韓資植誌 22(5) : 461~466(2009) Korean J. Plant Res. 마추출물이방사선처리식물세포의생장과핵 DNA 손상에미치는영향 권순태 1 *, 권인숙 2, 박윤문 1 1 안동대학교생명자원과학부, 2 안동대학교식품영양학과 Effects of Yam (Dioscorea batatas Dence) Extracts on the Growth and Nucleus-DNA Damage of the Plant Cells Treated with γ-radiation Soon-Tae Kwon 1 *, In-Sook Kwun 2 and Yoon-Moon Park 1 1 Dept. of Biological Resources, Andong Nat l Univ., Andong 760-749, Korea 2 Dept. of Food and Nutrition, Andong Nat l Univ., Andong 760-749, Korea Abstract - This study was carried out to evaluate the effects of yam (Dioscorea batatas Dence) extracts on the cell viability, growth and nucleus-dna damage of tobacco cells which were exposed to γ-radiation stress. The viability and growth of tobacco cells exposed to 20 Gy of radiation stress were effectively recovered by pretreatment of 10 mg/l ethylacetate (EtOAc) yam extract. Pretreatment of EtOAc extract showed 20% higher cell viability and fresh weight growth than that of cells without pretreatment in 20 Gy radiation treated tobacco cells. Nucleus-DNA damage was measured as the ratio of tail length (T) to head length (H) in individual comet image isolated from tobacco cells. The T/H ratio of control-cells and treated-cells at 20 Gy were 1.05 and 1.68, and % head DNA of those cell were 86.7 and 71.3%, respectively, suggesting that nuclei of tobacco cells were severely damaged in the integrity of DNA by the treatment of γ-radiation. However, pretreatment of MeOH, EtOAc and n-buoh extracts decreased radiation induced DNA-damage in the tobacco cells, showing T/H ratio of 1.37, 1.01 and 1.10 and % head DNA of 81.5, 87.6 and 88.7%, respectively. Key words - Chinese yam extracts, Comet assay, Radiation, Nucleus-DNA damage 서언 마 (Dioscorea batatas Dence) 의성분은전분이생체중의 8-24%, 점질물이 0.6-2.4% 를차지하며, 약용성분으로는 amylose, cholin, saponin 등이포함되어있다 (Kim et al., 1991) 한편마의주요약용성분으로알려진 steroidal saponin 은다양한생리활성에관여하는것으로알려져있는데, 세포의 DNA 돌연변이를방지하는항돌연변이원성작용, 항암및항염증작용 (Baek et al., 1994) 등이알려져있다. 지구상의모든생물은그정도의차이는있으나일상생활중에자연적인방사능에노출되어있다. 유해수준이하의저선량은식물의다양한생리활성을오히려촉진한다는보고도있으나, 고선량의방사선은식물의생육및개화억제, 발 * 교신저자 (E-mail) : skwon@andong.ac.kr 아력감소등생물의생존에심각한피해를주며, 유전물질인 DNA에직접적인손상을주어돌연변이를유발하는등의유해성을가지고있다 (Kim et al., 1999). 