α-MSH 억제제 스크리닝을 위한 방법 개발

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1 工學碩士學位請求論文 α-msh 억제제스크리닝을위한방법개발 Development of α-msh(melanocyte Stimulation Hormone) inhibitor screening methods 2006 年 2 月 仁荷大學校大學院 生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 金知惠 工學碩士學位請求論文

2 α-msh 억제제스크리닝을위한방법개발 Development of α-msh(melanocyte Stimulating Hormone) inhibitor screening methods 2006 年 2 月 指導敎授金殷基 이論文을工學碩士學位論文으로提出함 仁荷大學校大學院 生物工學科 ( 生物工學專攻 ) 金知惠 II

3 Development of α-msh(melanocyte Stimulating Hormone) inhibitor screening methods by Ji-Hye Kim A THESIS Submitted to the faculty of IHA UIVERSITY In partial fulfillment of the requirements For the degree of MASTER F SCIECE Department of Biological Engineering February 2006 III

4 이論文을金知惠의碩士學位論文으로認定함 年 2 月 主審 : 副審 : 委員 : IV

5 국문요약 MC1R은 melanocyte내에존재하는 seven transmembrane이다. 이MC1R에 UV 조사에의해서생성된 α-msh가결합하게되면 melanogenesis가유발된다. 본실험에서는이러한 Endogeneous melanocortin agonists인 α-msh가 MCR family의대부분에영향을미치지만, 특히피부색소를조절하는 MC1R에서의영향을보고자한다. MC1R은 agonist인 α-msh가특이적으로결합할수있는 domain을가지고있다. 이 domain은 agonist 또는 antagonist가결합하는것과이것에의한신호전달을조절한다. 현재까지 ASP가 antagonist로써기능한다고알려져있다. 이를토대로 Chemical DB 를통해 MC1R의구조를형성하였다. 이때 agonist, antagonist들이 binding 할때의구조적특징을확인하고, antagonist로써의가능성이있는후보물질 23개를 Virtual Screening을통해선별하였다. 하지만실제 B16F10 melanoma cell에적용했을때에는단지 3개의물질만이 α-msh의 antagonist로써효과를보였다. 또한, 현재까지의 antagonist 스크리닝방법이아닌, SPR biosensor를이용하여 α-msh가 MC1R에결합하는것을측정하였다. I

6 ABSTRACT MC1R is a seven transmembrane receptor in melanocyte. α- MSH(Melanocyte Stimulating Hormone), produced by UV irradiation, binds to MC1R, and initiate the melanogenesis in the melanocyte. Although α-msh, endogeneous melanocortin agonists, influences most of MCR family, the paper especially observed its effect with MC1R which controls skin pigmentation. The MC1R containing specific binding domain for α-msh. The domain regulate for agonist or antagonist recognition and stimulation. n the base of defined, composed the MC1R structure by chemical database. The most effective antagonist selected by virtual screening. But it observed antagonist effect only 3 in B16F10 melanoma cell. In this study, the binding reaction detected by SPR biosensor from different of now a antagonist screening methods. II

7 차 례 국문요약... I ABSTRACT... II 차례... III 그림목차...V 표목차...VI 1. 서론 과색소질환과그문제점 과색소질환의원인과치료 색소형성메커니즘 α-msh(melanocyte Stimulating Hormone) 에의해조절되는색소형성메커니즘 MC1R의 antagonist 후보물질선별 Antagonist 스크리닝현황 SPR biosensor의원리 연구목적 재료및방법 세포주및재료 멜라닌함량측정 tyrosinase 활성측정 Western blotting을이용한 tyrosinase 발현양측정 세포독성측정 SPR biosensor를이용한 α-msh binding assay 결과및고찰 MC1R의 antagonist 후보물질선별 멜라닌함량측정을통한 agonist와 antagonist의효과 멜라닌함량측정을통한 antagonist의효과 Tyrosinase activity와 western blotting SPR biosensor를이용한 α-msh와 MC1R의결합반응측정.. 33 III

8 5. 결론 참고문헌 IV

9 그림목차 Fig 1.The structure of the skin...3 Fig 2.Schematic illustration of the possible approaches to interfere with melanogenesis pathway...5 Fig 3.Biological effects of a-msh or ASP on melanocytes....8 Fig 4.Procedure of virtual screening...9 Fig 5.Surface Plasmon Resonance Sensor Fig 6. Melanin contents by dose dependent α-msh Fig 7. Melanin contents inhibition of o.177 by dose dependent α-msh Fig 8. Melanin contents inhibition of effective antagonists.. 29 Fig 9. Tyrosinase activity inhibition rate(%) of antagonist with agonist Fig 10. Decreased of tyrosinase protein by o153, o.238. (1) control, (2) α-msh, (3) o.153, (4) o Fig 11. Interaction of α-msh with immobilized cell (A) prescan mode of chip surface, (B) fixed mode Fig 12. Interaction of ddh 2 and BSA with immobilized cell (A) pre-scan mode of chip surface, (B) fixed mode V

