특집 DNA 하이드로젤기반기능성바이오소재 DNA Hydrogel-Based Functional Biomaterials 남건욱ㆍ김태형ㆍ노영훈 Keonwook NamㆍTae Hyung KimㆍYoung Hoon Roh Department of Biotechnology, Yonsei University, 50 Yonsei-ro, Seodaemoon-gu, Seoul 03722, Korea E-mail: yr36@yonsei.ac.kr 1. 서론 최근바이오소재중데옥시리보핵산 (DNA) 은유전정보를저장, 전달, 제어하는기존의생물학적역할과더불어나노구조체및지지체로서의응용가능성이매우뛰어난생체소재로주목을받고있다. DNA는생분해성일뿐만아니라분해된물질이생체내의대사산물이기에생체독성이적은생체친화적인고분자물질이다. 또한 DNA에는다양한화학적방법을통한기능기부착이가능하고, 기질특이성과염기서열정보에따라프로그램된자기조립기능을가지고있으며, 나노미터단위로정교한구조체형성이가능하다는장점이있다. 바이오소재측면에서의연구와더불어, 실생활과산업적활용을위해서다양한형태로의적용이필요한데그중대표적인것이고분자로이루어진하이드로젤이다. 하이드로젤이란명칭은 1894년에처음사용되었으며, 공유결합, 수소결합, 반데르발스힘 (Van der Waals Force) 등의물리화학적인인력과결합에의하여가교된 3 차원네트워크구조를가진친수성고분자를말한다. 1 하이드로젤은수용액일때다량의물을내부에함유하여팽윤하는성질을가지고있으며, 팽윤되었을때 90% 이상이물로구성되어있다. 고분자하이드로젤은표면의고분자사슬의높은유동성때문에표면장력이낮고, 이로인해하이드로젤내외부의물질전달이용이하며, 높은수분함량으로일반세포조직과유사한유연성을가지고있으면서, 생체적합성이좋다는장점이있다. 2 이런장점들때문에고분자하이드로젤은콘텍트렌즈, 의료용전극, 조직재생을위한세포배양시많이쓰이고특수한용도로성형재료나화상상처용붕대류, 수분공급을위한미용제품등의목적에도다양하게쓰인다. 현재는더좋은기능성과활용성을위하여생체소재를복합적으로사용하여물리적, 화학적특성을조절할수있고, 다양한기능성이부여된하이브리드고분자하이드로젤을제작및응용하는연구도활발히진행하고있다. 3 최근나노공학 (NT) 과생명공학 (BT) 를결합한나노바이오융합학문의발전으로핵산나노공법을이용한 DNA 기반하이드로젤제작과바이오소재로써의응용에대한연구가활발히진행중이다. 본특집에서는현재 남건욱 2013 시라큐스대학교생명공학과 ( 학사 ) 2014 카네기멜론대학교생명공학과 ( 석사 ) 2015-현재 연세대학교생명공학과 ( 박사과정 ) 김태형 2013 연세대학교생명공학과 ( 학사 ) 2013-현재연세대학교생명공학과 ( 석박통합과정 ) 노영훈 2002 연세대학교생명공학과 ( 학사 ) 2004 연세대학교생명공학과 ( 석사 ) 2010 코넬대학교생명공학과 ( 박사 ) 2011-2015 코넬대학교생명공학과 (Post-Doc.) MIT 화학공학과 (Post-Doc.) 2015-현재 연세대학교생명공학과조교수 120 Polymer Science and Technology Vol. 28, No. 2, April 2017
남건욱ㆍ김태형ㆍ노영훈 까지개발된 DNA 하이드로젤제조방법에대한대표적인유형들을소개하고, DNA 하이드로젤을이용한다양한의 생명공학적응용예시와활용가능성을소개하고자한다. 2. 본론 2.1 바이오소재로서의 DNA의특성 DNA의이중나선형구조는 1953년에 James Watson과 Francis Crick에의해처음으로밝혀졌고, 이들은 1954년에퓨린 (purine) 과피리미딘 (pyrimidine) 기의수소결합을통한뉴클리오티드 (nucleotide) 의상보결합 (hybridization) 으로구조체를이루는것을밝혀냈다 ( 그림 1). 