최근문제시되고있는오존층의파괴는지구로입사되는이온화방사선의증가를초래하며, 이는지구생태계와작물의생산성에큰영향을미칠것으로추정된다 (Stepleton and Walbot, 1994). Comet 분석은개개의세포로부터핵을분리하여핵 DNA 손상정도를간편하게측정하는방법으로단세포전기영동이라고한다 (Rojas et al., 1999). 이방법은핵 DNA의손상과회복정도를간편하면서도가시적으로측정할수있으므로의학및유전독성학, 식품의방사선조사여부, 환경오염피해의측정등다양한분야에이용되고있다. 특히식물세포의돌연변이원에의한 DNA 손상정도를파악하는데유용한방법으로활용되고있다 (Noroozi et al., 1998; Rojas et al. 1999). -461-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 22(5) : 461~466(2009) 본연구는마의성분이동식물세포의돌연변이방지에효과적이라는연구보고에착안하여 (Kim et al., 1989; Baek et al., 1994), 마추출물이손상된 DNA 를회복시키는능력을알아보고자실시하였으며, 마추출물을처리한식물세포가방사선스트레스에서세포의활력과생장및핵 DNA 손상에미치는영향을조사하였다. 재료및방법추출액제조본실험에사용된마 (Dioscorea batatas Dence) 의종류는단마이며, 경상북도농업기술원생물자원연구소로부터분양받아사용하였다. 마의지하부를 2-3 mm의크기로절편하여 30 에서감압건조하고 70% methanol에 120시간추출하였다. 농축된추출물은다시 n-hexane, chloroform (CHCl 3 ), ethylacetate(etoac), n-butanol(n-buoh) 및물층으로분획하여완전히건조시켜최종무게를측정하였다 (Fig. 1). 모든추출물은 ethanol 로다시녹여농도가 10 mg/ml 이되도록용액을제조하였다. 방사선처리및반응조사방사선을처리한식물세포는담배 Nicotiana tabacum cv. KY14를사용하였다. 배양세포는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본염류에 2,4-D 0.5 + kinetin 0.1 mg/l 및 sucrose 30 g/l가함유된액체배지에서분당 100회속도로현탁배양을하였으며 (Kwon et al., 2001), 계대배양은매7일간격으로실시하였고, 모든처리는배양후 3일째된세포를이용하였다. 담배배양세포에마추출액의최종농도가 10 mg/l이되도록 3일간전처리하여, 방사선 ( 60 Co, 선원강도 150 TBq) 0, 20 및 50 Gy/4 hr를조사하였다. 방사선과마추출액을처리한세포를일정기간정상상태에배양하면서세포의생체중과 TTC(triphenyl tetrazolium chloride) 에의한세포활력 (Towil and Masure, 1975) 을측정하였다. 세포핵의분리및 Comet 분석마추출액과방사선을처리한배양세포를채취하여 Rojas 등 (1999) 의방법에따라핵을분리하였다. 방사선을처리한직후배양세포에 0 의 Sörensen buffer(50 mm sodium phosphate ph 6.8, 0.1 mm EDTA, 0.5% DMSO) 를첨가하여핵의나출을유도하였고, 나출된핵은 1,000 rpm에 10분간원심분리하여수거하였다. Comet 분석은슬라이드준비, 전기영동, 핵의염색및관찰순으로실시하였다. 먼저슬라이드의준비를위해충분히냉각된슬라이드에 1.0% 의일반융점 agarose를골고루퍼지도록깐후, 수거한세포핵 10 μl와 1.0% 저융점 agarose 90 μl를혼합하여슬라이드에도포하고, 커버글라스를덮어 4 에서 10분간방치하였다. 제조된슬라이드를해리용액 (2.5 M NaCl, 1%sodium sarcosinate, 100 mm Na 2 EDTA, 10 mm Tris, ph 10) 에침지시킨후 unwinding 완충액 (1 mm Na 2 EDTA, 300 mm NaOH, ph 13) 에서 30분간침지시키고, 25 V, 300 ma에서 25분간전기영동을실시하였다. 전기영동후각각의슬라이드그라스를 EtBr로염색한후형광현미경으로처리당 10-20 개의핵을관찰하였다. Comet 이미지는머리부분직경 (head length, H), 꼬리부분의길이 (tail length, T) 및머리부분 DNA의함량 (% head DNA) 을구하였다. 결과및고찰 n-hexane [3.26g] CHCl 3 [0.58g] Fresh Chinese Yam [5,640g] Dry at 30 [900g] Methanol [71.51g] EtOAc [0.85g] n-buoh [4.62g] Water [62.20g] Fig. 1. Preparation process and yield (g) of extracts from Dioscorea batatas. 세포의생장과활력에미치는영향담배배양세포에단순히방사선 20 및 50 Gy를처리한것과마추출물 10 mg/l을 3일간전처리한후동일한선량의방사선을처리한것의경과시간별배양세포의활력변화를조사하였다 (Fig. 2). 먼저 50 Gy의고선량을처리한세포는무처리세포나마추출물을전처리한세포모두세포활력이현저히억제되어, 방사선처리 12일이경과한후에도세포의활력이회복되지않았다. 그러나비교적저선량의방사선인 20 Gy를처리한세포는무처리에비해마추출물을전처리한세포가세포활력의회복속도가빠르게 -462-
