BT News 기획특집 : 유전체분석 유전체교정시대의도래와전망 1. 서론 배상수교수한양대학교화학과 sangsubae@hanyang.ac.kr 장현기한양대학교화학과 alwaysjhk@gmail.com 지난 1998년에단호크, 우마서먼, 주드로주연의 가타카 (GATTACA) 라는제목의영화가국내에개봉된적이있다. 다소이상한영화제목은 DNA의 4가지염기인아데닌 (A). 티민 (T), 구아닌 (G), 시토신 (C) 의조합으로만든것인데, 유전공학기술이발달한먼미래를배경으로하고있다. 영화는자연임신으로태어난인간과유전자편집을통해우성인자들만가지고태어난인간이계층적으로구분되어살아가는모습을보여준다. 그런데당시에는예술인들의상상력으로구성한내용들이오늘날에와서는점차현실이되고있다. 이는바로제3세대유전자가위기술로일컬어지는 크리스퍼 (CRISPR) 유전자가위 기술의등장에기인한다. 이미 2015년에중국연구진들에의해인간의수정란인배아세포에서최초로중증빈혈질환과관련한유전자교정이성공한바있고, 올해 8월에는한국기초과학연구원 (IBS) 과미국오리건보건과학대 (OHSU) 등이공동연구를통해인간의배아세포에서심장질환을유도한다고알려진 MYBPC3 유전자의변이를성공적으로교정한연구내용이학술지 <Nature> 에서발표되었다. [1] 이는과학계뿐아니라, 사회, 법, 윤리분야에큰충격을주고있는데, 특정유전자의변이에기인한유전질환에대한치료법으로서기대감과, 정상적인개체로자랄수있는인간배아의유전자를교정하는것에대한우려를동시에낳고있다. 크리스퍼유전자가위의원리가되는 CRISPR-Cas 시스템은본래원핵생물이가지고있는후천적면역체계 (adaptive immunity) 로서, 외부의바이러스나다른원핵생물의유전물질이침투하면이를인지하고잘라내는역할을한다. [2] 2012년에는대표적인시스템인 CRISPR-Cas9의작동기작이매우자세히밝혀졌는데, 그특징은표적유전자에대한상보적인염기서열을가지고있는 crrna와 crrna에상보적으로결합하는 tracrrna가 Cas9 단백질과결합하여 Cas9이표적유전자를인식하고자르도록유도한다는점이다. [3] 즉, Cas9이라는단백질과이를타겟 DNA에인도해주는가이드 RNA만있으면, 특정부위의 DNA를인식해서자를수있다는내용으로, 30 2017 Vol.24 No.2
유전체교정시대의도래와전망 그림 1. 크리스퍼유전자가위의모식도. ( 가 ) 자연계에서발견된크리스퍼유전자가위의구성인자. Cas9 단백질과한쌍의가이드 RNA (crrna and tracrrna) 로구성되어있다. ( 나 ) 개조된크리스퍼유전자가위의구성인자. 하나로연결된가이드 RNA (single guide RNA; sgrna) 로작동할수있고, 자르는도메인을망가뜨린불활성 Cas9 단백질 (deactivated Cas9; dcas9) 을만들수있다. 그구성인자들을간단하고쉽게만들수있다. ( 그림 1) 그리고 1년도채안되어서복수의연구자들이독립적으로 CRISPR-Cas9을이용하여인간세포를포함한동물세포에서유전체편집에성공하였으며, 현재까지미생물, 식물, 곤충등다양한종에서매우폭넓게이용되고있다. [4-7] 본고에서는최근까지계속해서개발되고있는크리스퍼시스템을이용한유전체교정기술에대해설명하고, 그의미에대해간단히밝히고자한다. 2. 본론 2.1 세포본연의 DNA 수선기작을이용한유전자편집 크리스퍼유전자가위는기본적으로특정 DNA 타겟을자르는것으로, 절단된 DNA는이후세포스스로의다양한 DNA 수선기작 (DNA repair pathway) 에의해복구된다. 인간과같은고등세포에서는 DNA 수선은주로비상동말단부착 (nonhomologous end joining; NHEJ) 이라는기작을통해이루어진다. 비상동말단부착기작은종종몇개의염기서열이추가되거나제거되는삽입및결실 (Indel) 의돌연변이를유도하고, 이로인해유전자의코돈구성이어긋나면유전자의기능이망가지게된다. 이를이용하여특정유전자의녹아웃 (Knock-Out) 을유도할수있다. 한편, 크리스퍼유전자가위에의한 DNA 절단은때때로동형방식수선 (homology directed repair; HDR) 기작을통해고쳐지기도한다. 이때는동형유전자 (homologous DNA) 조각을주형으로하여돌연변이없이정확하게 DNA가복구된다. 이과정에서, 외래의원하는염기서열의 DNA 공여체 (donor DNA) 를다량으로넣어주면외래의 DNA 공여체를기반으로동형방식수선이이루어진다. 이를통해유전자의특정돌연변이를교정하거나외래유전자를삽입하는녹인 (knock-in) 을유도할수있다. 2.2 다양한종의크리스퍼유전자가위 현재가장널리쓰이고있는크리스퍼유전자가위는 Streptococcus pyogenes 종에서유래한 CRISPR-Cas9 시스템 으로, SpCas9 이라는단백질과표적유전자의 20 개염기서열을인식하는 sgrna 로구성된다. 이유전자가위는 DNA BT News 2017 31
