Genome engineering 을통한지능형인공미생물개발. 울산과학기술대학교 이성국교수 최근몇년간미국의 CNN 1, 영국의 BBC 2 와국영방송 3 등여러권위있는미디어매체를통해합성생물학의잠재성이보도되었다. 현재가장뜨거운관심이모아지고있는분야인합성생물학은기존몇개의유전자를

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미희 모
5 years ago
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1 Genome engineering 을통한지능형인공미생물개발. 울산과학기술대학교 이성국교수 최근몇년간미국의 CNN 1, 영국의 BBC 2 와국영방송 3 등여러권위있는미디어매체를통해합성생물학의잠재성이보도되었다. 현재가장뜨거운관심이모아지고있는분야인합성생물학은기존몇개의유전자를대상으로하는유전공학적실험방법이나기술들에국한된것이아닌, 특정유전체의전반적인이해를바탕으로한다. 특히새로운생체대사경로의제작뿐아니라나아가유전체설계및인공유전체합성등을가능하게하여지금까지다루어진적이없는새로운분야를다루는학문으로여겨지고있다. 지난반세기동안생물학분야의한줄기에불과했던유전공학은급격한성장을바탕으로생물체를기반한목적대사산물의생산량을상승시키거나다른생물체B로부터생물체A에는없는물질을생산하게하는등의일들을실현가능하게하였다. 지난고전적생물학적방법을통한생물체의유전자변형은몇가지가있어왔으나, 초기의연구자들은물리 화학적인방법을사용하여유전자에돌연변이를도입하였다. 4 5 비록유전자에돌연변이를도입시켜새로운유전자형 (genotype) 은얻었지만원하는표현형 (phenotype) 을제작하기는쉽지않은일이었다. Biomolecule의생산및분해그리고그들의상호작용을이해하기위한방대한양의지식의결여와함께모델링을위한 computational source의약한기반은생명체의이해를바탕으로공학적인개념을도입하는고자하는합성생물학의발전의큰장애물이었다. 하지만무엇보다도유전자서열의변화를위한분자생물학적인기술의부재는원하는표현형을얻기위해계획적변경 (rational alteration) 보다진화적최적화 (evolutionary optimization) 에의존하도록하였다. 하지만지난몇년간수천종의생명체유전자서열분석을통해서생물정보량이기하급수적으로증가하고그와동시에계산적생물학적도구 (computational tool) 의발전으로생명시스템을이해하게되고이를바탕으로새로운생명시스템및생명체를제작하고자하는합성생물학이급속적으로발전하게된다. 실질적으로인공생명시스템을제작하기위해서는다양한지놈엔지니어링 (genome engineering) 기술의도움이꼭필요하다. 최근개발되고있는지놈엔지니어링기법들은합리적인유전체의이해를바탕으로한유전자지도의설계와합성을통해대사산물의생산량을증가시킬수있는전략임과동시에다양한지능형인공생명체를제작할수있는기반을만들고있다. 이에최근에개발된인공미생물제작기술인지놈엔지니어링기술들과합성된새로운생물체들중우량균주의선별을효과적으로도울수있는 biomems 기술에대해서간략히설명하고자 1

2 한다. 가. 지놈엔지니어링기술들 1. Transcriptional activator-like effector genome editing 그림 1. Transcriptional activator-like effector nuclease 를이용한 genome engineering ( 지놈엔지니어링이유전자서열의특정부분을인식하고표적하는것을전제로하는특성덕분에 zinc-finger(zf) 나 transcriptionl activator-like(tal) effector와같은 DNA-결합단백질이하나의지놈엔지니어링기술이될수있었다. 제한효소와같은 DNA 변형효소와연결된 DNA-결합단백질은특정 DNA서열에결합한후잘라줌으로써이중가닥절단 (double strand break; DSB) 를형성할수있고상동적재조합 (homologous recombination) 이나비상동말단봉합 (non-homologous end joining; NHEJ) 을통하여 mutation을도입할수있었다. 초기에각광을받았던 ZF-nuclease는 motif당약 3개의 base pairs (bp) 를인식할수있었지만 motif를 stacking하더라도상대적으로낮은특이성과실험실수준에서얻기엔비싼단점으로인해최근에는 TALEN(TAL effector nuclease) 를이용하여지놈엔지니어링을하는추세이다. 비록한 motif당하나의 bp를인식하고큰 size로인해 assembly가복잡한편이지만긴 DNA서열을인식하기위한 stacking이비교적쉽기때문에지놈엔지니어링기술로많이사용되고있다. Iowa state university의 Yang`s 팀은최근 TALEN를이용하여효모 (Saccharomyces cerevisiae) 의유전체에있는 3 개의유전자제거 (gene knockout) 에성공하였다. 6 23bp까지인식가능한 TALEN을인위적으로제작하여효모의특정유전자를제거하였고예상되어지는표현형을얻을수있었다. 또한상동적재조합을통한유전자교체도 34% 의효율을보였다. 이러한 TALEN 활용 2

