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1 보안과제( ), 일반과제( o ) C 프론티어연구개발사업 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 Establishment of pluripotent human embryonic stem cells and operation of Stem Cell Bank 서울대학교 연구성과실용화진흥원

2 제출문 과학기술부장관귀하 본보고서를과학기술부 21 세기프론티어연구개발사업중과학기술부가지원하는세포응용연구사업 단 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 과제 ( 세부과제 인간전분화능줄기세포확 립및세포주은행운영 ) 의 1 단계보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 서울대학교 주관연구책임자 : 문신용 연 구 원 : 오선경 : 최영민 : 김석현 : 구승엽 : 김재상 : 성노현 : 김희선 : 설혜원외 35 명 위탁연구기관명 위탁연구책임자 : 주 ) 메디포스트 : 양윤선, 진창현 - 1 -

3 보고서초록 과제관리번호 연구사업명 연구과제명 SC11011 중사업명 세부사업명 해당단계연구기간 21 세기프론티어연구개발사업 세포응용연구사업 단계구분 (1 단계 ) / (3 단계 ) 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 연구책임자문신용 연구기관명및소속부서명 해당단계참여연구원수 총 : 43 명 내부 : 30 명 외부 : 13 명 해당단계연구비 서울대학교의학연구원참여기업명주 ) 메디포스트 국제공동연구상대국명 : 상대국연구기관명 : 위탁연구연구기관명 : 주 ) 메디포스트연구책임자 : 양윤선 요약 ( 연구결과를중심으로개조식 500 자이내 ) 정부 : 기업 : 계 : 보고서면수 2,413,000 천원 60,000 천원 2,473,000 천원 222 쪽 인간전분화능줄기세포주 11종확립하였고, 줄기세포주은행을통하여 24개연구팀에게 hes 22,146 colony, 3,810 EBs를분양및 25개기관 29명의연구자 Training을실시하였다. 인간배아줄기세포주로부터신경과상피세포쪽으로의분화능을비교하고성숙한신경세포로의분화를유도하였다. 심근세포로의분화는인간배아줄기세포주로배아체를형성하고 30일동안 suspension culture 한후배양접시로옮긴후에 20일이상배양하여beating cluster의형성을확인하였다. 유전적변형방법들이효율적으로적용되기위한수단으로단백질도입기술을적용하여 TAT PTD를매개로하는단백질도입이인간배아줄기세포에서효율적으로작용함을알수있었다. 따라서분화를유도하거나세포의특성을변화시키는단백질을인간배아줄기세포에전달해주는경우특정세포로의분화를통한세포치료또는분화과정에관여하는유전자의기능연구나새로운유전자의동정등에응용될수있다. 이러한연구결과를국내외논문20여편으로발표하였으며특허 1건, 학술대회 42건과중국, 영국등의국제협력과여러국가에서의강의실적이있으며특히복제된인간배아줄기세포주를확립하여국내외에서도인정받는연구결과를창출하였다. 색인어 ( 각 5 개이상 ) 한글인간배아줄기세포주확립, 인간배아줄기세포주은행, 인간배아줄기세포주분화 Establishment of human embryonic stem cell (hesc) lines, Human 영어 embryonic stem cell bank, Differentiation of hes cell - 2 -

4 요약문 Ⅰ. 제목 인간전분화능줄기세포확립및세포주은행운영 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 본연구는세포응용연구사업단의연구목표를달성하기위해기반이되는인간전분화능줄기세포주를확립하여줄기세포주은행의운영과세포주의분배를목표로하여, 인간전분화능세포주를분리하고확립하며, 각세포주의특성을규명하고, 이를토대로인체에이식가능한인간전분화능줄기세포주의확립을위한새로운배양체계를구축하고자하였다. 확립된인간전분화능세포주는세포주은행의설립및운영을통하여세포응용연구사업단연구진에분배및보급되도록하고인간전분화능세포주분배시세포주에대한교육및홍보를통하여연구진의연구성과를증대시키고자하였다. 생명공학회사들은배아줄기세포를이용하여세 포치료기술을포함한최신기술개발에연구역량을집중하고있다. 그러나인간 전분화능줄기세포주는현재전세계적으로도절대수가부족한상황이며이를생산할수있는기술인력또한많지않은실정으로이에많은투자가이루어진다면이분야에있어서앞서나갈수있다. 인간전분화능줄기세포주를활용한인공조직및장기개발, 분화관련유전자및단백체의발굴과기능해석을통한유용물질개발및신약개발등에활용된다면이로부터파생되는부가가치는현재로서예측하기어려울정도로막대할것으로보여진다. 인간전분화능줄기세포주는난치성질환의치료에이용되는치료제로서활용될수있을것이며, 따라서현재치료가매우어렵거나불가능한 5,000여종의질환에대한치료제로서의인간전분화능줄기세포를공익적차원에서세포주은행화하고이를통한다양한연구개발이이루어질수있다면많은고통을받는환자에게질병의치료뿐만아니라삶의질향상에도그게기여할수있을것이다. 더나아가인간전분화능줄기세포주연구는궁극적으로는국민건강복지향상에크게기여할수있다고사료된다

5 Ⅲ. 연구개발의내용 인간전분화능줄기세포의확립을위하여 1 단계 3 차년동안 11 주의인간전분화능 줄기세포주를확립하고확립된줄기세포주의특성규명및정도관리를시행하고인체 이식가능한인간전분화능줄기세포주의확립과새로운배양체계를구축한다. 확립된 인간 전분화능줄기세포주는세포주은행의설립및운영을통하여세포응용연구사 업단연구진에분배및보급되도록한다. 인간전분화능세포주분배시세포주에 대한교육및홍보를통하여연구진의연구성과를증대시키고자하였다. Ⅳ. 연구개발결과 인간전분화능줄기세포주 11종확립하였으며이들 Cell line 의특성분석을완료하였거나시행중에있다. 줄기세포주은행을통하여 24 개연구팀에분양하는등활발한은행운영을하였으며, 또한세포주의배양과정에대한교육과정을시행하여분양된세포주의이용에도움이되도록하여세포응용연구사업단과제참여연구팀이훌륭한성과를낼수있도록하였다. Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 인간전분화능줄기세포주의확립은향후엄청난부가가치가예상되는세포치료술개발을위한가장근간이되는기반기술의단계로세포주의보유자체가원천기술및산업재산으로활용될수있다고예상되어진다. 따라서연구진들의 Training program 을통하여인간배아줄기세포를배양할수있게하여확립된인간배아줄기세포주를분배받은연구진들이다양한조직으로의초기분화를연구할수있다. 이를바탕으로한지속적인연구개발로배아줄기세포를여러질병의세포치료에활용가능할것으로기대한다

6 S U M M A R Y 1. Title of Project Cell Bank Establishment of pluripotent human embryonic stem cells and operation of Stem 2. Objectives and Demands of Project This project aims at the establishment of pluripotent human embryonic stem cell lines and the operation of the Stem Cell Bank for distribution of the established cell lines, which is the basis of achieving the project objectives of the 21st Century Frontier Research and Development Program of the Stem Research Center. Specifically, this project attempts to separate and derive pluripotent human embryonic stem cell lines, to characterize each established cell line, and to set up a new culture system that is able to establish the transplantable cell lines. The established cell lines have been distributed to the research teams of the Stem Cell Research Center through the Stem Cell Bank. Numerous biotechnology corporations are focusing their researches on the development of new technologies including cell therapies using embryonic stem cells. However, the number of pluripotent human embryonic cell lines is quite low and the research personnels with expertise are not many worldwide. Therefore, it is highly probable that the Stem Cell Research Center and its research teams can take an initiative in the relevant research fields if significant financial investments and administrative supports are accompanied. Tremendous economic benefits are expected if the human embryonic cells from the present project can be used for the development of artificial tissues and organs, and for the application to material and pharmacologic industries through the search for differentiation-associated genes and proteoms followed by functional analysis and interpretation. Ultimately, pluripotent human embyonic stem cells can be utilized for the cell therapies of 5,000 intractable or incurable diseases. Taken together, a successful proceeding of this project will contribute to the - 5 -

7 therapeutics for the patients, the enhancement of nation' s health and welfare, and the improvement of well-being of people. 3. Contents of Project The establishment of 11 human embyronic stem cell lines has been proceeded. Characterization and quality assurance of the established cell lines have been performed. Pluripotent human embryonic stem cells that are clinically applicable are to be established with development of new culture systems. The established cells have been and will be distributed to the researchers after being deposited at the Stem Cell Bank that has been established and administered by the 21st Century Frontier Research and Development Program of the Stem Cell Research Center. Training, education and publicity activities have been executed when the cell lines are distributed in order to maximize the achievements of the project. 4. Achievements Eleven lines of pluripotent human embryonic stem cells have been and are to be established and characterized. The Stem Cell Bank has been established and administered under the regulation by the 21st Century Frontier Research and Development Program of the Stem Cell Research Center. The established human embryonic stem cells have been deposited into the Stem Cell Bank and actively distributed to the investigators of 24 research teams. The practical training program for handling and manipulation of human embryonic stem cells will be given to the researchers prior to distribution of the cells in order to improve the progress of researches administered by this center. 5. Plans for Application of Project Achievements Pluripotent human embryonic stem cells are to be used as an important and fundamental basis for the development of cell therapy, a high value-added technology. Accordingly, the establishment and maintenance of human embryonic stem cells can be utilized as a source of various applied technology and industrial property. For instance, lots of research teams can perform the diverse investigations on the early - 6 -

8 developments of distributed human embryonic stem cells into various tissues through qualified training program operated by the Stem Cell Research Center. It is more than highly expected that continuous further investigations on the human embryonic stem cells can make an advanced leap into the clinical application of cell therapy

9 C O N T E N T S Chapter 1. Overview of project Chapter 2. Status of technology development: domestic and overseas Chapter 3. Details in contents and results of project Chapter 4. Achievements and contribution to relevant fields Chapter 5. Plans for application of project achievements Chapter 6. Acquired information on science and technology overseas Chapter 7. Reference Chapter 8. Management of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell bank Appendix Ⅰ~ Ⅳ

10 목 차 제 1 장연구개발과제의개요 제 2 장국내외기술개발현황 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌 제 8 장인간제대혈유래줄기세포은행운영 ( 위탁연구 ) 부록 Ⅰ ~ Ⅳ