10 표목차 Table 1. Antagonist candidates Table 2. 1 st selection of effective antagonist Table 3. 2 nd selection of effective antagonist VI

11 1. 서론 1-1. 과색소질환과그문제점피부색소계는 90% 의각질형성세포와 5% 의랑게르한스세포및 5% 의멜라닌세포로구성되어있으며색소형성은이들세포간의상호작용에의해조절된다. 인체피부의멜라닌세포는 tyrosinase에의해유발된생화학적반응을통하여멜라닌을형성하여이를주위의각질형성세포에전달한다. 인종에따른피부색의차이는멜라닌의존재형태, 양및생화학적특성에따라결정된다. [rtonne JP] 우리나라를비롯일본, 중국등동양권유색인종은백인보다기미나흑자등과색소질환의발생빈도가높고피부손상후에색소침착이남는염증후과색소침착도흔하다. 이러한과색소질환은특히얼굴에발생하는경우미용상의문제와자신감의저하, 대인기피와같은사회생활의장애를초래할수있다. 최근생활수준의발달과주5일근무제등의도입으로미용에대한관심이높아지고있고이러한피부과색소질환에대한치료수요도매우증가하고있다 과색소질환의원인과치료이중에서도기미는자외선에의해유발 / 악화되고주로여성에서발생한다. 따라서기미의발생에영향을주는인자들에는자외선, 여성호르몬으로생각되고있다. 실제로자외선을피부에조사하면홍 1

12 반, 부종, 열감, 통증등의염증반응이발생하며피부타입에따라진한색일수록후에색소침착이남게된다. 이와같이자외선조사후에발생하는과색소침착에는자외선의멜라닌세포에대한직접적인작용외에도자외선을조사받은각질형성세포로부터나오는 cytokines, eicosanoids, growth factor, nitric oxide, neuropeptides, 또는 melanotrophic hormones(msh, ACTH) 에의해멜라닌세포가자극을받는간접작용도큰역할을할것이라생각되고있다. [STEFAIA BRIGATI][ Im S][Kang WH] 현재치료방법은멜라닌색소합성효소즉, tyrosinase를저해시키는 hydroquinone, retinoid, corticosteroid 제제를사용한다. 그러나실제치료에서효과를나타내는약제는거의없고, 부작용이흔해장기간사용하기힘들고대부분은재발하는것이보통이다. 한국미백화장품및자외선차단제의매출액은꾸준히증가추세이고기능성화장품중차지하는비중이높아지고있다. 최근미백화장품에대한관심및투자가많아져여러국내외화장품회사에서미백제품을내놓고있지만대부분 tyrosinase 억제효과를나타내는천연물을포함한화장품이며가격에비해그효능은미미하다. 따라서기미의효과적인치료를위해서는체계적인연구와근본적인색소조절기술이무엇보다필요하다. 2

13 Fig 1.The structure of the skin 3

14 1-3. 색소형성메커니즘 멜라닌은 melanosome에서합성되며, melanosome에는정장적인멜라닌을합성하는데필요한특이적인효소들을함유하고있다. 이효소들중가장잘알려진것으로 tyrosinase, tyrosinase related protein 1(TRP1) 과 Dopachrome tautomerase(dct) 등이있다. 이들을 melanosomal protein이라부르며, 소포체로부터골지체 (TG) 를거쳐소포체로부터유래한 premelanosome으로도달하게된다 [Jinbow K]. 그과정을자세히설명하면다음과같다. Melanosomal protein은 TG에축적되었다가 melanosome으로이동하게된다. Adaptor protein(ap) 중 AP-3는 tyrosinase와 TRP1과결합하여이들단백질이 TG으로부터 stage Ⅰmelanosome으로이동하는데관여한다. 그후 AP-3, rab 7, phosphatidyl inositol 3 kinase(pi3kinase) 에의해 tyrosinase와 TRP1이 stage Ⅱ melanosome으로이동하게된다. α-msh(melanocyte stimulating hormone) 에의해조절되는 stage Ⅱ melanosome에는 3가지 tyrosinase gene family 단백질모두가이동되며타원형이고세섬유 / 층판구조의기질을가진다. melanosome에서이들단백질이자기고유의효소작용을통해최종적으로 eumelanin을만들게된다. 반면 cysteine 혹은 glutathione과같은 sulfhydryl compounds의존 4

15 재하에 dopaquinone 으로부터 cysteinyldopa 가만들어지고결국 pheomelanin 이합성된다. Fig 2.Schematic illustration of the possible approaches to interfere with melanogenesis pathway (PIGMET CELL RES 16: ) 5