지놈엔지니어링은저비용과높은효율로원하는표현형을얻을수있는새로운기법으로 진핵생물의유전자변형에상당한역할을할것으로기대되어진다. 78 2. Genome editing using an engineered type II CRISPR system 그림 2. (a,b) Mechanism of CRISPR system.

3 지놈엔지니어링은저비용과높은효율로원하는표현형을얻을수있는새로운기법으로 진핵생물의유전자변형에상당한역할을할것으로기대되어진다 Genome editing using an engineered type II CRISPR system 그림 2. (a,b) Mechanism of CRISPR system. (Philippe H et al, Science, 2010) (c,d) Human genome editing with engineered type II CRISPR system. (Mali P et al, Science, 2013.) 원핵생물의적응면역시스템역시좋은지놈엔지니어링도구가될수있다. 파지감염 (phage infection) 이나세포간접합 (conjugation) 에의해세포내로유입된외래유전자와결합할수있는 RNA와 Cas9 nuclease가복합체를이뤄 DSB를야기하는 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 의원리를기본으로하는새로운방법이바로그예이다. 최근하버드메디컬스쿨의 Church`s 팀은 CRISPR의시스템을이용하여포유동물세포 (mammalian cell) 에서 non-sense GFP를 active한형태로바꾸었다. 9 Cas9 nuclease와결합할수있는 grna(guide RNA) 와타겟유전자를인식하는 RNA를결합시켜세포내로삽입시키고그와동시에코돈최적화된 Cas9을제작하여세포내로도입시키게되면 RNA가타겟 DNA서열과 RNA-DNA base pairing을형성하고 Cas9의 nuclease활성이 DSB를형성하게된다. 그로인해상동적재조합이촉진되게되므로원하는유전자형을도입할수있게된다. 더욱신기한것은 Cas9 nuclease가발현될때와그렇지않을때의상동적재조합확률이거의 8배나차이가난다는것이다. 이는지속적인 Cas9 nuclease의발현이상동적재조합을촉진한다는것을암시하기도한다. 3

이러한 CRISPR 시스템은낮게는 2% 에서높게는 25% 까지유전자변형효율을보였다. 이결과는 RNA-guided editing 은빠르고 multiplexible 한지놈엔지니어링도구로써가능 성을보여줬고이에따라추가적인연구들이진행되고있는추세이다. 10 3. Trackable multiplex recombineering(trmr) method 그림 3.

4 이러한 CRISPR 시스템은낮게는 2% 에서높게는 25% 까지유전자변형효율을보였다. 이결과는 RNA-guided editing 은빠르고 multiplexible 한지놈엔지니어링도구로써가능 성을보여줬고이에따라추가적인연구들이진행되고있는추세이다 Trackable multiplex recombineering(trmr) method 그림 3. (a) Trackable multiplex recombineering(trmr) method (b) Multiple strategy to rapidly generate cell mixtures with defined genetic modification. (Warner JR et al, Nat Biotechnol, 2010) 미생물지놈을이해하기위해서는많은수의 library 가필요하다는것을감안한다면적 절한유전자변이 (genetic variation) 을제작한후에그로부터파생되는연구를하는것이 시간적으로나비용적으로나훨씬경제적이라는것은누구도부정하지못할것이다. 최근 4

의지놈학 (genomics) 의발달과 multiplex DNA 합성기술, 그리고상동적재조합기술의발달은이러한일들이가능하게하고있다. 지놈학의발달은유전자제거와같은방법을통하여유전자의특성을파악하는데도움을주었고이는유전자의역활을확인할수있는강력한도구가되었지만다수유전자들의돌연변이에의해야기되는복합적인변화에서표현형을예측하고분석하는것에는아직아쉬운성과를보이고있었다.

