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1 DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 이재환서울산업대학교식품공학과 1. 서론 1.1 연구배경유지의산화는식품에서영양적, 관능적가치의저하를유발하여식품의소비자선호도를감소시키고, 과산화지질을발생시켜세포에손상을미치며이는각종질병의원인이될수있다 2) 3). 유지의산화메커니즘중자동산화는유리라디칼연쇄반응 (free radical chain reaction) 으로개시 (initiation), 전파 (propagation), 종결 (termination) 단계로구분된다. 개시단계에서유지는열, 빛, 물리적, 화학적에너지또는촉매등에의해분자내공유결합을이루고있는수소를잃어각종라디칼을형성하게된다. 전파단계에서는라디칼의연쇄반응에의해 alkoxyl(ro ), peroxyl(roo ), alkyl(ro ) radical 등각종라디칼들이증가하면서다양한산화생성물이생성되고, 종결반응에서는유지유래라디칼들의상호간결합에의해비라디칼화된다 ( 그림 1) 4) 5) CH3 (CH2)3 CH2 CH=CH CH2 CH=CH (CH2)7 COOH Initiation H (Metal, Energy) CH3 (CH2)4 CH CH=CH CH=CH (CH2)7 COOH OH CH3 (CH2)4 CH CH=CH CH=CH (CH2)7 COOH Propagation + O CH3 (CH2)4 CH CH=CH CH=CH (CH2)7 COOH + H H3 (CH2)3 CH2 Termination + C CH=CH CH=CH (CH2)7 COOH H O= - + H CH3 (CH2)4 CH CH=CH CH=CH (CH2)7 COOH CH3 (CH2)3 CH3 Pentane Hydroperoxide Decomposition 그림 1 Mechanisms of autoxidation using linoleic acid for the formation of pentane. 567 이재환.indd 오후 5:19:56

2 유지및유지를다량함유하고있는식품은불포화지방산의포함정도, 산화방지물질의종류및양, 가공공정및저장상태에따라산화안정성이달라지게된다. 유지는상온에서상대적으로긴산화안정도를갖기에가혹한테스트환경을활용하여유지의산화안정성을측정하고이를활용하여식품의유통기간등을설정할수있다. 이러한유지산화도측정에사용되는방법은유지에의해흡수된산소의양, 점도및색도등의물리적수치측정과 peroxides, aldehydes, alcohols, acids, epoxides, ketones, volatiles 등과같은산화생성물의양을직 간접적으로측정하는화학적방법그리고관능적평가등이있다. 측정에사용되는산화지표물질들은산화단계에따라생성, 분해, 증가및감소되기때문에한가지방법만으로유지산화도를정확하게측정하는것은쉽지않으며따라서목적에알맞은여러가지방법을병용해야한다 ( 그림 2) 6) 7) 8) 9). 안정한라디칼인 DPPH 는항산화제로부터전자혹은수소를제공받으면비라디칼로전환되면서흡광도가변화하며, 이원리로 DPPH 법은천연물의수용성혹은유기용매추출물의항산화활성측정법으로널리사용되고있다. 하지만 DPPH 라디칼은전자혹은수소뿐아니라유지에서유래된산화라디칼에의해서도비라디칼형태로전환될수있다 ( 그림 3). Initiation CH3 (CH2)3 CH2 CH=CH CH2 CH=CH (CH2)7 COOH Formation of conjugated dienes Formation of hydroperoxides Decomposition of hydroperoxides H CH3 (CH2)4 CH CH=CH CH=CH (CH2)7 COOH + O2 + H CH3 (CH2)4 CH CH=CH CH=CH (CH2)7 COOH l O l O l H Volatile formations (malonaldehydes, aldehydes, ketones) Formations of carbonyl group compounds CDA value Headspace oxygen depletion Peroxide value TBA value,p-av, Total volatile analysis Polar compound analysis, Weight gain, Total carbonyl compounds 그림 2 Principles and target compounds of lipid oxidation determining methods. 568 이재환.indd 오후 5:19:57

3 DPPH DPPH-H N Absorbance at 517nm N NH O2N NO2 O2N NO2 NO2 Hydrogen atom and Electron N NO2 Radical state : Violet color Non-radical state : Lemon yellow color 그림 3 Principles of DPPH method Pattern Change point Ads. at 517 nm BHT depletion by lipid radical from oxidized oils Concentration of inherent antioxidant Time (hr) 그림 4 Typical absorbance changes of DPPH with thermally oxidized lard containing BHT. 본연구진은최근이러한원리를이용하여 DPPH 법을활용한유지산화측정법을개발하여 SCI 학회지및등재지에보고하였다 10), 11). 새로운 DPPH 법을활용하면유지의초기전자혹은수소공여능, 산화방지물질의소진속도및산화라디칼의생성속도를계산할수있으며, 산화방지물질의소진시점을결정할수있다 ( 그림 4). 하지만 DPPH 법을활용한유지산패측정법은아직보완할부분이연구되어야한다. DPPH 흡광도의변화를유발하는것이유지의 hydroperoxide 에의한것인지혹은다른유지산화생성라디칼에기인한것인지혹은그이외의다른요인에의해유발된것인지에대한연구가필요한실정이다. 1.2 연구의필요성과목적 본연구진은 DPPH 가항산화물질뿐만아니라유지의산화과정에서도비라디칼화되어흡광도 DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 569 이재환.indd 오후 5:19:57

