식물병연구 Research Article Open Access Res. Plant Dis. 23(2): 186-192 (2017) https://doi.org/10.5423/rpd.2017.23.2.186 딸기육묘장토양내식물기생선충의감염현황과자묘를통한선충의분산 Incidence of Plant-Parasitic Nematodes in Strawberry Nursery and Nematode Dispersal by Daughter Plant 고형래 1 ㆍ이민아 1,2 ㆍ김은화 1 ㆍ김세종 3 ㆍ이재국 1 * 1 국립농업과학원농산물안전성부작물보호과, 2 티엔에스, 3 투엠바이오 *Corresponding author Tel: +82-63-238-3316 Fax: +82-63-238-3838 E-mail: jk2lee@korea.kr Hyoung Rai Ko 1, Min A Lee 1,2, Eun Hwa Kim 1, Se Jong Kim 3, and Jae Kook Lee 1 * 1 Crop Protection Division, Department of Agro-food Safety and Crop Protection, National Institute of Agricultural Sciences, Wanju 55365, Korea 2 Tomorrow & Solution (TnS), Daejeon 34141, Korea 3 2mbio Co., Ltd., Suwon 16229, Korea Received March 14, 2017 Revised March 31, 2017 Accepted April 2, 2017 To survey the incidence of plant-parasitic nematode in strawberry nursery, 117 soil samples were collected from main producing area of strawberry nursery plants in 2016. The incidences of two major problematic nematodes such as root-lesion nematodes (Pratylenchus spp.) and root-knot nematodes (Meloidogyne spp.) were 11% and 3%, respectively. Strawberry nurseries using upland soil either in fields or in plastic-houses showed were higher infection rates of Pratylenchus spp. or Meloidogyne spp. than others. On the other hand, a strawberry nursery using pots filled with bed soil in plastichouse was the lowest infection rate with 0%. Phylogenetic relationships and distance analysis were performed for identification of Pratylenchus spp. and Meloidogyne spp. detected from strawberry nurseries. As the results, they were identified as Pratylenchus penetrans, Pratylenchus vulnus and Meloidogyne hapla. Meanwhile, when nursery plants of strawberry infested with P. vulnus transplanted to pots filled with sterilized soil, P. vulnus was detected from soil in pots as 33% frequency. Thus, P. vulnus can be spread through nursery plants of strawberry infested with that. These studies suggested that Pratylenchus spp. and Meloidogyne spp. were ploblematic nematodes in major areas of strawberry nursery plants and P. vulnus could be spread through nursery plants of strawberry. Keywords: Incidence, Meloidogyne, Nursery plant, Pratylenchus, Strawberry 서론 딸기의총생산액은약 1 조 3 천억원으로미곡다음으로 큰시장을형성하고있으며, 농가에서도안정적이고고소 득을낼수있는작물로여기고있다 (MAFRA, 2015). 대부분 Research in Plant Disease pissn 1598-2262, eissn 2233-9191 www.online-rpd.org 의딸기시설재배농가들이연작을하고있으며, 이에따라식물기생선충에의한피해가지속적으로나타나고있다 (Kim 등, 2013). 딸기에피해를주는식물기생선충으로는뿌리혹선충 (Meloidogyne), 뿌리썩이선충 (Pratylenchus), 잎선충 (Aphelenchoides), 창선충 (Xiphinema), 바늘선충 (Longidorus), 주름선충 (Criconematoides) 등이알려져있다 (Brown 등, 1993; Esnard와 Zukerman, 1998). 또한, 국내딸기노지재배지와시설재배지 The Korean Society of Plant Pathology cc This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/ by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 186
