大韓本草學會誌제 29 권제 4 호 (2014 년 7 월 ) Kor. J. Herbology 2014;29(4):13-20 ISSN 1229-1765(Print), ISSN 2288-7199(Online) http://dx.doi.org/10.6116/kjh.2014.29.4.13. 아토피피부염외치치료제처방개발을위한실험적연구 김건우 1#, 박지원 1, 심부용 1, 김동희 1,2* 1 : 대전대학교한의과대학병리학교실, 2 : 대전대학교난치성면역질환의동서생명의학연구센터 An experimental study for the development of prescription on atopic dermatitis Gun Woo Kim 1#, Ji Won Bak 1, Boo-Yong Sim 1, Dong Hee Kim 1,2* 1 : Department of Pathology, College of Oriental Medicine, Daejeon University 2 : Traditional and Biomedical Research Center(TBRC), Daejeon University ABSTRACT Objectives : Atotang was composed of 10 kinds of traditional medicinal herb. This research was performed to examine biological effects of Atotang for the development of prescription on atopic dermatitis. Methods : Atotang was extracted with 80% EtOH. Free radical scavenging assay has tested for anti-oxidative activity as well as the contents of total polyphenol. We observed the production of ROS, nitric oxide(no) and the inflammatory cytokines such as interleukin-1beta(il-β), IL-6, tumor necrosis factor-alpha(tnf-α), Prostaglandin E2(PGE 2) in Raw 264.7 cells stimulated by LPS. We used Disc diffusion method to investigate antibacterial activity on Candida albicans, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermis. Result : Content of total phenolic compound of Atotang was 36.3 mg/g ext. DPPH and ABTS scavenging activities were 77% and 46% at 200 ug/ml respectively, showing dose-dependent increase. The amounts of ROS and NO in RAW 264.7 cells were decreased by 30% and 19% at 200 ug/ml, respectively, showing dose-dependent decrease. The prodcution of IL-1beta, IL-6 and TNF-alpha in RAW 264.7 cells were decreased dose-dependently by 81%, 67%, and 20% at 200 ug/ml, respectively. Atotang was reduced LPS-stimulated production of PGE 2 by 33%. Atotang on C. albicans, S. aureus and S. epidermis was selected by a disc diffusion method and inhibition effect of the Atotang on the growth of S. epidermis was the greatest. Conclusion : The results indicated that Atotang showed biological activities showing anti-oxidant, anti-inflammatory and antibacterial effects. Based on these results, it is concluded that Atotang can be applied to the prescription on atopic dermatitis. Key words : anti-oxidant effect, anti-inflammatory effect, antibacterial effect, atopic dermatitis 서론 1) 아토피는고대그리스어인 'a-topos' 가어원으로피부의만성적인염증성질환으로피부건조증및가려움증이주증상이며 1), 그외홍반, 피부균열, 염증진행과가피형성등의증상이장기간동안회복, 재발생이반복되는만성-소모성질환으로가족력과관련이있다 2). 2000년대접어들면서그유병률이매우빠른속도로증가하고있어인류가해결해야할중요한난치성피부질환으로인식되고있다 3). 아토피피부염 은환경적요인뿐만아니라면역학적요인도작용하는데, 특히 IgE 수치의증가와 helper T cell의침윤이중요한역할을하고있는것으로보고 3,4) 되고있다. 또한피부장벽의손상도아토피피부염을악화시키는요인으로알려져있는데, 손상의원인및아토피피부염의발생요인중산화적손상과의관련성이제기 3) 되고있다. 또한아토피환자의피부에서포도상구균과같은세균이나바이러스등에의해피부염증이악화 3,5) 된다는보고도있다. 주로사용되는약물로는항히스 * 교신저자 : 김동희. 대전광역시동구대학로 62 번지. 대전대학교한의과대학 Tel : 042-280-2623 FAX : 042-280-2624 E-mail : dhkim@dju.kr # 제 1 저자 : 김건우. 대전광역시동구대학로 62 번지. 대전대학교한의과대학 Tel : 042-280-2828 FAX : 042-280-2624 E-mail : gunwoo1980@hanmail.net 접수 :2014 년 6 월 30 일 수정 :2014 년 7 월 16 일 채택 :2014 년 7 월 16 일