마추출물이방사선처리식물세포의생장과핵 DNA 손상에미치는영향 나타났다 (Fig. 2). 방사선을처리한후 12일째의세포활력을보면방사선을처리하지않은무처리세포가 94%, 방사선 20 Gy만단독으로처리한세포가 58% 였고, 마추출물을전처리한후방사선 20 Gy를처리한세포가 73% 의활력을보였다. Fig. 3은방사선을처리한후 12일째의배양세포의생체중을조사한결과이다. 무처리세포는플라스크당생체중이 2.7 g이나방사선 50 Gy를처리한경우는 0.5 g로방사선을처리한이후에는식물세포를정상상태로되돌려도세 Fig. 2. Changes in tobacco cell viability treated with γ -radiation with or without methanol extracts (M) of D. batatas. Tobacco cells were treated with 10 mg/l of methanol extract 3 days before radiation treatment. Gy means total dosage of radiation exposed, gray. Fig. 1. Preparation process and yield (g) of extracts from Dioscorea batatas. 포의증식이이루어지지않았다. 한편 20 Gy를처리한세포의생체중은플라스크당 1.3 g으로방사선을처리하지않은세포 (2.7 g) 의 48.1% 수준을보였으나, 마추출물을처리한후방서선 20 Gy를처리한경우는 1.8 g을나타내어무처리세포와비교하여 66.7% 수준을보였다. 이결과로보면, 마추출물을전처리한세포가전처리를하지않은세포보다 20 Gy방사선에의한세포의생체중억제활성이약 20% 경감되는것으로나타났다. Fig. 2와 Fig. 3의결과에서마의추출물을처리한배양세포가방사선처리에의한세포활력과생체중의억제를현저히감소시키는효과가인정되어, MeOH 추출물을다시 n-hexane, CHCl 3, EtOAc, n-buoh 및 water 층으로분획한추출물을담배배양세포에처리하였다 (Fig. 4). MeOH 추출물로부터분획된 5개의추출물중방사선처리에의한세포활성과세포의생체중억제효과를가장감소시키는것은 EtOAc 층으로나타났다 (Fig. 4). 추출물을처리하지않고방사선 20 Gy만을처리한세포의생체중은 1.34 g이고, 세포활력은 58% 로무처리세포에비하여생체중 50.2%, 세포활력 61.1% 수준을보인반면, EtOAc 분획의추출물을처리하고방사선 20 Gy를처리한세포의생체중은 2.13 g, 세포활력은 74% 로무처리세포에비해각각 78.9%, 77.9% 까지회복된것을알수있었다. EtOAc 분획추출물은 MeOH 추출물을처리한것보다방사선에의한세포활성및생체중억제를더욱경감시키는것으로나타났다. 이결과로보아 MeOH 추출물의방사선피해감 Fig. 3. Fresh weight of tobacco cells treated with γ-radiation with or without methanol extracts (M) of D. batatas. Tobacco cells were treated with 10 mg/l of methanol extract at 3 days before radiation treatment. Cell fresh weight was determined at 12 days after treatment. Fig. 4. Cell fresh weight and viability of tobacco cells treated with 20 Gy of γ-radiation and various extracts of D. batatas. Solvent of extracts M; methanol, H; n-hexane, C; chloroform, E; Etylacetate, B; n-buoh, W; water, treated with 10 mg/l. Data were determined at 12 days after treatment. -463-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 22(5) : 461~466(2009) 소효과는 MeOH 추출물에함께포함된 EtOAc 분획에존재하는물질일것으로판단된다. 