16 1-4. α-msh(melanocyte Stimulating Hormone) 에의해조절되는색소형성메커니즘. Keratinocyte에는여러종류의호르몬을생성하는전조단백질즉, PMC(pre-pro-opiomelanocortin) 이존재하고있으며, 이것이 UV 에의한자극을받았을때분해되면서 ACTH, α-msh, β-msh, γ-msh, other hormones(β-endorphin, β-lipotropic hormone) 을생성한다. 이호르몬들을 melanocortin이라고부르며, 다양한세포또는조직에영향을준다. 지금까지 MC1R~MC5R 5개의 melanocortin receptors가알려져있다. 그중에서 MC1R은 melanocyte에서만발현이된다고알려져있고 [Mountjoy KG], melanin 색소형성정도를조절하는 MSH(Melanocyte-Stimulating Hormone) 와결합반응을일으킨다. 또한, α-msh는 MC1R과가장높은결합력을지니는 agonist로써작용하며,[suzuki I] 많은 vertebrates에서생리적 melanogenic hormone으로써역할을하므로 pigment cell biologists에게가장흥미있는대상이다. 1961년 Lerner [Lerner AB] 가처음으로 MSH가멜라닌합성에영향을준다고발표한이후, 이사실은여러학자들에의해오랫동안논란의대상이었다. 그러나지난 10년간 α-msh 6

17 는 melanocyte의증식과멜라닌화를유도하는것으로밝혀졌다. Hunt et al. 와 De Luca et al[hunt G],[De Luca M] 는 human melanocyte에서 α-msh의 direct biologist effects, 즉 α-msh stimulated melanogenesis와 mitogenic effect를증명하였다. α-msh 처리는 tyrosinase activity, melanogenic enzymes인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2와 melanocyte proliferation을증가시키고이것은결국 MC1R에서 ligands의 binding에의해 camp가증가되어위와같은효과가나타난다는것을밝혔다. 즉, camp에의한 PKA(protein kinase A) 활성화, MITF(Microphthalmia associated transcription factor) 생성, tyrosinase 합성증가로이어진다.[Romero Graillet C, Gilchrest BA] MC1R 결합반응에서 ASP는경쟁적 antagonist로써행동한다. ASP 는 MC1R을통하여 eumelanin: pheomelanin switch point의조절에관여한다 [Kobayashi T]. 즉, ASP는 α-msh가 MC1R에 binding하는것을경쟁적으로억제하고 camp 생성을억제시킨다. 이것은또한 mra level에서 tyrosinase, TRP-1, TRP-2를급격히감소시키고, tyrosinase와 TRP-1의 protein level을감소시킨다 [Sakai C]. Human melanocyte에서 ASP는 eumelanin: pheomelanin ratio를 20-25% 감소시키지만, 현재까지는 ASP가독립적인 ligands로써 single receptor를통해 a-msh와반대의신호를전달하고각각의 7

18 binding 을억제하는지에관해서는아직그기작이밝혀지지않았고, 많은논쟁중이다.[Cone] Fig 3.Biological effects of a-msh or ASP on melanocytes MC1R의 antagonist 후보물질선별 ASP가 α-msh에경쟁적으로결합한다는점에착안하여이와유사한기능을가질수있는 antagonist를찾아내었다. 이를 Structure Based Drug Design (SBDD) 이라고부르며, antagonist modeling program인 CERIUS 2를사용하여, 이를통해 MC1R의 3차원구조를예측하고이미알려져있는 α-msh와 ASP의결합반응을통해그 8

19 구조적특징을파악하여약 300 만건의 Phamacophore DB 에서 23 개의 antagonist 후보물질을 virtual screening 을통해선별하였다. 그순서는 Fig 4. 에서와같다 Fig 4.Procedure of virtual screening 9

20 1-6. Antagonist 스크리닝현황현재까지 α-msh의 antagonist를스크리닝하는방법으로는약 3가지정도가사용되고있다. 첫째, α-msh의 antagonist의활성은세포내 camp양이변하면세포내색소입자의분산이변화하는 Lerner에의해개발된 Xenopus melanophore cell line을이용한 bioassay가있다.[potenza] 이방법은 α-msh와 / 또는 antagonist를세포에처리한다음, 색소분산을유도시킨다음그변화정도를정량하는방법이다. 둘째, Immunofluorescence에기초한방법이있다. 이것은 antagonist에 epitope를 tagging하여세포의표면에서의결합반응을시킨다음, anti-ha antibody를사용하여 fluorescence microscopy로측정하였다. 셋째는가장많이이용되고있는방법인 hmc1r을 HEK-293 cell line에 transfection시켜 camp를측정하는방법이있다. 본실험에서는기존에 ASP가 B16F10 melanoma cell을모델로하여 antagonist로써행동한다 [Blanchard, Willard] 는이론을참고로하여, 23개의 antagonist 후보물질에대하여세포내멜라닌함량, tyrosinase activity, western blot을통한 tyrosinase의발현양등을측정하였고, 기존에 antagonist 측정시중요시하지않았던부분인세포독성을측정하였다. 또한기존의복잡한 antagonist 스 10

