대한수혈학회지 : 제 20 권제 3 호, 2009 시험관법을이용한검사법에따른 ABO 동종응집소역가비교 강민구ㆍ이승재 1 ㆍ오진숙 2 ㆍ임영애 = Abstract = 아주대학교의과대학진단검사의학교실, 의학과 1, 아주대학교병원진단검사의학과 2 Comparison of ABO Isoagglutinin Titers by Different Tube Hemagglutination Techniques Min Gu Kang, Seung Jae Lee 1, Jin Sook Oh 2, Young Ae Lim Department of Laboratory Medicine, Division of Medical Science 1, Ajou University School of Medicine, Department of Laboratory Medicine, Ajou University Medical Center 2, Suwon, Korea Background: The ABO isoagglutinin titer is useful for the evaluation and observation of ABO incompatible bone marrow transplantation or organ transplantation, yet the results can be different depending on the test methods. Measurement of isoagglutinin titer using the gel test has recently been reported, but this test is expensive. In this study, we investigated isoagglutinin titer distribution of normal individuals using the different tube hemagglutination technique to help select the best test method and to interpret the agglutinin titer. Methods: Normal healthy individuals were selected from those patients who underwent a physical examination at Ajou University Hospital, during July 2009. Sixty healthy individuals, (10 men and 10 women per each ABO blood group) were recruited for the study. The immediate spin method (IS), the anti-human globulin method with dithiothreitol treatment (DTT-AHG) and the anti-human globulin method without DTT treatment (AHG) were performed simultaneously. The reciprocal of the highest serum dilution that showed macroscopic agglutination 1+ or more was regarded as the isoagglutinin titer. Results: The isoagglutinin titer measured by the AHG was the highest in the all blood groups. In case of blood groups A and B, the isoagglutinin titer by the IS was higher than that by the DTT-AHG, but this was quite the reverse in the case of the blood group O. Conclusion: If it is not necessary to distinguish IgM antibody and IgG antibody, then it seems that the AHG is the best practical method of those three methods. It was more sensitive than the IS and more rapid and easier than the DTT-AHG. (Korean J Blood Transfus 2009;20:227-234) Key words: ABO isoagglutinin titer, Tube hemagglutination technique, IgG 접수일 :2009년 12월 7일, 승인일 :2009년 12월 16일책임저자 : 임영애 442-749 경기도수원시영통구원천동산 5번지아주대학교의과대학진단검사의학교실 TEL: 031) 219-5786, FAX: 031) 219-5778, E-mail: limyoung@ajou.ac.kr - 227 -