Research in Plant Disease Vol. 23 No. 2 187 를대상으로토양내식물기생선충감염현황을조사한결과에서도뿌리혹선충과뿌리썩이선충이주요문제선충으로나타난바있다 (Choi, 1977; Ko 등, 2016). 이러한식물기생선충의종동정은형태적특징과각형태부위별길이, 폭등의평균측정치가주로이용되어왔으나 (Powers, 2004), 최근에는 28S rrna D2 D3 부위유전자나 mitochondrial DNA cytochrome c oxidase subunit II (COII) 부위유전자와같은특정유전자부위를대상으로한중합효소연쇄반응 (PCR), 제한효소절편길이다형성 (restriction fragment length polymorphism) 등과같은분자생물학적기법이널리이용되고있다. 식물기생선충은이들이감염된토양이묻은작업화, 농기계및관개수등을통해인근포장으로확산될수있는것으로알려져있다 (Castillo 등, 2007). 특히, 딸기는모주 (mother plant) 의런너 (runner) 에의해생산되는자묘 (daughter plant) 를모종으로이용한다. 딸기자묘가식물기생선충이감염된토양과접촉하면식물기생선충은딸기의본포장으로확산될수있으며, 이를막기위해서는식물기생선충이감염되지않은토양에서건전한육묘를생산하는것이중요하다. 하지만국내에서는아직까지딸기육묘장에서문제될수있는식물기생선충의감염현황, 피해와확산등에대한연구가수행되지않았다. 이에따라, 본연구에서는딸기육묘장의지역, 육묘형태및육묘에이용되는토양종류별식물기생선충의감염현황을조사하고, 문제선충의종을동정하며, 이들이자묘를통해인근지역이나타지역의딸기본포장으로확산될수있는지여부를조사하고자하였다. 재료및방법 딸기육묘장토양및자묘채취와선충분리. 2016년 6월 24일부터 9월 1일까지충남의 2개지역 ( 논산, 부여 ), 전남의 3개지역 ( 담양, 곡성, 순천 ) 과경남의 2개지역 ( 진주, 밀양 ) 총 7개지역의딸기육묘장으로부터 117점의토양시료를채취하였다. 토양시료는육묘장의지역, 육묘형태및육묘토양종류를기준으로구분하여채취하였다. 모든시료는분석에사용하기전까지 10 C 저온창고에보관하였다. 채취한토양으로부터선충을분리하기위해토양을골고루섞어플라스틱비커를이용하여 300 cm 3 를정량하고, 수돗물이들어있는플라스틱통에넣어현탁액을만들었다. 토양현탁액을 20 mesh와 400 mesh 체 (sieve) 를이용하여거른다음변형시킨 Baermann 깔때기에올려놓고실험실조건에서 48시간동안배양하였다 (Barker 등, 1985; Kim 등, 2014). 48시간경과후, 변형시킨 Baermann 깔때기의고무튜브에모인선충을 15 ml 플라스틱튜브를이용하여회수하였다. 분리된선충은실체현미경 (MZ12; Leica, Wetzlar, Germany) 을이용하여 50배율로관찰하면서식물기생선충의종류와밀도를조사하였다. 딸기육묘장주요문제선충의 DNA 추출과 PCR. 국내딸기육묘장의주요문제선충종동정을위해부여 1개, 담양 1개와순천 3개포장으로부터분리된뿌리썩이선충과담양 1개, 순천 1개포장으로부터분리된뿌리혹선충을각각 3 10마리씩표준집단으로선발하여 Iwahori 등 (2000) 의방법을통해 genomic DNA를추출하였다 (Table 1). 슬라 Table 1. The origin of nematodes used in phylogenetic analysis Genus Sample Collection date (day/mo/yr) GPS coordinates Accession no. Pratylenchus BY06 4/8/2016 36.2393290, 126.8331930 DY20 17/8/2016 35.2855620, 126.9270960 SCN01 20/7/2016 34.9111580, 127.2749330 SCN05 20/7/2016 34.9061680, 127.2861530 SCN07 20/7/2016 34.9082950, 127.2873990 Meloidogyne SCN07 20/7/2016 34.9082950, 127.2873990 DY14 17/8/2016 35.2671380, 126.9194010 GPS, Global Positioning System. KY752520 KY752521 KY752522 KY752523 KY752524 KY853755 KY853756