14 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 4, 2014 타민제, 스테로이드제, cyclosporin, DNA 합성저해제등다양한약물이임상에서사용 6) 되고있으나, 이들을장기간사용했을때각종부작용이문제되고있어새로운치료법에대한필요성이증가 3) 되고천연물로부터기능성물질을찾아내려고하는노력들이다양하게이루어지고있다 7). 한약재 50여종을가지고아토피관련실험을통해선택된 10가지약물을조합하여아토피외치치료용으로개발하고자아토탕을만들었으며, 본연구에서는아토탕에대한항염및항산화, 항균작용에대한효과를연구하였다. 항산화작용을검증하기위해폴리페놀함량측정, DPPH 소거능검사, ABTS 소거능검사및 ROS 생성에미치는영향을조사하였고, 항염증효과를보기위해 RAW 264.7 세포에서 NO 생성억제능, 사이토카인생성량측정, Prostaglandin E2 생성량을측정하였다. 또한, 항균작용을보기위해디스크확산법을시행하였다. 재료및방법 1. 재료 1) 약재본실험에사용한아토피탕의구성약재들은 ( 주 ) 옴니허브 (Daegu, Korea) 에서구입하였고, 대전대학교지역혁신센터난치성면역질환의동서생명의학연구센터 (TBRC) 에서정선후사용하였다. 그내용과분량 (1첩) 은다음과같다 (Table 1). Table 1. The Composition of Component Herb Latin Name Weight (g) 苦蔘 Sophorae Radix 6 蕎麥 Fagopyri Semen 6 白鮮皮 Dictamni Radicis Cortex 6 蛇梅 Duchesneae Herba 8 沙參 Adenophorae Radix 6 松津 Terebinthinae Oleum 6 魚腥草 Houttuyniae Herba 8 烏梅 Mume Fructus 6 紫草 Lithospermi Radix 8 地膚子 Kochiae Fructus 6 Total 66 Immunoassay kit은 Millipore사 (Bellerica, MA, USA) 에서, HNO3(Duksan, Korea), As, Pb, Hg, Cd standard solution(scp Science, Canada), Folin-Ciocalteu's phenol reagent(merck, Germany), gallic acid(sigma-aldrich, USA), sodium carbonate (Sigma-Aldrich, USA), Nutrient Broth와 Nutrient Agar는 DIFCO사 (MD, USA), 종이디스크 (Whatman, England) 를사용하였다. 본실험에사용된기기는 rotary vacuum evaporator(eyela, Japan), CO incubator (SANYO, Japan), Freeze dryer (IlShin, Korea), ELISA reader (Molecular Devices, U.S.A), Luminex (Millipore, U.S.A.), Flow cytometry system(bd Biosciences immunocytometry systems, U.S.A.) 를이용하였으며, ICP(Shimadzu, Co., Japan), 수은분석기 (TELEDYNE Leeman Labs, USA) 등을사용하였다. 2. 방법 1) 시료제조아토탕 1첩을 80% 에탄올 1 l에넣고, 3시간동안환류추출하였다. 그여액을 rotary evaporator 를이용하여 50 ml로감압, 농축하여동결건조한후완전건조된조성물을냉동보관하여사용하였다. 2) 안정성검사 (1) 중금속검사납, 비소, 카드뮴분석의경우조성물 0.5 g을극초단파시료전처리장치전용용기에넣고질산 10 ml을넣은후, 용기를후드안에정치시켜발생가스를제거하고극초단파시료전처리장치를사용하여분해하였다. 분해가끝난다음분해액을여과지로여과하여용량플라스크에넣고물을넣어적절하게표준액의농도범위로희석하여검액으로하였다. 따로질산 10 ml를극초단파시료전처리장치전용용기에넣어검액조제와같은방법으로조작하여공시험액으로사용하였다. 준비된검액, 표준액및공시험액을가지고유도결합플라즈마분광계 (ICP) 를이용하여검량선을작성하고공시험액으로보정하여검액을측정하였다. 수은분석의경우조성물 50 mg 을정확하게달아특별한전처리과정없이수은분석기를이용하여측정하였다. 2) 세포실험에사용된 RAW 264.7 세포는한국세포주은행에서구입하였다 3) 시약및기기 Lipopolysaccharide(LPS), dimethyl sulfoxide (DMSO), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) 는 Sigma-Aldrich사 (st. Louis, MO, USA) 에서, Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), Penicillin 및 Streptomycin 은 Hyclone사 (Logan, Ut, USA) 에서, Cell viability assay kit은 Daeillab sevice사 (Seoul, Korea) 에서, Nitric Oxide detection kit은 Intron Biotechnology사 (Suwon, Korea) 에서구입하였다. Cytokine Milliplex Map (2) 세포독성측정 Raw 264.7 세포는 96 well plate에 10 4 cells/well로분주하여 24시간동안배양하였다. 실험을하기전에새로운배양액으로교체하였고, 아토탕 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg / ml의농도로처리하여다시 24시간동안배양하였다. 배양후 10 μl의 WST solution 을첨가하여세포배양기 (3 7, 5% CO 2) 에서 30분간반응시켰다. 반응후 450 nm에서흡광도의변화를측정하여대조군에대한세포생존율을백분율로표시하였다. 3) 항산화활성측정 (1) 총폴리페놀함량측정총폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteu 시약을이용하는방
