥산, 부탄올, 물분획물중에가장우수한효과를나타내었다. [0169] [0170] [0171] 3-4. 세포내미백관련단백질발현양상측정실시예에서얻은시료들의색소침착효과를알아보기위하여미백과관계되어진티로시나제 (tyrosinase) 단백질의양을문헌에개시된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (Yamamura T, Onishi J and Nishiyama T. (2002) Antimelanogenic activity of hydrocoumarins in cultured normal human melanocytes by stimulating intracellular glutathione synthesis. Arch. Dermatol. Res. 294(8), ) 마우스흑색세포종 (B16F10) 을이용하여 100mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간동안배양하여 cell을안정화시켰다. 배지를제거한후추출물을농도별로처리한배지로 48시간배양한후다시배지를제거하고 PBS로 2번세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를가하여용해시킨뒤, 4 12,000rpm 에서 20분간원심분리하였다. 원심분리하여얻은상층액은 bradford assay로정량하여 30μl의단백질을 10% 의 SDS-PAGE gel에서전기영동하여분리하였다. 분리된단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)

20 를이용하여 PVDF membrane에옮긴다음실온에서 1시간 blocking buffer(5% skim milk in TBST) 에서 incubation 시켰다. 1차항체를희석하여 4 에서 over night한다음, 다시 10분간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의각각의 2차항체를 1:1,000로희석하여실온에서 2시간동안배양하였다. 3회 washing한뒤 LAS 4,000 기기를이용하여밴드확인및정량하였다. [0172] 본실험결과, 만형자에틸아세테이트분획물이 melanin 합성관련 MITF, tyrosinase, 단백질발현에미치는영향을도 8 및도 9에나타내었다. 만형자에틸아세테이트는 MITF, tyrosinase 단백질발현을농도의존적 (5, 10, 25, 50 μg/ml) 으로억제하였다. 또한미백제로사용되고있는 arbutin의양성대조군 (data not show) 과 50 μg/ml농도에서비교한결과에틸아세테이트 MITF, tyrosinase의단백질발현을효과적으로억제하는것을확인하였다. 이상의결과, 만형자에틸아세테이트분획물은 tyrosinase 활성과 melanin 합성억제효과를갖고있으며, 이러한효과는 MITF 발현억제를통한 tyrosinase의발현감소를확인하였다. [0173] 실험예 4. 주름개선효능실험 [0174] [0175] [0176] 4-1. 엘라스타제 (Elastase) 저해활성측정실시예에서얻은시료들의엘라스타제 (Elastase) 저해활성을시험하기위하여카넬 (Cannell) 등을응용하여하기와같이실험하였다 [Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM and Walker JM. (1988) Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta Media. 54(1), 10-14]. 기질로서 n-succinyl-(l-ala) 3 -p-nitroanilide를사용하여 37 에서 20분간기질로부터생성되는 p- nitroanilide의생성량을 445nm에서측정하였다. 즉, 각시험용액을일정농도가되도록조제하여 0.5ml씩시험관에취하고, 50mM tris-hcl buffer (ph 8.6) 에녹인 porcine pancreas elastase (2.5U/ml) 용액 0.5ml을가한후기질로 50mM tris-hcl buffer (ph 8.6) 에녹인 n-succinyl-(l-ala) 3 -p-nitroanilide (0.5mg/ml) 을첨가하여 20분간반응시켜측정하였다. 엘라스타제저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. [0177] [0178] 인체의중성구과립구내에존재하는엘라스타제 (elastase) 는진피내피부탄력을유지하는데중요한기질단백질인엘라스틴을분해하는효소이며, 다른중요한기질단백질인콜라겐을분해할수있는비특이적가수분해효소이다. 따라서엘라스타제저해제는피부주름을개선하는작용을나타내며, ursolic acid 등이엘라스타제저해제로이용되고있다. 또한체내의 elastin을분해하는백혈구과립효소중의하나로이상조직에서는그효소의활성이극히높아조직파괴에직접적인원인이되어피부의주름및탄력성소실을유발하였다. 이러한주름생성과관련된엘라스타제저해활성을만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물 10, 100, 1000μ g/ml농도에서측정하였다. 본실험결과, 도 10에서나타난바와같이, 만형자분획물의 IC 50 값은표 6에나타낸것과같이에틸아세테이트 ( μg/ml) 헥산 ( μg/ml) 물 ( μg/ml) 부탄올 ( μg/ml) 로만형자에틸아세테이트 가엘라스타제저해활성이가장뛰어난것을확인하였다. [0179] 표 6 엘라스타제저해활성 Sample Elastase IC 50 (μg/ml) Vitamin C ±1.60 Hexane fraction (VR-H) ±1.11 EtOAc fraction (VR-EA) ±2.01 BuOH fraction (VR-B) ±3.62 Water fraction (VR-W) ±1.81 [0180] 4-2. 프로 - 콜라겐생합성측정