188 Research in Plant Disease Vol. 23 No. 2 이드글라스위에멸균수를한방울떨어뜨리고뿌리썩이선충또는뿌리혹선충을건져넣은다음, 작게자른필터페이퍼조각으로선충을짓눌렀다. 이때, 체벽이파쇄되면서나오는세포성분을필터페이퍼에묻혀 15 μl의 Proteinase K solution (2 M KCl 2, 10 mm Tris-HCl, 1 M MgCl 2, 10% [w/v] Triton- X 100, 20.6 mg/ml Proteinase K) 이들어있는 PCR tube에넣고 60 C에서 30분, 94 C에서 10분간배양시켜 DNA를추출하였다. 뿌리썩이선충의 PCR은 28S rrna D2 D3 expansion segments 부위유전자에대한 universal primer인 #D2A (forward primer, 5 -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3 ) 와 #D3B (reverse primer, 5 -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3 ) 를이용하여수행하였다 (Nunn, 1992). 뿌리혹선충의 PCR은 COII 부위유전자에대한 universal primer인 #C2F3 (forward primer, 5 -GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3 ) 와 #1108 (reverse primer, 5 -TACCTTTGACCAATCACGCT-3 ) 를이용하여수행하였다 (Powers와 Harris, 1993). PCR을위해 template DNA 4 μl, PCR premix (HelixAmp TM Ready-2X-Go Series; Nanohelix, Daejeon, Korea) 15 μl, forward와 reverse primer 각각 0.5 μl와 triple distilled water 30 μl를 0.2 ml centrifuge 튜브에넣고혼합하였다. 혼합한 0.2 ml의튜브를 PCR cycler (PTC-200; MJ Research, Alameda, CA, USA) 를이용하여뿌리썩이선충은 94 C에서 1분간 denaturation, 55 C에서 40초간 annealing, 72 C에서 1분간 extension 과정을 35회반복하였으며, 뿌리혹선충은 94 C 에서 1분간 denaturation, 48 C에서 1분간 annealing, 68 C에서 3분간 extension 과정을 35회반복하였다. PCR 결과는전기영동장치 (Mupid exu; ADVANCE, Tokyo, Japan) 를이용하여 1% 아가로오스겔, 1 TAE buffer (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA) 에서 100 V, 25 ma로 25분간전기영동한다음, UV장치 (UVCI-1100; Major Science, New Taipei City, Taiwan) 에서확인하였다. 분자생물학적계통수및종내 종간변이율분석. 뿌리썩이선충과뿌리혹선충의 PCR 증폭산물은 PCR Purification Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany) 를이용하여정제하였으며, DNA 염기서열은 ( 주 ) 제노텍유전체분석센터에서 Sanger dideoxy sequencing 기반장비 (ABI PRISM 3730xl DNA sequencer; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를이용하여분석하였다. 분석결과로부터 Chromas Lite 2.0, EditSeq 5.05와 SeqMan 5.05 프로그램을이용하여 DNA 염기서열을결정하였으며, 미국국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 에기등록된데이터들과함께 Clustal X 1.83의기본값으로정렬하였다. 분자생물학적계통수는 Mrbayes 3.2.6의 General Time Reversible substitution model (GTR+G) 을이용하여작성하였고 (Vovlas 등, 2015), Dendroscope 3.5.7을이용하여편집하였다. 뿌리썩이선충의외집단분류군 (outgroup) 은 Palomares-Rius 등 (2010) 의연구결과를참고하였으며, 뿌리혹선충의외집단분류군은 Humphreys-Pereira 등 (2014) 의연구결과를참고하였다. 종내 종간변이율분석에는 MEGA 6.06의 distance 분석도구를이용하였다. 딸기자묘를통한뿌리썩이선충의포장간분산여부검정. 2016년 8월 9일, 순천의사과뿌리썩이선충 (Pratylenchus vulnus) 이감염된딸기노지토경육묘장으로부터생산된자묘를 3포기채취하였다. 채취한자묘뿌리를수돗 Table 2. The incidence of plant-parasitic nematodes in strawberry nursery Location No. of soil samples % of nematode infestation (nematode density*) Meloidogyne Pratylenchus Tylenchidae Nonsan 25 0 20 (8.4±7.44) 36 (6.5±5.94) Buyeo 12 0 8 (6 ) 8 (77) Damyang 21 10 (7.5±7.78) 10 (24.5±26.16) 5 (4) Gokseong 12 0 0 17 (4±2.83) Suncheon 15 13 (4.5±3.54) 33 (63.2±89.15) 20 (15±23.39) Jinju 22 0 0 0 Miryang 10 0 0 20 (23.5±16.26) Total 117 3 (6.0±5.23) 11 (31.8±58.55) 15 (14.4±19.33) *Nematode density=mean±standard deviation of nematodes numbers in 100 cm 3 soil. Detected from a single nursery.