대한수혈학회지 : 제 20 권제 3 호 서론 ABO 자연항체는대부분 IgM 항체이지만, ABO 특이성을보이는 IgA 항체와 IgG 항체또한존재한다. ABO 혈액형동종응집소는용혈수혈부작용과신생아용혈성질환의원인이될수있고, 고형장기이식에서급성거부반응을일으킬수있으며 ABO 부적합골수이식에서는용혈을일으켜적혈구와거핵구생착을지연시킬수있다. 1) 따라서 ABO 혈액형의동종응집소역가는 ABO 부적합골수이식또는장기이식에서의경과관찰및예후평가, ABO 혈액형의아형에대한검사, ABO 혈액형부적합수혈시반응에대한관찰등에도움을줄수있다. 2-5) 특히이식후거부반응의예측에중요한정보를제공하여혈장교환술, 비장절제, 항-CD20 단클론성항체, 면역글로불린정주요법등과같은치료방법의선택에도움을줄수있는데, 6) 인종이나연령간유의한차이를보일수있을뿐아니라, 검사법에따라서많은영향을받을수있다. 대부분의수혈관련면역반응이나장기이식에서의면역반응은 IgM 동종응집소에의한것이지만, IgG 동종응집소또한중요한역할을하고있다. 그러므로 IgG ABO 동종응집소가 IgM보다더높은역가로존재할경우에는 IgG까지측정할수있는방법이필요하다. 그러나 ABO 동종응집소 IgG 측정방법은표준화되어있지않으므로그역가는검사실에따라또는측정방법에따라매우다양하게측정된다. 따라서국내의대부분의검사실에서는 IgM과 IgG를구분하지않고실온식염수법만으로측정하고있으므로, ABO 동종응집소 IgG에대한정보를얻기어려운실정이다. 최근미세원주응집법을이용한 ABO 동종응집 소역가측정의유용성이보고되었기는하나, 7,8) 검사비용이고가라는단점이있으므로, 저자들은시험관을이용한동종응집소검사법에따른정상인들의역가분포를살펴보아결과를해석하고, 동종응집소검사법선택에도움을주고자하였다. 대상및방법 1. 대상 2009년 7월한달간아주대병원건강증진센터에서검진을받은 20세이상, 60세미만의건강한성인중혈액형별로남녀각각 10명씩선정하여 (A형 20명, B형 20명, O형 20명 ) 총 60명을대상으로하였다. 2. 동종응집소역가측정방법 1) 실온식염수법 (Immediate spin method) 2) 9개의시험관에생리식염수 100 ul를분주한후첫번째시험관에피검혈청 100 ul를충분히혼합한다음 100 ul를다음시험관에분주하여계단희석하였다. 해당하는시험관에 2% A형혈구부유액, 또는 2% B형혈구부유액 100 ul를넣은후실온에서혼합하고 3,400 rpm에서 15초간원심분리한후응집여부를판독하여최대희석배수에서응집강도가 1+ 이상인경우를역가로판정하였다. 2) DTT처리하지않은항글로불린법 (37 o C incubation+polyspecific anti-human globulin) 위 1) 의실온식염수법에의한동종응집소역가측정에서원심분리후판독을거친시험관을 37 o C의항온수조에서 30분간항온한다음생리식염수로 3회세척하였다. Polyspecific anti-human - 228 -
시험관법을이용한검사법에따른 ABO 동종응집소역가비교 globulin을각각의시험관에한방울씩넣고혼합및원심분리한후응집여부를판독하여최대희석배수에서응집강도가 1+ 이상인경우를역가로판정하였다. 3) 0.01 M DTT처리후항글로불린법 (37 o C incubation+polyspecific anti-human globulin) 9) 8개의시험관에생리식염수 50 ul를분주한후첫번째시험관에피검혈청 50 ul를충분히혼합 한다음 50 ul를다음시험관에분주하여계단희석하였다. 따로준비한 9개의시험관에 0.01 M 의 DTT 50 ul를분주한후, 첫번째시험관에는피검혈청 50 ul를충분히혼합하였고두번째시험관부터는미리계단희석해둔 8개의피검혈청 50 ul를순서대로분주하여충분히혼합하였다. 그후 37 o C의항온수조에서 30분간항온하였고해당하는시험관에 2% A형혈구부유액, 또는 2% B형혈구부유액 50 ul를혼합하여 37 o C의 Fig. 1. Histogram of ABO isoagglutinin titers according to blood group. (A) Anti-B titer in blood group A. (B) Anti-A titer in blood group B. (C) Anti-A titer in blood group O. (D) Anti-B titer in blood group O. Abbreviations: IS, immediate spin method; DTT-AHG, 37 o C incubation+polyspecific AHG (with DTT treatment) method; AHG, 37 o C incubation+polyspecific AHG (without DTT treatment) method. - 229 -