11 제 1 장연구개발과제의개요 1 절연구개발의목적 인간배아줄기세포분리 세포주확립은 1998년 Thomson 등에의하여최초로보고되었으며, Shamblott 등 (1998) 에의한유산태아생식선유래인간배아생식세포분리및인간배아줄기세포주의체외분화능확인등의연구성과를토대로발전되어져왔다. 2001년 8월미국행정부는전세계연구기관이보유한 72 개의배아줄기세포주를대상으로한연구를허가하였으며, 이를계기로첨단의료기술개발연구가진행되기시작하였다. 세계생명공학회사들은배아줄기세포를이용하여세포치료기술을포함한최신기술개발에연구역량을집중하고있다. 인간전분화능줄기세포주의확립은향후엄청난부가가치가예상되는세포치료술개발을위한가장기본적재료로서활용될예정에있어세포주의보유자체가원천기술및산업재산으로활용될수있다고예상된다. 따라서본연구에서계획하는인간전분화능줄기세포주의확립과이에따른세포주은행의운영은곧바로세포치료및유전자치료기술개발을획기적으로향상시킬수있는기초로활용될수있을뿐만아니라궁극적으로는난치병환자의치료세포로활용될수있다. 따라서보다많은난치병환자의치료또는발생과정의이해및신약개발등의응용을위해서는보다다양한종류의인간전분화능줄기세포주를확립하기위한전세계적노력이치열하게전개될전망이다. 국내의경우도세포응용연구사업단을중심으로하는치료용인간전분화능줄기세포주의확립과세포주은행의운영은범국가적차원에서지원되어야할것으로사료된다

12 2 절연구개발의필요성 배아줄기세포는생체내모든조직으로분화가능한전분화능 (pluripotency) 을가지고있다. 전분화능분석을통한분화제어연구는 2000년 Itskovitz-Eldor 등이인간배아줄기세포를심근및조혈모세포로분화시키는데성공함으로서기틀이확립되었다. 이어 Shundiner 등 (2000) 이배아줄기세포를뇌, 피부, 간, 췌장, 근육, 뼈, 심근및조혈모세포들로분화시킬수있다고보고하였으며, Rumelsky (2001) 는생쥐배아줄기세포를인슐린생산췌도및췌도유사세포, 근육, 혈구, 그리고신경세포로분화시키는데성공하였다. 한편, Assady 등 (2001) 은배아줄기세포를췌장 β-세포로분화시켰으며, Kahat 등 (2001) 은상이한방법을이용하여심근세포, Kaufmann 등은조혈모세포, 그리고 Reubinoff 등 (2001) 은신경세포들로분화유도시킬수있다고발표하였다. Geron 사의경우 Affymetrix 사와함께대량으로배아줄기세포유전자발현분석을수행중이며, 이를통하여줄기세포분화및역분화기전을규명하고있다. 이러한연구동향으로볼때인간전분화능줄기세포주의잠재력은무한하다고판단되며특히향후각종세포치료법의개발에따른치료제로서의줄기세포로서활용될가치가충분하다고인정된다. 따라서다양한연구활동을위한재료로서뿐만아니라세포치료제로서의인간전분화능줄기세포주의개발을필수적이라고판단된다. 현재까지인간전분화능줄기세포주의확립은향후엄청난부가가치가예상되는세포치료술개발을위한가장기본적재료로서활용될예정에있어세포주의보유자체가원천기술및산업재산으로활용될수있다고예상된다. 따라서본연구에서계획하는인간전분화능줄기세포주의확립과이에따른세포주은행의운영은곧바로세포치료및유전자치료기술개발을획기적으로향상시킬수있는기초로활용될수있을뿐만아니라궁극적으로는난치병환자의치료세포로활용될수있다. 따라서보다많은난치병환자의치료또는발생과정의이해및신약개발등의응용을위해서는보다다양한종류의인간전분화능줄기세포주를확립하기위한전세계적노력이치열하게전개될전망이다. 국내의경우도세포응용연구사업단을중심으로하는치료용인간전분화능줄기세포주의확립과세포주은행의운영은범국가적차원에서지원되어야할것으로사료된다. 또한인간전분화능줄기세포내로유전자나단백질을전달하는기술은발생연구나

13 분화유도에있어개발되어야할필수불가결한것으로서, 많은연구자들이기술개발에참여하고있으므로빠른시간에해결될것으로판단되며, 개발된기술을바탕으로인간전분화능줄기세포에서높은효율로분화를유도하는것이가능해질것이다

14 제 2 장국내외기술개발현황 본연구과제와관련된배아줄기세포의국내외기술개발현황은크게배아줄기세포 의확립및배양에관한기술과난치성질환의세포치료를위한특정세포로의분화유 도에관한기술로나누어볼수있다. 1 절배아줄기세포의확립및배양에관한기술현황 1. 국외 1998년 Thomson 등이인간배아줄기세포를최초로확립한이후미국국립보건원은전세계적으로 2001년 8월이전에확립된인간배아줄기세포에대한등록제를실시하여등록된인간배아줄기세포에대한정보를제공하고연구자들이등록된인간배아줄기세포를사용할수있도록분양정보를구축하였으며 ( /registry), 많은국가들이인간배아줄기세포의확립및배양에관한연구를활발히진행하고있다. 특히배아줄기세포의배양에관한연구로는인간배아줄기세포를세포치료제로서임상에적용하기위한인간배아줄기세포의배양방법을개발하는것으로, 현재배아줄기세포의배양체제는생쥐의배아섬유세포를영양세포층 (feeder layer) 로사용하여순수분리한배아줄기세포를함께배양하는것인데, 이는이종간배양체제로서종간동물병원체의감염위험성이매우높을뿐더러인간배아줄기세포의순수분리를어렵게하는문제점을가지고있다. 따라서인간배아줄기세포의배양에있어서이종간배양체제가아닌동종간의배양체제를확립하여야만한다. 최근 feeder layer로생쥐배아섬유세포대신인간유래섬유세포 (human-derived fibroblast) 를사용하여이종간의감염위험성을배제시킨배양방법에관한연구가많이이루어지고있는데, Xu 등 (2001) 은영양세포층이없이다양한세포외기질과영양세포층의배양액만을이용하여인간배아줄기세포를성공적으로배양하였으며, Richards 등 (2002) 은인간유래세포를처음으로영양세포로이용하여인간배아줄기세포의배양에성공하였고, 그이후로인간성체골수세포 (Cheng et al., 2003), 인간포피세포 (Amit et al., 2003; Hovatta et al., 2003) 를이용하여이종세포의사용을배제하고자하는노력이지속되고있다

15 이러한인간유래세포를영양세포로사용하고자하는연구와더불어feeder-free 조건에서인간배아줄기세포의미분화특성을유지시키는인자들의탐색에관한연구도활발히이루어지고있다 (Amit et al., 2004; James et al., 2005; Beattie et al., 2005). 또한이런배양기술을바탕으로 Inzunza 등 (2005) 은기존의인간배아줄기세포와는달리인간영양세포와serum replacement를사용하여종간동물병원체의감염위험성을배제한세포이식에적합한인간배아줄기세포주를확립하였다. 2. 국내 본연구에참여하는서울대, 미즈메디병원및포천중문의대는 2001년전세계에존재하는 72종의배아줄기세포중에서 3개의세포주를미국국립보건원 (NIH) 에정식으로등록하여세포주로서인정을받았으며또한등록된세포주외에도새로운인간배아줄기세포주를 20종이상보유하고있어국내연구진들에게분양할수있는제반준비를갖추고있다 (Park et al., 2003; Oh et al., 2005). 본연구팀은세포응용사업단출범과동시에인간배아줄기세포주은행을운영하고있으며, 그동안세포주은행을유지하면서축적된인간배아줄기세포주확립및배양기술을발표하였다 (Oh et al., 2005; Kim et al., 2005). 특히 2004년 Hwang 등은체세포핵치환술을이용한인간복제배아줄기세포를세계최초로확립하였고책임저자로참여하였다. 또한국내연구자들에의해서인간배아줄기세포의가장효과적인동결보존방법이개발되었고 (Kim et al., 2004; Ha et al., 2005), 배아줄기세포의자가증식 (self-renewal) 에관여하는신호전달체제 (Kim et al., 2005) 및인간유래세포를이용한영양세포층의개발 (Lee et al., 2004), 그리고이종동물유래물질을최대한으로배제한상태에서세포이식에적합한인간배아줄기세포주를확립 (Lee et al., 2005) 하는등인간배아줄기세포의확립과배양에관하여선진외국과비교하여거의거의대등하거나앞서는기술을보유하고있다

16 2 절배아줄기세포의분화유도에관한기술현황 1. 국외 배아줄기세포의분화에관한연구는현재세포치료제로서의활용가능성때문에가장활발히연구되고있는분야이다. 이들연구는주로생쥐배아줄기세포를가지고이루어졌지만, 최근이러한실험에서얻은지식을토대로인간배아줄기세포에서의분화연구가활발히이루어지고있다. 분화실험의방법은분화유도인자의처리, 유전자조작을통한분화, 공배양 (coculture) 을통한분화등이있는데, 분화실험의기본골격은미분화상태의배아줄기세포배양시미분화조건을제거한후에초기배아의분화단계인배양체 (embryoid body) 를형성하고, 적절한분화유도인자들을처리함으로써특정세포로의분화를유도하는것이다. 분화유도인자를처리하여배아줄기세포의분화를유도한연구로는 1996년 Okabe등은생쥐배아줄기세포로부터성장인자인 basic fibroblast growth factor(bfgf) 가첨가된배지에서신경전구세포군을만들었고, bfgf를제거해줌으로써뇌, 신경세포로분화를유도할수있었다. 2001년 Zhang등도 bfgf를이용하여인간배아줄기세포로부터신경전구세포군을얻을수있었으며, 이들로부터최종분화된신경세포를유도했으며, 생쥐의뇌에이식했을때고르게분포하고각각의위치에서특정신경세포로분화하여존재하는것을확인하였으며, Guan등 (2001) 은 bfgf 외에비타민 A 유도체인 retinoic acid를이용하여생쥐의배아줄기세포로부터신경계세포의분화를유도하였다. 또한 Li등 (2001) 은원숭이배아줄기세포를분화시키는과정에서 bone morphogenic protein-4(bmp-4) 를사용함으로써보다효율적으로혈액전구세포들로의분화를유도하였다고발표하였으며, Kramer등 (2000) 은 BMP-2, 4를이용하여연골세포분화를유도하였다. 적절한분화유도인자를이용한배아줄기세포의분화는가장보편적인방법으로배양액에첨가된분화유도인자는배아줄기세포의특정유전자를발현시켜성장, 분화조건을바꾸어특정세포로의분화를촉진시킨다. Soria등 (2000) 은 neomycin 유전자를인슐린 promoter에의해조절되도록재조합하여생쥐의배아줄기세포로이입시킨후분화시켜 neomycin 유도체를넣어줌으로써인슐린을분비하는세포만을선별할수있었으며, 당뇨병을가진쥐에이식후치료효과가있음을보고하였다. 이처럼