Research in Plant Disease Vol. 23 No. 2 189 물로깨끗이씻은다음 1,000 cm 3 의멸균토양이들어있는토분 ( 직경 13 cm) 에 2016년 8월 11일정식하였다. 정식 33일후, 토양내뿌리썩이선충밀도를확인하기위해 20 mesh와 400 mesh 체를이용한체법과 Baermann 깔때기법으로선충을분리하였다. 실체현미경 (MZ12) 을이용하여분리한선충시료에서뿌리썩이선충의존재여부와밀도를확인하였다. 결과및고찰 딸기육묘장의식물기생선충감염현황. 2016년 6월부터 9월까지국내딸기육묘장 117개포장의토양시료의식물기생선충감염현황을조사한결과, 딸기육묘장의토양에서는뿌리혹선충 (Meloidogyne spp.), 뿌리썩이선충 (Pratylenchus spp.) 과참선충 (Tylenchidae) 이검출되었다 (Table 2). 주요검출선충가운데참선충은딸기에피해를일으키지않는선충으로알려져있기때문에 (Choi, 1977) 딸기육묘장에서가장문제되는선충은뿌리썩이선충과뿌리혹선충으로생각된다. 이러한결과는시설재배주산단지포장에서뿌리썩이선충과뿌리혹선충이주요문제선충으로나타난연구결과와일치하였다 (Ko 등, 2016). 뿌리썩이선충의지역별검출빈도는순천과논산이 33% 와 20% 로가장높았으며, 뿌리혹선충은담양과순천에서 10% 와 13% 의비교적낮은빈도로검출되었다. 그러나딸기주요기생선충이자묘를통해본포장으로확산될수있음을고려하였을때, 결코낮지않은검출빈도로생각된다. 한편, 딸기의문제선충으로알려져있는잎선충 (Aphelenchoides spp.) 의발생조사를위해 117개포장가운데피해가의심되는 29개포장에서자묘를채취하여잎선충감염여부를조사하였으나검출되지않았다 (data not shown). 이는잎선충이감염되지않은조직배양묘의보급이나피해의심주발생시농가에서조기제 거하기때문에검출되지않았을것으로생각된다. 딸기의육묘형태와토양종류별식물기생선충감염현황. 국내딸기육묘장 117개포장을대상으로육묘형태와토양의종류별식물기생선충의발생현황을조사한결과는 Table 3과같다. 노지 (field) 또는비닐하우스 (plastic house) 에서밭토양 (upland soil) 을이용하여토경육묘를했을때, 딸기의주요기생선충으로알려진뿌리썩이선충과뿌리혹선충 (Ko 등, 2016) 의검출빈도는노지에서 17% 와 2%, 비닐하우스에서 21% 와 13% 로다른육묘방법에비해상대적으로높게나타났다. 비닐하우스에서화강토 (granite soil) 를이용하여포트육묘를했을때는뿌리썩이선충이 5% 의낮은빈도로검출되었다. 이와달리, 노지에서화강토를이용하거나비닐하우스에서상토 (bed soil) 를이용하여포트육묘를했을때뿌리썩이선충과뿌리혹선충등어떠한식물기생선충도검출되지않았다. 하지만노지와비닐하우스의포트육묘에이용되는화강토는동일하므로화강토를이용한노지포트육묘에서도식물기생선충이검출될수있는가능성을배제할수없다. 한편, 국내에서는딸기육묘에있어잎선충의피해를예방하기위해모주정식전살선충제침지처리를통한방제효과에대한연구이외에는모주재배지의선충관리방안에대한연구가수행되지않았다 (Kim 등, 2008). 이에따라, 비닐하우스에서상토를이용하여포트육묘를하면잎선충을제외한토양내서식하는주요기생선충의감염을사전에예방할수있는친환경적인선충관리방안으로생각된다. 딸기육묘장문제선충의종동정. 딸기육묘장의문제선충으로나타난뿌리썩이선충과뿌리혹선충의종을확인하기위해유전자분석을수행하였다 (Fig. 1). 유전자분석을위해뿌리썩이선충은 28S rrna 유전자부위마커를, Table 3. The incidence of plant-parasitic nematodes in strawberry nurseries with different nursery and soil types Nursery type Soil type No. of samples % of nematode infestation (nematode density*) Meloidogyne Pratylenchus Aphelenchoides Tylenchidae Field Upland soil 41 2 (7.3±5.51) 17 (33.9±60.62) 0 39 (15.0±19.75) Plastic house Upland soil 24 13 (6.0±5.23) 21 (31.8±58.55) 0 8 (14.4±19.33) Pot on field Granite soil 11 0 0 0 0 Pot in plastic house Granite soil 20 0 5 (2 ) 0 0 Pot in plastic house Bed soil 21 0 0 0 0 *Nematode density=mean±standard deviation of nematode numbers in 100 cm 3 soil. Detected from a single nursery.