5 의지놈학 (genomics) 의발달과 multiplex DNA 합성기술, 그리고상동적재조합기술의발달은이러한일들이가능하게하고있다. 지놈학의발달은유전자제거와같은방법을통하여유전자의특성을파악하는데도움을주었고이는유전자의역활을확인할수있는강력한도구가되었지만다수유전자들의돌연변이에의해야기되는복합적인변화에서표현형을예측하고분석하는것에는아직아쉬운성과를보이고있었다. 최근개발된 TRMR은기존의문제점을보완하고쉽고빠르게다수의돌연변이를제작할수있는방법으로소개되었다. 단 1일만에전체대장균의유전자의 95% 를변형하였고이로부터원하는표현형의미생물을선별할수있었다. 11 기존에흔히사용되던 on-off방식이아닌 up-down방식으로유전자의발현을조절함으로써타겟유전자에대해보다폭넓은이해를제공하였다. 인위적으로합성된 dsdna는 rolling circle amplification에의해증폭되고세포내에서지놈으로삽입됨으로써타겟유전자의발현을조절하게되는데이때만들어지는 mutant library는선별과정을거치면서원하는표현형의세포만을선별할수있다. 이러한과정을통해단일주일만에원하는형질에영향을주는유전자들을확인할수있었다. 대다수의유전자들은새로이밝혀진유전자들이었으며일부는기존에이미밝혀져있던유전자였고그중에서는새로운기능이밝혀지기도하였다. TRMR을통해서무수히많은 mutant library를제작할수있으며이를통해 switches, oscillators 혹은 sensors와같은추가적인역할을하는유전자들에대해서도규명할수있을것이다 Multiplex automated genome engineering 그림 4. Rapid and continuous generation of sequence diversity by MAGE (Wang HH et al, Nature, 2009) 많은지놈엔지니어링기술이하나의유전자돌연변이에주로초점을맞춘데에는이유 5

가있다. ZFN이나 TALEN, 그리고 group II intron system을이용한기법은모두 DSB를야기하기때문에다수의유전자의돌연변이에는적절치않다.

또한 λ-red system에의해매개되는 dsdna 재조합역시낮은효율을보이기때문에다수의돌연변이제작에는적절치않다.

MAGE (multiplex automated genome engineering) 은작은 ssdna가 lagging strand의 Okazaki fragment

약 30~100bp의 ssdna는상동의말단만있으면타겟유전자부위에상보적으로결합함으로써우리가원하는유전자서열을딸세포로도입시킬수있다.

6 가있다. ZFN이나 TALEN, 그리고 group II intron system을이용한기법은모두 DSB를야기하기때문에다수의유전자의돌연변이에는적절치않다. 이러한 DSB가다수생성되게된다면전체지놈을파괴할뿐아니라 NHEJ에의해의도치않은 rearrangement를발생시킨다. 또한 λ-red system에의해매개되는 dsdna 재조합역시낮은효율을보이기때문에다수의돌연변이제작에는적절치않다. 이러한문제점을보완하기위해서최근에는 dsdna가아닌 ssdna를이용하는방법이소개되었다. MAGE (multiplex automated genome engineering) 은작은 ssdna가 lagging strand의 Okazaki fragment 합성에프라머 (primer) 로작용하여딸세포지놈에도입되면서유전자변이를유도한다. 13 MAGE는 ssdna를세포내로도입시킴으로써아주간단하게다수의돌연변이를제작할수있었다. 약 30~100bp의 ssdna는상동의말단만있으면타겟유전자부위에상보적으로결합함으로써우리가원하는유전자서열을딸세포로도입시킬수있다. 14 비슷한원리로 MAGE는 mismatch repair에관여하는 muts 유전자를제거시킴과동시에 λ-red system의발현을통해 ssdna 삽입을 1000배까지도증가시킬수있었다. MAGE와같이 ssdna-mediated recombination의경우다른 plasmid나 dsdna보다유전자도입 (transformation) 확률이높기때문에보다높은효율의유전자재조합을기대할수있을뿐만아니라한 cycle당소요되는시간이상대적으로다른기법들보다짧아많은수의돌연변이균주를만들수있다. 또한간단한원리덕분에다양한균주에서도적용가능할것으로예상된다. ssdna-mediated recombination의많은장점덕분에현재도많은연구들이추가적으로진행되고있는상황이다. 15,16,17,18 나. 미세유체장치를이용한우수균주선별 c 그림 5. 다양한미세유체장치가응용된사례들 D 6