대한수혈학회지 : 제 20 권제 3 호 항온수조에서다시 30분간항온하였다. 항온이끝난각시험관을생리식염수로 3회세척한다음 polyspecific anti-human globulin을각각의시험관에한방울씩넣고혼합및원심분리한후응집여부를판독하여최대희석배수에서응집강도가 1+ 이상인경우를역가로판정하였다. 3. 통계처리 Excel과 SPSS를이용하여각검체의동종응집소역가를나타낸최대희석배수의역수의중앙값과 interquartile range (25 percentile 75 percentile) 로표시하되, 계산된값이 2배수희석배수의역수와일치하지않을경우에는가장근접한희석배수의역수로표기하거나, 각희석배수의중앙으로가장근접한희석배수의역수로표시할수없는경우에는범위로나타내었다. 각혈액형별로세가지방법의비교는 Friedman test를사용하였고, P값이 0.05 미만일때유의한것으로판정하였다. 결과실온식염수법 (IS로약함 ), 0.01 M DTT처리후항글로불린법 (DTT-AHG로약함 ), DTT처리하지않은항글로불린법 (AHG로약함 ) 으로측정한동종응집소역가의분포는그림으로제시하였다 (Fig. 1). 또한세가지방법으로측정한동종응집소역가의중앙값 (interquartile range) 은각각 A형의 anti-b는 8 (8 16), 2 (0 4), 8 (4 16), B형의 anti-a는 16 (8 16), 4 (2 16), 8 16 (8 32) 로서 anti-a (χ 2 =21.46, df=2, P<0.001) 와 anti-b (χ 2 = 29.49, df=2, P<0.001) 모두 AHG법이가장높은역가를보였으며그다음으로 IS법, DTT-AHG법의순으로나타났다. O형의경우도 anti-a의 IS법, Table 1. Median values (Interquatile ranges; 25 75 percentile) of ABO isoagglutinin titer by tube hemagglutination technique Blood Antibody IS DTT-AHG AHG group A anti-b 8 (8 16) 2 (0 4) 8 (4 16) B anti-a 16 (8 16) 4 (2 16) 12* (8 32) O anti-a 16 (8 32) 32 (8 64) 64 (32 64) O anti-b 8 (4 16) 8 (8 32) 32 (16 64) Abbreviations: IS, immediate spin method; DTT-AHG, 37 o C incubation+polyspecific AHG (with DTT treatment) method; AHG, 37 o C incubation+polyspecific AHG (without DTT treatment) method. *8 16. DTT-AHG법및 AHG법의역가는 16 (8 32), 32 (8 64), 64 (32 64), anti-b는 8 (4 16), 8 (8 32), 32 (16 64) 로서 anti-a (χ 2 =18.74, df=2, P< 0.001) 와 anti-b (χ 2 =24.97, df=2, P<0.001) 모두 AHG법이가장높은역가를보이고그다음으로는 DTT-AHG법, IS법순으로나타나 A형과 B형과는차이를보였다 (Table 1). 고찰 미국혈액은행협회에서발간하는 Technical manual에따르면, 항체의역가는연속적으로두배희석한혈청과혈구를반응시킨후육안상응집을보인최대혈청희석배수의역수로표현된다. 이와같은역가측정은혈청에존재하는항체의상대적인양이나적혈구항원표현의상대적인강도에대한정보를제공할수있다. 10) 한국성인에서 A형과 B형의동종응집소역가의중앙값이동일하다고보고한김등의연구와는 11) 달리본연구의동종응집소역가의중앙값은 A형의항-B항체보다 B형의항-A항체가 IS법, - 230 -