BT News 기획특집 : 유전체분석 그림 2. Class II 크리스퍼유전자가위의작동모식도. ( 가 ) Cas9 은표적 DNA 염기서열말단의 PAM 을인식하고, PAM 과가까운위치의 DNA 를잘라서평활말단 (Blunt end) 을만든다. 종에따라 PAM 의길이및서열이다르다. *NGG 는 SpCas9 의 PAM. ( 나 ) Cpf1 은표적 DNA 염기서열의시작부분 (Upstream) 의 5 -TTTV-3 PAM 을인식하고 PAM 에서먼쪽의 DNA 를잘라점착말단 (Staggered end) 을만든다. ( 다 ) C2c2 는표적 RNA 와결합하여활성화되면표적 RNA 뿐아니라비표적 RNA 도자른다. ** 표적 RNA 가잘리는위치는아직까지명확하게밝혀지지않았다. 에있는 5 -NGG-3 의 PAM (protospacer adjacent motif) 이라불리는염기서열을인식해서 DNA에결합하고 DNA 를자른다. 이를이용하면이론적으로전체유전체내에서 1/8에해당하는부분을특이적으로자를수있게된다. SpCas9외에도많은종의세균에서유래한다양한변종들 (orthologs) 이발견되고있다. [8] 크게분류하자면, 여러단백질들이모여 Cascade를형성해야만 DNA를인식하고자르는 Class I과하나의단백질이타겟 DNA를인식하고자를수있는 Class II 가있다. 이중에서하나의단백질로작동하는 Class II가유전체편집에이용하는데유리하다. Class II 크리스퍼중에서 SpCas9은 Type II로분류되는데, Type II는 DNA를자르는 HNH domain과 RuvC domain 이있고, 평활말단 (Blunt end) 을만드는특징이있다. SpCas9 외에도크기가작아 Adeno-associated virus (AAV) 벡터를이용한전달이가능한 Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) 과 Campylobacter jejuni Cas9 (CjCas9) 과, 다양한 PAM을인식하는 Streptococcus thermophiles Cas9 (StCas9), Neisseria meningitides Cas9 (NmCas9), Treponema denticola Cas9 (TdCas9) 등이유전체편집에이용되고있다. 한편, Class II 중에서 Cpf1 (Cas12a) 은 Type II Cas9과달리, tracrrna없이 crrna만으로도타겟 DNA를인식하고자를수있고, 표적 DNA 타겟염기서열의시작부분 (Upstream) 에있는 5 -TTTV-3 을 PAM으로인식하는특성이있어, 이를따로 Type V로분류하였다. [9] 최근에는 Cpf1이 Cas9에비해더욱표적에특이적으로작동하고, 표적이아닌곳 (off-target site) 에작동하는빈도가적다는연구결과가보고되기도했다. [10] 또한, 가장최근에는 Class II 중에서 DNA 이중나선을표적으로하여자르는 Cas9이나 Cpf1과달리, 한가닥 RNA 를표적으로하여자르는 C2c2 (Cas13a) 단백질이발견되었는데이를새롭게 Type VI로분류하였다. [11] C2c2는 C2c1 (Cas12b), C2c3 (Cas13c) 와함께박테리아의유전체데이터분석을통해예측되었는데, [12] Cpf1처럼 tracrrna를필요로하지않는특징이있고, [13] 표적 RNA와결합한후에는비표적 RNA들까지자르는특성이있어, 특정바이러스를검출하는센서로개발되기도하였다. [14] Class II 유전자가위의여러형태를정리하면위의그림 2와같다. 2.3 크리스퍼유전자가위변형을통해만든새로운유전자교정기술 크리스퍼유전자가위는기본적으로가이드 RNA 와상보적인타겟 DNA 에결합하여이중나선을절단하는방식을 32 2017 Vol.24 No.2
유전체교정시대의도래와전망 그림 3. 크리스퍼유전자가위변형을통해만든새로운유전자교정기술모식도. ( 가 ) 표적유전자발현을억제하는 CRISPRi. ( 나 ) 유전자의발현을촉진시키는 CRISPRa. ( 다 ) DNA 절단및외래 DNA 공여체없이교정이가능한 CRISPR base editing. 일컫는다. 하지만, DNA를절단하는 domain을없애면, 특정 DNA에결합할수는있지만절단할수는없게된다. 