다양한합성생물학적기술을사용해서재구성된새로운유전체는각각의개체들이모두다른활성을가지게한다. 예를들어위에설명된 MAGE와같은방법으로재구성된 DNA를가진균주들이만들어지면, 이를로부터원하는표현형의균주를선택적으로분리하기위해서는고전적방법으로는많은노동력과시간이필요했었다.

7 다양한합성생물학적기술을사용해서재구성된새로운유전체는각각의개체들이모두다른활성을가지게한다. 예를들어위에설명된 MAGE와같은방법으로재구성된 DNA를가진균주들이만들어지면, 이를로부터원하는표현형의균주를선택적으로분리하기위해서는고전적방법으로는많은노동력과시간이필요했었다. 하지만최근미세유체공학 (microfluidics) 등과같은새로운기술이등장하면서좀더손쉽고, 빠르고효과적으로고속대량스크리닝 (high-throughput screening; HTS) 을가능하게하였다. 합성생물학과는완전히다른연구분야인미세유체공학이함께협업 (collaboration) 되어성공적일수있다는가능성을보여주었던사례는 2005년스탠포드의퀘이크연구그룹이자동화된미세유체장치내에서미생물의생장을촉진, 저해, 유도등과같이다양한방법을통해무려 40일간관찰했던것이잘알려져있다. 19 또한, CIT의 Leadbetter 그룹은 microfluidic 장치를이용해기존에유전정보가전혀알려져있지않았던미생물 Traponema의대량 10 6 개의 PCR을해냈다. 이는 biomems 기술의장점인대량의 sample 처리가능능력과반응에극소량의 chemical만이필요한점을십분살려, target DNA 자세한정보를알지못해도특정 gene의존재여부를가려낼수있는 PCR등의기술에적용할수있다는것을보여준다. 20 위에설명된두가지미세유체장치를기점으로한다양한지놈엔지니어링기술은미세유체장치를이용한기술들과함께최근까지적용되어져왔다. 예를들면, 가장기본적인 PCR과같은기술들이미세유체장치내에서재현되었고 21, 위에설명된퀘이크그룹의 bioreactor는여전히많은관심을받고있으며, DNA sequence 22, 특정된단백질의검량, 검출이가능한자동화된장치 23, 크기나다른외부요인을사용한생물체의 separation위한미세유체장치 24, 단시간내에 10 7~9 개의샘플분석이가능한구획화된미세방울생성및저장장치 25 등등여러가지방법들이합성생물학분야연구에활용되고있다. 그림 6. High-throughput screening of strains (Jina Y et al, Nat commun, 2013) 7