4 R : lipid radicals -R, -OR, -OOR, -OH O2N N N NO2 NO2 + RO : alkoxyl lipid radicals ROO : Peroxyl lipid radicals OH : hydroxyl radicals O2N N N NO2 Hydrogen from RH, NO2 ROH, ROOH or New hydrogen donating compounds from lipid radicals 그림 5 Proposed reaction mechanisms of DPPH with oxidized oils. 가변화한다는점을발견하였지만이러한 DPPH 흡광도의변화요인이유지산화과정중의산화생성물에의해 DPPH 라디칼을비라디칼화시킨다고예측만할뿐, 정확한원인규명은못한실정이다 ( 그림 5). 본연구의목적은 linoleic acid 모델시스템을활용하여유지산화단계에따른 hydroperoxide, conjugated diene, aldehyde 등의변화와 DPPH 흡광도의변화를확인하고 nuclear magnetic resornance(nmr) 을활용하여유지산화과정에의해생성된여러가지라디칼 (alkyl, alkoxyl, peroxyl, hydroxyl radical 및 hydrogen atom) 과 DPPH 와의결합가능성여부를결정하는것이다. 이를활용하여 DPPH 흡광도변화를유발하는주요요인을규명하고기존에널리활용되고있는유지산화측정법과의상관관계를확인함으로써 DPPH 법을활용한유지산화측정법의장점및한계점을과학적으로증명하는것이다. 2. 연구방법 본연구는 linoleic acid 열산화에따른 DPPH 흡광도, CDA value, hydroperoxide, p-av, DPPH-H 의변화및 DPPH 흡광도가변화하는주요산화생성물을분리및동정하는두단계의과정을진행하였다. 먼저첫번째단계에서는 linoleic acid를산소의유입이자유로운상태와, 질소치환을통해산소가제한된상태에서의열산화에따른 DPPH 흡광도, CDA value, hydroperoxide, p-av, DPPH-H 등을측정하여유지산화단계에따른변화들을관찰하였으며, 또한이들간의상관관계를알아보았다. 두번째는열산화된시료를 thin layer chromatography(tlc) 를통하여분획한후 DPPH 용액을도포하여반응하는 spot들을확인하였다. 확인된 TLC spot을분획 채취하여 NMR 분석을통하여 DPPH 와반응하는주요유지산화생성물을확인하고자하였다. 570 이재환.indd 오후 5:19:57

5 Part 1. Linoleic acid 열산화에따른 DPPH 흡광도, CDA value, hydroperoxide, p-av, DPPH-H 의변화및상관관계확인 1. 산소의유입이자유로운상태에서의열산화에따른변화확인 2. 질소치환을통해산소가제한된상태에서의열산화에따른변화비교및확인 Part 2. DPPH 흡광도변화의주요원인물질분리및동정 1. TLC를이용한 linoleic acid의산화생성물분획및 DPPH 와의반응성여부확인 2. DPPH 흡광도주요인추측물질의 NMR 분석 2.1 실험재료및기기시약및재료 Linoleic acid와 DPPH 는 Sigma-Aldrich 사 (St. Louis, MO, USA) 의제품을, acetonitrile 과 methanol 은 HPLC 급의 Fisher Scientific 사 (Fairlawn, NJ, USA) 의제품을사용하였다. Isooctane 은 Junsei chemical 사 (Tokyo, Japan) 의제품을, p-anisidine 은 Kanto chemical 사 (Tokyo, Japan) 의제품을사용하였다. 이밖에 acetic acid, diethyl ether, n-hexane 및 chloroform 등은 Daejung chemical 사 (Seoul, Korea) 의제품을사용하였다. Teflon-coated rubber septa와 aluminium cap은 Supelco 사 (Bellefonte, PA, USA) 의제품을, TLC silica plate(20 20cm) 는 Merck 사 (Darmstadt, Germany) 의제품을사용하였다. 기기및장비본연구에사용된기기와장비로는 convection oven(win science, Seoul, Korea), high performance liquid chromatography(hplc)-uv/vis detector(hitachi, Tokyo, Japan), gas chromatography-thermal conductivity detector(gc-tcd) (Agilent Technology, Palo Alto, CA, USA), UV/Vis spectrophotometer (Model UV-1650PC, Shimadzu, Kyoto, Japne) 및 1 H-NMR은 Mercury 400 MHz/CP-MAS(Varian, Walnut Creek, CA, USA) 을사용하였다. 2.2 실험방법 Linoleic acid의열산화산소의유입이자유로운상태에서의 linoleic acid 열산화에따른변화를알아보기위하여 linoleic acid 700mg 을 10mL vial에분취한후 capping 을하지않은상태로 93 oven에서 0, 5, 10, 20, 40분간열산화시켰다. 보관시간에따른산화를억제하기위하여시료채취즉시분석을실시하였다. 산소가제한된상태에서의 linoleic acid의변화를알아보기위하여 linoleic acid 700mg 을 air-tight vial에분취한후한가지시료군은질소주입을통해 air-tight vial 내의산소농도가 0%(LNH) 가 DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 571 이재환.indd 오후 5:19:57

6 되게하였으며, 대조군은질소치환없이일반대기상태에동일한 20.9% 가함유된상태 (LAH) 로 air-tighting 하였다. 두가지시료군을 93 oven에서각각 0, 10, 30, 60, 120, 180, 270분간열산화시켰으며, 보관시간에따른산화를억제하기위하여시료채취후즉시분석을실시하였고, 모든실험은 3회반복측정하였다. Headspace oxygen 함량측정 (GC-TCD) LAH와 LNH 시료내부의 permanent gas를 air-tight syringe 를이용하여 100µL 를채취하였고 GC- TCD를이용하여산소의농도를측정하였다. GC는 Agilent 7890series 를사용하였으며, 고정상으로는 Restek사의 MS-5A 60/80 packed column(3m length, 2mm ID) 을사용하였다. Injector 와 detector 의온도는 180 이고 oven은 60 를유지하였다. Carrier gas는 helium 을사용하였으며 gas pressure 는 30psi 로유지하였다. Nitrogen 과 oxygen의 peak area 비율을토대로산소농도를산출하였다. DPPH를활용한유지산화측정법 DPPH 는 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 로이는 stable free radical 로서분자내에 free radical 을가지고있다. DPPH 는수용액상태에서보라색이지만, 전자 (electron) 나 radical에의해 scavenging 되면담황색으로변하게된다. 이때감소하는자색의수치를 UV/Vis-spectrophotometer 를이용하여 509 nm에서측정할수있다. 본연구진은식용유지에서 DPPH 를이용한산화측정방법을고안하여보고하였으며, 본연구에서는이를약간변형하여사용하였다. 열산화된시료 50mg 을 5mL의 DPPH(95% isooctane) 에첨가하여암실에서 30분간정치시킨후, UV/Vis spectrophotometer 를이용하여 509nm 에서의흡광도를측정하였다. Conjugated dienoic acid(cda) value CDA는 conjugated dienoic acid의약자로이는공액형태 (conjugated type) 로결합된산을말한다. 일반적으로자연계의지방산에 2개이상의이중결합이 1,4-Penta-di-en 은비공액형을이루고있는데 1,4-penta-di-en 의 3번탄소와결합한수소는다른위치의수소에비해해리에너지가낮기때문에수소를잃고 radical 이되기쉽다. 1,4-penta-di-en 의 3번수소가해리되어, 1번또는 4번에위치해있는이중결합이 2번또는 3번에위치하게되며이구조를공액형이라고한다. 이공액형구조는 UV/Vis-spectrophotometer 를이용하여측정할수있는데 conjugation 이중결합은 233nm 에서높은흡광도를나타낸다 ( 그림 6). 572 이재환.indd 오후 5:19:57