17 유전자조작을통한배아줄기세포의분화는가장효과적이고확실한방법이라할 수있으나, 삽입된유전자가 유전체에무작위로삽입되기때문에삽입에의한유 전자변이가문제가될수있을뿐아니라항생제를이용한무리한유도선택을통하여세포의변이를유도할가능성이있다. 공배양을통한분화연구로는 Buttery등 (2001) 이생쥐의골세포와배아줄기세포를함께배양함으로써배아줄기세포로부터골세포로의분화를유도하였고, Kawasaki 등 (2000) 은 PA6 기질세포와함께배아줄기세포를배양함으로써도파민성신경세포로분화를유도하였다. 2. 국내 인간배아줄기세포를이용한분화에관한국내연구는아직초기단계로실적이많 이보고되고있지는않다. 그러나세포응용연구사업단출범이후인간배아줄기세포 를이용한분화연구실적이최근보고되고있는실정이다. 한양대학교이상훈교수연 구팀은인간배아줄기세포로부터도파민을분비하는신경세포로의분화연구를보고하 였다 (Park et al, 2005; Ko et al., 2005)

18 제 3 장연구개발수행내용및결과 1 절연구개발수행내용 1. 이론적접근방법 본과제는세포응용연구사업단의정책지정과제로서사업단운영에필요로하는전분화능줄기세포주를다량으로확립하고이를세포주은행화하여참여연구진에게분배하여동시에난치병환자의치료를위한연구의기틀이되고자한다. 가. 인간배아줄기세포주의확립 본과제에서이용한인간배아는불임시술과정에서냉동보존된배아가존재하고환자자신이더이상냉동보관을원하지않으며불임치료개발또는인간배아줄기세포연구에기증할의사가있는경우동의서를받아배아줄기세포확립에이용하였다. 나. 인간배아줄기세포주은행의운영및교육 새로운인간배아줄기세포주의확립과확립된새로운세포주의특성분석과초기분화연구를수행하여각세포주의분양시각각분화연구및인간배아줄기세포주연구에적합한세포주를분양한다. 또한, 인간배아줄기세포관련교육프로그램을운영하고관련연구진에게 세포를분배한다. 인간배아줄기세포는연구에적합한상태로의계대유지와 Colony 증식이매우까다로우므로지속적인교육을통해효율적인연구가이루어 지도록한다

19 이때사업단에서정한 MTA(Material Transfer Act) 를분배받고자하는연 구팀과작성한다. 다. 인간배아줄기세포주의분화연구 인간배아줄기세포가특정한세포종류로의분화를유도하는조건하에서 원하는종류의세포로분화유도가가능하기때문에세포치료의적절한재료로간 주되고있다. 이와같은특징을바탕으로파키슨병, 당뇨병, 심혈관계질환등의 난치병치료의한방법이될수있을것으로기대되고있다. 이러한배아줄기세포 의특성에따라현재줄기세포를특정한세포종류로분화유도시키기위한다양 한연구가진행되고있다. (1) 심근세포로의분화 인간의심근세포는출생후완전히분화되어, 일단심장조직이손상을입을경우다시재생되지않는다고알려져있다. 일부줄기세포들이손상을입었을경우이동하기도하지만심근의병리학적인환경을변화시키기는미약하다. 손상된심근의기능을회복시키기위한방법의하나로세포치료가시도될수있다. 그러나이러한세포치료에사용될수있는공급원은매우한정적이다. 또한이식후면역거부반응, 세포괴사등을비롯한부작용등으로인해크게효과를나타내지는못하고있다. 그러므로많은양의세포를이식하거나이식후 survival을높이는연구가필요한상태이다. 1998년 Thomson 등에의해처음으로보고된인간배아줄기세포는인체를구성하는모든종류의세포로분화할수있는능력을가진세포로이러한인간배아줄기세포의특성때문에심근세포로분화시킬경우세포치료에적합한공급원이될것으로기대되고있다. (2) 신경세포로의분화 질병이나상해에의한뇌또는신경조직의손상은자연적으로는재생이힘

20 들고이에따라치유가어렵거나불가능한경우가많으며그만큼대부분인체에 치명적이다. 이에따라이전부터연구되어진분화인자나분화조절기작들을이용하 여배아줄기세포로부터뇌세포나신경세포를생산하여이를뇌, 신경질환에의한 손상에적용하고자하는연구들이활발히진행되고있다. 더욱이배아줄기세포는 단계별로신경전구세포나더욱분화된신경세포로분화단계를조절할수있기때 문에경우에따라목적에맞게사용할수있다. (3) 단백질도입기술 인간배아줄기세포에적용된 genetic modification 기술의현황을보면 plasmid transfection의경우 5% 미만의효율로전달되며, retroviral transduction 의경우 gene silencing이일어나전달된유전자의발현이억제되는것으로알려져있으며, 가장높은효율로전달된다고보고된 lentiviral transduction의경우도효율이 7% 에머물러있다. 따라서유전자전달기술이인간배아줄기세포관련연구에큰제한요소로작용하고있다. 본연구에서는유전자의산물인단백질을단백질도입기술을이용하여높은효율로인간배아세포에전달하는기술을개발하여그러한기술적난점을극복하고인간배아발생과분화유도에관련된연구의활성화를도모하고자한다. 본연구를통하여인간배아줄기세포에단백질을도입하는것이가능해지면, 심근세포나신경세포, 췌장베타세포등의발생에관여하는주요전사인자들을이용하여각세포로분화를유도할수있고, 이를통해허혈성심장질환이나신경퇴행성질환, 당뇨병환자의세포치료에적용될수있으므로경제산업적으로큰파급효과가예상된다. (4) 거핵세포로의분화 인간전분화능줄기세포로부터거핵세포와혈소판의분화유도는몇가지중 요한가치를가진다고생각된다. 첫째, 응고기능저하의치료에쓰여질수있다 는점이다. 인간전분화능줄기세포에서만들어진혈소판은현재쓰여지고있는 헌혈된혈청보다훨씬더안전할것으로생각된다. 또한줄기세포의증식력을

21 고려할때조혈모세포에서혈소판을유도하는것보다훨씬더경제적일수있다고 생각된다. 둘째, 동맥경화증치료신약개발에필요한시험관내 system 으로쓰 여질수있다는점이다. 심혈관계질환은우리나라에서도이미중요한사망원인 으로자리잡고있으며혈소판기능조절을통한합병증치료개발이시급한상황 이다. 혈소판의활성과응집에는 thrombin 과 vasopressin 을포함한여러물질에 의하여조절받는다양한신호전달체계가관여되어있으며이들은혈소판특이적 인 integrin 이라는수용기를활성화시킴으로써그효과를나타낸다. 신약개발은 혈소판활성화조절에관한연구를통하여이루어질수있으며동질성을가진혈 소판의안정적공급은중요한전제조건이다. 우리나라의경쟁력중의하나가인 간전분화능줄기세포의다량공급가능에있다는것을고려할때 이와같은연구 는그경쟁력을최대한으로활용하여바로임상치료와신약개발로연장될수있 는연구라는점에서그의미가돋보인다고생각된다

22 2. 실험적접근방법및내용 가. 인간배아줄기세포주의확립 냉동보존된전핵시기의배아를융해후배반포 (blastocyst) 까지배양하였다. 배반포에서내세포괴 (ICM) 을분리하기위하여기존에많이쓰이던 immunosurgery 방법외에내세포괴와영양세포 (trophoblast) 의일부분만을절개하여배양하는부분배아의배양방법 (partial embryo culture method) 그리고전체배아의배양방법 (whole embryo culture method) 을이용하였다. 이세가지방법은각각배반포의상태에따라서적절하게이용할수있다. 나. 인간배아줄기세포주은행의운영및교육 확립된인간배아줄기세포주는초기상태에냉동보존하여두고필요한시기에융해하여배양한다. 모든연구진을상대로전체 workshop을시행하거나원하는경우개별 training course를시행한다. 개별 training course에는인간배아줄기세포배양방법, 배양액만드는법, 영양세포층배양방법등의과정으로진행하며분양을원하는경우 MTA 작성후시행한다. 다. 인간배아줄기세포주의분화연구 (1) 심근세포로의분화 인간배아줄기세포로부터심근세포로의분화유도는현재까지크게자연적 인분화유도 (spontaneously differentiation) 와성장인자의처리를통한분화유도 (induced differentiation) 의두가지로분류될수있다. 본연구에서는 SNUHES3 인간배아줄기세포주를이용하여심근세포로의분화를유도하고나아가이들을임상 적모델에적용하려고한다

23 (2) 신경세포로의분화 3개의인간배아줄기세포주 (SNUhES1, SNUhES2, and SNUhES3) 로부터신경과상피세포쪽으로의분화능을비교하고성숙한신경세포로의분화를유도하였다. (3) 단백질도입기술 인간배아줄기세포의경우유전자변형기술의효율이낮아서연구에장애점이되고있다. 본연구에서는이러한유전자변형의낮은효율에따른연구의어려움을해결하는대안으로인간배아줄기세포에서단백질도입기술을적용해보고자한다. 대부분의단백질은지질막을통과하지못하므로세포내로전달이안되지만, HIV-1 TAT 단백질의경우세포막을통과하여바이러스프로모터를활성화시 킬수있다는것이발견되었다. 본연구에서는인간배아줄기세포에서 TAT PTD 에의해단백질이세포내로전달되는지의여부와심근세포에특이적인유전자의 발현이유도되는지를조사하였다. (4) 거핵세포로의분화 인간배아줄기세포 (human ES Cells) 로부터거핵구와혈소판의분화유도는이제까지거핵구와혈소판연구에사용된다양한 sources인골수 (bone marrow), 말초혈액 (peripheral blood), 그리고제대혈 (cord blood) 세포에서의분화에비해괄목할만한장점을갖고있다. 첫째, 인간줄기배아세포의증식력은무제한적이어서현재까지사용되어온제한적인조혈모세포에서혈소판을유도하는것보다훨씬경제적일것이다. 둘째, 수혈을통한혈소판공급은현재AIDS와같은질병으로인한오염의큰위험부담을안고있는데반해인간배아줄기세포에서유도된혈소판공급은매우안전할것으로사료된다. 셋째, 동맥경화증치료신약개발에필요한시험관내 system을구축할수있다. 심혈관계질환은우리나라에서도이미주요한사망원인으로나타나고있으며혈소판기능조절을통한합병증치료개발이시급한현실이다. 혈소판의활성과응집에는 thrombin, ADP, VWF, Epinephrine등을포함한여러가지물질에의해조절받는다양