21 크리닝법대신 SPR biosensor 를이용하여실시간으로결합반응을 측정하였다 SPR biosensor란? 프리즘이입사매질이고, 광의입사각이프리즘과금속박막의경계면에서임계각보다큰각도를갖도록설정하여금속박막의반사도를측정한다. 입사광에의해발생된표면플라즈몬파 ( 금속표면에서진행 ) 와소산파 ( 금속내부로진행 ) 는특정한입사각및박막의두께에서두파수벡터의성분의크기가같아지면서공명하게된다. Fig 5.Surface Plasmon Resonance Sensor 11

22 이때입사광의에너지는모두금속박막에흡수되어반사광은소멸. 이를표면플라즈몬공명이라고한다. 반사광이가장낮은최저공명각을찾아시간에따른반사도의변화측정한다. 센서칩표면의유전체질량이증가하거나구조가변형되면결과적으로굴절률이변화하여공명각이달라지게된다. 따라서이러한물질의변화를광학적인방법으로계측할수있는 SPR 원리를이용하면다양한생화학물질들사이의선택적결합이나분리와같은생화학적반응을공명각의변화로감지할수있어 SPR 센서는고감도생화학센서로활용할수있다. 12

23 2. 연구목적 삶의질향상과더불어아름다움에대한여성의소망을반영한미백화장품에대한기대가높다. 하얀피부를가지고싶어하는것은모든여성의한결같은바람이다. 피부미백의정의는피부가자외선에계속노출되어멜라닌색소세포가증가하고그결과로색소침착이늘어나게되어생기는기미나주근깨를교정또는회복시키는기능을말한다. 표피는기본적으로 keratinocyte와 melanocyte로구성되어있다. 그리고자외선을받은 keratinocyte는이에대응하기위해 melanocyte에멜라닌을형성하라는신호를보낸다. 이신호가바로 α-msh이며, 주로과색소침착을일으키는원인이된다. 이에본연구에서는기존의멜라닌을제거시키는것이아닌, α- MSH가 MC1R로의결합을억제시켜외부요인에의한멜라닌생성을억제시키는것을목표로삼았다. 이미 α-msh와 MC1R의결합반응에서 ASP가경쟁적으로그결합을억제시켜 pheomelanin생성을유도한다는실험결과는앞에서보다시피많은연구가되어있고진행중이다. 따라서이에기초하여, ASP와같이 α-msh의 inhibitor 역할을하는즉, ASP와유사한기능을가지는 antagonist를찾고자한다. 13

24 3. 재료및방법 3-1. 세포주및재료실험에는 B16F10 mouse melanoma 세포주를사용하였다. 세포주는 Dulbecco s modified essential medium(dmem), 10% fetal bovine serum, penicillin(100u/ml). streptomycin(100μg/ml)(gibco BRL, USA) 을첨가한것을기본배지로하여 humidified 5% C incubator 에서계대배양하며실험에사용하였다.[Lee S.H.] 3-2. 멜라닌함량측정세포멜라닌함량측정을위하여 6-well plate에 1x10 5 이되게세포를 plating하고 1일경과후 agonist and/or antagonist를첨가하여배양하였다. 배양이끝난후세포를회수하여 PBS로 2번 washing하고 10% DMS/1 ah를 200μl씩첨가한다음 80 항온조에서 1시간동안처리하였다. 이후 405nm에서흡광도를측정하였다. B16 mouse melanoma에서 α-msh, 물질각각을첨가했을때와함께첨가했을때의멜라닌함량변화를측정하였다.[V.M. Virador] 세포에처리한 antagonist는 1mg/ml이되도록 DMS에녹여서사용하였다. Melanin inhibition rate(%)=[(c-s)/c]*100 14

25 C: α-msh 만처리했을경우흡광도값 S: antagonist 첨가시흡광도값 3-3. tyrosinase 활성측정 Tyrosinase 활성은 DPA oxidase 활성을측정한것으로나타내었다. 멜라닌함량측정실험과같은방법으로세포를배양한후 trypsin으로세포를떼어내고원심분리하였다. 회수한세포를 PBS 로 2번 washing하고원심분리하였다. 상등액을제거한후 lysis buffer를첨가하여 4 에서 1시간반응시켜세포를 lysis 시켰다. 원심분리하여얻은세포상등액 40μl와 5mM DPA in potassium phosphate buffer(ph6.8) 40μl, potassium phosphate buffer 120μl를혼합하여 37 에서 30분간반응시켰다. 반응후 tyrosinase에의해 DPA로부터형성되는 dopachrome의양을파장 475nm에서흡광도를측정하여상대적 tyrosinase 활성으로나타내었다.[ P.R. Gordon] Tyrosinase inhibition rate(%)={[(c-d)-(a-b)]/(c-d)}*100 A: sample+tyrosinase+l-dpa B: sample+phosphate buffer+l-dpa C: D.W+tyrosinase+L-DPA 15