이상의결과에서마의 MeOH 추출물은담배배양세포의방사선에의한피해를경감시키는효과가있는것으로인정되고, 그중 EtOAc 분획에서추출된물질이가장효과적인것으로나타났다. 따라서방사선에의한세포의핵 DNA 손상을경감시키는데어떠한작용을알아보기위하여 comet 분석을실시하였다. Comet 분석에의한핵 DNA 손상검정방사선을처리한담배배양세포에서핵을분리하여 comet 분석을실시한결과 DNA의손상정도에따라다양한형태의핵모양을관찰할수있었다 (Fig. 5). DNA 가손상을받지않은핵은거의구형에가까운형태 (Fig. 5의 A 사진 ) 를보이나, DNA 가손상된핵은파괴된 DNA 조각이전기영동의원리에의해양 (+) 전기쪽으로이동하여긴꼬리를가진혜성모양 (Fig. 5의 B 사진 ) 을형성하게된다 (Fig. 5). 핵의모양을관찰해보면동일한식물체내에서도다양한형태로나타나게되는데, DNA 손상이심해질수록핵의머리부분은작아지고꼬리부분은길어져심한경우에는핵의머리부분이완전히사라지고꼬리부분만관찰되는경우도있었다. Fig. 5. Nuclear-DNA damage analyzed by comet assay. Intact nuclear (A) without comet-tail, damaged nuclear (B) with long comet-tail by treatment of 20 Gy γ-radiation. Comet 분석에서핵의머리길이 (head-lenght, H) 와꼬리길이 (tail-length, T) 의비율 (T/H ratio) 과머리부분에남아있는 DNA 량 (% head DNA) 을측정한결과는 Table 1과같다. 무처리세포의핵 DNA의머리길이 (H) 와꼬리길이 (T) 는각각 31.7 μm및 33.4 μm로나타나 T/H 비율은 1.05이었고, 머리부분에남아있는 DNA량 (% head DNA) 는 86.7% 로나타났다. 한편핵 DNA 손상물질로알려진 (Rojas et al. 1999; Gichner et al. 2000) ethyl methanesulfonate(ems) 5 mm을처리한세포는머리길이 20.5 μm, 꼬리길이 134.9 μm로 T/H 비율이 6.58, head DNA 는 48.7% 로상당한핵 DNA가손상을받은것을알수있었다. 즉방사선처리에의해손상을받은핵일수록꼬리의길이가길어지며 head DNA 량은감소하는것을알수있다. 방사선 20 Gy를처리한경우머리길이와꼬리길이는각각 29.5 μm및 49.8 μm로관찰되어 T/H 비율이 1.68로무처리세포의 T/H 비율 (1.05) 보다큰값을나타내어방사선처리에의해핵 DNA가상당히손상된것을알수있었고, head DNA 도 71.3% 로나타나무처리 (86.7%) 보다현저히낮은값을보였다. 마추출물중 n-hexane, chloroform 및물층을전처리한후 20 Gy의방사선을처리한담배배양세포의 T/H비율은각각 1.52, 1.58 및 1.65이며, head DNA는각각 69.3%, 70.3% 및 74.3% 로전처리없이방사선 20 Gy만을처리한세포의 T/H 비율 (1.68) 과 head DNA (71.3%) 간에는유의차가인정되지않았다. 한편 MeOH, EtOAc 및 n-butanol 분획추출물을전처리한경우는 T/H비율이각각 1.37, 1.01 및 1.10이며, head DNA 는각각 81.5%, 87.6% 및 88.7% 로핵 DNA의손상정도가현저히낮아진것을알수있었다. 특히 EtOAc 층과 n-butanol 층을전처리하고 20 Gy의방사선을처리한경우는방사선을처리하지않은무처리세포의 T/H 비율 (1.05) 과 head DNA(86.7%) 가유사한값을보였다. 이결과는이들분획추출물에는담배배양세포의방사선에의한 DNA 손상을억제하는물질이존재하고있음을시사한다. 정상세포의 head-dna 가 100% 가되지못하는것은, 스트레스가없는상태에서도일부의식물세포들은끝임없이소실되고생성되는과정을반복하는것으로추정하고있으며, 일부는핵을분리하는과정에서핵들이손상을받을수도있다고한다 (Navarrete et al. 1997). 따라서실험의수행과정에온전한핵을분리하는것도 comet 분석의신뢰성을높이는중요한요인으로판단된다. -464-