8 이러한지놈엔지니어링을접목한합성생물학과대사공학은굉장히많은 platform 균주들을만들어냈고 ethanol 26, higher alcohol 27, fatty acids 28 등이많은재조합균주들로부터생산되고있다. 최근에는 MAGE와 TRMR과같이다중엔지니어링기술이발달함에따라수많은미생물군집에서적절한균주를선별하기위한스크리닝기술이필요하게되었다. 하지만형광물질을통한특정균주선별 ( 29 이나 enrichment와같은선택압 (selective pressure) 을사용하는기존의 HTS 30 는많은시간이소모된다는단점을가지고있다. 이에따라생물학적스크리닝보다좀더쉽고빠른방법으로 biomems가떠오르고있고관련연구가수행되고있다. 이처럼지놈엔지니어링은합성생물학및대사공학의발전을위한충실한도구로써그리고 biomems는새로운파트너로써인공미생물의개발에중요한역할을하고있다. 참고문헌 1 Synthetic biology inches toward the mainstream, CNN, Cherise Fong, 2 Playing God, BBC Documentary, 3 Eight great technologies, UK speeches, 4 Altenburg, E (1928) The limit of radiation frequency effective in producing mutations. The American Naturalist 5 Auerbach C, Robson JM, Carr JG (1947) Chemical Production of Mutations. Science 6 Li T, Huang S, Zhao X, Wright DA, Carpenter S, Spalding MH, Weeks DP, Yang B (2011) Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 7 Sander JD, Cade L, Khayter C, Reyon D, Peterson RT, Joung JK, Yeh JR (2011) Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 8 Hockemeyer D, Wang H, Kiani S, Lai CS, Gao Q, Cassady JP, Cost GJ, Zhang L, Santiago Y, Miller JC, Zeitler B, Cherone JM, Meng X, Hinkley SJ, Rebar EJ, Gregory PD, Urnov FD, Jaenisch R (2011) Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat. Biotechnol. 9 Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 10 Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 11 Warner JR, Reeder PJ, Karimpour-Fard A, Woodruff LB, Gill RT (2010) Rapid profiling of a microbial genome using mixtures of barcoded oligonucleotides. Nat. Biotechnol. 12 Lu TK, Khalil AS, Collins JJ (2009) Next-generation synthetic gene networks. Nat.Biotechnol. 13 Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, Sun ZZ, Xu G, Forest CR, Church GM (2009) Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature 14 Ellis HM, Yu D, DiTizio T, Court DL (2001) High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15 Swingle B, Markel E, Costantino N, Bubunenko MG, Cartinhour S, Court DL (2010b) Oligonucleotide recombination in Gram-negative bacteria. Mol. Microbiol. 8

9 16 van Pijkeren JP, Britton RA (2012) High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Res. 17 Sawitzke JA, Costantino N, Court DL (2011) Probing cellular processes with oligo-mediated recombination; using knowledge gained to optimize recombineering. J. Mol. Biol. 18 Esvelt KM, Wang HH (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology. Mol. Sys. Biol. 19 Balagaddé FK, You L, Hansen CL, Arnold FH, Quake S (2005) Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science 20 Ottesen E A, Hong JW, Quake SR, Leadbette JR (2006) Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science 21 Lagallya ET, Simpson PC, Mathies RA (2000) Monolithic integrated microfluidic DNA amplification and capillary electrophoresis analysis system. Sensor and Acuators 22 Hahm J. Lieber CM (2004) Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors. Nano Lett. 23 Hellmich W, Pelargus C, Leffhalm K (2005) Single cell manipulation, analytics, and label free protein detection in microfluidic devices for systems nanobiology. Electrophoresis 24 Inglis DW, Riehn R, Austin RH (2004) Continuous microfluidic immunomagnetic cell separation. Appl. Phy. Lett. 25 Huebner A, Bratton D, Whyte G, Yang M (2009) Static microdroplet arrays: a microfluidic device for droplet trapping, incubation and release for enzymatic and cell-based assays. Lab on a Chip 26 Ingram LO, Gomez PF, Lai X, Moniruzzaman M, Wood BE, Yomano LP, York SW (1998) Metabolic engineering of bacteria for ethanol production. Biotechnol. Bioeng. 27 Atsumi S, Hanai T, Liao JC (2008) Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature 28 Steen EJ, Kang Y, Bokinsky G, Hu Z, Schirmer A, McClure A, Del Cardayre SB, Keasling JD (2010) Microbial production of fatty-acid-derived fuels and chemicals from plant biomass. Nature 29 Hoover SW, Tyler Youngquist J, Angart PA, Withers ST, Lennen, RM, Pfleger BF (2012), Isolation of improved free fatty acid overproducing strains of Escherichia coli via nile red based high-throughput screening. Environ. Prog. Sustainable Energy 30 Yang J, Seo SW, Jang S, Shin S-I, Lim CH, Roh T-Y, Jung GY (2013) Synthetic RNA devices to expedite the evolution of metabolite-producing microbes. Nat. Commun. 9

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미래의학 - 맞춤형의학 유전자가위 미래의학 유전자가위 / 맞춤형의료 Dr. Shoukhrat Mitalipov AUGUST 2, 2017 Center for Embryonic Cell and Gene Therapy, Oregon Health & Science University, Portland, Oregon, USA Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health