아토피피부염외치치료제처방개발을위한실험적연구 15 법으로측정하였다. 아토탕 1 ml에 50% Foiln-Ciocalteu's phenol reagent 0.5 ml를가하여실온에서 3분간반응시켰다. 반응용액에 Na 2CO 3 포화용액 1 ml와 7.5 ml증류수를차례로혼합하여 30분간정치시킨뒤, 12,000 rpm에서 10 분간원심분리한후상등액을취해 760 nm에서흡광도를측정하였다. 총폴리페놀함량은 gallic acid를표준물질로이용하여작성한검량선에따라함량을구하였으며측정단위로는 GAE(Gallic acid equivalent)/g 을사용하였다. (2) DPPH radical 소거능측정자유라디칼소거활성시험은안정한자유라디칼 DPPH를사용하는방법으로에탄올에용해시킨 0.2 mm의 DPPH 용액 150 ul와아토탕 50, 100, 200 μg / ml을 100 ul씩각각혼합하여 37 에서 30분간반응시킨후, 517 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군은시료액대신물을넣어보정값을얻었다. 자유라디칼소거율은아래의식에따라계산하였다. 소거율 (%)= (1- 시료첨가군의흡광도 ) 100 대조군의흡광도 (3) ABTS radical 소거능측정 ABTS assay 방법은기존에보고된방법을 96 well plate 에맞게수정하여실시하였다. ABTS 용액은 7.4 mm ABTS (2,2 azino bis-(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)) 와 2.6 mm potassium persulphate 를제조한후, 암소에하루동안방치하여양이온 (ABTS +) 을형성시킨다음 734 nm에서흡광도를측정하여흡광도값이 1.5 이하가나오도록희석하고, 희석된 ABTS + 용액 150 μl와아토탕 5 μl를혼합하고, 실온에서 10분간반응시킨후, 734nm에서흡광도를측정하였다. 항산화능은증류수를대조군으로하여대조군에대한 ABTS 라디칼소거능을백분율로나타내었다. 소거율 (%)= (1- 시료첨가군의흡광도 ) 100 대조군의흡광도 (4) 세포내 ROS 활성측정 Raw 264.7 세포내에서 reactive oxygen speies (ROS) 를측정하기위하여 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) 를이용하였다. 12well plate에 Raw 264.7 세포를 1.5 10 cells/well 이되게분주하였다. 24시간동안배양한후, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml과 LPS 1 μg / ml을처리하여, 다시 24시간동안 37, 5% CO 배양기에서배양하였다. 배양후, 1,200 rpm에서 5분간원심분리하여모은세포를차가운 PBS로 2회세척한후, DCF-DA 10 µm이되도록첨가하여 15분동안빛이차단된 37 에서염색하였다. 염색후차가운 PBS를넣어 1,200 rpm에서 5분간원심분리한다음상청액을제거하고다시 PBS 400 μl를부유시켜유세포분석기 (Flow cytometer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ USA) 를이용하여형광강도의세기에따른변화를분석하였다. 4) 항염증효능측정 (1) Total Nitric oxide 생성억제효과측정 NO의농도는배양액내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을이용하여측정하였다. Raw 264.7 cells은 96well plates에 10 4 cells/well 로분주하여 24시간동안배양한후, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml과 LPS 1 μg / ml을각각처리하여, 다시 24시간동안 37, 5% CO 배양기에서배양하였다. N1 buffer를 50 μl를각 well에처리한후, 10분간상온에서암소반응후, N2 buffer 50 μl를각 well에처리하고, 10분간반응시킨후, 540 nm에서흡광도를측정하였다. Nitrite standard 의농도별표준곡선을이용하여배양액의 NO 농도를결정하였다. (2) 사이토카인생성량측정 Raw 264.7 cells을 12 well plates에 1.5 10 cells/ ml이되도록분주하고, 24시간동안배양한후, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml과 LPS 1 μg / ml을처리하였다. 다시 24시간동안 37, 5% CO 배양기에서배양한후세포배양액을수거하여배양액에함유된 IL-1β, IL-6, TNF-α 를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을이용하여측정하였다. 분석은 Milliplex analyst를통해이루어졌다. (3) PGE 2 생성량측정 Raw 264.7 cells을 12 well plates에 1.5 10 cells/ ml이되도록분주하고, 24시간동안배양한후, 아토탕 50, 100, 200 ( μg / ml ) 과 LPS 1 ug/ ml을처리하였다. 24시간동안배양한후세포배양액을수거하여일정량의상등액을취해 PGE 2 kit을사용하여 PGE 2 측정하였다. 5) 항균활성측정 ( 디스크확산법 ) Candida albicans, Staphylococcus aureus, S. epidermis 를대상으로디스크확산법을시행하였다. Nutrient broth 액체배지에서 30, 24시간배양한균주를 0.5 McFarland 탁도 (530 nm) 로맞추어균농도가 1.5 X 10 6 CFU/ml 되도록제조하였다. 균액을 pour plating 방법으로 NA (Nutrient agar) 배지에고르게도말한후 DMSO에녹인항균제를각각 0.1, 0.2, 0.4 mg의농도로 6 mm 종이디스크에투여하였다. 균을접종한배지를 30 에서 48시간배양한후균의생장이억제된크기를보았다. 6) 통계처리본실험에서얻은결과는세번이상의반복된실험결과를평균 ± S.D. 값으로나타내었고, 유의성검증은 Student's t-test 분석법을이용하여통계처리하였다. p values가 0.05 이하인경우통계적으로유의성이있는것으로보았다. 1. 중금속함량 결과 아토탕의중금속함량을측정한결과, 납의경우검출되지않았고, 그외중금속의경우기준치이하로검출되었다 (Table 2).