7 O OH linoleic acid C18:2 (non-conjugated dienoic acid) O OH initiation stage of oxidation a. b. O a. b. OH O oxidized linoleic acid (conjugated dienoic acid) OH 그림 6 Mechanism of conjugated dienoic acid method. 본연구에사용된 CDA법은 American oil chemists society(aocs) 법 Ti-la-64 14) 에의거하여측정하였다. 시료 100mg 을 25mL 의 isooctane 에정용하고이를다시 isooctane 으로 10배 (v/v) 희석한후 UV/Vis spectrophotometer 로 233nm 에서흡광도를측정하였다. 흡광도는다음식에의해 CDA value로환산하였다. CDA value (%) = 0.84 A 233 bc-k 0 K 0 : acid 의흡광도계수 (0.03), A 233 nm 에서의흡광도 b: cell 의길이 (cm), c: L 당시료의무게 (g) p-anisidine value(p-av) 측정 2-Alkenal과 2,4-alkadienal 은이중결합을가지고있는지방산의산화과정중에 radical의발생과에너지준위에의해서 radical 주위의결합이끊어지면서발생하는물질이다 ( 그림 7). 이 aldehyde 류의물질은 acetic acid 존재하에 p-anisidine 과반응하여황색색소를생성하는데이를 UV/Visspectrophotometer 를이용하여 350nm 에서측정할수있다. Aldehyde 가이중결합을가지고있으면 250nm 에서의흡광도가증가하므로 anisidine 값은주로 2-alkenal 양의추정치가된다. DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 573 이재환.indd 오후 5:19:58

8 b. O O OH b. O O 2,4-decadienal(2,4-alkenal) 그림 7 Mechanism of p-anisidine value method. OH oxidized fatty acid and new compounds (p-anisidine value) 본연구에사용된 p-av 측정법은 AOCS법 Cd ) 에의해측정하였다. 시료 100mg 을 25mL 의 isooctane 에정용하고, UV/Vis spectrophotometer 로 350nm 에서흡광도를측정하였다. 이용액 2.5mL 에 0.25%(w/v) p-anisidine 용액 0.5mL 를혼합하고 15분간반응시킨후, 동일파장에서흡광도를측정하고다음식에의해 p-av를계산하였다. p-anisidine value(%) = 25 (1.2As-Ab) W As: anisidine 시약과반응한후의시료용액의흡광도 Ab: anisidine 시약과반응하기전의시료용액의흡광도 W: 시료무게 (g) HPLC-UV 를이용한 hydroperoxides 분석산화에의해생성된 linoleic acid의 hydroperoxide는 HPLC-UV로분석하였다 13). 고정상으로는 LiChrosorb C 18 reverse phase( mm, 5µm)(Merck) column과 Novapak C 18 stationary phase guard column 그리고 Vydac(Hesperia, CA, USA) 0.5µm pre-column filter을사용하였다. 이동상은 acetonitrile, water 및 acetic acid를 60:40:0.12(v/v) 로혼합된용매를사용하였으며, 이때유속은 1.5 ml/min 이었고, 주입량은 10µL 이었다. 분석파장은 234nm 이었으며, column oven 온도는 30 로유지해주며분석하였다. DPPH-H 의측정 DPPH 라디칼을비라디칼형태인 DPPH-H 의형태로전환시켜흡광도를감소시키는것으로잘알려진수소공여능이뛰어난 α-tocopherol, sesamol, BHA, TBHQ 를활용한선행실험결과농도의존적으로즉, 더많은 DPPH-H 를생성할수록 324와 509nm 에서의흡광도비는증가하는것을확인하였다. 이는 324와 509nm 에서의흡광도비는 DPPH-H 의생성및변화를간접적으로나타 574 이재환.indd 오후 5:19:58

9 내는지표로간주할수있다. 따라서열산화된 linoleic acid 를 200~600nm 에서의 scanning 을통하 여 324 와 509nm 의흡광도비를산출함으로써 DPPH-H 의변화를확인하였다. TLC를이용한산화생성물분획시료 2µL를취하여 TLC silica plate 에전개시켰으며, n-hexane, diethyl ether 및 acetic acid를 50:50:1(v/ v) 의비율로혼합된전개용매를사용하였다. 전개가완료된 TLC plate는 dry oven을이용하여건조시킨후, 자외선조사를통해산화생성물의특징적인분획물 (spot) 들을확인하였다. DPPH 분무 (spray) 를통한반응분획물 (spot) 확인 TLC를통해분획된 linoleic acid의산화생성물과 DPPH의반응성을확인하기위하여분획된 TLC plate에 1mM의 DPPH 용액을분무 (spray) 한후암실에서 30분간반응시켰다. 이때 DPPH 와반응하는분획물은노란색으로탈색되게되며, 이를통하여 DPPH 와반응할수있는산화생성물을확인하였다. 또한 DPPH 와반응하는분획부분을채취하여 chloroform 으로 24시간동안암실에서추출한후질소농축하여 NMR 및분광광도법측정에사용하였다. 1 H-NMR 분석 1 H-NMR 분석은 Mercury 400 MHz/CP-MAS(Varian, Walnut Creek, CA, USA) 를사용하였다. 분석용매는내부표준물질로 tetramethylsilane(tms, d=0) 을함유한 deuterium chloroform(cdcl 3 ) 을사용하였다. Statistical analysis 측정된결과는 SPSS program(spss Inc., Chicago, IL, USA) 을이용하여분산분석한후유의적차이가있을경우다중비교분석법인 Duncan s multiple range test를이용하여 p<0.05 유의수준에서비교하였다. DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 575 이재환.indd 오후 5:19:58