예를들어, SpCas9의경우, RuvC domain과 HNH domain을치환하여망가뜨리면 DNA를자르는기능을상실하고표적유전자에대한특이적부착기능만남은 deactivated Cas9 (dcas9) 이되어새로운형태의유전체편집도구가된다. ( 그림 1나 ) 이러한 dcas9에특정기능의단백질을결합하는형태로다양하게응용될수있다. [15] 예를들어, 그림 3가와같이 dcas9에 kruppel-associated box (KRAB) 단백질을부착하면전사과정 (Transcription) 에서 RNA 중합효소의진행을막아서유전자의발현을억제할수있는데, 이러한 CRISPR 기반의유전자발현억제기술을 CRISPR interference (CRISPRi) 라고부른다. [16] 반대로그림 3나와같이 dcas9에 VP64나 p65 activation domain (P65AD) 단백질을결합하면표적유전자의발현을촉진시킬수있는데, 이러한기술을 CRISPR-mediated gene activation (CRISPRa) 라고부른다. 특히, CRIPSRa 기술은다양한분야에응용할수있는데, Joshua B. Black 그룹에서는 Brn2, Ascl1, Myt1l 유전자 (BAM factors) 의과발현을통해쥐의배아유래섬유아세포 (mouse embryonic fibroblast) 를신경세포로직접분화 (direct reprograming) 시키는데성공하였다. [17] 한편, 2.1절에서서술한바와같이, 유전자의특정돌연변이를원하는염기서열로정확하게교정하기위해서는외래의 DNA 공여체를넣어동형방식수선 (HDR) 기작을유도해야한다. 그러나이는효율이매우낮고 (1% 내외 ), 외래의 DNA 공여체가필요하다는측면에서어려움이있다. CRISPR-base editor는그림 3다와같이 dcas9의말단에 Cytidine deaminase를결합한형태로만들어특정위치의 C 염기를 T( 또는 G 염기를 A) 로바꿀수있도록제작되었다. [18,19] CRISPR-base editor는 DNA 두가닥절단을일으키지않아위험성이적을뿐아니라, 외래의 DNA 공여체의추가전달이필요없어동물실험에유리하고, 작동효율도수십 % 정도로매우높다는장점이있다. 앞으로 CRISPR-base editor의타겟부위를좀더정밀하게하거나, 교정할수있는염기서열의폭을넓힌다면더욱강력한유전체편집도구가될것으로기대된다. 3. 결론 2013 년크리스퍼유전자가위를이용한유전체편집이성공한이후로유전체편집관련분야는매우빠르게발전하고 있다. 또한크리스퍼유전자가위기술의높은접근성은유전체편집외의다양한분야에서 CRISPR 기술이널리쓰일 BT News 2017 33
BT News 기획특집 : 유전체분석 수있도록해주었다. 이러한파급력을바탕으로 CRISPR 시스템은더욱다양한기술적요구와만나고, 그에상응하는다양한기술들이개량되어왔다. 이분야가하루가다르게발전하고있는만큼본고에서미처다루지못한부분들이있을수있다. 한편, 빠르게발전한유전체교정기술에상응하여법적, 제도적, 사회적장치들이아직제대로정립되지못하고있다. 유전체교정기술은제대로활용하면유전자치료, 새로운식물육종의개발, 기초유전자연구활용등그가능성이무궁무진한반면, 맞춤형아기, 무분별한편집시도등과같은부작용또한클수있다. 따라서유전체교정기술을올바르게활용할수있도록사회적논의및합의가필요할것이다. 이는시험관아기시술의개발및적용과유사하다. 시험관아기시술은난자와정자를체외에서수정시켜자궁에착상시키는방법으로일찍이 1978년영국에서최초로시도되었고, 1985년국내에도입되었다. 현재에는국내에서만매년수만명의아이가이시술로태어나고있는데, 처음시도될당시에는여러사회적, 윤리적우려들이있었던것이사실이다. 유전체교정기술도이와마찬가지로, 그장점및활용을극대화하여사회에기여할수있기를기대한다. 참고문헌 1. H. Ma, N. Marti-Gutierrez, S.-W. Park, J. Wu, Y. Lee, K. Suzuki, A. Koski, D. Ji, T. Hayama, R. Ahmed, H. Darby, C. Van Dyken, Y. Li, E. Kang, A.R. Park, D. Kim, S.-T. Kim, J. Gong, Y. Gu, X. Xu, D. Battaglia, S.A. Krieg, D.M. Lee, D.H. Wu, D.P. Wolf, S.B. Heitner, J.C.I. Belmonte, P. Amato, J.-S. Kim, S. Kaul, S. Mitalipov, Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos, Nature advance online publication (2017). 2. L.A. Marraffini, E.J. Sontheimer, CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea, Nat Rev Genet 11(3) (2010) 181-190. 