24 한신호전달체계가관여하고있으며이들은혈소판특이적인 integrin 이라는수용기를 활성화함으로써그효과를보인다. 신약개발은혈소판활성화조절에관한연구를통하 여이루어질수있으며동질성을가진혈소판의공급은중요한전제조건이다

25 2 절연구결과 1. 대표연구성과 세계최초인간복제배아줄기세포확립가. 연구내용및주요결과 1) 2004년 2월 12일미국시애틀에서개최된미국국가과학진흥회 (American Association for the Advanced Science : AAAS) 연례회의에서한국의황우석, 문신용교수를대표로하는공동연구진은체세포를복제한배아를이용하여인간복제배아줄기세포를세계최초로확립하였다고보고하였음 2) 복제배아줄기세포에서유래한세포를체세포공여자본인에게이식할경우면역거부반응을일으키지않아이제까지치료가불가능하였던난치병을근본적으로치료하는데이용할수있음 3) 연구진은세포응용연구사업단및세계각국의윤리규정을참고하여인간개체복제를사전에방지할수있는연구방침을정하였고, 한양대학교임상시험윤리위원회에서연구계획을승인받았으며, 십여명의자발적난자공여자로부터총 242개의정상난자를제공받아연구에이용함 4) 자발적으로참여한여성의난자및체세포를채취한후난자의투명대에구멍을만든후핵을제거하여용이하게탈핵난자를만듬, 난자제공자와동일인의난구세포를탈핵된난자에주입하여핵이식난자를만든후, 전기자극을가해세포융합을유도하였으며, 연구팀고유의탈핵방법, 난자제공자와동일인의난구세포를핵이식용체세포로이용한점이본연구성공의가장중요한요인으로평가됨 5) 핵이식난자의활성화를촉진시키기위하여화학물질인칼슘아이노포어 (A23187) 를적절히적용하여핵이식난자의배발육을촉진하였고, 총 30개의배반포를얻어내세포괴를배양한결과이중한개의복제배아줄기세포가확립됨 6) 확립된복제배아줄기세포는 DNA 지문분석방법으로체세포공여자와복제배아줄기세포의유전자가일치하며 ( 오차확률은 8.8x10-16), 일곱가지의표식인자확인및염색체분석을통하여정상적인배아줄기세포로서의특성을지니고있음을확인

26 7) 배상체형성과실험동물생체내이식실험결과전분화능을지니고있으며, 체외배 양과정을통하여이들세포가신경세포로분화하는것도확인하였음 나. 연구성과와관련된이미지 1) 연구성과 세계최초로확립된 인간복제배아줄기세포 핵이제거된난자내로체세포핵을 이식하는과정의사진

27 2. 인간배아줄기세포주의확립 가장널리이용되는 antibody( 항체 ) 와 complement( 보체 ) 를이용한 immunosurgery 방법 ( 그림 1) 으로 6개의세포주를확립하였고부분배아의배양방법 ( 그림 2) 으로 4개의세포주를확립하였다. 또한전체배아의배양방법 ( 그림 3) 으로 1개의세포주를확립하였다. 그림 1. Immunosurgery 를이용한내세포괴의분리

28 그림 2. 부분배아배양방법에의한내세포괴의분리 그림 3. 전체배아배양방법에의한내세포괴의분리

29 이렇게얻어진배아줄기세포가미분화상태인가를확인하기위하여다음과같은특성분석을실시하였다. 먼저형태학적으로판단하기위해위상차현미경하에서인간배아줄기세포를관찰하여세포의대부분을핵이차지하는미분화상태임을확인하였다 ( 그림 4와 5). 그림 4. 확립된미분화배아줄기세포를계대유지하기위해유리피펫을이용하여잘라주는모습 그림 5. 확립된배아줄기세포중분화세포가있는경우그부위를제외하고계대유지하는모습

30 또한 Alkaline Phosphatase 활성도가나타났고줄기세포에서발현되는 Oct-4가확인되었다 ( 그림 6). 미분화표식인자인 SSEA-3 & 4, TRA-1-60와 TRA-1-81이발현되었고생쥐배아줄기세포에서발현되는 SSEA-1은발현되지않았다 ( 그림 7). 이들을장기간배양하였을때 Telomerase 활성도가계속존재함을확인할수있었다. 그림 6. Alkaline phosphatse 와 Oct-4 그림 7. SSEA-4, TRA-1-60 와 TRA

31 확립된배아줄기세포가정상적인핵형을가지는가를확인하였고 ( 그림 8) 각세포주가각각의다른배아에서기원한것임을판단하기위해 DNA finger printing 을또한시행하여기원이다른배아임을확인할수있었다. 확립된세포 주의분화능을알아보기위해 SCID mice 에인간배아줄기세포를주입하여 teratoma 를형성시켰으며이들을조직검사한결과삼배엽기원의세포를만들수 있음을확인할수있었다 ( 그림 9). 그림 8. 핵형분석결과 그림 9. SCID mice 에미분화배아줄기세포를주입한후획득한 teratoma

32 3. 인간배아줄기세포주은행의운영및교육 각연구진을상대로 workshop을개최하여 25명의연구자가참여한가운데인간배아줄기세포의이해를증진시키고자하였으며또한각실무연구자들을상대로 training program을실시하여총 25개기관 29명의연구자들이이수하였다. 이러한결과로각연구진들이인간배아줄기세포에대한실험을보다용이하게할수있도록하였다. 또한이러한 workshop과 training을바탕으로인간배아줄기세포에대한연구바탕이확립된연구진에게본연구팀이확립한인간배아줄기세포를 21개연구진에게분양하여이를이용한인간배아줄기세포의특성과분화에미치는영향에관한연구를할수있게하였다. 가. Workshop 개최실적 제 1 차세포응용연구사업단배아줄기세포워크숍 The 1st Embryonic Stem Cell Workshop 일시 : 2002 년 10 월 24 일 ( 목 ) 13:00-17:00 장 소 : 세포응용연구사업단 서울대학교의과대학의학연구원 2 층회의실, 3 층실험실 주 대 최 : 세포응용연구사업단정책지정과제연구팀 상 : 21 세기프론티어세포응용연구배아줄기세포분야연구협약팀을대상 으로각과제별 2 명이내로선별하여 20 명으로제한함 참가인원 : 25 명 * 참고 : 부록 Ⅰ [ 첨부 1 ] 워크숍유인물 ( 별지첨부 ) [ 첨부 2 ] 워크숍참가자명단 ( 별지첨부 )

33 나. 연구자 Training 실적 인간배아줄기세포배양기술교육 (1-3 차년도 ) 대상 : 인간배아줄기세포를이용한실험수행을목적으로배양기술을습득하고자 하는연구원을대상으로한다. 교육기간 : 교육기관의상황과일정에맞춰논의한후결정한다. 기본적인교육기간은 3 일간으로하며여건에따라기간조정가능하다. 교육내용 1) review about hesc culture proccess 1 일 2) preperation of hesc medium and STO medium 3) expansion of feeder cells(sto) 4) preperation of subculture dish 2 일 3 일 5) hesc transfer 6) STO freezing 7) hesc media change and culture 8) Hand-out checking * 참고 : 부록 Ⅱ [ 첨부 1] : 인간배아줄기세포주분양및배양기술교육에관한공지문 [ 첨부 2 ] : 배양기술교육의구체적내용 [ 첨부 3 ] : 1-3 차년도교육생명단

34 다. 세포주분양실적 총 24 개연구팀 - hes : colony 이상 - hes EB : 3810 EBs 이상분양함 * 참고 : 부록 Ⅲ

35 4. 인간배아줄기세포주의분화연구 가. 심근세포로의분화 hesc로부터 cardiomyocyte로의분화를유도하였다. Undifferentiated ESC를 collagenase type Ⅳ(2mg/ml) 를처리하여분리한후, EB를 formation 하였다 ( 그림 10). 형성된 EB를 30일동안 suspension culture 한후 culture dish로옮긴후에 20일또는그이상부착한상태에서배양하였다. 부착된상태에서배양후 beating cluster의형성을확인할수있었다 ( 그림 11). A SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 B 그림 10. 다양한세포주와배양날짜에따른 EB 의형태변화 A ; 3 일째 EB. B ; 21 일째 EB

36 100 μm 그림 11. 배양후형성된 beating cluster 의모습 beating 은 in vitro 상에서 30 일이상지속. DAPI ctn I α MHC DAPI/cTn I/α MHC 100 μm 100 μm 100 μm 100 μm 50 μm 50 μm 50 μm 50 μm 그림 12. 심근특이적인표지자의발현양상 분화된세포에서 cardiomyocyte specific marker 들의발현은 immunostaining 과 RT-PCR 방법을이용하여확인하였다 ( 그림 12). cardiac muscle contraction에중요한역할을하는 troponin complex의 subunit인 ctni, cardiomyocyte motor protein의 subunit 인 ámhc, á actinin 등이 cardiomyocyte로분화유도된세포에서발현되었으며, 중배엽성세포로의분화과정에서발현되는 transcription factor인 GATA4, Nkx2.5, cardiomyocyte에서분비

37 되는호르몬의한종류인 ANF, cardiac actinin 등의발현을 RT-PCR 방법으로확인하였다 ( 그림 13). 또한 growth factor 중중배엽성분화과정에관여하는것으로알려진 BMP2와 FGF2를처리한결과 cardiac specific marker 들의발현양이증가하는것을확인하였다 ( 그림 14 ~ 21). Expression of β- actin in each cell lines (200 bp) ES N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 hes3 hes2 hes1 그림 13. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 β- actin mrna 양의비교 (200 bp)