10 Absorbance at 509nm 3. 결과및고찰 3.1 Linoleic acid 열산화에따른 DPPH 흡광도, CDA value, hydroperoxide, p-av, DPPH-H 변화및상관관계확인 산소의유입이자유로운상태에서의열산화에따른변화 1) DPPH 흡광도변화열산화된 linoleic acid의 DPPH 흡광도변화는그림 8에나타내었다. Linoleic acid의산화시간이 0, 5, 10, 20, 40분으로증가할수록 DPPH 흡광도값은 0.941, 0.795, 0.627, 0.154, 로유의적으로감소하였다 (p<0.05). 이는 linoleic acid의산화가진행됨에따라 DPPH 라디칼을비라디칼로전환시킬수있는물질이지속적으로생성및증가되고있음을의미한다 Time(min) 그림 8 Changes of DPPH absorbance in thermally oxidized linoleic acid at 93 for 40 min. 2) Hydroperoxides 변화 Linoleic acid를 93 에서 40분간산화시킨시료의 hydroperoxides 를분석한 chromatograms 는그림 9에나타내었다. 이중결합을 2개가지고있는 linoleic acid는산화에의해주로 13-hydroperoxy- 9-cis-11-trans-octadecadienoic, 13-hydroperoxy-9-trans-11-trans-octadecadienoic, 9-hydroperoxy 이재환.indd 오후 5:19:58

11 trans-12-cis-octadecadienoic, 9-hydroperoxy-10-trans-12-trans-octadecadienoic 와같은네가지형태의 hydroperoxide 이성체 ( 그림 10) 가생성되며 13), 본 HPLC 조건에의해서의해서도네가지 peak 가검출되었다 ( 그림 9). 이때네가지 hydroperoxide peak 면적의합은그림 11 에나타내었으며, 0분의 mau에비해 40분간열산화시 mau로약 11.8 배유의적으로증가하였다 (p<0.05) (a) mau (b) mau (c) mau 그림 9 HPLC chromatograms of hydroperoxides in thermally oxidized linoleic acid. (a): 0 min, (b): 20 min, (c): 40 min. DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 577 이재환.indd 오후 5:19:58

12 Total peak areas of hydroperoxides (mau time, 10 6 ) (a) 13-hydroperoxy-9-cis-11-trans-octadecadienoic H3C (b) 13-hydroperoxy-9-trans-11-trans-octadecadienoic OOH H3C COOH OOH COOH (c) 9-hydroperoxy-10-trans-12-cis-octadecadienoic (d) 9-hydroperoxy-10-trans-12-trans-octadecadienoic OOH COOH H3C HOO COOH CH3 그림 10 Structures of hydroperoxide isomers Time(min) 그림 11 Changes of hydroperoxides in thermally oxidized linoleic acid at 93 for 40 min. 3) CDA value 및 p-av 변화열산화된 linoleic acid의 CDA value, p-av는표 1에나타내었다. Non-conjugated type의 diene 구조에서생성되는 1차산화생성물을측정하는방법인 CDA value는 0분의 0.28% 에서 40분열산화시 1.01% 로약 3.6 배증가하였으며, 2차산화생성물인 aldehydes 를측정하는 p-av의경우 9.74 에서 로약 2.0 배유의적으로증가하였다 (p<0.05). 즉 linoleic acid 내공유결합을이루고있던 11 번 578 이재환.indd 오후 5:19:59

13 표 1 Changes of CDA value and p-av in thermally oxidized linoleic acid at 93 for 40min 0min 5min 10min 20min 40min CDA value 0.28±0.01a 0.45±0.02b 0.53±0.02c 0.76±0.06d 1.01±0.08e p-av 9.74±0.76a 10.00±2.43b 13.75±0.79c 15.75±1.05d 19.54±2.58e 위치의수소가외부의열에너지에의해떨어져나가 alkoxy 라디칼 (RO ) 이생성되며, 전자의이동으로인해 non-conjugated diene 형태가생성된다. 이에따라공액이중산가를나타내는 CDA value 는증가하게되며, 주변의산소와결합하여생성된 peroxy 라디칼 (ROO ) 은주변의다른 linoleic acid로부터 hydroperoxide(rooh) 를생성시킨다. 산화가진행됨에따라 hydropeorxide는분해되어 2차산화생성물인 aldehyde 류가생성되며, 이에따라 p-av는증가하게된다. 4) DPPH-H 의변화일반적으로 DPPH법은 DPPH 라디칼의소거능측정을통해천연물질의수용성혹은유기용매추출물의항상화지표로서널리사용되고있다. 특히 DPPH 라디칼소거능을가진물질들은 DPPH 라디칼을비라디칼인 DPPH-H 형태로전환시켜흡광도를감소시키는것으로알려져있다. 하지만상기연구결과 ( 그림 8) 와같이유지산화생성물에의해서도 DPPH 라디칼은비라디칼화되어흡광도를감소시키지만대표적인비라디칼형태인 DPPH-H 의생성및증가여부는확인되지않았다. 따라서 DPPH 라디칼을비라디칼형태인 DPPH-H 로변환시켜흡광도값을감소시키는것으로잘알려진수소공여능이뛰어난 α-tocopherol, sesamol, BHA, TBHQ 등과같은항산화물질을이용하여 324와 509nm 에서의흡광도비를산출하여보았으며, 그에따른결과는그림 12에나타내었다. 라디칼소거물질인 α-tocopherol 이존재하지않을때에는약 1.3~1.6 의흡광도비를나타내며, 약 1mM이첨가될시에는약 2.36 으로약 1.77 배유의적으로증가하였다 (p<0.05). 따라서 α-tocopherol 로부터수소를제공받은 DPPH 라디칼은 DPPH-H 형태의비라디칼로전환되고, 이에따라 509nm 에서의흡광도값은감소하게되며 DPPH-H 를간접적으로나타내줄수있는 324/509nm 의흡광도비는증가하게된다. 상기결과를토대로열산화시킨 linoleic acid와 DPPH를반응시킨후 UV-Vis spectrophotometer 를이용하여 200에서 600nm의범위를 scanning 한결과는그림 13에나타내었으며, 산화시간에따른 324와 509nm 에서의 DPPH 흡광도비는그림 14에나타내었다. 선행연구와마찬가지로산화가진행되지않은 0분의시료는 의흡광도비를나타내었으며, 산화가진행될수록흡광도비는 1.654, 2.102, 5.160, 로유의적인증가를보였다 (p<0.05). 이는 linoleic acid 산화생성물에의해 DPPH 라디칼이 DPPH-H 형태의비라디칼화되고, 이에따라 DPPH 흡광도값은감소하며 ( 그림 8), 324와 509nm 에서의흡광도비는증가하게된다. 즉, linoleic acid 산화에의해생성된산화생성물은 DPPH 라디칼에수소를제공 DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 579 이재환.indd 오후 5:19:59