16 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 4, 2014 Table 2. Content of Pb, As, Cd and Hg in Component. Pb As Cd Hg Permissive density (mg/kg) 5 3 0.3 0.2 Component N.D. 1) 0.35 0.01 0.002 1) N.D. : Not detected. 2. 세포독성 Raw 264.7 세포의생존율에미치는영향을알아보기위하여 MTT assay를실시하였다. 대조군을 100 ± 7.3% 로나타냈을때, 아토탕 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg / ml농도에서각각 103.8 ± 12.5%, 101.6 ± 11.2%, 93.6 ± 13.9%, 91.1 ± 6.0%, 90.6 ± 8.0%, 86.4 ± 13.2% 의세포생존률을나타내었고 50, 100, 200 μg / ml농도로실험을진행하였다 (Fig. 1). Fig. 2. DPPH and ABTS free radical scavenging activity of Atotang. The extract was incubated with DPPH solution at 37 for 30 mins and ABTS solution at RT for 10 mins. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 nm for DPPH and at 734nm for ABTS. The results are expressed as mean±s.d. from three independent experiments. 3) ROS 생성에미치는영향아토탕의 ROS 생성저해활성은대조군을 100.0 ± 12.1(%) 로나타냈을때, 정상군은 44.3 ± 6.8(%) 으로나타났으며, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml농도에서각각 90.9 ± 4.5(%), 74.2 ± 6.5(%), 69.9 ± 5.0(%) 로나타나, 대조군에비하여 100과 200 μg / ml의농도에서유의성있는 ( **, p<0.01, ***, p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 3). Fig. 1. Effects of Atotang on the cell viability of RAW 264.7 cells. Cells were treated with 25, 50, 100, 200, 400, 800 ug/ml of Atotang for 24hr. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean ± S.D. from three independent experiments. Statistical significance is based on the difference when compared with 0 ug/ml. 3. 항산화능에미치는영향 1) 총폴리페놀함량아토탕에존재하는총폴리페놀함량을 gallic acid를표준물질로하여측정한결과, Table 3과같이 36.3 mg/g의폴리페놀함량을나타냈다 (Table 3). Table 3. Total phenolic contents of Atotang. 1) Total phenolic contents was expressed as milligram of gallic acid equivalent (GAE) per gram of extract. Fig. 3. Effects of Atotang on the ROS production in Raw 264.7 cells. The Raw 264.7 cells were stimulated with LPS(1ug/ml) and treated with Atotang(50, 100, 200 ug/ml) for 24 hours. The ROS production was analysed following incubation with DCFH-DA by flow cytometry. The results were represented by the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test ( **, p<0.01, ***, p<0.001). 4. 항염증효능에미치는영향 1) Total Nitric oxide 생성에미치는영향아토탕의 NO 생성량은대조군을 100.0 ± 3.1(%) 로나타냈을때, 정상군은 23.0 ± 4.9(%) 로나타났으며, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml농도에서각각 98.9 ± 2.2(%), 81.3 ± 1.2(%), 81.0 ± 1.5(%) 로나타나농도의존적으로감소를했으며, 대조군에비하여 100과 200 μg / ml의농도에서유의성있는 ( ***, p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 4). 2) ABTS radical 소거능에미치는영향아토탕의 ABTS 소거율을측정한결과, 50, 100, 200 μg / ml각각의농도에서 12.4 ± 3.0%, 23.3 ± 2.3%, 46.2 ± 3.3% 로나타났으며농도의존적으로라디칼소거능이증가함을나타내었다 (Fig. 2). Fig. 4. Effects of Atotang on LPS-induced NO production in Raw 264.7 cells. Cells were stimulated with LPS(1ug/ml) and treated with Atotang (50, 100, 200 ug/ml) for 24hr. The results were represented by the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test ( ***, p<0.001).