마추출물이방사선처리식물세포의생장과핵 DNA 손상에미치는영향 Table 1. Percentage head DNA and length of comet for nuclei isolated from tobacco cells treated with 20 Gy of γ-radiation with various extracts of D. batatas Treatments 1) Length of comet(μm) Radiation Extracts Head(H) Tail(T) T/H % Head DNA Control cell 31.7±2.2 33.4±3.1 1.05±0.2 86.7±8.7 20 Gy only 29.5±2.3 49.8±4.1 1.68±0.3 71.3±6.3 + MeOH 30.3±1.7 41.5±3.2 1.37±0.2 81.5±6.4 + n-hexane 33.4±3.1 50.8±5.4 1.52±0.8 69.3±7.2 + chloroform 32.7±1.8 51.8±3.5 1.58±0.6 70.3±2.2 + Etylacetate 32.3±1.7 32.5±3.2 1.01±0.4 87.6±6.8 + n-butanol 31.3±1.7 34.5±4.2 1.10±0.2 88.7±7.6 + Water 29.6±2.7 48.8±4.6 1.65±0.5 74.3±2.2 5 mm EMS 2) 20.5±1.5 134.9±7.8 6.58±2.1 48.7±2.7 1) Nuclei for comet assay were isolated at 24 hrs after treatment. 2) Ethyl methanesulfonate (EMS) treated for 24 hrs before comet assay. Values are mean±se 생물체는끊임없이외부의스트레스에노출되어있고특정의물리 화학적스트레스는생물체의핵 DNA에손상을주어이것이세포의생존을위협하거나돌연변이를유발하는것으로알려져있다. 지금까지알려진돌연변이유발물질로는자외선, 방사선등과같은단파장의스트레스와화학물질인 EMS, cyclohexamid, cadmium 및 chromium 등이알려졌으며, 산화적스트레스를유발하는 H 2O 2 등도세포핵의 DNA를손상시키는것으로알려져있다 (Navarrete et al. 1997; Rajos 1999; Gichner et al. 2000). Comet 분석은주로동물세포를대상으로약물이나환경오염물질에대한핵 DNA의손상정도를신속하게시각적으로판단하는유용한기법으로유전독성학, 의학, 환경의모니터링등에다양하게이용되어왔다 (Fairbairn et al. 1995). 식물세포는동물세포와달리세포벽을가지고있어온전한핵을나출시키는데세포벽의해리과정이필요하다 (Navarrete et al. 1997). 식물에서 comet 분석을시도한예를보면, 돌연변이유발물질인 EMS를담배의잎에처리하여핵 DNA의손상및회복정도와돌연변이를파악하였고 (Gichner et al. 2000), maleic hydrazid 나 X-ray(Koppen and Angelis 1998) 등을처리한식물체의유전독성효과를조사한바있다. 본실험에서는마추출물을담배배양세포에전처리한후방사선을처리하여세포의활력, 세포의생체중및핵 DNA가손상되는정도를분석하였다. 20 Gy의방사선을처리하기전에마추출물중 MeOH 또는 EtOAc 분획추출 물을처리한경우방사선에의한세포활력과생체중의억제를현저히감소시키는효과가인정되었다. 한편분획추출물중 EtOAc 또는 n-butanol 추출물의전처리는방사선이처리에의한세포의핵 DNA 의손상에대해상당한보호효과가있는것으로나타났다. 한편 EtOAc 분획추출물이방사선을처리한세포의활력과생체중의억제를현저하게경감한효과와동일한분획추출물이방사선에의한핵 DNA의손상을경감하는효과와는밀접한관련성이있을것으로사료된다. 따라서 EtOAc 분획추출물에는세포를환경스트레스로부터보호하여세포의생존력을증가시키는물질이존재함을시사하고있다. 지금까지식물체추출물을대상으로생물체의핵 DNA 손상억제효과를연구한결과가없으나, 추출물의구체적인효과와기작을밝히기위해서는마추출물로부터핵 DNA의손상을억제하는물질의분리동정이필요할것으로사료된다. 한편이들물질이동식물의타환경스트레스에의한 DNA 손상에미치는영향에관한연구도필요하다. 금후이연구는마추출물이식물의환경스트레스에의한유전독성과돌연변이유발을경감하는원인물질을탐색하여작물보호에이용될수있을것이다. 사사본연구는 2008년도농림기술센터연구비지원에의해수행되었습니다. -465-
韓資植誌 Korean J. Plant Res. 22(5) : 461~466(2009) 적요식물세포에마 (Dioscorea batatas Dence) 추출액의전처리가방사선스트레스에노출된배양세포의활력, 생장및핵 DNA 손상에미치는영향을조사하였다. 마의분획추출물중 EtOAc 분획추출물을식물세포에전처리하고 20 Gy의방사선에노출시키면, 마추출물을전처리하지않고방사선 20 Gy만처리한세포보다세포의활력과생체중이 20% 이상증가하였다. Comet 분석에서꼬리부분의길이 (T) 와머리부분의길이 (H) 를측정하여 T/H 비율을조사하였다. 