14 Abs. Ratio of DPPH absorbance at 324/509 nm Abs. 해줌으로써 DPPH-H 를생성케하며이는 DPPH 흡광도감소와 324/509nm 에서의흡광도비를 증가하게하는것으로고려된다 α-tocopherol Sesamol BHA TBHQ without antioxidant Concentration(mM) 그림 12 Changes of ratio of DPPH absorbance at 324/509 nm in the mixture of DPPH and α-tocopherol, sesamol, BHA, TBHQ, or without antioxidant (a) (b) nm nm 그림 13 UV/Vis spectrophotograms of linoleic acid (a) and thermally oxidized linoleic acid (b). 580 이재환.indd 오후 5:19:59

15 Ratio of DPPH absorbance at 324 and 509 nm Time(min) 그림 14 Changes of ratio of DPPH absorbance at 324/509 nm in thermally oxidized linoleic acid at 93 for 40 min. 5) DPPH 흡광도변화와유지산화지표들간의상관관계 Linoleic acid의열산화에따른 DPPH 흡광도변화와 CDA value, p-av, hydroperoxide 및 DPPH-H의상관관계를알아보기위하여시간대별로회귀분석한결과는표 2에나타내었다. p-av를제외한 CDA value, hydroperoxides 및 324와 509nm에서의 DPPH 흡광도비는 0.92 이상의높은 r 2 를보여높은상관관계를나타냄을알수있었다. 전체적으로 0~10 분사이보다는 0~20분사이에서높은상관관계를보였으며 CDA value, hydroperoxides, p-av 및 324 와 509nm에서의 DPPH 흡광도비와의상관계수 (r 2 ) 는 0.932, 0.996, 및 0.920이었다. 이는 DPPH 흡광도변화는 hydroperoxides와가장높은상관성을나타내며, p-av가가장낮음을의미한다. 0~40 분구간에서는 CDA value와의상관성이가장높았으며, 기타다른 parameter 와의관계는감소하였다. 특히 40분의 DPPH 흡광도값은 20분간의흡광도변화를고려하면상대적으로너무낮게변화하여 0~20 분간의지표가더욱정확한것으로고려된다. 본연구의첫번째소주제인산소의유입이자유로운상태에서의열산화에따른변화를알아보기위하여 linoleic acid를 93 에서 0, 5, 10, 20, 40분간열산화시킨결과 DPPH 흡광도는산화시간이증가함에따라감소하며, 이때 CDA value, hydroperoxides, p-av 등의일반적으로널리사용되고있는유지산화지표들역시증가하였다. 또한 DPPH-H 의생성및증가를간접적 DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 581 이재환.indd 오후 5:20:00

16 표 2 Correlation of DPPH absorbance with CDA value, peak areas of hydroperoxides, p-av, and absorbance ratio of 324/509 nm Lipid oxidation methods 0~10 min 0~20 min 0~40 min r 2 r 2 r 2 CDA value p-av Total peak areas of hydroperoxides Ratio of absorbance at 324 and 509 nm 으로나타내줄수있는 324와 509nm 에서의 DPPH 흡광도비는증가하여 linoleic acid 산화에의한생성물에의해 DPPH-H 가생성및증가함을확인하였다. 특히여러유지산화측정지표중 hydroperoxide 와의상관성이높은것으로판단되며, 이는산화생성물인 hydroperoxide 혹은 hydroperoxide 형성전 후에생성되는물질에의해 DPPH 가비라디칼화되는것으로생각된다. 질소치환을통해산소가제한된상태에서의열산화에따른변화첫번째연구결과는시료가담긴 vial의뚜껑을개방된상태에서산화를진행하였기때문에산소가지속적으로제공되는상태였다. 이에두번째연구에서는질소치환을통해산소가존재하지않는조건 (LNH) 과 air tighting 을하였지만대기중의산소농도와동일한조건 (LAH) 의두가지조건에서산화를진행하였으며, 첫번째연구와동일한유지산화지표들을측정하였다. 1) Headspace oxygen 함량변화먼저 LNH와 LAH의 0, 10, 30, 60, 120, 180, 270분간산화시킨 linoleic acid의 headspace 의산소농도변화는그림 15에나타내었다. LNH의경우질소치환을통해산소를제거한상태이기때문에산화가진행되어도산소의농도가 0% 로유지되었다. LAH의경우최초 0분의 % 에서산화시간이 10, 30, 60, 120, 180, 270분으로증가함에따라 , , , 9.436, 7.362, 7.260% 로유의적으로감소하였다 (p<0.05). 이는산화가진행됨에따라생성된 alkyl (R ) 라디칼이주변의산소분자와결합함으로인해 headspace 의산소가소진되어감소함을의미한다. 2) DPPH 흡광도변화 LAH와 LNH의 93 열산화에따른 DPPH 흡광도변화는그림 16에나타내었다. LAH의경우 0, 10, 30, 60, 120, 180, 270분으로산화시간이증가함에따라 DPPH 흡광도는 0.111, 0.073, 0.069, 0.068, 0.082, 0.088, 을나타내었다. Control 인 0분시료의 DPPH 흡광도가 을나타내었 582 이재환.indd 오후 5:20:00

17 Headspace oxygen concentration(%) 20.0 LNH LAH Time(min) 그림 15 Changes of headspace oxygen contents in thermally oxidized linoleic acid with or without nitrogen flushing. 는데이는첫번째실험에서 0분시료의흡광도가 를나타내었던것으로미루어보아 pure한 linoleic acid를구매하여사용했음에도이미어느정도산화가진행된상태였음을예측해볼수있다. LNH의경우산화시간이증가함에따라흡광도값은 0.111, 0.065, 0.074, 0.068, 0.533, 0.733, 을나타내었는데특히 60분이후에는유의적인증가를나타내었다 (p<0.05). 이는산화가진행된상태의 linoleic acid를사용하였기때문에이미생성되어있던산화생성물에의해 DPPH 라디칼이비라디칼화되어 DPPH 흡광도값이감소한것으로예측해볼수있다. 하지만 60분이후에는 DPPH 흡광도값을감소시키는원인물질의분해속도가생성속도보다높아짐에따라혹은더이상의생성은없이분해가진행됨에따라 DPPH 흡광도값은증가하는것으로판단된다. 즉 DPPH 흡광도의변화원인물질은산화과정중산소에의해생성된산화생성물로부터기인하는것으로생각되며, 본결과와같이산소가제한된상태에서는생성되지않거나생성보다는분해가현저히빠르게일어난다는것을알수있었다. 3) Hydroperoxides 변화 LAH와 LNH의열산화에따른 hydroperoxides의변화는그림 17에나타내었다. 이때 hydroperoxides 는 HPLC 분석시검출되는네가지 peak들의면적의합으로나타내었다. LAH의경우산화시간이 0, 10, 30, 60, 120, 180, 270분으로증가함에따라 hydroperoxides 의면적은 0.34, DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 583 이재환.indd 오후 5:20:00