4,5 DNA를구성하는퓨린기중아데닌 (adenine) 과구아닌 (guanine) 염기는피리미딘의타민 (thymine) 과시토신 (cytosine) 과의특이적결합을이루고이러한결합특이성을염기쌍형성규칙 (base pairing rule) 이라한다. 추후과학기술의발달로 DNA의기계적, 물리적, 화학적및생물학적특성들을발견하게되어생체재료로서의활용이연구되었다. 6 기계적으로 DNA 구조는지속길이 (persistence length) 를기준으로유연함혹은단단함을조절할수있다. 지속길이는 DNA 구조의구성에영향을받으며이중가닥의 DNA의경우 ~50 nm, 단일가닥의 DNA의경우 ~1 nm가된다. 이지속길이보다 DNA 염기서열이길면유연하고짧으면단단한성질을지니며, 환형 DNA와같은구조체로인한초나선 DNA 형성을통해서도 DNA의기계적특성변화를줄수있다. 또한이중가닥 DNA는물리적으로 2 nm의폭과뉴클리오티드당 0.34 nm의길이인나노사이즈의매우작은생체재료이기때문에정교한 DNA 구조체및지지체형성이 가능하다. DNA는특정뉴클리오티드와상보결합을이루어형성되므로결합적특이성을갖고있다. 그러므로 DNA 염기서열을디자인하여정교한모양의구조체형성및유전정보를전달할수있다. 화학적으로 DNA는독성이없고, 안정적이며수용성이다. 또한생물학적및화학적반응을활용하여 DNA를옹스트롬 (angstrom) 단위로조작할수있다. 예를들어다양한종류의효소들을이용하여 DNA 구조의특정부위를잘라내거나이어주고복제할수있으며선택적으로재결합하는등 DNA 구조체의모양을정교하게변형이가능하다. 7,8 또한화학적반응을통해다양한소재의작용기를결합하여 DNA 구조체에기능성을부여할수있다. DNA의소재적특성과핵산나노공법을활용하여하이드로젤을만드는방법은크게세가지가있다. 첫째로 DNA의끝에존재하는접착성말단 (sticky end) 을상보결합을통해두 DNA의조각들을일시적으로부착하고리가아제 (ligase) 연결효소로 DNA 구조의당인산중추 (sugar-phosphate backbone) 부위를연결하는생물학적방법으로하이드로젤과같은지지체형성이가능하다 ( 그림 2). 둘째로는 DNA 복제효소를통해긴 DNA 가닥들을생성하고물리적상호작용을통해얽히게되어형성되는하이드로젤이있다. 마지막으로 DNA의접착성말단에반응성기능기를부착하여외부자극에화학적반응이초래되어생성되는화학적반응을통한하이드로젤공법이있다. 그림 1. 이중나선형의 DNA 구조. 프리미딘과퓨린으로구성되어있는 DNA 는염기서열의특이적상보결합을통해이중나선형의구조를형성한다. 그림 2. 연결효소를활용한구조체제작. 두 DNA 구조체의서열에있는접착성말단의상보결합을통해각 DNA 구조체를결합하고, 생성된홈을효소반응을통해연결시키는 DNA 결합법. 8 Reproduced with permission of Chem. Soc. Rev. (2006) Royal Society of Chemistry. 고분자과학과기술제 28 권 2 호 2017 년 4 월 121
특집 DNA 하이드로젤기반기능성바이오소재 2.2 생물학적반응을통한 DNA 하이드로젤제작및응용 DNA 하이드로젤은 DNA의구조적및소재적특성과효소결합을이용하여 Dan Luo그룹에서 2006년에처음으로보고되었다. DNA 하이드로젤제작을위해서는우선 DNA 의염기서열에따른선택적인상보결합능력과정교한온도조절을통하여 X-, Y-, T-와같은다양한형태의접착성말단이존재하는분지형 DNA 나노단위체의합성이필요하다 ( 그림 3a). 9,10 합성된분지형 DNA 나노단위체접착성말단의추가적인상보결합과단일 DNA 가닥간인산디에스테르결합을촉진하는 Ligase 연결효소를통해나노단위체간의뼈대를연결하고중첩으로인한정전기상호작용, 반데르발스힘, 소수성효과등이작용하여구조체를안정화한다. 경화된 DNA 구조체는하이드로젤을구성하는지지체로구조적인역할을한다 ( 그림 3b). DNA 나노단위체를기반으로 그림 3. X,Y,T 모양의분지형 DNA 나노단위체와효소반응을통해경화된 DNA 하이드로젤 : 여러 DNA 가닥들의상보결합을통해만들어진 X,Y,T 모양의분지형 DNA 나노단위체와중합된하이드로젤의구조, SYBR 으로염색된 DNA 하이드로젤사진. 