26 D: D.W+phosphate buffer+l-dpa 3-4. Western blotting을이용한 tyrosinase 발현양측정세포의상등액은 tyrosinase activity를측정한것과같은방법으로준비하였다. 세포상등액의단백질은 bicinchoninic acid(bca) 방법으로정량하였으며, 100μg의단백질로 12% SDS-PAGE를실시하였다. 전기영동이끝난후 PVDF membrane을 blocking solution[tbst with 5% skim milk] 으로실온에서 1시간동안반응시켰다. Primary antibody는 tyrosinase(from goat) 인 C- 19(SantaCruz, CA) 를이용하였다. Membrane을 blocking solution 에 1:200이되게희석하여 primary antibody와실온에서 1시간동안반응을실시하였다. TBST로 15분씩 4회 washing하였고, antigoat HRP-conjugated secondary antibody를 blocking solution에 1:1000으로희석하여 1시간동안반응하였다. 반응이끝난후 TBST로 15분씩 4회 washing하였다. Protein band는 TMB membrane peroxidase substrate(kpl) 를이용하여나타내었다.[ H. Mahalingam] 3-5. 세포독성측정 각물질들의세포독성을조사하기위하여 MTT 분석방법을이용하 16

27 였다. 96-well plate애 B16 mouse melanoma 세포주를 1.5x10 3 의 cell이되도록 plating하였고, 24시간배양을한다음 agonist or/and antagonist를첨가하여 48시간배양하였다. 배양이끝난후배지를제거하고, 100μl의 MTT solution(0.5mg/ml) 을첨가하여 4 시간동안반응시켰다. 반응후 100μl의 DMS를첨가하여 formazan crystals를용해시켰다 분강하게흔들어준다음, ELISA reader로파장 590nm에서흡광도를측정하였다. agonist를첨가한대조군을기준으로하여 % of control로데이터화하였다.[im S. J.[H. Mahalingam] cell toxicity(%)=[(c-s)/c]*100 C: α-msh만처리했을경우흡광도값 S: antagonist 첨가시흡광도값 3-6. SPR biosensor를이용한 α-msh binding assay Gold chip에세포를키우기위하여 poly-d-lysine으로 4 에서 2 시간동안표면처리한다. 이후 3차수로 5번정도 washing 해준다. 여기에 PDMS를씌우고, 세포를 1*10 4 cell/well이되도록 plating한다. 사용하고남은표면처리된 gold chip은냉동실에보관하여사용한다. 세포는 30시간배양후, gold에고정시키기위하여 2% 17

28 para-formaldehyde를이용하여 4 에서 1시간동안반응시킨다. 이후차가운 PBS(phosphate buffer saline ph7.4) 로 5회정도 washing을한다음, SPR biosensor에 chip을장착한다. Running buffer는 PBS를사용하며 flow rate는 7.5μl /ml, 온도는 22 로설정한다. 약 1시간동안 Base line을안정화시킨다음, α-msh를주입하고, 시간에따른반사도의변화에따라결합반응을측정한다. 18

29 19 S H S H H F 4. 결과및고찰 4-1. MC1R 의 antagonist 후보물질선별이방법은구조에바탕을둔분자설계 (structure based drug design:sbdd) 를이용하여이미그활성이알려져있는 α-msh 와 ASP 가 MC1R 에결합할때의구조와유사한 antagonist 후보를선별하였다. Table 1. 에서구조를확인할수있다. Table 1. Antagonist candidates o.16 o.23 o.30 o.47 o.54 o.60 S H H H S H

30 20 H H H o.78 o.85 o.92 o.108 o.115 o.122 o.139 o.146 o.153 o.160 o.177 o.184 F H F H S H Br S H H H Cl H S H S H S H S H S H 2 H 2 H H S H

31 H 2 H 2 H H S H H 2 S S Cl o.191 o.207 o.214 H H S o.221 o

32 4-2. 멜라닌함량측정을통한 agonist 와 antagonist 의효과 위의후보물질 23개를이용하여 B16F10 melanoma cell에처리하여그결과를멜라닌함량측정을통하여그효과를확인하였다. α- MSH만을처리한것을실험대조군으로하였다. 실험에사용한 α- MSH의농도는 Fig 1. 에서의실험을통해멜라닌함량이일정수준으 로유지되는부분, 즉 50nM 로첨가하였다. 그리고 α-msh 와 antagonist 20μM과함께처리한것을비교하였다. 실험결과멜라닌의생성을억제시키지만, 예를들어세포의수지상돌기가비정상적으로뻗어져나간다던가세포가잘자라지못하게하는 antagonist 가존재하였다. 이렇게세포의변성을많이일으키는 antagonist는실제피부에적용했을때의부작용을유발할가능성이크므로다음실험에서제외를시켰다. 따라서멜라닌생성억제비율 30% 이내, 세포독성 10% 이내의조건을만족하는 antagonist를 1차선별하 였다. 이렇게해서선별한 antagonist 는다음 Table 2. 에서확인할 수있다. 또한 1차선별에서효과가없었던 antagonist에대하여농도를 2배높인 40μM에서역시같은조건으로만족하는 antagonist 를 Table 3. 에서 2차선별하였다. 두실험을통해얻은 8개의 antagonist는그농도범위를 5-80μM로넓힌다음 Sigma plot을이용하여 nonlinear regression에서 fitting curve를통해 IC50 값을 22