38 Endoderm Amylase (490 bp) ES N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 hes 3 hes 2 hes1 그림 14. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 endoderm marker 인 Amylase (490bp) 의 mrna 양변화

39 Albumin (450 bp) ES N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES hes 3 hes 2 hes 1 ES D2 D4 D6 D9 D13 D17 D21 그림 15. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 endoderm marker 인 Albumin (450bp) 의 mrna 양변화

40 Ectoderm Keratin (780 bp) ES N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES hes3 hes2 hes ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 16. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 ectoderm marker 인 Keratin (780bp) 의 mrna 양변화

41 Neuro Filament Heavychain (400 bp) ES N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES hes3 hes2 hes ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 17. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 ectoderm marker 인 Neuro Filament Heavychain (400bp) 의 mrna 양변화

42 Mesoderm Cartilage Matrix Protein (620 bp) ES N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES hes3 hes2 hes ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 18. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 mesoderm marker 인 Cartilage Matrix Protein(620bp) 의 mrna 양변화

43 Enolase (490 bp) ES N SNUhES1 SNUhES2 SNUhES hes3 hes2 hes ES D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D9 D11 D13 D15 D17 D19 D21 그림 19. 각각의세포주에서배양날짜별로발현되는 mesoderm marker 인 Enolase (490bp) 의 mrna 양변화

44 GAPDH (302bp) ANF (190bp) cact (620bp) ctn I (200bp) hes EBs N GATA4 (475bp) Nkx2.5 (233bp) 그림 20. 인간배아줄기세포와배아체에서자연분화때의심근특이적으로발현되는 유전자의변화 APDH(302bp) ANF (190bp) cact (620bp) ctn I (200bp) hes EBs N GATA4 (475bp) Nkx2.5 (233bp) 그림 21. 인간배아줄기세포와배아체에서유도분화때의심근특이적으로발현되는 유전자의변화

45 나. 신경세포로의분화 세개의인간배아줄기세포주 (SNUhES1, SNUhES2, and SNUhES3) 로부터신경과상피세포쪽으로의분화능을비교하고성숙한신경세포로의분화를유도하였다. 배상체를형성한후 N2 supplement와 bfgf가첨가된배지에서신경모세포로분화를유도한결과배양 7일째에신경모세포의표식자인 nestin mrna의발현이최고점에달했으며 ( 그림22) 그림 22. 인간배아줄기세포를부착배양때배양기간에따른 Nestin 의발현양상 이때의세포들에서신경모세포로의분화때특이적으로보여지는신경모세포들의신경망형성을비교했을때유의한차이가나타남을볼수있었다. 사용한세포주중 SNUhES1은가장많은형성률 (~36%) 을갖는것으로나타났으며 SNUhES2에서는거의신경망형성을볼수없었다 (<2%)( 그림 23)

46 Cell line Frequnency SNUhES ± 5.8% (26/88, 26/65, 23/59) SNUhES2 < 2% (1/66, 0/57, 1/55) SNUhES ± 1.7% (14/79, 20/96, 16/88) 그림 23. 인간배아줄기세포를신경으로분화시킬때세포주에따른신경망 형성율비교 유세포분석을통해 nestin 발현세포의비율을비교한결과 70% 정도로 큰 차이가없게나타나는데실제로이들을면역조직학적분석을해보면 nestin 을발 현하는세포들이신경모세포의형태가아닌것을알수있었다 ( 그림 24). 그림 24. 배양조건과세포주에따른신경모세포형성율

47 SNUhES1 SNUhES2 SNUhES3 Suspension cultured EB Attachment cultured EB 그림 25. 각각의인간배아줄기세포주로만든 EB 를부착배양할때나타나는 신경전구체및신경망형성 이러한결과는 nestin 을발현하는세포들이모두신경모세포는아닌것으로 보여지며분화를더욱진행시켜성숙한신경세포를만들었을때도 SNUhES2 는 거의신경세포가나타나지않는것으로볼때 SNUhES2 는같은조건아래서는신

48 경세포로의분화가이루어지지않는것으로보인다. 반면에 SNUhES1의경우분화를진행시키면대부분의세포군에서성숙한신경세포의표식자인 betaiii-tubulin 과 neurofilament heavy chain을발현하는세포들이나타나며 retinoic acid를처리할경우대부분의세포가 (>80%) 상피세포의표식자중하나인 pancytokeratin을발현하는것을볼수있으며, 반면에 SNUhES1과 SNUhES3에서는일부만이 (<20%) 이와같은세포들로분화하는것을볼수있었다 ( 그림 25 ~ 26). NF-H)/βIII tubulin a Pancytokeratin (d)/myosin/gfap(f) d b e c f 그림 26. 세포주에따른분화양상의차이 SNUhES1 (a, e, f), SNUhES2 (b, d), SNUhES3 (c) cell line on spontaneous (e), RA (d), β-ngf (a,b,c), PDGF treatment culture (f)

49 βiii-tubulin A2B5 그림 27. 배아줄기세포로부터분화된신경세포및신경세포특이적표지자의 발현양상 이러한결과로볼때각각다른배아줄기세포주들은그분화능에있어서차이를보이며원하는실험과얻고자하는목표세포로의분화를위해서는세포주의선택이하나의관건이될수있으며경우에따라서는세포주에따라각각다른방법들이사용되어져야할것으로사료된다

50 다. 단백질도입기술 인간배아줄기세포에서는여러가지유전적변형방법들이효율적으로적용 되지않고있어연구에제한점이많다. 이를해결하는수단으로세포막을통과시 켜단백질을세포내로직접전달해주는방법인단백질도입기술을적용해보았다. 본연구에서는 HIV-1 TAT 단백질에서 47 ~ 57 번까지 11 개의아미노산으로이 루어진부위로서세포막을통과하는활성을가지는 TAT protein transduction domain (PTD) 이인간배아줄기세포에서작용하는지를조사하여보았다. TAT 펩타이드에형광색소인 FITC를융합시켜인간배아줄기세포에처리했을때대부분의세포에서형광이나타났으며, 배아체 (embryonic body) 를 TAT-FITC로처리한후 flow cytometry로분석한결과 70% 이상의세포에서형광이나타났다 ( 그림 28 ~ 29). FITC TAT-FITC ES 400 um EB 그림 28. 형광표지된단백질을도입한세포를형광현미경으로관찰한모습 위 : ES, 아래 : EB, 좌 : FITC control, 우 : TAT-FITC

51 또한췌장의발생에필수적인역할을하는 Pdx1 단백질을 TAT PTD에융합시켜인간배아줄기세포에처리해보았다. 그결과 TAT-Pdx1 단백질이세포내로전달됨을확인할수있었고단백질도입이 1 시간내에일어나는빠른과정이었다. 세포내로전달된 TAT-Pdx1 단백질이활성을가지는지알아보기위해 EB를 TAT-Pdx1으로처리한후 Pdx1 전사인자가췌장발생과정에서그발현을조절하는것으로알려진 insulin, Pdx1, somatostatin, glucokinase 등의하위표적유전자 (downstream target gene) 들에대해서 RT-PCR을수행해보았다. 그림 29. 배아체 (embryonic body) 를 TAT-FITC 로처리한후 flow cytometry 로분석한결과. 그결과 insulin과 Pdx1의 mrna 수준이증가하는것으로조사되었다. insulin에대한항체로배아체를염색해본결과인슐린단백질발현의증가를관찰할수있었다. 이상의결과로 TAT PTD를매개로하는단백질도입이인간배아줄기세포에서효율적으로작용함을알수있었다. 따라서단백질도입기술은다른여러종류의단백질에대해서도적용할수있을것이며특히분화를유도하거나세포의특성을변화시키는단백질을인간배아줄기세포에전달해주는경우특정세포로의분화를통한세포치료 (cell-based therapy) 또는분화과정에관여하는유전자의기능연구나새로운유전자의동정등에응용될수있는유용한연구수단을제공할것이다

52 라. 거핵세포로의분화 본연구팀은인간배아줄기세포 (SNUhES3) 에서거핵구로의분화능을유체분석기 (FACS) 를이용하여시간에따른연구결과 ( 그림 30) 를얻었다. CD41 CD42bα 그림 30. 시간에따른거핵구의분화양상 Megakaryocytic Differentiation (Time Dependent)

53 또한거핵구분화시수반되는 polyploidization 을인간배아줄기세포에서분화된세 포들 (30, 40 일 ) 을 DAPI staining 하여다음과같은결과 ( 그림 31) 를얻을수있었다. d.30 d.40 d. 그림 31. 인간배아줄기세포로부터분화된거핵구의형태학적특징 ( 200, DAPI Staining) Morphologies of Differentiated hes ( 200, DAPI Staining) 이러한연구결과를바탕으로거핵구분화시발현되는유전자동정, 단백질동정및 polyploidization시나타나는핵의다양성을 PI staining을통해살펴볼예정이다. 또한혈소판으로의분화를 OP9 cells에서유도하여혈소판이상증상으로인한질병에이상적인대체임상치료에사용할계획이다. 이와같은연구는인간배아줄기세포의다량공급이가능한그경쟁력을최대한으로활용하여임상치료와신약개발로연장될수있다는점에서그의미가혁신적이라사료된다

54 마. 인간배아줄기세포로부터췌장내분비세포의분화유도기술개발 미분화된 ES cell을췌장세포로분화시키는방법을개발하고자, embryoid body 형성및배양기간과 adhesion culture 시배양기간에따른 gene expression 을관찰하여, 유도분화에적절한시기를선택하고자하였다. 자연분화시전반적인 EB의모양은 simple EB로단순한 cell 덩어리를이룬것이대부분이었으며, 배양 2주부터, EB내에 cyst를형성한 cystic EB가형성되기시작하였다. 배양기간에따라미분화 marker인 oct-4 와 nanog의 expression 을관찰해보면, 전배양기간중모든시기에발현이되나, EB 배양기간이길어짐에따라감소하는경향을나타내었다. Endoderm marker의발현은주로 EB 배양 2, 3주경가장많이발현되나, 그발현양상은각 marker에따라다른양상을보여준다 ( 그림 32). EB: 0d 4d 1wk 2wk 3wk 4wk 6wk NC Oct-4 (219 bp) Nanog (380 bp) Nestin (495 bp) AFP (676 bp) Amylase (490 bp) Ngn3 (948 bp) Pdx-1 (262 bp) GAPDH (302 bp) 그림 32. EB 배양기간에따른유전자의발현양상관찰 (RT-PCR) 1) Undifferentiated M arker expression: Oct-4, Nanog 2) Endoderm M arker: AFP, Amylase, Albumin 3) Pancreatic endocrine progenitor cell marker: Pdx-1, ngn 3 4) Internal control marker: GAPDH