기준자는 1 cm 를나타냄. 9 Reproduced with permission of Nat. Mater. (2009) Nature Publishing Group. 생성된하이드로젤은 DNA 나노단위체의종류와농도에따라기공의크기및분포또는젤의팽윤정도와같은특징들을조절할수있으며, 이를통해하이드로젤의생분해성, 물성, 약물전달률의최적화가가능하다. 효소를통한 DNA 하이드로젤은구조적조절성으로인해약물전달체로서의응용이가능하다. 암환자의경우주로인체의면역체계가손상되어있으므로면역반응을회복하였을때암증식억제효과를보기위해 Makiya Nishikawa 그룹에서는면역반응을초래하는 immunostimulatory agents 를 DNA 하이드로젤로전달하였다. 11 디뉴클레오티드인시토신- 인산-구아닌 (unmethylated Cytosine-Phosphate-Guanine; CpG) 은널리알려진면역자극생산물질으로, CpG 서열을반복적으로포함한염기서열과그렇지않은염기서열을사용하여 X 모양의분지형 DNA 나노단위체를형성하고효소적경화를통해하이드로젤을생산하였다 (CpG DNA 하이드로젤 ). 그후암 CpG DNA 하이드로젤의증식억제효과를비교해보았고더욱효과적인치료를위해 DNA 염기서열사이의층간화합 (intercalation) 에의해결합하는항암제독소루비신 (doxorubicin, DXR) 을첨가하여암치료효과를확인하였다. 12 그결과독소루비신을단독으로처리한암세포보다면역자극물질과항암제를복합적으로전달하였을때더욱효과적인항암효과를확인할수있었다 ( 그림 4). 그외에도 DNA 나노단위체의염기서열디자인을통해안티센스치료와항암제전달을복합적으로진행할수있기때문에기존의치료법보다더욱효과적인치료가기대된다. 또한효소를통해제작된 DNA 하이드로젤은 DNA 나노단위체의구조적, 물리적특성조절뿐만아니라단위체의접착성말단에다양한기능을가져응용될수있다는큰특징이있다. 현재각 DNA 나노단위체에형광이미지용물질, 단백질, 핵산등의다양한물질을결합해기능성을부여하는연구가진행중이다. 대표적인예로써는, X 모양의 DNA 나노단위체에특정단백질유전자정보가있는플라스미드를결합해무세포의환경에서단백질을생산하는하이드로젤시스템 (cell-free protein production gel, P-gel) 으로응용되고있다 ( 그림 4). 13,14 플라스미드가함유된 DNA 하이드로젤을효소와마이크로패터닝을통해패드모양으로경화시킨후, 단백질생산에필요한리보솜과 RNA 중합효소및 mrna 생성에필요한뉴클레오티드, 에너지원이될 ATP 등을첨가하여세포외의환경에서단백질생산이가능하도록하였다 (in vitro translation system). 단백질생산확인을위하여 Renilla Luciferase 와 Aequorea coerulescens green fluorescent protein(acgfp) 와같이형광을발현하는표적단백질의플라스미드를결합하여형광발현량을확인한결과, P-gel이기존의수용액상단백질발현시스템 (solution phase system, SPS) 을통한생산량보다 Renilla Luciferase 122 Polymer Science and Technology Vol. 28, No. 2, April 2017