무처리세포와방사선 20 Gy를처리한세포의 T/H 비율은각각 1.05 및 1.68로나타났고, head DNA 량은각각 86.7% 및 71.3% 로무처리세포와방사선을처리한세포간에는큰차이를보여, 방사선에의한심각한핵 DNA 손상을관찰할수있었다. 그러나마추출물중 MeOH, EtOAc 및 n-buoh 분획추출물을식물세포에전처리하고 20 Gy 방사선을처리하면, T/H 비율은각각 1.37, 1.01 및 1.10이었고, head DNA 량은 81.5%, 87.6% 및 88.7% 로방사선을처리하지않은무처리세포수준으로회복되었다. 인용문헌 Baek, S.H., S.H. Kim, K.H. Son, K.C. Chung and H.W. Chang. 1994. Inactivation of human pleural fluid phospholipase A 2 by dioscin. Arch. Pharm. Res. 17:218-222. Fairbairn, D.W., P.L. Olivie and K. O Neill. 1995. The comet assay : a comprehensive review. Mutation. Res. 339:37-44. Gichner, T., O. Ptacek, D.A. Stavreva, E.D. Wagner and M.J. Plewa. 2000. A comparison of DNA repair using the comet assay in tobacco seedlings after exposure to alkylating agents or ionizing radiation. Mutagenesis. 15:503-506. Kim, C.M., K.H. Son, S.H. Kim and H.P. Kim. 1991. Steroidal sapogenin contents in some domestic plants. Arch. Pharm. 14:305-310. Kim, J.S., Y.K. Lee, H.S. Song, H.S. Park and J.K. Kim. 1999. Effects of low dose ionizing radiation on the growth and yield of soybean cultivars. Kor. J. Environ. Agriculture. 18:66-69. Koppen, G. and K.J. Angelis. 1998. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32:281-285. Kwon, S.T., E.A. Jung and J.S. Kim. 2001. Effect of γ -radiation on growth and antioxidant enzyme activities in red pepper. Kor. J. Life Science. 11:612-617. Murashige, T., F. Skoog. 1962. Revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15:473-479. Navarrette, M.H., P. Carrera, M. Mitguel and C. Torre. 1997. A fast comet assay variant for solid tissue cells. The assessment of DNA damage in higher plants. Mutation Res. 389:271-279. Noroozi, M., W.J. Angerson and M. Lean. 1998. Effects of flavonoids and vitamin C on oxidative DNA damage to human lymphocytes. Am. J. Clinical Nutrients. 64:1210-1218. Rojas, E., M.C. Lopez and M. Valverde. 1999. Single cell gel electrophoresis assay; methodology and application. J. Chromatography B. 772:225-254. Stepleton, A.E. and V. Walbot. 1994. Flavoniods can protect maize DNA from the induction of ultraviolet radiation damage. Plant Physiol. 105:881-889. Towil, L.E. and P. Masure. 1975. Studies on reduction of 2,3,5-TTC as a viability assay for plant tissue. Can. J. Bot. 53:1097-1102. ( 접수일 2009.7.22; 수락일 2009.9.22) -466-