55 AFP의경우는발생초기에는 extraembryonic endoderm marker (visceralendoderm marker) 이지만, 시간이지남에따라 liver의 specific marker로사용되는데, EB배양기간에따른발현은배양 2주경부터나타나기시작하여 3주경에 peak을이루고이후서서히감소하는경향을나타낸다. Albumin은 liver 발생의 specific marker 인데, 배양전과정에서발현이되지않았다. Amylase는 pancreatic exocrine cell marker로서전기간에걸쳐발현되나, 역시배양 2, 3주경 가장많이발현되는양상을보인다. Pancreatic endocrine progenitor cell marker 인 Pdx-1은 insulin producing cell의분화초기에 expression되다가사라진후 insulin producing cell maturation 시기에많이발현되는 gene으로배양중인 EB에서는배양 2주부터서서히나타나기시작하여점점증가되는양상을보인다. ngn3 는 pdx-1 발현이후, 나타나는 gene인데, 본실험결과는배양전과정에서발현되는것으로나타났다 ( 그림 33) Nanog (380 bp) Oct-4 (219 bp) GAPDH (302 bp) Lane 1: EB 3wk (simple), Lane 2: EB 3wk (cystic), Lane 3: EB 3wk+ AD 2 day, Lane 4: EB 3wk + AD 4 day, Lane 5: EB 3wk + AD 7 day, Lane 6: EB 3wk + AD 14 day, Lane 7: Undifferentiated ESC, Lane 8: ES w/o feeder 2 day, Lane 9: ES w/o feeder 4 day, Lane 10: ES w/o feeder 7 day, Lane 11: Blank(w/o RT) 그림 33. 부착된 EB 의분화기간에따른 gene expression 조사 EB 배양 1, 2, 3, 4주후 adhesive culture를하여 1주일간 ITS-X media로배양한다음 4주간 N2+B27+10mM Nicotineamide로배양하여 HNF3β와 insulin의발현을 ICC로관찰하였다. EB 3주에서 insulin의경우 1주및 2주, 4주에는거의발현되지않은반면에, HNF3β는모든경우고루발현됨을관찰하였다 ( 그림 34 ~ 37)

56 <HNF3β> <Insulin> <DAPI staining> <Merge> 그림 34. 인간배아줄기세포로부터분화된세포들중에서나타나는 Pancreatic β-cell marker. HNF3β: early endodermal cell lineage marker hes2 P EB Differentiation Phase contrast MS Image HNF3β HNF3β + DAPI staining 그림 35. SNUhES2 세포주로부터분화된세포들중에서나타나는 Pancreatic β-cell marker. HNF3β: early endodermal cell lineage marker

57 H-E staining of hes3 EB 8 wks Morphology of Whole EBs Ductal epithelia and glandular cell Endothelial cells Morphology of neuroepithelia or neural tubes 그림 36. 인간배아줄기세포로부터만들어진 EB 를자연분화시킬때나타나는 각종분화된세포들의형태학적특징 hes2 P EB Differentiation Phase contrast MS Image HNF 3 β Cytokeratin 19 Merge (w/ DAPI) 그림 37. SNUhES2 세포주로부터분화된세포들중에서나타나는 Pancreatic β-cell marker. Cytokeratin 19: epithelial marker, HNF3β: early endodermal cell lineage marker

58 유도분화의또다른조건으로 RA를사용하였다. RA 7day sample을 cytokeratin19과 HNF3β로 ICC staining 한결과대부분의 cell들이 cytokeratin 19 에 positive 하고, 극히일부의 cell 만이 HNF3β에 positive한결과를보였다. 유도분화때 mrna 수준에서차이를보기위해 RT-PCR을진행하였으며자연분화와의차이점을비교하였다 ( 그림 38). mrna expression during the inducing culture Pdx-1 (? bp) HNF3β (199 bp) Amylase (490 bp) Oct-4 (219 bp) GAPDH (302 bp) Lane 1: Undifferentiated hesc Lane 2: EB 7 days Lane 3: EB + AD culture 7days, Lane 4: RA treatment 7days, Lane 5: N2+B27+bFGF 7days, Lane 6: N2+B27+nicotinamide, Lane 7: Blank, 그림 38. 유도분화에따른 Endoderm-related gene 의발현양상 Endoderm-related gene expression in the inducing culture

59 RA를이용한췌장세포로유도를확인하기위해 RA 1일간처리, bfgf 및 nicotinamide처리후 cell morphology를관찰하고 dithizone staining을하였다. hes3에서극히일부가 dithizone에 staining 되었다. 이부분에서인슐린이생성되는지보기위해인슐린과 c-peptide의항체를이용하여조직형광염색을수행한결과일부에서 positive한결과를얻을수있었다 ( 그림 39 ~ 42). RA 1+ bfgf 3d RA 1+bFG F 6d RA 1+bFGF 7+N IC 4 RA 1+bFG F 7+NIC 6d 그림 39. RA 1 일간처리후 bfgf 및 nicotinamide 처리후나타난 cell 의모양 그림 40. 인간배아줄기세포로부터분화된세포중 Dithizone staining 에염색된세포군

60 그림 41. Immunocytochemical staining: Insulin(Red)+C-peptide(G) 그림 42. w/o RA + bfgf 7 일처리한 sample: HNF3β(Red) + Nestin (Green)

61 바. 배양기간에따른인간배아줄기세포의특성변화 인간배아줄기세포를계대배양하는동안 passage에따라변화를발견할수있는데이러한관찰을토대로계대배양동안세포의증식및분화능에어떠한차이가나타나는지를정량화하고 further study에도움을주고자본연구를수행하였다. 각 group에서 day 2일부터 day 6일까지 linear 상태이기때문에 day 2일을기준으로 doubling time을계산한결과 50계대 (middle) 이후에는세포증식이빨라지는것을관찰할수있었다. Early hes cell, 20계대 : 2.31 day (55.44 hours); Mid hes cell, 70계대 : 0.81 day (19.44 hours); Late hes cell, 120계대 : 1.04 day (24.96 hours) ( 그림 43 ~ 45) Colony Size(Area) ADU P16-12 P22-58 P Day Early Mid Late Day Day Day Day Day Early Mid Late hes Day Day Day Day Day 그림 43. 배양기간에따른배아줄기세포군의면적변화

62 그림 44. 배양기간에따른배아줄기세포군의수적변화 그림 45. 회귀분석적용을통한 3 차모형에적용

63 hes cell을장기간배양하며실험하였을때, passage가지남에따라 EB의형성및 adhesive culture( 즉 differentiation) 가잘되지않는현상이나타남을관찰하였다. 또한 hesc가 passage가지남에따라분화능이떨어지며, 미분화상태를유지하려는경향이있는것으로관찰되었다. EB 배양기간에따른유전자발현양상관찰에서미분화 marker인 Oct-4, Nanog 등은 EB 배양기간에관계없이 expression되었으나 EB형성후 EB의만들어진상태에따라서는변화가관찰되었다. 미분화및분화 marker의 gene expression은 real-time PCR을이용하여정량적분석을하고, adhesive culture 동안 surface marker의발현을 IHC로관찰하였다 ( 그림 46 ~ 48). Oct-4 Expression Pattern Nanog Expression Pattern A rbitrary Un i Samples A r b it r a r y U n it ( A U Samples 그림 46. Real time PCR 결과 1, 미분화 hesc (early passage, P26); 2, 미분화 hesc (middle passage, P78); 3, 미분화 hesc (late passage, P117); 4, 3주째 EBs(early passage, P21, simple EBs); 5, 3주째 EBs(early passage, P21, cystic EBs); 6, 3주째 EBs(middle passage, P73, simple EBs); 7, 3주째 EBs(middle passage, P73, cystic EBs); 8, 3 주째 EBs(late passage, P112, simple EBs); 9, 3주 EB+2 주부착배양 (early passage, P21); 10, 3주 EB+2 주부착배양 (middle passage, P73); 11, 3주 EB+2 주부착배양 (late passage, P73)

64 Early Passag e(p21) M iddle passag e(p73) L ate passag e(p112) 그림 주째 EB 의부착배양에따른형태적특징 Oct-4 (219 bp) Nanog (380 bp) Nestin (495 bp) GAPDH (302 bp) Lane 1:un-hESC (Early), Lane 2: un-hesc (Middle), Lane 3: un-hesc ( Late), Lane 4: EB 3wk (Early, simple), Lane 5: EB 3wk (Early, cystic), Lane 6: EB 3wk (middle, simple) Lane 7: EB 3wk (middle, cystic), Lane 8: EB 3wk (Late, simple), Lane 9: EB 3wk + AD 2 week (Early) Lane 10: EB 3wk + AD 2 week (Middle), Lane 11: EB 3wk + AD 2 week (Late) 그림 48. Conventional RT-PCR 결과

65 사. 인간배아줄기세포의 3 차원배양에서 alginate hydrogel 의역할및효과 인간배아줄기세포의분화에영향을주는요인들은너무나도많지만대부분의연구들은주로특정유전자나분화인자에치우쳐있다하지만실제로생체내에서분화에관련된환경에는이러한요소들만이아니라세포들이위치하고있는 3차원적환경또한중요한역할을할것으로여겨지고있다. 이에본실험에서는생체내의환경과꼭같지는않지만 alginate를이용하여인위적으로 3차원적환경을만들어줌으로써새로운분화요인을찾아보고자하였다. ESC Culture Using Various Materials cell line matrix treatment differentiation 1.6% alginate gel lens-shaped colonies Magyar et al. (2001) R1(mouse ESC) 1.1% alginate gel spontaneously beating areas 1.1% alginate gel RA smooth muscle actinα, calponin monolayer culture epithelial cell dominant Chen et al. (2003) R366.4(monkey ESC) collagen gel coculture with HPI.1 NCAM(45%)ChromograninA(20 %) NCAM(65%)ChromograninA(45 %) Vimentin(40%)FactorⅧ(15%) collagen sponge coculture with HPI.1 Vimentin(80%)FactorⅧ(25%) RA cytokeratin positive areas Levenberg et al. (2003) H9(human ESC) PLGA50%,PLLA50% TGF-β activin-a secreting GAG producing AFP, albumin, PDX-1 IGF producing AFP and albumin