18 DPPH absorbance at 509 nm LNH LAH Time(min) 그림 16 Effects of nitrogen flushing on the changes of DPPH absorbance during thermal oxidation of linoleic acid at 93 for 270 min. 0.66, 0.93, 1.26, 1.26, 1.10, 0.72 mau( 10 6 ) 를나타내었다. 산화초기에는 hydroperoxides 의생성속도가분해속도보다빠르기때문에전체양은증가하다가 120분이후에는분해속도가생성속도보다빠르기때문에 hydroperoxide 의양은감소하게된다. 반면에 LNH의경우산화시간에따라 hydroperoxide 의양은 0.34, 0.37, 0.27, 0.21, 0.13, 0.11, 0.09 mau( 10 6 ) 를나타내었다. 즉산소가제한된상태에서는 peroxy radical(roo ) 을생성시킬수있는산소 (O 2 ) 가존재하지않기때문에 hydroperoxide 는생성되지않으며, 분해만이일어난다는것을알수가있다. 4) CDA value 및 p-av 변화 LAH와 LNH의열산화에따른 CDA value 변화는그림 18에나타내었다. LAH의경우선행연구와같이 0, 10, 30, 60, 120, 180, 270분으로산화가진행됨에따라생성되는 conjugated dienoic acid 의증가에따라 CDA value가 0.420, 0.738, 1.068, 1.594, 1.925, 2.314, 로유의적으로증가하였다 (p<0.05). LNH의경우산화시간이증가함에따라 CDA value가 0.420, 0.518, 0.418, 0.488, 0.446, 0.462, 을나타내어유의적인증가를확인할수없었다 (p>0.05). 이는산소가존재하지않는상태에서는최초개시단계에의해생성된 alkyl radical(ro ) 의전자이동이제한되어 conjugate 형태를생성하지못하는것으로판단된다. 584 이재환.indd 오후 5:20:00

19 Conjugated dienoic acid value (%) Total peak areas of hydroperoxides (mau, 10 6 ) LNH LAH Time(min) 그림 17 Peak areas of hydroperoxides in thermally oxidized linoleic acid with or without nitrogen flushing at 93 for 270 min LNH LAH Time(min) 그림 18 Changes of CDA value in thermally oxidized linoleic acid with or without nitrogen flushing. DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 585 이재환.indd 오후 5:20:01

20 p-anisidine value LNH LAH Time(min) 그림 19 Changes of p-av in thermally oxidized linoleic acid with or without nitrogen flushing. LAH와 LNH의열산화에따른 p-av의결과는그림 19에나타내었다. p-av는 2차산화생성물인 aldehydes 를측정할수있는방법으로 LAH의경우산화시간이증가함에따라 9.000, , , , , , 으로 180 분까지는유의적인증가를나타내었다 (p<0.05). LNH 도산화시간이증가함에따라 9.000, , , , , , 로증가하였다. LNH의경우그림 17의결과와같이산소가존재하지않기때문에 hydroperoxide 가생성되지않지만이미생성되어있던 hydroperoxide 가분해됨에따라 LNH의 p-av가증가하는것으로판단된다. 5) DPPH-H 변화 LAH와 LNH의열산화에따른 324와 509nm 에서의 DPPH 흡광도비는그림 20에나타내었다. LAH의 324와 509nm 의 DPPH 흡광도비는 30분의 까지증가하다가그이후에는감소하기시작하여 270분에는 DPPH 흡광도비가 6.79 까지감소하게된다. LNH의 DPPH 흡광도비는 10 분의 까지증가하다가그이후감소하기시작하여 120 분에 2.02 를나타낸후 270분까지주로 1.5~1.6 사이의 DPPH 흡광도비를나타내었다. LNH의경우 509nm 에서의 DPPH 흡광도값과 324와 509nm 에서의 DPPH 흡광도비로미루어보아산화과정중 DPPH 라디칼을소거할수있는물질이생성되었으며, 이는 DPPH-H 의생성과밀접한관계가있다는것을생각해볼수있다. 특히 LNH의산화시간이 120 분에서 270분까지증가할때 509nm 에서의 DPPH 흡광도값은 이재환.indd 오후 5:20:01

21 Ratio of DPPH absorbance at 324/509 nm LNH LAH Time(min) 그림 20 Changes of DPPH absorbance ratio 324 nm to 509 nm in linoleic acid with or without nitrogen treated with thermal oxidation at 93 for 280 min. 에서 로급격히증가하는데이때의 DPPH 흡광도비역시 에서 로급격히감소하게된다. 이를통해산화에의해생성된물질이 DPPH 에수소를공여해줌으로써 DPPH 라디칼은비라디칼화되며, 이로인해 DPPH 흡광도값은감소하게되며, DPPH-H 를간접적으로나타내어주는 324와 509nm 에서의흡광도비는증가하는것으로판단된다. 6) DPPH 흡광도변화와유지산화지표들간의상관관계 DPPH 흡광도와다른유지산화측정지표들간의상관관계 (r 2 ) 는표 3에나타내었다. LAH와 LNH의 270분간열산화시 DPPH 흡광도와가장높은상관관계를나타내는지표는 324와 509 nm에서의 DPPH 흡광도비로써각각 0.94 와 0.86 을나타내었다. 또한 180 분간열산화시에도 DPPH 흡광도와가장높은상관관계를나타내는지표는 324와 509nm 에서의흡광도비였다. LAH의열산화에의한 DPPH 흡광도변화에있어 hydropeorxide는유의적인상관성이상대적으로낮은것으로판단된다. LAH와 LNH 모두 DPPH 흡광도와 DPPH 흡광도비가높은상관관계를나타내었는데이는 free radical 소거물질의생성으로인해 DPPH-H 가생성되는것으로고려된다. 두가지지표인 DPPH 흡광도와 DPPH 흡광도비의변화를통해산화가진행됨에따라 free radical 을소거할수있는물질이생성되어 DPPH 라디칼을 DPPH-H 로전환시키는것으로생각해볼수있다. DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 587 이재환.indd 오후 5:20:01