남건욱ㆍ김태형ㆍ노영훈 (c) (d) 그림 4. X 모양의 DNA 나노단위체에단백질발현플라스미드를결합한단백질생산하이드로젤시스템 (P-gel): 단백질생산하이드로젤의공정과정. 하이드로젤을구성할구조체를효소반응을통해 PDMS 틀에서경화하여하이드로젤패드 (P-gel pads) 를형성한뒤단백질생산에필요한물질들을추가하여 mrna 와단백질생산, 제작된 DNA 하이드로젤패드 (P-gel pads) 의공초점현미경분석. (c, d) P-gel 의단백질생산효율과기존의단백질생산시스템 (SPS) 의단백질생산량비교 (c: Rluc,d: AcGFP). 13 Reproduced with permission of Nat. Mater. (2009) Nature Publishing Group. 의경우전체단백질생산량대비 134배, AcGFP는 11.8배가량으로월등히더높았다 ( 그림 4c, d). 2.3 물리적상호작용을통한 DNA 하이드로젤제작및응용물리적상호작용을이용한 DNA 하이드로젤제작도보고되어있다. Dan Luo그룹에서는 2012년에환형 DNA 나노구조체를만든후이로부터회전환복제 (rolling circle amplification, RCA) 기작을통하여생산된긴가닥의 DNA 가물리적인상호작용으로서로얽혀서지지체로형성되는원리를이용하여 DNA 하이드로젤을합성하였다. 15 회전환복제기작을위해필요한환형 DNA 나노구조체는선형 DNA의양끝을연결해제작한다. 선형 DNA의양끝을접합시키기위해짧은프라이머 (primer 1) 를상보결합시킨뒤 ligase 효소를통해연결하여환형 DNA 나노구조체를형성한다. 형성된환형 DNA 나노구조체에포함된염기정보를반복적으로생산하는중합효소를추가하면회전환복제가무한히반복하여진행되면서단일가닥의긴 DNA가생성된다. RCA를통하여길게뽑혀나오는 DNA 가닥에상보결합하는추가적인프라이머 (primer 2, 3) 를활용하면중합효소가다프라이머연계복제기작 (multi-primed chain amplification, MCA) 을진행하여추가적으로단일가닥의 DNA를복제한다. 이러한과정을통해다발적으로복제되는 DNA 가닥들이물리적인상호작용으로엉키면서 DNA 하이드로젤이생성된다 ( 그림 5a). 물리적상호작용으로인해생성된 DNA 하이드로젤은긴가닥 DNA의유연한기계적인특징으로인해수용액상에서형태를유지하고, 물을제거하였을때에는형태를잃어버리는특이한성질의메타물질로 RCA와 MCA 의시간조절을통해하이드로젤의기계적물성조절이가능하다 ( 그림 5b). 물리적상호작용으로생성된 DNA 하이드로젤의대표적인예로는병원체진단플랫폼으로서의응용이있다. 16 RCA 기작을위해환형 DNA 구조체제작이필요한데, 이때진단하고자하는감염병의병원체유전자의특정염기서열정보를프라이머로써활용하여환형 DNA 나노구조체가병원체 그림 5. 물리적상호작용을통해제작된 DNA 하이드로젤 : 환형 DNA 구조체를기반으로 RCA 를진행하여긴 DNA 가닥을생성하고, 생성된 DNA 가닥을 MCA 로복제하여물리적상호작용을통한 DNA 하이드로젤생성과정, 물을추가해주어짧은시간안에형태가변환되는과정. 15 Reproduced with permission of Nat. Nanotechnol. (2012) Nature Publishing Group. 유전자가존재할경우에만생성되도록디자인이가능하다 ( 그림 6a). 진단방법은검출하고자하는병원체유전자에상보적인염기서열을지닌선형 DNA를유체관 (fluid chamber) 벽에고정한후병원체유전자를흘려준다. 검출하고자하는병원체유전자의존재여부에따라상보결합시, 환형 DNA 나노구조체를형성하고다음단계로 RCA 기작을진행하면 고분자과학과기술제 28 권 2 호 2017 년 4 월 123
특집 DNA 하이드로젤기반기능성바이오소재 병원체유전자를기반으로 DNA 하이드로젤이형성된다 ( 그림 6b). 병원체유전자의특정염기서열이존재할경우에만하이드로젤이생성되며, 병원체유전자가없을시에는환형 DNA 나노구조체가생성되지않아다음단계인회전환복제기작이작용할수없어하이드로젤이생성되지않는다. 따라서하이드로젤의생성여부에따라병원체유전자의존재를 그림 6. 물리적상호작용을활용해 DNA 하이드로젤을응용한병원체유전자진단시스템 : 병원체유전자와상보적인접착성말단을지니는선형 DNA 제작한후, 선형 DNA 와병원체유전자의상보결합을통해구조체형성함. 