33 구하였다. 그리고 antagonist의농도가 100μM 이상에서는세포의독성이있을뿐아니라, 이것의상업적가치또한감소하므로범위설정에서제외를시켰다. 실험은모두한물질에대하여같은 plate 에서 3개 well씩 2번반복수로수행하였다. 실험결과 melanin inhibition rate와 cell toxicity를고려하였을때, IC50 값이낮은 o. 177, o. 153, o.238이효과가가장좋음을알수있다. 23

34 .D value(405nm) y = x R2 = pM 50pM 500pM 5nM 50nM 500nM a-msh concentration Fig 6. Melanin contents by dose dependent α-msh 대조군으로사용이되는 α-msh의농도는 50nM로결정 24

35 Table 2. 1 st selection of effective antagonist Antagonist Melanin inhibition rate(%) 1 Cell toxicity (%) 2 IC50(μM) 3 o ± ± o ± ± o ± ± o ± ± Table 3. 2 nd selection of effective antagonist Antagonist Melanin inhibition rate(%) Cell toxicity (%) IC50(μM) o ± ± o ± ± o ± ± o ± ± Melanin inhibition rate(%)=[(c-s)/c]*100 2 Cell toxicity(%)=[(c-s)/c]*100 3 IC50: 50% Inhibition concentration. Sigma plot 의 onlinear Regression 에서 fitting curve 를이용함. 25

36 3.0 mlanin contents.d value(405nm) a-msh a-msh+o.177 5pM 50pM 500pM 5nM 50nM 500nM a-msh concentration Fig 7. Melanin contents inhibition of o.177 by dose dependent α-msh α-msh는 5pM에서 500nM까지처리한것을대조군으로하여, α-msh와 20μM의 o.177를함께처리한결과와의비교그래프이다. 26

37 이결과는 IC50 값이가장낮은 o.177의 α-msh 농도별로 melanin 생성억제함량을측정한것이다. 여기서 α-msh의농도가낮을경우에는멜라닌생성을 1.9% 억제함으로써 antagonist 효과를거의보이지않았다. 하지만 α-msh의농도가높아질수록농도에비례하여멜라닌생성을약 40% 까지억제시키는것을확인할수있었다. 앞의그래프에서 α-msh의효과는그농도가 5nM 이상에서가장높은활성을보이므로, 이 o. 177의효과는 α-msh의양이가장많을때에최고의활성을보인다고결론지을수있다. 27

38 4-3. 멜라닌함량측정을통한 antagonist 의효과 앞의결과에비추어봤을때, α-msh 즉, antagonist와경쟁적작용을하는 agonist가없을때에는세포내에어떠한영향을주는지에대한결과를 Fig 8. 에서확인하였다. 그결과 antagonist만처리한세포에서는아무것도처리하지않은세포와멜라닌함량이거의같은것을알수있었다. 즉, antagonist 자체만으로는세포내에서영향을주지않는것으로알수있었다. 이러한사실은본실험에서사용된 antagonist가 agonist인 α-msh와경쟁적으로 MC1R에작용한다는것을뒷받침할수있는근거가된다. 28

39 melanin contents.d value(405nm) control antagonist Fig 8. Melanin contents inhibition of effective antagonists. 29

40 4-4. Tyrosinase activity 와 western blotting α-msh가 MC1R에결합하게되면세포내 camp가증가하게되고, tyrosinase activity와 tyrosinase protein을증가시킨다.[suzuki I] 실제로 α-msh만을세포에처리했을때 tyrosinase activity는약 4 배정도증가하는것을확인하였다. 본논문에는결과를올리지않았다. 여기에 3가지 antagonist를 α-msh와함께처리했을때세포내 tyrosinase activity는 agonist와 antagonist의경쟁작용에의해감소한것을 Fig 92. 에서확인할수있다. 하지만 western blot을이용한 tyrosinase protein은그효과가적었다. o.177 antagonist 에서는 tyrosinase protein은변화가없었고, o.153, 238 antagonist에서는약간감소한것을 Fig 30. 에서확인할수있다. 이것은세포내 tyrosinase activity에는영향을주지만, protein양에는크게영향을미치지않는것으로보인다. 30

41 tyrosinase activity inhibition rate(%) antagonist Fig 9. Tyrosinase activity inhibition rate(%) of antagonist with agonist 31