22 표 3 Coefficient of determination(r 2 ) among DPPH absorbance, CDA, peak areas of hydroperoxides, p-av, and DPPH absorbance ratio of 324nm/509nm in thermally oxidized linoleic acid with or without nitrogen flushing DPPH CDA p-av Hydropeorxide Ratio of 324/509nm DPPH CDA value LAH 0~270 min p-av Hydroperoxides Ratio of 324/509 nm 1.00 DPPH CDA value LNH 0~270 min p-av Hydroperoxides Ratio of 324/509 nm 1.00 DPPH CDA value LAH 0~180 min p-av Hydroperoxides Ratio of 324/509 nm 1.00 DPPH CDA value LNH 0~180 min p-av Hydroperoxides Ratio of 324/509 nm 이재환.indd 오후 5:20:01

23 3.2 DPPH 흡광도변화의주요원인물질분리및동정 TLC 분리를통한 DPPH와 linoleic acid 산화생성물의주요반응물확인 Linoleic acid를 93 에서 40분간산화시킨시료를 silica TLC plate를이용하여분획한후 1mM 의 DPPH solution 을도포한후 30분간암실에서반응시킨후의사진은그림 21에나타내었다. DPPH 는라디칼상태에서는보라색혹은자색을띠다가전자나수소공여능을가지고있는물질에의해비라디칼화되면노란색으로탈색된다. 산화된 linoleic acid를 TLC 분획시특징적인 4~5 가지의 spot을확인할수있었다. 분획된산화생성물의 spot들과 DPPH 반응시 (b) spot이가장많이탈색되며이는 DPPH 라디칼을비라디칼화시켜흡광도를변화시키는주요원인물질로예측되었다. 특징적인네가지 spot의동정을위하여먼저 hydroperoxides 의 HPLC 분석조건으로분석을실시하였다. Linoleic acid를 40분간 93 에서열산화시킨시료의 hydroperoxides HPLC 분석 chromatogram 과네가지산화생성분획물의 HPLC chromatogram 은각각그림 22, 23에나타내었다. Linoleic acid를 40분간열산화시킨시료의 hydroperoxide 분석결과 8.367, 8.623, 분에서세가지 unknwon peak이검출되었으며, 9.390, 9.690, , 분에네가지 hydroperixde 이성체가검출되었다. 네가지산화생성물의분획을채취하여 chloroform 을이용하여회수한후, 질소농축하여상기의 hydroperoxide 분석조건과동일하게분석한결과 (a) spot에서 hydroperoxides 가검출되었으며, (c) 에서는앞서 unknwon peak으로추정하였던물질들이검출되었다. 또한 (b) 와 (d) spot에서특정적인 peak은확인할수없었다. 이를통해 93 에서 40분간열산화시킨 linoleic (a) (b) (c) (d) 그림 21 TLC chromatograms of oxidized linoleic acid spots in the box were oxidized compounds which can react with DPPH. DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 589 이재환.indd 오후 5:20:02

24 acid의네가지주요산화생성물중 Rf값이가장큰 (a) spot은 hydroperoxides 였으며, (c) 는아직동정되지않은미지의산화생성물임을확인할수있었다. DPPH 흡광도를변화시키는것으로주원인물질로고려되는 (b) spot은상기 HPLC 조건에서는검출되지않았으며, 이로미루어보아 hydroperoxides 는 DPPH 흡광도를변화시키는주원인물질은아님을알수있었다. 500 UV Linoleic acid 40min Retention Time Area mau 그림 22 HPLC chromatogram of oxidized linoleic acid for 40 min. (1): unknown, (2): unknown, (3): unknown, (4): 13-HPODE(9c, 11t), (5): 13-HPODE(9t, 11t), (6): 9-HPODE(10t, 12c), (7): 9-HPODE(10t, 12t). 500 UV Linoleic acid-1 Retention Time Area (a) 500 UV Linoleic acid-2 Retention Time Area (b) mau mau (c) 500 (d) mau mau UV Linoleic acid-3 Retention Time Area UV Linoleic acid-4 Retention Time Area 그림 23 HPLC chromatograms of recoverd spots from TLC results. 590 이재환.indd 오후 5:20:03

25 Abs UV/Vis scannig을통한 DPPH와반응하는주요산화생성물의분석 Linoleic acid에서분획된네가지산화생성물중 DPPH 의흡광도를변화시키는주원인물질로생각되는 (b) spot 을 UV/Vis spectrophotometer 를이용하여 200~700nm 범위를 scanning 한결과는그림 24에나타내었다. 상기물질의구조는 277nm 파장을흡수할수있는구조를가지고있는것으로고려된다 No P/V Wavelength n Abs (b) (a) nm 그림 24 UV/Vis spectrophotogram of spot (b). (a): solvent(isooctane), (b): sample DPPH와반응하는주요산화생성물의 1 H-NMR 분석 Linoleic acid에서분획된네가지주요산화생성물중 DPPH 흡광도를변화시키는주요원인물질은 hydroperoxides 는아님을확인하였으며, 주원인물질로고려되는 (b) spot의구조동정을위하여 1 H-NMR 분석을실시하였다. 먼저대조군으로사용하기위하여산화가진행되지않은 linoleic acid를 1 H-NMR 과 COSY 분석한결과는그림 25, 26에나타내었다. 또한 linoleic acid의산화생성분획물중 DPPH 흡광도를변화시키는주원인물질이라생각되는 (b) 분획물의 NMR 분석결 DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 591 이재환.indd 오후 5:20:03

26 과산화가진행되지않은 linoleic acid 의 NMR spectrum 과는다른경향의결과를얻을수있었다. 하지만분획된산화생성물의농도가낮아정확한구조동정은불가하였으며, 현재더많은양의 산화생성물을분획하기위하여연구수행중에있다 ppm 그림 25 1 H-NMR spectrum of linoleic acid. F2 (ppm) F1 (ppm) 그림 26 2D 1 H-NMR spectrum of linoleic acid. 592 이재환.indd 오후 5:20:03