190 Research in Plant Disease Vol. 23 No. 2 뿌리혹선충은 COII 유전자부위마커를선발하여 PCR을수행하였다. 그결과뿌리썩이선충의모든시료로부터약 750 bp의증폭산물을얻었으며, 뿌리혹선충의모든시료로부터약 500 bp의증폭산물을얻었다 (data not shown). DNA 염기서열을기반으로분자생물학적계통분석을위해각선충표준집단의 PCR 증폭산물에대한 DNA 염기서열분석을수행하였으며, 이를통해작성한분자생물학적계통수는 Fig. 1, 2와같다. 부여 1개, 담양 1개와순천 3개포장에서각각검출된뿌리썩이선충과담양 1개, 순천 1개포장에서각각검출된뿌리혹선충의분자생물학적계통분석결과, 딸기뿌리썩이선충 (Pratylenchus penetrans) 과사과뿌리썩이선충 (P. vulnus) 2종의뿌리썩이선충과당근뿌리혹선충 (Meloidogyne hapla) 1종의뿌리혹선충이확인되었다. 정확한종동정을위해 MEGA 6.06 프로그램을이용하여 distance 분석을수행하였다. 딸기뿌리썩이선충 clade로분류된 BY06 개체군 (population) 을 NCBI에기등록된 P. penetrans (EU130863) 와종내변이율을분석한결과, P. penetrans (EU130863) 와는 1.9% 의종내변이율을나타냈다. 근연종과의종간변이율분석에는 P. penetrans (EU130863) 와 Pratylenchus dunensis (AM231943) 를이용하였으며, P. penetrans (EU130863) 와는 1.9%, P. dunensis (AM231943) 와는 12.6% 의종간변이율을나타냈다. 이러한결과에따라, 부여 1개포장에서검출된뿌리썩이선충은딸기뿌리썩이선충 (P. penetrans) 으로동정되었다. 사과뿌리썩이선충 clade로분류된 DY20, SCN01, SCN05 와 SCN07 국내개체군들간의종내변이율을분석한결과 0.2% 로나타났다. 근연종과의종간변이율분석에는 P. vulnus (EU130888), Pratylenchus crenatus (EU130853) 와 Pratylenchus pratensis (AM231935) 를이용하였으며, P. vulnus (EU130888) 와는 2.8%, P. crenatus (EU130853) 와는 20.3%, P. pratensis (AM231935) 와는 22.6% 의종간변이율을나타냈다. 이에따라, 담양 1개와순천 3개포장에서검출된뿌리썩이 Fig. 1. The bayesian tree inferred from 28S rrna expansion segments D2 D3 region sequences with general time reversible substitution model (GTR+G) of Pratylenchus. Newly obtained sequences of Pratylenchus species indicated in bold.