효소반응으로환형 DNA 구조체에서 RCA 기작을활용하여긴가닥의선형 DNA 를반복적으로생성하고물리적상호작용에의한하이드로젤생성, 유체관에부착될프라이머서열과진단을위한선형 DNA 를고정하고효소를통해병원체유전자결합및환형 DNA 형성함. RCA 를진행하여 DNA 증폭후하이드로젤생성여부를통해병원체유전자진단. 16 Reproduced with permission of Adv. Mat. (2015) John Wiley & Sons. 판단할수있어다종의유전자들사이에서도미량의특이적인병원체유전자를검출하여질병의진단을할수있다. 2.4 화학반응을통한 DNA 하이드로젤제작및응용화학반응을통하여분지형 DNA 나노단위체에기능기를부여하여하이드로젤을제작하기도한다. 2010년에 Dan Luo그룹에서 PEGA와결합한분지형 DNA 나노단위체를광가교결합 (photocrosslinking) 을통해나노단위의 DNA 하이드로젤을생성하였다 ( 그림 7). 17 다른예시로화학반응을통한광가교결합제조방법으로 DNA를통해약물방출이조절가능한하이브리드하이드로젤을제작할수있다. 아크릴아마이드 (acrylamide) 에선형 DNA 가닥을결합한후, trans 구조의아조벤젠 (azobenzene) 이함유된연결 DNA(Azo-DNA linker) 를통해아크릴아마이드에부착된여러 DNA 가닥에가교결합하여각각의아크릴아마이드를서로연결하여네트워크구조를형성시킬수있다. 18 자외선 (~350 nm) 을조사할경우에는이연결 DNA가 cis 구조로변형되어가교결합이불가능하여액상으로존재하고, 오직가시광선 (~450 nm) 을조사할경우에만 trans 구조로변하여광가역적인하이드로젤이형성된다. 이처럼중합된아크릴아마이드 DNA 사이에약물이갇히게하여광가역적으로약물전달이조절가능한하이드로젤을제작할수있다 ( 그림 8). 광가역적하이드로젤에항암제독소루비신을탑재하여암세포억제능을확인하였을때, 가시광선에의해젤의형태로경화된상태에서는약물이거의방출되지않아암세포가 20% 정도사멸된것에비해, 자외선에의해액화되어약물방출하였을때암세포가 80% 이상사멸되었다. 광가역적하이드로젤을이용하여체내원하는부위에서약물전달이선택적으로가능할것으로기대된다. (c) 그림 7. 광가교결합을통해합성한나노사이즈의 DNA 하이드로젤 : 선형 DNA 에화학반응을통해 PEGA 를결합시킨뒤 X 모양의 DNA 나노단위체를형성하고광가교결합을진행하여나노사이즈의하이드로젤제작. 제작된나노사이즈의하이드로젤의투과전자현미경분석. 기준자는 200 nm 를나타냄. (c) DNA 나노구조체의광가교결합전과후크기비교분석. 17 Reproduced with permission of Macromol. Rapid Commun. (2010) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. 그림 8. 광가교결합을통해제작한광가역적약물전달용 DNA 하이드로젤. 아크릴아마이드에선형 DNA 를결합하고상보적인아조벤젠 DNA 를추가하여자외선과가시광선을통해아조벤젠의구조를변형하여상전이를통한약물전달이가능함. 18 Reproduced with permission of Langmuir (2010) American Chemical Society. 124 Polymer Science and Technology Vol. 28, No. 2, April 2017
남건욱ㆍ김태형ㆍ노영훈 3. 결론 본특집에서는 DNA 기반하이드로젤의다양한제조방법과제조된하이드로젤의응용사례들에대하여기술하였다. DNA 기반바이오소재를이용한하이드로젤은효소적결합, 물리적상호작용, 그리고화학적반응등의제조방법에따라다양한형태적, 물성적, 기능적특성을보이게된다. DNA 하이드로젤은주로나노크기의핵산기반구조체를단위체로활용하기에더욱정교한공극크기와물성적특성을조절하는것이가능하며생체분해성이뛰어나고세포독성이적다. 또한사용목적에따라하이드로젤의경도, 탄성등의물리적인특성조절과다양한물질과의결합을통한기능부여가가능하다. 