아토피피부염외치치료제처방개발을위한실험적연구 17 2) IL-1β생성량에미치는영향아토탕의 IL-1β 생성량은대조군에서 32.3 ± 4.5 (pg/ml), 정상군에서 4.2 ± 5.5 (pg/ml) 를생성하였으며, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml농도에서각각 27.6 ± 2.2 (pg/ml), 26.8 ± 2.2 (pg/ml), 25.5 ± 5.2 (pg/ml) 를생성하여농도의존적으로감소를하였으나, 유의성은나타나지않았다 (Fig. 5). 희석한후 C. albicans, S. aureus, S. epidermis를대상으로디스크확산법을시행하였다. 그결과 0.4 mg의농도에서 C. albicans, S. aureus, S. epidermis 모든균주에항균활성을나타내었다. S. epidermis에서 7 mm 정도의항균활성을보여가장높았으며, 다음으로 S. aureus와 C. albicans에서 5와 3 mm의항균활성을나타내었다 (Fig. 6). 3) IL-6 생성량에미치는영향아토탕의 IL-6 생성량은대조군에서 61212.3 ± 11624.3 (pg/ml), 정상군에서 2.6 ± 1.2 (pg/ml) 를생성하였으며, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml농도에서각각 41988.1 ± 9350.6 (pg/ml), 40712.5 ± 3954.0 (pg/ml), 19880.6 ± 9089.6 (pg/ml) 를생성하여농도의존적으로감소를했으며, 대조군에비하여 100과 200 μg / ml의농도에서유의성있는 ( *, p<0.05) 감소를나타내었다 (Fig. 5). 4) TNF-α 생성량에미치는영향아토탕의 TNF-α생성량은대조군에서 6055.3 ± 1230.3 (pg/ml), 정상군에서 128.5 ± 14.5 (pg/ml) 를생성하였으며, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml농도에서각각 5828.6 ± 903.1 (pg/ml), 5724.8 ± 630.5 (pg/ml), 4819.6 ± 631.5 (pg/ml) 를생성하여농도의존적으로감소를하였으나유의성은나타나지않았다 (Fig. 5). 5) PGE 2 생성량에미치는영향아토탕의 PGE 2 생성량은대조군에서 943.7 ± 100.4 (pg/ml), 정상군에서 386.8 ± 170.6 (pg/ml) 를생성하였으며, 아토탕 50, 100, 200 μg / ml농도에서각각 906.7 ± 91.0 (pg/ml), 644.9 ± 91.3 (pg/ml), 631.9 ± 84.8 (pg/ml) 를생성하여농도의존적으로감소를하였고, 대조군에비하여 100과 200 μg / ml의농도에서유의성있는 ( ***, p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 5). Fig. 5. Effects of Atotang on LPS-induced IL-1β, IL-6, TNF-α and PGE 2 production in Raw 264.7 cells. Cells were stimulated with LPS(1ug/ml) and treated with Atotang(50, 100, 200 ug/ml) for 24hr. The results were represented by the mean ± S.D. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test( *, p<0.01, ***, p<0.001). 5. 