Research in Plant Disease Vol. 23 No. 2 191 Fig. 2. The bayesian tree inferred from cytochrome c oxidase subunit II (COII) region sequences with general time reversible substitution model (GTR+G) of Meloidogyne. Newly obtained sequences of Meloidogyne species indicated in bold. 선충은사과뿌리썩이선충으로동정되었다. 당근뿌리혹선충 clade로분류된 SCN07과 DY14 국내개체군들간의종내변이율을분석한결과 1.4% 로나타났다. 근연종과의종간변이율분석에는 M. hapla (AY757902, KF993633), Meloidogyne chitwoodi (KF993641) 와 M. enterolobii (KF993632) 를이용하였다. SCN07, DY14와 M. hapla (AY757902) 와는 2.5%, M. hapla (KF993633) 와는 1.0%, M. chitwoodi (KF993641) 와는 32.9%, M. enterolobii (KF993632) 와는 23.1% 의종간변이율을나타냈다. 이를통해담양 1개와순천 1개포장에서검출된뿌리혹선충은당근뿌리혹선충 (M. hapla) 으로동정되었다. 사과뿌리썩이선충과딸기뿌리썩이선충은국내딸기재배지일부지역의선충조사결과에서검출이확인된바있으며 (Choi, 1977; Park 등, 2005), 사과뿌리썩이선충과당근뿌리혹선충은진주지역딸기시설재배포장의문제선충으로도잘알려져있다 (Ko 등, 2016). 본연구결과에따라, 딸기육묘장에서자묘를생산함에있어딸기뿌리썩이선충, 사과뿌리썩이선충과당근뿌리혹선충의피해가문제될것으로생각되며, 육묘전이들의감염여부확인및방제대책을마련하는것이필요할것으로생각된다. 어날수없다고하였다. 하지만뿌리썩이선충이감염된토양이묻은농기구나신발을통해서빠르게확산될수있고, 관개수를통해서먼거리를이동할수있다고하였다. 사탕무씨스트선충 (Heterodera schachtii) 도작업화나작업차량에묻은토양을통해인근포장으로확산될수있으며, 강우시유거수를통해서도확산될수있다고알려진바있다 (Kwon 등, 2016). 딸기의경우런너를통해생성되는자묘를모종으로이용하기때문에딸기주요기생선충이자묘뿌리에묻은토양을통해서확산될가능성이있을것으로생각된다. 그러나본연구에서는뿌리썩이선충이감염된토양을제거한자묘를통해서도이들선충이다른포장으로확산될수있는지여부를확인하고자하였다. 그결과, 토양이묻지않은자묘를통해서도뿌리썩이선충이확산될수있음을확인하였다. 뿌리혹선충도마찬가지로딸기뿌리에혹과난낭을형성하므로자묘를통해서다른포장으로확산될수있을것으로생각된다. 이에따라딸기육묘시모주를정식하기전관할지역시군농업기술센터나도농업기술원을통해딸기육묘예정지에뿌리썩이선충이나뿌리혹선충과같은주요문제선충이감염되었는지를확인하고육묘에들어가는것이좋을것으로생각된다. 딸기자묘를통한식물기생선충의포장간분산. 순천에서채취한사과뿌리썩이선충이감염된딸기자묘를멸균토양에정식했을때 33% 빈도로사과뿌리썩이선충의감염이확인되었다. Castillo 등 (2007) 에의하면뿌리썩이선충은스스로이동할수있는거리가제한되어있기때문에뿌리썩이선충스스로다른포장으로의확산은빠르게일 요약 2016년 6월부터 9월까지국내딸기육묘장 117개포장의토양으로부터식물기생선충의토양내감염현황을조사하였다. 그결과뿌리썩이선충 (Pratylenchus) 과뿌리혹선충 (Meloidogyne) 이 11% 와 3% 로검출되어딸기육묘장의문제
192 Research in Plant Disease Vol. 23 No. 2 선충으로나타났다. 육묘형태별로는토경육묘에서뿌리 썩이선충과뿌리혹선충의발생빈도가다른육묘방법에비 해높았고, 상토를이용한비가림포트육묘에서는식물기 생선충이검출되지않았다. 뿌리썩이선충은딸기뿌리썩이 선충 (P. penetrans) 과사과뿌리썩이선충 (P. vulnus) 2 종이확인 되었으며, 뿌리혹선충은당근뿌리혹선충 (M. hapla) 1 종이 확인되었다. 사과뿌리썩이선충은딸기자묘를통해식물 기생선충이감염되지않은건전한토양으로의확산이확 인되었다 (33%). Conflicts of Interest No potential conflict of interest relevant to this article was reported. Acknowledgement This research was supported by a grant (Project No. 010929) from Rural Development Administration, Republic of Korea. References Barker, K. R., Carter, C. C. and Sasser, J. N. 1985. An Advanced Treatise on Meloidogyne. Volume II. Methodology. North Carolina State University Graphics, Raleigh, NC, USA. 223 pp. Brown, D. J. F., Dalmasso, A. and Trudgill, D. L. 1993. Nematode pests of soft fruits and vines. In: Plant Parasitic Nematodes in Temperate Agriculture, eds. by K. Evans, D. L. Trudgill and J. M. Webster, pp. 427-462. CAB International, Wallingford, UK. Castillo, P., Vovlas, N. and Brill, E. J. 2007. Pratylenchus (Nematoda: Pratylenchidae): Diagnosis, Biology, Pathogenicity and Management. Brill, Leiden, Netherlands. 