66 Alginate hydrogel 안에서 EB를배양할경우일반적인 EB 보다크기가작고 compact 해지는것을관찰하였다. 이때 gel 안의 EB는 pod-like structure를가지는구조물이종종나타나며조직학적검사시좀더 homogenous한세포들로이루어지는것을관찰하였다 ( 그림 49). EB control (day14) x100 EB in alginate hydrogel (day14) x200 그림 49. Alginate hydrogel 안에서 EB 배양시배양시간에따른형태적변화

67 RT-PCR S1 S2 S3 A0 A1 A2 A3 Oct-4 Nanog Nestin Amylase GAPDH S1: Small clump suspension S2: EB suspension culture S3: ES colony A0: Single cells in alginate A1: Small clump in alginate A2: EB in alginate A3: ES colony in alginate 그림 50. Alginate hydrogel 을이용한배양에따른유전자발현의차이 RT-PCR 결과미분화 marker 인 Oct4 와 nanog 는 suspension cultured EB 와별차이가없었으나외배엽이나내배엽쪽의발현은억제되는결과가나타났다 ( 그림 50)

68 아. 인간배아줄기세포로부터 motor neuron 으로의분화 인간배아줄기세포로부터 motor neuron 으로의분화를유도하기위하여 feeder-free culture 하에서 chemical method 혹은 lentiviriral vectors 을이용하여 hes cells 내로특 정유전자 (ngn1, olig2) 를도입하여, direct neural progenitor 로의분화를유도할수 있는 cell line 을확립하고 human foreskin fibroblast-conditioned medium 을이용한 feeder-free 상태에서 human embryonic stem cells 의배양조건확립하고자본연구 를수행하였다 ( 그림 51 ~ 53). Transfection Liposome Lentivirus SuperFect FUGENE6 On STO vs Feeder-free Feeder-free On STO vs Feeder-free DNA:Reagent attached clump 그림 51. 유전자도입계획 x100 x100 relative efficiency Fugene6 1 SuperFect 2 x100 x100 그림 52. Liposome 에의한 transfection 효율비교

69 By lentivirus Feeder-free vs on STO 48hr 72 hr 96 hr 그림 53. Lentivirus 의한 transfection Conclusion 1. Transfection efficiency On STO => failed SNUhES3 cells (Early: p16-40 Middle: p22-80) By liposome By lentivirus Feeder-free => a little be successed On STO => failed Attached reaction => failed Feeder-free => failed Clump reaction => failed 2. G418 resistance => SNUhESCs : 50 ~ 100 ug/ml

70 자. 인간배아줄기세포배양을위한지지세포배양조건의확립 인간배아줄기세포는주로지지세포위에서배양이되고있는데각연구자마다지지세포의배양조건을달리하고있으며이러한차이들은인간배아줄기세포배양에영향을줄수있다. 본연구에서는지지세포의증식을억제하는대표적인두가지방법 (mitomycin처리, gamma-irradiation) 이사용될때이들이줄기세포증식에어떠한영향을줄수있는지검정해보았다 ( 그림 54 ~ 57). 그림 54. 미분화 marker 인 Oct4/SSEA3 의발현비교 그림 55. 미분화 marker 인 Oct4/SSEA4 의발현비교

71 그림 56. 미분화 marker 인 Oct4/Tra1-60 의발현비교 그림 57. 미분화 marker 인 Oct4/Tra1-60 의발현비교

72 차. 정상인간배아줄기세포와염색체이상을갖는인간배아줄기세포에서 CD30 의발현차이비교 CD30은암세포나비정상적으로증식하는세포에서발현되는것으로알려져있으며최근줄기세포에서의발현이보고된바있다. 본연구에서는인간배아줄기세포에서 CD30의발현양상을확인하고비정상적인염색체를갖는인간배아줄기세포에서와의발현차이를비교하고자하였다 ( 그림 58 ~ 60). Abnormal versus Normal hescs hes19 p36 Normal XY hes19 p36 XY, +12 hes3 p Normal XY hes3 p XY, +12 All images magnified x 400 그림 58. 정상과비정상적인염색체를갖는인간배아줄기세포에서 CD30 발현의차이

73 FACS: CD30 in hes3 2.1% Negative control 67.6% 78.0% Normal Abnormal 그림 59. 유세포분석에의한 CD30 의차이비교 x400 그림 60. 분화에따른 CD30 발현의감소 DAPI(blue), Oct4(green), CD30(red), differentiated region(arrow)

74 카. 인간배아줄기세포로부터 Oligodendrocyte 로의분화 손상된신경세포의 remyelination에중요한역할을하는 oligodendrocyte를인간배아줄기세포로부터분화시키기위해본연구를실행하였다. 신경계전구체형성후 oligodendrocyte의전구체를형성하였으며이들로부터성숙한 oligodendrocyte를얻을수있었고 myelination을확인하였다 ( 그림 61 ~ 67). Day 7 Day 11 Day 19 Day 27 Day Expansion of undifferentiated ES cells Formation of EBs Induction of A2B5 -positive cells(opc) Selection of nestinpositive cells Differentiation to mature oligodendrocytes Stage I Stage II Stage III Stage IV Stage V 그림 61. Oligodendrocytes 의분화단계 A B C D 200um 200um 100um 100um 그림 62. EB 로부터 Neural progenitor(npc) 로의분화

75 E F G H 50um 50um 50um 50um 그림 63. NPC 로부터 mature oligodendrocyte 로의분화 그림 64. Mature oligodendrocyt(ng2-red, O1-green) 그림 65. Oligodendrocyt 전구체의수율 (75.89%)

76 Stage1, 2, 3, 4, 5 A B C D E F GAPDH Nestin PDGF-R NG2 MBP PLP 그림 66. Stage-specific mrna expression 그림 67. 인간배아줄기세포로부터분화된 oligodendrocyte myelination 의 전자현미경관찰

77 5. 논문, 학술회의발표및특허출원 / 등록실적 1) 논문발표 : 21 건 국외 구분발표자논문제목 SCI Hwang WS, Ryu YJ, Park JH, Park ES, Lee EG, Koo JM, Chun HY, Lee BC, Kang SK, Kim SJ, Ahn C, Hwang JH, Park KY, Cibelli JB, Moon SY Yu DH, Lee KH, Lee JY. Kim S, Shin DM, Kim JH, Lee YS, Lee YS, Lee YS, Oh SK, Moon SY, Lee SH, Lee YS Suh MR, Lee Y, Kim JY, Kim SK, Moon SH, Lee JY, Cha KY, Chung HM, Yoon HS, Moon SY, Kim VN, Kim KS Kim SJ, Park JH, Lee JE, Kim JM, Lee JB, Moon SY, Roh SI, Kim CG, Yoon HS Chang KH, Lim JM, Kang SK, Lee BC, Moon SY, Hwang WS Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst Changes of Gene Expression Profiles During Neuronal Differentiation of Central Nervous System Orecursors Treated With Ascorbic Acid Human embryonic stem cells express a unique set of micrornas Effects of type IV collagen and laminin on the cryopreservation of human embryonic stem cells. An optimized protocol of a human-to-cattle interspecies somatic cell nuclear transfer 학술지 명칭 Science J Neurosc i Res Dev Biol Stem Cells. Fertil Steril 권 : 쪽 ( 년도 ) 303 : (2004) 78 :29-37 (2004) 15 ;270: (2004) 22: (2004) 82: (2004) impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 책임 공동 공동 5.8 공동 공동 비 고

78 구분발표자논문제목 학술지 명칭 권 : 쪽 ( 년도 ) impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 비 고 Kim TM, Park TS, Shin SS, Han JY, Moon SY, Lim JM. An interclass nuclear transfer between fowl and mammal: in vitro development of chicken-to-cattle interclass embryos and the detection of chicken genetic complements. Fertil Steril. 82(4) :957-9 (2004) 공동 국 외 SCI Oh SK, Kim HS, Ahn HJ, Seol HW, Kim YY, Park YB, Yoon CJ, Kim DW. Kim SH, Moon SY SK Oh, HS Kim, YB Park, HW Seol, YY Kim, DW Kim, SY Moon SK Kim, MR Suh, HS Yoon, JB Lee, SK Oh, SY Moon, SH Moon, JY Lee, JH Hwang, WJ Cho, KS Kim Derivation and Characterization of New Human Embryonic stem cell lines, SNUhES1, SNUhES2 and SNUhES3 Methods for Expansion of Human Embryonic Stem Cells Identification of Developmental Pluripotency Associated 5 Expression in Human Pluripotent Stem Cells Stem Cells Stem Cells Stem Cells 23 :211-9 (2005) ;23 :605-9 (2005) 23 : (2005) 5.8 책임 5.8 책임 5.8 공동 Lee EM, Kim JY, Cho BR, Chung WK, Yoon BW, Kim SU, Lee BC, Hwang WS, Moon SY, Lee JS, Ahn C. Down-regulation of MHC class I expression in human neuronal stem cells using viral stealth mechanism. Bioche m Biophy s Res Comm un 28;326: (2005) 공동

79 국외 구분발표자논문제목 SCI WS Hwang, SI Roh, BC Lee, SK Kang, DK Kwon, S Kim, SJ Kim, SW Park, HS K, CK Lee, JB Lee, JM Kim, C Ahn, SH Paek, SS Chang, JJ Koo, HS Yoon, JH Hwang, YY Hwang, YS Park, SK Oh, HS Kim, JH Park, SY Moon, G Schatten SY Ha, BC Jee, CS Suh, HS Kim, SK Oh, SH Kim, SY Moon HS Kim, SK Oh, YB Park, HJ Ahn, LA Lee, DW Kim, SY Moon YD Kwon, SK Oh, HS Kim, S-Y Ku, SH Kim, YM Choi, SY Moon Patient-Specific Embryonic Stem Cells Derived from Human SCNT Blastocyst Cryopreservation of human embryonic stem cells without the use of a programmable freezer Derivation of Human Embryonic Stem Cells Depending on Quality of Blastocyst Cellular Manipulation of Human Embryonic Stem Cells by TAT-PDX1 Protein Transduction 학술지 명칭 권 : 쪽 ( 년도 ) impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 Science 공동 Human Reprod Stem Cells Molecular Therapy 20; (2005) submiit ed submiit ed 책임 5.8 책임 책임 비 고