42 Fig 10. Decreased of tyrosinase protein by o153, o.238. (1) control, (2) α-msh, (3) o.153, (4) o

43 4-5. SPR biosensor 를이용한 α-msh 와 MC1R 의결합반응측정 현재까지알려져있는 antagonist 스크리닝방법에는시간이오래걸리고비용이많이드는단점이있다. 그래서본실험에서는 SPR biosensor를이용하여좀더간단한측정을수행하고자하였다. 우선세포표면에있는 MC1R과의반응을위해서 gold chip 위에세포를부착시켰다. α-msh를첨가했을때의반응은다음 Fig 41. 에서와같다. 반응을하기전 gold chip의 pre-scanning에서는최저반사도의공명각이 54.0였다. α-msh와의반응이끝난후의공명각은 53.5도로측정이되었다. 이것은 gold 표면위의세포가떨어져나간현상으로예측이되며, 이와같은사실을증명하기위해 Fig 52. 의실험을다시측정하였다. 즉, α-msh가특이적으로 MC1R과반응을해서떨어져나간것인지를확인하기위하여같은조건의 gold chip을사용하여증류수와 BSA를첨가하였다. 이경우공명각의변화는 0.1도로측정이되었다. 이러한결과로미루어보았을때, 앞에서의 α-msh와 MC1R 반응이특이적이라는사실을짐작할수있다. 33

44 Fig 11. Interaction of α-msh with immobilized cell (A) pre-scan mode of chip surface, (B) fixed mode Fig 12. Interaction of ddh 2 and BSA with immobilized cell (A) pre-scan mode of chip surface, (B) fixed mode 34

45 5. 결론 Mammalian melanocytes는 eumelanin과 pheomelanin 모두를생산하지만 melanocyte에서 MC1R의 α-msh와 ACTH에의한활성은 eumelanin 생산으로이끈다.[Millar] 따라서이러한 MC1R의 antagonist로써기능하는물질을첨가하면 α-msh에의해유도된 eumelanin 형성을억제시킬수있을것으로예측하였다.[Michael M] 현재까지기존의 α-msh의 active site를변형시키거나, ASP의 active site를 α-msh의 sequence에삽입하여 MC1R에결합을억제하는결과가발표되었다. 이들의 IC50 값의범위는대략 100μM 이하로설정하였다.[Pilgrim J],[Jerry Ryan Holder] 이를바탕으로본실험에서는 Pharmacophore DB에서 Virtual screening을통해 23개의 antagonist 후보를선별하였고, 농도범위를 5μM에서 80μM 까지로설정하였다. 하지만 Virtual screening 결과와는달리실제세포에적용했을때에는단지 3개의물질만이 α-msh의 antagonist로써효과를보였다. 즉, α-msh와 antagonist를동시에처리한경우에서멜라닌함량과 tyrosinase activity가억제되는것을확인함으로써 antagonist로써의역할을확인할수있었다. 또한, antagonist만을처리했을경우아무것도처리하지않은세포와멜라닌함량이같은것을확인함으로써이와같은사실을뒷받침할수있었다. 35

46 지금까지의 α-msh antagonist에관한연구는주로당뇨나비만에관련된 MC3R과 MC4R에서진행되었고, 이와관련된유도체들이많이밝혀져있다. [Jerry Ryan Holder] 색소형성과관련된 MC1R에관련연구가부진한이유는미백에대한관심이주로서양보다는동양에서만다루기때문이라생각된다. 그러므로본실험에서연구한 3개의 α-msh antagonist 유도체들은그것의상업적가치또한높을것이라예상된다. 그리고 SPR sensor 를이용한 antagonist 스크리닝법은떨어져나간세포를정량화하는방법과세포테스트결과효과가있는것으로확인되었던 3개의 antagonist를 α-msh와함께경쟁적으로반응하는것을측정하는문제를해결해야한다. 36

47 6. 참고문헌 1. Bennett DC, Lamoreux ML.,et al., (2003) The color loci of mice-a genetic century. Pigment Cell Res;16: Blanchard, S.G., C.. Harris,.R.R. Ittoop, J.S. ichols, D.J. Parks, A.T. Truesdale, and W.. Wilkison.(1995) Agouti antagonism of melanocortin binding and action in the B16F10 murine melanoma cell line. Biochemistry 34: Busca R, Ballotti R., et al.(2001) Cyclic AMP a key messenger in the regulation of skin pigmentation. Pigment Cell Res;13: Cone, R.D., D. Lu, S. Koppula, D.I. Vage, H. Klungland, B. Boston, et al.(1996) The melanocortin receptors: Agonists, antagonists, and the hormonal control of pigmentation. Recent Prog. Horm. Res. 51: De Luca M, Siegrist W, Bondanza S, Mathor M et al. (1993) α-melanocyte stimulating hormone(αmsh) stimulates normal human melnoctye growth by binding to high-affinity receptors. J Cell Sci;105: Gilchrest BA, Park HY, Eller MS, Yaar M.,et al. (1996) 37