항균작용에미치는영향 아토탕의항균활성은각각 0.1, 0.2, 0.4 mg 의농도로 Fig. 6. Antibacterial activity of Atotang from Candida albicans, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermis. A : 0.1 mg, B : 0.2 mg, C : 0.4 mg 고찰 아토피피부염은 1933년 Wise와 Sulzberger 에의해처음제안된질환 8) 으로유소아기부터주로발생 9) 하는만성적재발성의염증성피부질환 10-12) 으로, 현재까지정확한원인과발병기전이밝혀져있지않으나, 유전적, 환경적, 면역학적, 심리적, 약리적및표피장벽기능이상의복합적인결과 13,14) 로나타난다. 또한, 여러종류의세균과진균에대한감염증은아토피피부염의병인기전에서중요한역할을하는데, S. aureus은아토피피부염환자의피부감염의가장흔한원인균으로서, 환자의증상정도와피부에형성된균수와상관관계가있다 15). S. aureus는특히화상부위에침입해전신적으로퍼져나가맹장염, 담낭염, 골수염등의원인이되기도하고인체의여러염증질환에작용하는중요한미생물중하나인것으로알려져있다 16). 세균못지않게정상피부에존재하는진균도아토피피부염의발생에영향을주는것으로알려져있는데, 피부를뚫고침투하여면역반응을유발할수있으며, 이러한반응이아토피피부염의악화인자로작용할수있다. 아토피피부염의경우에는집먼지진드기보다오히려진균의일종인 C. albicans가알레르기유발물질로더강력하게작용한다는연구결과도보고 17) 되어있다. 아토피피부염의치료는주로염증과소양감의조절, 2차병변의발생방지를목적으로스테로이드제나항히스타민제가사용되고있지만, 약물의지속적인사용시심각한문제를일으킬수있으며피부부작용뿐아니라전신적부작용의발생우려가커새로운아토피피부염치료제의개발이절실히필요하며, 치료제의개발과관련된재료로부작용이적은천연물이사용 7) 되어지고있다. 천연물을원료로한신약및기존의치료제에천연물을배합한형태의개발이활성화되고, 다
18 大韓本草學會誌 Vol. 29 No. 4, 2014 양한천연물의항염증, 항산화, 항균및소양감억제작용등의많은연구결과가보고 18) 되고있다. 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 은한개이상의부대전자를가진불안정한화합물을총칭하는것으로세포막을공격하여신호전달체계를망가뜨리고면역력을떨어뜨리며, 때론외부에서박테리아나곰팡이가침입했을때백혈구로부터병원체를방어하는작용 3) 을한다. Niwa 등에따르면, 아토피피부염환자의각질층에는활성산소에의해손상된단백질들이정상인에비해크게증가되며활성산소제거효과의활성도크게감소해있다는연구결과 19) 가있다. 또한, Omato 등에따르면, 아토피피부염이걸린아동에서활성산소로인한내부적손상에대한보고 20) 도있다. 그외에도 Taniuchi 등에의하면, 아토피피부염환자의혈청에 NO 유도체의농도가증가되어있고, 피부염이개선되면혈청내 NO의농도도감소한다고보고 21) 된바있다. 본처방에사용되는구성약물중류등은고삼의 EtOAc 분획물이항산화효능 22) 을, 송은고삼의중요성분이 IgE 생산을억제하여면역조절효과 23) 를, 이등은사매에탄올추출물에대한항산화및항염증효능 24) 을, 조는백선피의항염효능 25) 을나타내는것을보였다. 또한, 나등은지부자추출물이혈관신생억제및항산화, 항염증효과 26) 를, 서등은오매추출물이 NF-kB 조절을통해항염효과 27) 를, 이등은어성초물추출물의항염효능 28) 을, 민은사삼의항산화효과 29) 를보였다. 본연구에서는아토피질환의염증을개선시킬수있는대체치료제와새로운신규소재를발굴하고자항염, 항산화및항균력을연구하여아토피피부염의염증개선원리를이해하고자하였다. 실험에앞서약물의안정성을확보하기위해중금속함량을측정한결과, 비소, 카드뮴, 수은의경우기준치이하로검출되었고납은검출되지않았다. 아토탕의총폴리페놀함량은 36.3 (mg GAE/g ext.) 을나타냈으며, DPPH와 ABTS free radical 에대한소거능이농도의존적으로증가했고, ROS 생성저해활성에미치는영향이유의한감소를보여항산화효능이있음을알수있었다. 