27 Linoleic acid의 C11 위치의수소는 C8과 C14 의 75 Kcal/mol 과 C18 과수소사이의약 100Kcal/ mol에비해비교적낮은결합에너지 (50 Kcal/mol) 를가지고있어물리 화학적요인에의해쉽게떨어져나갈수있다 16). Linoleic acid의 C11 위치에라디칼이생성되므로 C9와 C13 의전자들은공액형 (conjugate) 으로재배열되게된다. 삼중항산소는 C9와 C13 위치에생성된라디칼과결합하여 peroxy radical(roo ) 을생성하게되며, 주변의다른 linoleic acid로부터수소를빼앗아와 hydroperoxide(rooh) 를생성하게된다. 이렇게생성된 hydroperoxide 는결합에너지에의해 peroxy radical(roo ) 과 hydrogen atom으로분해되기보다는 alkoxy radical(ro ) 과 hydroxy radical(oh ) 을형성하게된다 2), 17). 본연구진은산화에의해생성된 peroxy(roo ), alkoxy(ro ), alkyl(r ) 및 hydroxy ( OH) 등의유지산화라디칼이 DPPH 라디칼과직접적으로결합하는것으로생각하였다 11). 하지만상대적으로크기가큰 peroxy(roo ), alkoxy(ro ), alkyl(r ) 들은 DPPH 라디칼에쉽게접근하여반응하기는힘들것으로고려된다. 본연구결과 Linoleic acid 열산화에의해수소를제공하여 DPPH 라디칼을소거할수있는물질이생성된다. 또한상기의산화생성물은 509nm 에서의 DPPH 흡광도를감소시키며, 324와 509nm 에서의 DPPH 흡광도비를증가시킨다. 이를통해 DPPH-H 의존재를확인할수있었으며, 산화기간동안지속적으로 DPPH 라디칼을소거할수있는물질이생성됨을확인하였다. 또한 hydorperoxide 와 CDA value는산소의유입이자유로운조건에서는높은상관관계를가지지만, 질소치환을통해산소가존재하지않는조건에서는낮은상관관계를나타내었다. 따라서 hydroperoxides 와 conjugated diene 은 DPPH 라디칼소거를통해 DPPH-H 를생성시킬수있는주요산화생성물이아닐것으로판단되며, 이는 TLC 분획물들의 HPLC 분석을통해서도확인되었다. DPPH 흡광도를변화시키는주원인물질의구조동정을위하여산화생성물을분획 채취하여 NMR 분석을수행하였지만저농도의문제로정확한동정을할수없었다. 이에본연구진은상기원인물질을고농도로채취한후 NMR, IR, LC/MS 등의추후연구를지속적으로진행할예정이다. Headspace oxygen 농도변화, hydroperoxides, CDA value 및 p-av 등의일반적인유지산화측정지표들로는유지산화의연쇄반응 (chain reaction) 을충분히설명하기가어렵다. 그러나 DPPH 법은 509nm 에서의흡광도와 324와 509nm 에서의흡광도비라는두가지지표를제공해줌으로써유용하고효율적으로유지산화에의한변화를관찰할수있는새로운측정법이라사료된다. DPPH 를활용한유지산화의실시간측정법개발 : HPLC 와 NMR 분석을이용한 DPPH 와유지산화물간의반응성연구 593 이재환.indd 오후 5:20:03

28 4. 요약 본연구진에서는 DPPH 의흡광도가유지산화과정중에변화한다는사실을이용하여새로운유지산화측정법을고안하였다. 하지만유지산화에의해 DPPH 흡광도가변화한다는경향만확인하였을뿐정확한원인규명은이루어지지않은실정이다. 이에본연구에서는 linoleic acid model system을활용하여 DPPH 흡광도를변화시키는원인물질을규명하고자하였다. Linoleic acid를 93 에서산소의유입이자유로운상태와질소치환을통해산소가제한된상태 (LNH) 에서열산화시킨후 DPPH 흡광도변화를관찰하였고일반적으로널리사용되고있는 CDA 법, p-av법, HPLC 를활용한 hydroperixdes 분석을통하여 DPPH 흡광도와유지산화지표들간의상관성을확인하여보았다. 특히 324와 509nm 에서의 DPPH 흡광도비를통해 DPPH-H 의생성및증감여부를확인하여보았다. 또한 DPPH 흡광도변화원인물질을규명하기위하여 TLC 를이용하여산화생성물들을분획하였으며, DPPH 분무 (spray) 를통해반응성여부를확인하였다. 상기결과 DPPH 와주로반응하는것으로고려되는산화생성분획물을채취하여 UV/Vis scnning 과 NMR을이용하여원인물질의구조를동정하고자하였다. 선행연구결과와동일하게 linoleic acid가산화됨에따라 DPPH 흡광도는감소하였으며, DPPH-H 를간접적나타내어주는 324와 509nm 에서의 DPPH 흡광도비는증가하였다. 또한 CDA value, hydroperoxides, p-av 등도산화가진행됨에따라증가하였다. 하지만산소가제한된상태에서는 DPPH 흡광도는증가하였으며, DPPH-H 는감소하였다. CDA value는유의적인변화가없었으며 (p>0.05), hydroperoxides 감소하였고, p-av는증가하였다. 상기결과들을통해 linoleic acid 산화가진행됨에따라생성되는산화생성물중 DPPH 흡광도를변화시키는원인물질은산소가제한된상태에서는더이상생성되지않으며, 이는 CDA 혹은 aldehyde 류의물질이아닌것을의미한다. 또한 TLC 분획물의 HPLC 분석결과 linoleic acid 산화생성물중 DPPH 와반응하는주요물질로고려되는분획물은 hydroperoxides 가아닌것으로확인되었으며, 277nm 파장을흡수할수있는구조를가지고있었다. 상기분획물을 1 H-NMR 분석한결과산화가진행되지않은 linoleic acid의 spectrum 과는다른경향의결과를얻었으며, 농도의문제로인해정확한구조동정은불가하였기에현재에도구조동정을위하여연구를지속적으로수행중에있다. 참고문헌 1) Channon HA, Trout GR. Effect of tocopherol concentration on rancidity development during frozen storage of a cured and an uncured processed pork product. Meat Sci. 62: 9-17 (2002) 2) Choe YO, Min DB. Chemistry and reactions of reactive oxygen species in foods. J. Food Sci. 70: (2005) 594 이재환.indd 오후 5:20:03

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