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49 26(6) Jerry Ryan Holder, Zhimin Xiang et al., (2002) Structure-Activity Relationships of the Melanocortin Tetrapeptide Ac-His-D-Phe-Arg-Trp-H at the Mouse Melanocortin Receptors. 4. Modifications at the Trp Position. J. Med. Chem. 45, JESUS SACHEZ MAS, CHRISTA HAHMA, et al. (2004) Agonist-Independent, High Constitutive Activity of the Human Melanocortin 1 Receptor. Pigment Cell Res 17: Jinbow K, Park JS, Kato F, et al.(2000) Assembly, targeting signaling and intracellular transport of tyrosinase gene family proteins in the initial stage of melanosome biogenesis. Pigment Cell Res;13: Kang WH, Yoon KH, Lee ES, Kim J, Lee KB, et al.(2002) Melasma: histopathological characteristics in 56 Korean patients. Br J Dermatol;146: Kobayashi T, Vieira VD, Sakai D, et al.(1995) Modulation of melanogenic protein expression during the switch from eu- to pheomelanogenesis. J Cell 39

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52 27. Romero Graillet C, Aberdam E, Clement M, rrtonne J- P, Ballotti R.(1997) itric oxide produced by ultravioletirradiated keratinocytes stimulates melanogenesis. J. Clin Invest.;99: Sakai C, llmann MM, Barsh GH, Imokawa G, Barsh GS, Hearing VJ.(1997) Modulation of murine melanocyte function in vitro by agouti signal protein. EMB J ;16: STEPAIA BRIGATI, EMAUELA CAMERA, MAUR PICARD(2003) Chemical and Instrumental Approaches to Treat Hyperpigmentation. Pigment Cell Res 16: Suzuki I, Cone RD, Im S, ordlund J, Abdel-Malek ZA. (1996)Binding of Melanotropic Hormones to the Melanocortin Receptor MC1R on Human Melanocytes Stimulates Proliferation and Melanogenesis. Endocrinology 137: Thody A.J., and Graham,A, et al., (1998) Does α-msh have a role in regulating skin pigmentation in humans? Pigment Cell Res.;11:

53 32. V.M. Virador,. Kobayashi, J. Matsunaga, and V.J. Hearing.(1999 ) A standard protocol for assessing regulators of pigmentation. Anal. Biochem. 270, Willard, D.H., W. Bodnar, D. Harris, L. Kiefer, J.S. ichols, S. Blanchaard, C. Hoffman, M., et al.(1995) Agouti structure and function: Characterization of a potent alpha-melanocyte stimulating hormone receptor antagonist. Biochemistry 34:

54 감사의글 수많은선배들의논문을보았을때, 내가쓰게될기회가온다면어떤말을담아야할까많은상상을해보았습니다. 그때당시는상상만으로도흐뭇했었습니다. 하지만지금은많은아쉬움이남는다고해야할까요 대학원 2 년의시간은 26 년의생애에서가장많은변화와의미가있었던시간이었습니다. 가장힘들었던시기이기도했지만, 한번쯤겪어야할과정이라는것도이젠알것같습니다. 교수님, 교수님의좋은말씀과조언들은앞으로살면서어떠한상황에서도저를일깨울것입니다. 그리고개개인의능력과생각을소중하게여기시고, 실험실에들어와서한사람이변화해서나가는모습을봤을때가장뿌듯하시다는말씀은항상제마음에남을것이고, 저도그러한사람이되도록노력하겠습니다. 실험실에서즐거웠던시간도많았지만, 많은갈등과고민이있었을때도와준사람들 은영선배, 은숙선배. 이렇게마무리를하기까지동기들이가장큰힘이되어주었습니다. 많은충고와조언을해주셨던영범오빠, 향복언니, 뿌리에대해서확실하게알게해주시고든든한선배님이셨던동준오빠, 오랜시간함께생활해온중진오빠, 지호오빠, 정선언니, 정옥선배, 소영선배. 선배들의도움으로또한이렇게논문을쓸수있었고, 감사의말씀전하고싶습니다. 그리고지난 1 년간많이고생한상희랑 윤영이에게도감사합니다. 박식한지훈오빠 학부때부터지금까지많은 도움받고있는김박사님 항상자신감있는모습이저에게도많은 44

55 용기를주었답니다. 친언니같았던지숙언니 어려움에부딪힐때마다 언니가제시해주었던길은저에게많은도움이되었습니다. 언니를 통해서많은인내심을배울수있었습니다. 감사합니다. 그리고 어리버리 00 함께있다는것하나만으로도대학생활은늘 빛이났습니다. 윤영, 혜정, 홍졔, 영박, 대식, 태창, 근형, 명훈, 훈철항상고맙다! 그외일일이인사드리지못한선 후배, 생공과동기분들께도진심으로감사드립니다. 언제나믿어주시고, 아낌없는지원과자신감을주셨던부모님과동생진태가있었기에지금의제가있을수있었습니다. 사랑합니다. 마지막으로지금이있기까지언제나믿음과아낌없는사랑을준, 인생의선배이자삶의동반자인사랑하는나의남편에게이논문을바칩니다. 45