페놀성화합물은식물의대표적인 2차대사산물로다양한생리활성에관여하는것으로알려져있으며, 특히항산화활성은페놀성화합물의종류나함량이미치는영향이큰것으로알려져있고 30), 특히항산화작용과관련하여최근생체내에서의산소자유라디칼반응이생체조직의노화나질병과관련이있는것으로보고 31) 되어졌다. DPPH는비교적안정한 free radical 로서항산화물질을검색하는데많이이용되고, 간편하고비용이저렴한항산화실험법으로널리쓰이고있다. ABTS 항산화측정법은 DPPH와같은라디칼소거법에의한항산화능측정법이며, 화학반응을통해 free radical 이유발된용액에시료를넣어항산화를측정한다 32). Reactive oxygen species(ros) 는생체내에서지속적으로생성이되지만적절하게제어되지않으면축적되어단백질, 지질, 핵산등에손상을야기시키며, 질병의원인이되기도한다 31). 또한아토피질환의염증개선효과를검증하고자 RAW 264.7 세포배양액내 NO 생성량과염증사이토카인 (IL-1beta, IL-6, TNF-alpha) 및염증인자인 PGE 2 등의생성량을측정하였다. IL-1β와 TNF-α 는주로대식세포에서 분비되고, T세포와 B세포의기능을증가시키며, NO와 PGE 2 의생성을촉진한다. NO는혈관의긴장, 혈소판기능, 신경전달, 면역기능에서중요한역할을하며, NO의과생산은지속적인염증과조직손상에관련되어있다. 또한, PGE 2 는통증과염증에관여되며, 세포보호, 신장혈류량과기능유지, 그리고신체의평형유지등에매우중요한역할을한다. IL-6은 IL-1과 TNF-α 에의해분비가촉진되는급성조절단백질이며주요한염증성사이토카인이다 33). RAW 264.7 세포에서 NO 생성량을측정한결과아토탕처리군은대조군에비해유의성있는감소를나타내었다. RAW 264.7 세포에서 IL-1β 생성량을측정한결과정상군보다대조군이증가했으며아토탕처리시대조군에비해농도의존적으로감소는하였으나유의성은나타나지않았다. 또한 IL-6의경우정상군보다대조군이증가했으며아토탕처리시대조군에비해유의성있는 ( * p<0.01) 감소를나타내었다. TNF-α의경우정상군보다대조군이증가했으며아토탕처리시대조군에비해농도의존적으로감소는하였다. RAW 264.7 세포에서 PGE 2 생성량을측정한결과정상군보다대조군이증가했으며아토탕처리시대조군에비해유의성있는감소를나타내었다. 아토탕이아토피피부염환자의증상을악화시켜염증을유발할수있는균주 S. aureus, 알레르기유발물질에강력하게작용하는균주 C. albicans, 여드름유발에관여하는 S. epidermis의감염을억제하는지를확인하기위하여항균활성을측정하였는데, S. epidermis, S. aureus, C. albicans 균주순으로성장을억제시켰다. 이와같이아토탕은항산화, 항염증및항균효능을나타냈으며아토피에대한치료제로사용될수있다고생각한다. 추후기본검색을떠나보다다양한인자및구성약물에대한개별적인검색에대한심도있는연구가필요하며, 또한여드름이나각종다양한염증성, 알레르기성피부과질환에임상적으로광범위한활용가치가있을것으로사료되고작용기전에대한연구가지속되어야할것이라사료된다. 결론 아토피피부염외치치료제처방의개발과관련하여아토탕의효능을규명하기위하여산화적손상및염증관련인자들의변화, 항균에대한효과를 in vitro 실험을통해확인한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 아토탕의총폴리페놀함량을측정한결과, 36.3 mg/g 으로나타났다. 2. 아토탕의 DPPH와 ABTS의소거활성은농도의존적으로소거활성을나타냈으며, 특히 200 μg / ml의농도에서각각 76.6% 와 46.2% 의높은소거능을나타내었다. 3. 아토탕은 ROS 생성율을대조군에비해농도의존적으로감소시켰으며, 특히 100과 200 μg / ml의농도에서각각 25.8% 와 30.1% 의유의적인감소를보였다.