550 pp. Choi, Y. E. 1977. Studies on plant-parasitic nematodes associated with strawberry. Res. Rev. Kyungpook Natl. Univ. 23: 309-316. (In Korean) Esnard, J. and Zukerman, B. M. 1998. Small fruits. In: Plant and Nematode Interactions, eds. by K. R. Barker, G. A. Pederson and G. L. Windham, pp. 685-725. American Society of Agronomy, Madison, WI, USA. Humphreys-Pereira, D. A., Flores-Chaves, L., Gomez, M., Salazar, L., Gomez-Alpizar, L. and Elling, A. A. 2014. Meloidogyne lopezi n. sp. (Nematoda: Meloidogynidae), a new root-knot nematode associated with coffee (Coffea arabica L.) in Costa Rica, its diagnosis and phylogenetic relationship with other coffeeparasitising Meloidogyne species. Nematology 16: 643-661. Iwahori, H., Kanzaki, N. and Futai, K. 2000. A simple, polymerase chain reaction fragment length polymorphism-aided diagnosis method for pine wilt disease. Forest Pathol. 30: 157-164. Kim, D. G., Kang, M. W. and Lee, J. H. 2008. Effect of nematicidedipping methods for the control of Aphelenchoides fragariae in strawberry. Korean J. Appl. Entomol. 47: 101-105. (In Korean) Kim, S. H., Park, S. E., Ko, N. Y., Ryu, T. H., Shin, H. S., Kwon, H. R., Seo, M. J., Yu, Y. M. and Youn, Y. N. 2013. The major plant-parasitic nematodes in plastic vinyl house field. J. Agric. Sci. 40: 101-106. (In Korean) Kim, S. J., Yu, Y. M. and Whang, K. S. 2014. Molecular identification of Meloidogyne spp. in soils from fruit and vegetable greenhouses in Korea. Korean J. Appl. Entomol. 53: 85-91. (In Korean) Ko, H. R., Lee, M. A., Kim, E. H., Kim, S. J. and Lee, J. K. 2016. Incidence of major plant-parasitic nematodes in main producing areas of strawberry in Korea. Res. Plant Dis. 22: 249-256. (In Korean) Kwon, O. G., Shin, J. H., Kabir, F. Md., Lee, J. K. and Lee, D. W. 2016. Dispersal of sugar beet cyst nematode (Heterodera schachtii) by water and soil in highland Chinese cabbage fields. Korean J. Hortic. Sci. Technol. 34: 195-205. (In Korean) [MAFRA] Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs. 2015. Agriculture, Food and Rural Affairs Statistics Yearbook. MAFRA, Sejong, Korea. 387 pp. (In Korean) Nunn, G. B. 1992. Nematode molecular evolution: an investigation of evolutionary patterns among nematodes based upon DNA sequences. Ph.D. thesis. University of Nottingham, Nottingham, UK. 187 pp. Palomares-Rius, J. E., Castillo, P., Liébanas, G., Vovlas, N., Landa, B. B., Navas-Cortés, J. A. and Subbotin, S. A. 2010. Description of Pratylenchus hispaniensis n. sp. from Spain and considerations on the phylogenetic relationship among selected genera in the family Pratylenchidae. Nematology 12: 429-451. Park, S. D., Khan, Z., Yeon, I. K. and Kim, Y. H. 2005. A survery for plant-parasitic nematodes associated with strawberry (Fragaria ananassa Duch.) crop in Korea. Plant Pathol. J. 21: 387-390. Powers, T. 2004. Nematode molecular diagnostics: from bands to barcodes. Annu. Rev. Phytopathol. 42: 367-383. Powers, T. O. and Harris, T. S. 1993. A polymerase chain reaction method for identification of five major Meloidogyne species. J. Nematol. 25: 1-6. Vovlas, N., Vovlas, A., Leonetti, P., Liébanas, G., Castillo, P., Subbotin, S. A. and Rius, J. E. P. 2015. Parasitism effects on white clover by root-knot and cyst nematodes and molecular separation of Heterodera daverti from H. trifolii. Eur. J. Plant Pathol. 143: 833-845.