이러한 DNA 하이드로젤의특성들을적절히이용하면단백질생산시스템으로써의생물공정적활용, 특정병원체검출가능진단기술로써의의료적활용, 그리고약물전달시스템으로써의의학적활용을포함한다양한응용분야에대하여적용될수있다. DNA 하이드로젤을기능성바이오소재로활용하는연구는전세계적으로활발히진행되고있으며, 앞으로도지속적인연구가진행됨과동시에산업화과정을통하여다양한제품이개발되어우리의삶의질을향상시켜줄것을기대해본다. 참고문헌 1. E. M. Ahmed, J. of Adv. Res., 6, 105 (2015). 2. E. Calo and V. V. Khutoryanskiy, Eur. Polym. J., 65, 252 (2015). 3. D. E. Discher, Science, 310, 1139 (2005). 4. J. D. Watson and F. H. C. Crick, Nature, 171, 737 (1953). 5. F. H. C. Crick, Chemistry, 40, 756 (1954). 6. D. Luo, Mater. Today, 6, 38 (2003). 7. N. C. Seeman and N.R. Kallenbach, Biophys. J., 44, 201 (1983). 8. Y. H. Roh, R. C. H. Ruiz, S. Peng, J. B. Lee, and D. Luo., Chem. Soc. Rev., 40, 5730 (2011). 9. S. H. Um, J. B. Lee, N. Park, S. Y. Kwon, C. C. Umbach, and D. Luo., Nat. Mater., 5, 797 (2006). 10. Y. Li, Y. D. Tseng, S. Y. Kwon, L. d'espaux, S. Bunch, P. L. McEuen, and D. Luo., Nat. Mater., 3, 38 (2003). 11. M. Nishikawa, Y. Mizuno, K. Mohri, N. Matsuoka, S. Rattanakiat, Y. Takahashi, H. Funabashi, D. Luo, and Y. Takakura., Biomaterials., 32, 488 (2011). 12. T. Andre, D. C. Daniele, and D. D. Christian., Nat. New Biol., 239, 110 (1972). 13. N. Park, S. H. Um, H. Funabashi, J. Xu, and D. Luo., Nat. Mater., 8, 432 (2009). 14. N. Park, J. S. Kahn, E. J. Rice, M. R. Hartman, H. Funabashi, J. Xu, S. H. Um, and D. Luo., Nat. Protoc., 4, 1759 (2009). 15. J. B. Lee, S. Peng, D. Yang, Y. H. Roh, H. Funabashi, N. Park, E. J. Rice, L. Chen, R. Long, M. Wu, and D. Luo., Nat. Nanotech., 7, 816 (2012). 16. H. Y. Lee, H. Jeong, I. Y. Jung, B. Jang, Y. C. Seo, H. Lee, and H. Lee., Adv. Mater., 27, 3513 (2015). 17. Y. H. Roh, J. B. Lee, S. J. Tan, B. Kim, H. Park, E. J. Rice, and D. Luo., Macromol. Rapid Commun., 31, 1207 (2010). 18. H. Kang, H. Liu, X. Zhang, J. Yan, Z. Zhu, L. Peng, H. Yang, Y. Kim, and W. Tan., Langmuir, 27, 399 (2011). 고분자과학과기술제 28 권 2 호 2017 년 4 월 125