아토피피부염외치치료제처방개발을위한실험적연구 19 4. 아토탕은 NO 생성율을대조군에비해감소시켰으며, 특히 100과 200 μg / ml의농도에서각각 18.7% 와 19.0% 의유의적인감소를보였다. 5. 아토탕은 LPS 처리한 RAW 264.7 세포에서대조군에비해 IL-1b 생성율이특히 200 μg / ml의농도에서 21.2% 감소를보였다. 6. 아토탕은 LPS 처리한 RAW 264.7 세포에서대조군에비해 IL-6 생성율이특히 100과 200 μg / ml의농도에서각각 33.5 % 와 67.5% 의유의적인감소를보였다. 7. 아토탕은 LPS 처리한 RAW 264.7 세포에서대조군에비해 TNF-α 생성율이특히 200 μg / ml의농도에서 20.4% 감소를보였다. 8. 아토탕은 LPS 처리한 RAW 264.7 세포에서대조군에비해 PGE 2 생성율이특히 100과 200 μg / ml의농도에서각각 31.7 % 와 33.0% 의유의적인감소를보였다. 9. 아토탕은디스크확산법에서 0.4 mg의농도에서 S. epidermis, S. aureus, C. albicans 순으로항균효과가나타났다. 위결과를종합해보면, 아토탕은항산화능이있고, 면역조절작용에의한아토피피부염염증개선효과와항균효과가객관적을규명되어, 향후다양한임상에서의활용이제고될수있을것으로기대된다. 감사의글 본연구는지식경제부지정대전대학교난치성면역질환의동서생명의학연구지역혁신센터의지원에의한것입니다. References 1. Yang GS. A study on anatibiotic effect of aroma oils on the growth of Staphylococcus aureus existing in the skin of the atopic dermatitis. Chonnam National University. 2007. 2. Lee GH. How aroma oil affects animal model with atopic dermatitis by DNCB on anti-inflammatory and immune. Daejeon University. 2010. 3. Cho SE. Anti-oxidative, anti-inflammatory and immunomodulatory effects of chamaecyparis obtusa leaves extracts for atopic dermatitis. Konkuk University. 2011. 4. Kim JJ, Yang SW, Son NW, Ahn KS. Anti-inflammatory action by gamisangryosamul-tang and the effect of ziyang-go on atopic dermatitis-like lesion and pruritus in NC/Nga mice. Korean J Orient Physiol Pathol. 2003 ; 17(2) : 428-35. 5. Kwon HJ, Kim YJ, Jang SH, Bae BK, Youn HY, Lee HW. Stimulatory effect of staphylococcal protein A on inflammatory response in human HaCaT keratinocytes. Korean J Microbiol. 2011 ; 47(4) : 348-55. 6. Kwon HY. The anti-atopic effects of flavonol content from Ginkgo biloba leaves on NC/Nga murine model with mast cell and DNCB-induced atopy. Daejeon University. 2012. 7. Park DB, Han JK, Kim YH. Effect of Yanghyeuljeseuptang on immunological factors in spleen and draining lymph node of atopic dermatitis induced NC/Nga mouse by dinitrochlorobenzene. Res inst Korean Med. 2007 ; 16(2) : 251-65. 8. Yu JS. The effects of lonicerae flos, forsythiae fluctus and hwangryunhaedok decoction pharmacopuncture on atopic dermatitis in NC/Nga mice. Woosuk University. 2012. 9. Sim BY, Ji JG, Lee WY, Kim SJ, Kim HY, Lee JY, Kim DH. Experimental research of baechsunpijibujabokhap-banng on atopic dermatitis treatment. Res inst Korean Med. 2014 ; 22(2) : 67-79. 10. Bang CK, Choi JJ, Eom DM, Kim DH. The effects of BGG on various immunological factors related to pathogenesis of allergic dermatitis in NC/Nga mice induced by der-f. Res inst Korean Med. 2007 ; 16(2) : 147-69. 11. Jung JH. Anti-inflammatory effects of herbal mixture(rubus coreanus, Rehmanniae Radix, Houttuynia cordata, Betulae cortex) on acute atopic dermatitis mice. Kyungwon University. 2010. 12. Ko HY, Kim DH. Study on combination of external gosamgamibang and internal chenggihaedok-san for the treatment of atopic dermatitis. Korea J Orient Physiol Pathol. 2009 ; 23(6) : 1282-91. 13. Kim TH. Alleviation of atopic dermatitis symptoms by extracts of camellia sinensis. Gyeongsang National University. 2013. 14. Lee IH, Lee SH, Lee IS, Park YK, Chung DK, Choue RW. Effects of probiotic extracts of kimchi on immune function in NC/Nga mice. Korean J Food Sci Technol. 2008 ; 40(1) : 82-7. 15. Jo YR, Kang SM. Lactococcus lactis culture methods for the enhanced depression of inducers in atopic diseases. Korean J Microbiol Biotechnol. 2012 ; 40(4) : 310-8. 16. Kim JM, Oh HC, Song SP, Kim NK, Hwang CY. Study on the anti-microbacterial activity, anti-inflammatory and anti-allergic effects of several herb-extract. Korean J Oreint Physiol
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