21 [0181] [0182] [0183] 실시예에서얻은시료들의프로-콜라겐 (pro-collagen) 생합성에미치는영향을시험하기위하여문헌에기재된방법을응용하여하기와같이실험하였다 [Kim JE. (2003) Effect of epigallocagechin-3-gallate on heatmodulated type Ⅰprocollagen, MMP-1, and TIMP-1 expression in cultured human dermal fibroblasts. Korea University. Seoul, Korea]. 세포배양액내콜라겐생합성정도는 procollagen type-Ⅰc peptide(pip) EIA kit(takara) 을사용하여 propeptide의양을측정하였다. CCD-986sk세포 (ATCC) 에시료를농도별로처리했을때 pro-collagen type Ⅰ의합성양을측정하기위해 Procollagen Type-Ⅰ C-Peptide (PIP) EIA kit를 TAKARA Bio Inc. (Shiga, Japan) 에서구입하여이용하였다. 96-well plate에각 well당 cells/well세포가되도록심어준후 24시간을안정화하였다. 이렇게실험한세포의배양액을모아서실험에사용하였다. 세포배양액내콜라겐생합성정도는 procollagen type-Ⅰc peptide(pip) EIA kit(takara) 을사용하여 propeptide의양을측정하며, MMP-1의측정은 amersham matrix metallproteinase-1, human, biotrak ELISA system(ge Healthcare) 을사용하여측정하였다. [0184] 본실험결과, 선별된만형자헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물에의한섬유아세포의생존율을 ( 도 11-Fig. 6) 과같이확인하였다. 만형자각각의분획물을 5, 10, 15, 20, 25, 50μg/ml의농도로 fibroblast 세포의생존율을확인한결과, 대조군에비해 25μg/ml 농도에서헥산, 물분획물의경우 80% 의세포생존율을나타내었지만, 헥산분획물의경우 50μg/ml의농도에서도 60% 에가까운독성을나타내어높은세포독성을나타내었지만에틸아세테이트, 부탄올, 물분획물의경우 30% 의낮은세포독성을나타내는것을확인하였다. [0185] [0186] 4-3. 콜라게나제저해활성측정실시예에서얻은시료들의콜라게나제 (collagenase) 저해활성을시험하기위하여문헌에기재된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (WE and Heindrich HG. (1963) Zur quantitativen bestimmung der collagenase. Hoppe-Seyler's. Physiol. Chem. 333: ) [0187] 반응구는 0.1M tris-hcl buffer (ph 7.5) 에 4mM CaCl 2 를첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu- Gly-Pro-D-Arg (0.3mg/mL) 를녹인기질액 0.25mL 및시료용액 0.1mL의혼합액에콜라게나제 (collagenase; 0.2mg/mL) 0.15mL를첨가하여실온에서 20분간방치한후 6% citric acid 0.5mL을넣어반응을정지시킨후, ethyl acetate 1.5mL을첨가하여 320nm에서흡광도를측정하였다. 콜라게나제저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. 수학식 2 [0188] [0189] 세포외기질 (extracellular matrix) 의주요구성성분인 collagen은피부의섬유아세포에서생성되는주요기질단백질이다. 또한생체단백질총중량의약 30% 를차지하는중요한단백질로서견고한 3중나선구조를가지고있다. Collagen은피부, 건 (tendon), 뼈및치아의유기물질의대부분을형성하는데, 특히뼈와피부의진피에그포함량이높다. Collagen의주된기능으로는피부의기계적견고성, 결합조직의저항력과조직의결합력, 세포접착의지탱, 세포분할과분화의유도등이알려져있다. 이러한 collagen은연령및자외선조사에의한광노화에의해감소하였으며, 이는피부의주름형성과밀접한연관이있다고알려져있다. 또한 collagen은트립신등의단백질분해효소의작용을받지않으나, 콜라게나제에의해분해된다는보고가있어, 만형자분획물 10, 100, 1000μg/ml농도에서콜라게나제저해활성을측정하였다