80 국내 구분발표자논문제목 SCI 비 SCI Lee KJ, Choi SJ, Kim J, Park JK, Kang WS, Park KH, Kim S, Moon SY, ChungHM, Hwang TS, Song J 김희선, 안희진, 김윤영, 설혜원, 오선경, 서창석, 김석현, 문신용오선경, 김희선, 안희진, 윤철종, 문신용 김희선, 안희진, 김석현, 김수진, 오선경, 문신용 권영도, 오선경, 문신용 김윤영, 김희선, 오선경, 구승엽, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용김희선, 설혜원, 안희진, 오선경, 구승엽, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용 Neuronal Differentiation of Human ES Cells by Co-Culturing with PA6 Stromal Cells 배양액의조성차이에따른인간배아줄기세포의계대배양에관한연구 인간배아줄기세포의전자현미경적연구 인간배아줄기세포에서 Flow cytometry analysis를이용한 Apoptosis에관한연구 TAT PTD를이용한 Nkx2.5 단백질의인간배아줄기세포로의도입 인간배아줄기세포의심근세포로의분화유도 양수세포를이용한인간배아줄기세포의배양방법 학술지 명칭 Korean J Genetics 인구의학연구논집 인구의학연구논집 인구의학연구논집 인구의학연구논집 인구의학연구논집 대한불임학회지 권 : 쪽 ( 년도 ) 2004;26 : ;15: ;17 : ;17: ;17 : ;17 : ;31 : impact factor 책임또는제 1 저자및공동저자구분 공동 책임 책임 책임 책임 책임 책임 비 고

81 2) 학술대회발표 : 42 건 구분발표자학술회의명칭발표제목 국외 Oh SK, Kim HS, Ahn HJ, Kim YY, Seol HW, Moon SY Kim HS, Oh SK, Sung KC, Kang MJ, Moon SY Moon SY Kim YY, Seol HW, Ahn HJ Moon SY Moon SY Moon SY Oh SK, Kim HS, Seol HW, Ahn HJ, Kim YY, Kang MJ, Sung KC, Cho MS, Moon SY Keystone symposia Keystone symposia Pre-Congress course stem cells International society for stem cell research forth International seminar on reproductive medicine and asistedreproductive technology in Beijing Asian Stem Cell Network Workshop, kti2003 Stem cells and somatic cells cloning research: present status and future trends Keystone symposia Establishment of Human Embryonic stem cell and difference of temporal expression pattern in embryoid bodies The study on vitrification and ultrarapid thawing of human emryonic stem cells Establishment and characterization of human embryonic stem cells Temporal expression of differentiation markers in embryoid bodies from various human embryonic stem cell lines. Establishment and characterization of human embryonic stem cells Establishment and characterization of human embryonic stem cells Key Lecture : Future challenge in stem cell technology : Therapeutic cloning : Clinical application Human amniotic fluid cells prolonged expansion culture of human embryonic stem cell 발표년월일 ( 장소 ) (Keystone) (Keystone) (Madrid) (washington) (Beijing) (Kobe) (chulalongkorn Univ.) (Keystone) 국명비고미국포스터미국포스터스폐인구연미국포스터중국강연일본강연 태국강연미국포스터

82 구분발표자학술회의명칭발표제목 국외 Ahn HJ, Seol HW, Oh SK, Kim HS, Kang MJ, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim MH, Kim DW, Moon SY International Society for Stem Cell Research (ISSCR) International Society for Stem Cell Research (ISSCR) Moon SY ASRM Ha SY, Oh SK, Kim HS, Suh CS, Moon SY Cho MY, Oh SK, Kim MH, Kim DW, Moon SY Kim HS, Park YB, Oh SK, Yoon CJ, Moon SY Keystone symposia Keystone symposia Keystone symposia Comparison of Harvesting Methods for Cytogenetic Analysis of human embryonic stem(hes) Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines Assisted Regenerative Medicine: The Future of ART? Improved cryopreservation efficiency of human embryonic stem cells via modified slow freezing protocols Distinct properties in induction of neuronal phenotypes among three hes cell lines Ultrastructural analysis of undifferentiated and differentiated hesc 발표년월일 ( 장소 ) 2004, World Trade Center in Boston, Mass. 2004, World Trade Center in Boston, Mass Philadelphia, USA (Banff) (Banff) (Banff) 국명비고미국포스터미국포스터미국강연캐나다포스터캐나다포스터캐나다포스터

83 구분발표자학술회의명칭발표제목 국내 김희선, 이기주, 안희진, 오선경, 서창석, 김석현, 최영민, 문신용안희진, 김희선, 김윤영, 설혜원, 오선경, 서창석, 김석현, 최영민, 문신용 Oh SK, Kim HS, Ahn HJ, Kim YY, Seol HW, Moon SY Kim YY, Seol HW, Ahn HJ, Cho MS, Kim HS, Oh SK, Moon SY Oh SK Cho MS, Oh SK, Ku SY, Kim HS, Choi YM, Kim JG, Moon SY 김희선, 윤철종, 안희진하성윤, 김윤영, 성기청, 설혜원, 오선경, 김석현, 문신용 Oh SK, Seol HW, Ahn HJ, Kim YY, Kang MJ, Kim HS, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Moon SY Kim JS 대한불임학회 대한불임학회 조직공학회 조직공학회 2003 KRIBB Conference 대한불임학회 대한불임학회 대한불임학회 천연의약연구소심포지엄 인간배아줄기세포의확립과그특성분석 배양액의조성차이에따른인간배아줄기세포의계대배양에관한비교연구 Establishment of Human Embryonic Stem Cell lines cel and difference of Temporal Expression Pattern in embryoid bodies Temporal expression of differentiation markers in embryoid bodies from various human embryonic stem cell lines. Biological and laboratory aspect of human embryonic stem cell Effect of the some neural inducing factors in neural differentiation of human embryonic stem cells 인간배아줄기세포와배아체의전자현미경적연구 Human amniotic fluid cells prolonged expansion culture of human embryonic stem cell Sox10 maintains the multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural differentiation of neural crest stem cells 발표년월일 ( 장소 ) ( 서울 ) ( 서울 ) ( 서울 ) ( 서울 ) ( 생명공학연구원 ) ( 서울 ) ( 서울 ) ( 서울 ) ( 한림대학교 ) 국명한국한국한국한국한국한국한국한국한국 비고포스터포스터구두포스터강연구연포스터포스터강연

84 구분발표자학술회의명칭발표제목 국내 Kim JS Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim DW, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim DW, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim MH, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim DW, Moon SY 박용빈, 설혜원, 김희선, 오선경, 정순간, 문신용하성윤, 오선경, 김희선, 구승엽, 지병철, 서창석, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용 Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim MH, Kim DW, Moon SY Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Kim YY, Kim MH, Kim DW, Moon SY Seol HW, Oh SK, Kim HS, Ko HJ, Lim A, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim JG, Moon SY 한국분자세포생물학회 기초의학회학술대회 한국생화학분자생물학회학술대회 대한불임학회 대한불임학회 대한불임학회 생리학회학술대회 대한기초치의학학술대회 한국뇌신경과학회학술대회 대한의학유전학회 Molecular characterization of neural stem cells of CNS and PNS Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines, Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines 인간배아줄기세포 (SNUhES 3) 의자발적분화에따른내배엽세포유전자의발현 동결보존액의조성에따른인간배아줄기세포의대량동결보존에관한연구 Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines 줄기세포연구의현황및전망 Distinct properties in neural differentiation among human embryonic stem cell lines, SNUhES1, SNUhES2 and SNUhES3 Occurrences of chromosomal abnormalities in prolonged human embryonic stem cell (hesc) cultures 발표년월일 ( 장소 ) ( 강원도 ) 2004, ( 고려대학교, 서 울 ) 2004, (COEX 전시관 ) ( 서울, 한양대 ) ( 서울, 한양대 ) ( 서울, 한양대 ) 2004, ( 경기도 중소기업종합 지원센터 ) ( 서울 ) 2004, 12.1 ( 서울대학교 문화관 ) ( 서울, 삼성서울병원 ) 국명한국한국한국한국한국한국한국한국한국한국 비고강연포스터포스터포스터포스터포스터포스터강연포스터구연

85 구분발표자학술회의명칭발표제목 김희선, 안희진, 김석현, 김수진, 성기청, 강문주, 오선경, 구승엽, 김석현, 최영민, 김정구, 문신용 대한불임학회 포배기배아의내세포괴분리방법에따른인간배아줄기세포의확립 발표년월일 ( 장소 ) ( 서울 ) 국명 한국 비고 구연 권영도, 김윤영, 오선경, 최영민, 김정구, 문신용 대한불임학회 Cellular modification of human embryonic stem cells by Pdx1 protein transduction ( 서울 ) 한국 구연 Oh SK, Seol HW, Kim HS, Ko HJ, Lee LA, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim JG, Moon SY 대한불임학회 Occurrences of chromosomal abnormalities in prolonged human embryonic stem cell (hesc) cultures ( 서울 ) 한국포스터 Doh HM, Kim BM, Oh SK, Ahn HJ, Ku SY, Kim SH, Kim WB, Moon 대한불임학회 Effect of Glucose Concentrations on Human Embryonic Stem Cell Culture ( 서울 ) 한국포스터 국내 김은희, 지애리, 안희진, 오선경, 백선하, 문신용 Park YB, Huh WJ, Seol HW, Kwon HJ, Kim HS, Oh SK, Chung SG, Moon SY Cho MS, Oh SK, Kim HS, Seol HW, 대한불임학회 대한불임학회 Kim YY, Lee L, Kim 대한불임학회 MH, Kim DW, Moon SY Kim YY, Kim HS, Oh SK, Ku SY, Kim SH, Choi YM, Kim JG, Moon SY Kang SM, Cho MS, Oh SK, Kim DW, Moon SY 대한불임학회 대한불임학회 Gamma-Irradiation 과 Mitomycin C 처리된영양세포가인간배아줄기세포배양에미치는영향 Proliferation rate and differentiation potential during extended culture of human embryonic stem cells Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into GABAergic Neurons Differentiation of cardiomyocyte from human embryonic stem cell Efficient Generation of Oligodendrocytes from Human Embryonic Stem Cells ( 서울 ) ( 서울 ) ( 서울 ) ( 서울 ) ( 서울 ) 한국포스터한국포스터한국포스터한국포스터한국포스터