3. M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J.A. Doudna, E. Charpentier, A Programmable Dual-RNA Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity, Science 337(6096) (2012) 816-821. 4. S.W. Cho, S. Kim, J.M. Kim, J.-S. Kim, Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease, Nat Biotech 31(3) (2013) 230-232. 5. L. Cong, F.A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, N. Habib, P.D. Hsu, X. Wu, W. Jiang, L.A. Marraffini, F. Zhang, Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems, Science 339(6121) (2013) 819-823. 6. P. Mali, L. Yang, K.M. Esvelt, J. Aach, M. Guell, J.E. DiCarlo, J.E. Norville, G.M. Church, RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9, Science 339(6121) (2013) 823-826. 7. W. Jiang, D. Bikard, D. Cox, F. Zhang, L.A. Marraffini, RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems, Nat Biotech 31(3) (2013) 233-239. 8. A. Cebrian-Serrano, B. Davies, CRISPR-Cas orthologues and variants: optimizing the repertoire, specificity and delivery of genome engineering tools, Mammalian Genome 28(7) (2017) 247-261. 9. B. Zetsche, Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Ian M. Slaymaker, Kira S. Makarova, P. Essletzbichler, Sara E. Volz, J. Joung, J. van der Oost, A. Regev, Eugene V. Koonin, F. Zhang, Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell 163(3) (2015) 759-771. 10. D. Kim, J. Kim, J.K. Hur, K.W. Been, S.-h. Yoon, J.-S. Kim, Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells, Nat Biotech 34(8) (2016) 863-868. 11. S. Shmakov, A. Smargon, D. Scott, D. Cox, N. Pyzocha, W. Yan, O.O. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, K.S. Makarova, Y.I. Wolf, K. Severinov, F. Zhang, E.V. Koonin, Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems, Nat Rev Micro 15(3) (2017) 169-182. 12. S. Shmakov, O.O. Abudayyeh, K.S. Makarova, Y.I. Wolf, J.S. Gootenberg, E. Semenova, L. Minakhin, J. Joung, S. Konermann, K. Severinov, Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems, Molecular cell 60(3) (2015) 385-397. 13. O.O. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, S. Konermann, J. Joung, I.M. Slaymaker, D.B.T. Cox, S. Shmakov, K.S. Makarova, E. 34 2017 Vol.24 No.2
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