22 [0190] 만형자에틸아세테이트분획물이가장우수한저해능을나타내었다 ( 도 12). 만형자분획물의 IC 50 값은표 7 에 나타낸것과같이만형자에틸아세테이트 (283.43μg/ml) 만형자물 ( μg/ml) 만형자부탄올 (346.43μ g/ml) 만형자헥산 (412.42μg/ml) 로만형자부탄올에서콜라게나제저해활성이가장뛰어난것을확인하였다. [0191] 표 7 콜라게나제저해활성 Sample Collagenase IC 50 (μg/ml) Vitamin C (Vit. C) ±5.48 Hexane fraction (VR-H) ±1.23 EtOAc fraction (VR-EA) ±0.13 BuOH fraction (VR-B) ±3.06 Water fraction (VR-W) ±2.23 [0192] [0193] [0194] [0195] [0196] 4-4. 세포내항노화관련단백질발현양상측정실시예에서얻은시료들의세포내항노화관련단백질발현양상에미치는영향을시험하기위하여문헌에기재된방법을응용하여하기와같이실험하였다 (So SH, Lee SK, Hwang EI, Koo BS, Han GH, Lee MJ, Chung JH and Kim NM. (2008) Mechanisma of korean red ginseng herb extracts(ktng0345) for anti-wrinkle antivity. J. Ginseng Res. 32(1), 39-47) MMP-1의측정은 amersham matrix metallproteinase-1, human, biotrak ELISA system(ge Healthcare) 을사용하여측정하였다. 실시예추출물의항노화효과를알아보기위하여 cell line(ccd-986sk) 을 100mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간동안배양하여 cell을안정화시켰다. 배지를제거한후추출물을농도별로처리한배지로 48시간배양한후다시배지를제거하고 PBS로 2번세척해주었다. RIPA buffer 10ml에 complete mini 1 tab를가함 100μl로용해해서 4 12,000rpm에서 20분간원심분리하였다. 원심분리하여얻은상층액은 bradford assay로정량하여 30μl의단백질을 10% 의 SDS-PAGE gel을이용하여분리하였다. 분리된단백질은 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA) 를이용하여 PVDF membrane에옮긴다음실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST) 에서 incubation 시켰다. 1차항체를희석하여 4 에서 over night한다음, 다시 10분간격으로 TBST로 3회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의각각의 2차항체를 1:1,000로희석하여실온에서 2시간동안배양하였다. 3회 washing한뒤 LAS 4,000 기기를이용하여밴드확인및정량하였다. 노화와관련된인자인 MAPK에가장많은영향을받은인자는 c-fos이며이는 p38의영향을받는다. 이러한요인들이활성화되면 MMPs의발현을강력히조절한다. 본연구에서는 MMP family 중 MMP-1의단백질발현을측정하였다. [0197] 본실험결과, 만형자에틸아세테이트분획물처리군에서 MMP-1 의 protein 발현모두 5, 10, 25μg/ml 의농도 의존적으로억제되었다 ( 도 13). [0198] 이하, 본발명의제형예로서크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의제형을예시하고있으 나, 본발명의화장품조성물을포함하는제형은이에한정되는것은아니다. [0199] 제형예 1. 크림조성물

23 [0200] 유상과수상을각각 75 로가열혼합한후실온으로냉각한다. [0201] [0202] [0203] 제형예 2. 맛사지크림조성물 유상과수상을각각 75 로가열용해혼합한후실온으로냉각한다. [0204] [0205] 제형예 3. 로션조성물

24 [0206] 유상과수상을각각 75 로가열혼합유화한후실온으로냉각한다. [0207] [0208] [0209] 제형예 4. 스킨로션조성물 수상과에탄올상을각각제조혼합한후여과한다. [0210] [0211] 제형예 5. 에센스조성물

25 [0212] 수상과에탄올상을각각제조혼합한후여과한다. [0213] [0214] [0215] 제형예 6. 팩조성물 수상과에탄올상을각각분산용해하여혼합시킨후실온으로냉각한다. [0216] [0217] [0218] 제형예 7. 클렌징폼조성물 수상과오일상을각각분산용해하여혼합검화한후실온으로냉각한다. [0219]

26 도면 도면 1 도면

27 도면 3 도면

28 도면 5 도면

29 도면 7 도면

30 도면 9 도면

31 도면 11 도면

32 도면