시험관법을이용한검사법에따른 ABO 동종응집소역가비교 DTT-AHG법, AHG법모두에서약간더높은결과를보였다. 또한김등의연구에서는 11) A형과 B형의 IgM 동종응집소역가의중앙값이 64를보였는데, 8 16의분포를보인본연구와는차이를보였다. 이러한결과는항체역가측정방법이각검사실마다차이가있을수있음을의미하는데, Redman 등 12) 은환경의차이가동종응집소역가에큰영향을미칠것이라고하였다. 이는또한검사에사용된적혈구항원의종류, 반응시간, 반응온도, 판독자의기술및경험에따른차이등도결과에영향을미칠수있기때문으로여겨진다. 13) 대부분의수혈관련면역반응이나장기이식에서의면역반응은 IgM 동종응집소에의한것이지만, IgG 동종응집소또한중요한역할을하고있기에 IgM 동종응집소만을측정할수있는검사법만을사용할경우에는 IgG 동종응집소에의한반응을간과할수있다. 특히 O형은 A형과 B형에비하여동종응집소 IgG가높은비율을차지하는데, 14) IgM만을측정할수있는방법을사용할경우 IgG를측정할수없게된다. 실제로본연구에서도 O형의경우에 IgM을주로측정하는 IS법에의한동종응집소역가에비해 DTT-AHG법으로측정한동종응집소 IgG의역가가더높았기때문에 IS법만을사용하였다면, 정확한 ABO 동종응집소역가를측정하지못하였을것이다. 2-mercaptoethanol (2-ME) 나 DTT와같은 sulfhydryl 화합물은 IgM 항체의이황화결합을깨뜨려혈청중에존재하는임상적으로중요한 IgG 항체의존재를조사하는데유용하게사용될수있으며, 1) 임상적으로혈액형항원과항체반응에서중요한역할을하는항체인 IgG 동종응집소의역가측정에있어서 DTT의유용성은외국의보고에서도논의된바있다. 9) 본연구에서사용된 DTT-AHG법은동종응집 소 IgG의역가를측정하는데이용될수있으나, DTT 처리와두번의항온단계를거치므로검사법이번거롭고시간이많이소요되었다. 반면본연구에서 AHG법으로측정한동종응집소역가가가장높은결과를보인것은동종응집소 IgM과 IgG를모두반영하기때문으로여겨졌다. 따라서 IgM과 IgG를특별히구별하여야하는경우가아니라면 IS법에비하여더민감하고, DTT-AHG법에비하여빠르고간편한, AHG법이실용적인방법으로판단되었다. 최근일본에서의연구에따르면성공적인 ABO 부적합신장이식을위해서는 ABO 동종응집소역가의정확한측정이필요하지만, 표준화된측정법이아직수립되지않은실정이며대부분의기관에서시험관법을사용하여혈청의연속적인두배희석에의하여 ABO 동종응집소역가를측정하고있지만기관간의변이가크다고하였다. 15) 일본 ABO 부적합이식위원회의보고에따르면, 설문지를통한조사로기관간다양한동종응집소역가측정방법을통일한후역가를측정하게한결과기관간변이가 8배미만으로까지현저히감소하였다고하여 ABO 동종응집소역가측정방법의표준화교육및정도관리를위한정기적인조사가중요함을시사한바있다. 5) 본연구에서는동종응집소역가측정에관한세가지방법을제시하였고각방법에따라혈액형별로역가의차이를보일뿐만아니라, 동일혈액형에서도세가지방법에따른역가의차이를보여각방법에따른역가의차이가매우큼을알수있었다. 최근유럽의세기관에서미세원주응집법과시험관법의 ABO항체역가측정을비교한보고에서는미세원주응집법이시험관법에비하여기관간의항체역가의변이를유의하게감소시킬수있는것으로보고하였고, 7) 국내에서도미세원주응집법을이용한연구가보고된바있 - 231 -
대한수혈학회지 : 제 20 권제 3 호 다. 8) 그러나국내의보험급여체계에서는미세원주응집법을통상적인동종응집소역가검사에이용하기에는현실적인어려움이많다. 또한 ELISA assay, flow cytometry, surface plasmon response, KODE technology 등도시험관법에비하여 ABO 항체역가의측정에있어재현성이더좋은방법으로소개되고있으나, 이러한검사법들을실제로일선검사실에서도입하기에는어려운실정이라하였다. 7) 이는이러한새로운검사법들을도입하기위해서는고가의검사비용및검사의용이성, 검사인력의양성, 고가의장비도입등과같은제반사항등이고려되어야하기때문이라고설명될수있다. 이에반해시험관법은자동화가어렵고시간이많이소요되며, 검사자의주관이개입될수있다는단점이있지만, 가장널리알려지고행해지고있는방법이며혈구응집의원리에의하여역가판정을할수있다. Shirey 등의보고에의하면전통적인시험관법에의한동종응집소역가측정법을간소화한방법및미세원주응집법을전통적인시험관법과비교평가한결과, 이두가지방법이모두기존의전통적시험관법과의높은일치율을보여간소화한방법을사용할경우시간이많이소요되는시험관법의단점을보완할수있음을시사하였다. 16) 그러나검사실간에역가측정이이루어지는환경의다양성및재현성있고정밀한역가측정의어려움은아직까지도해결해야할문제점으로인식되어왔다. AuBuchon 등은항체역가측정의검사실간변이를감소시키기위하여 35개의검사실에항체역가측정에대한자세하고통일된방법 ( 시험관법 ) 을제시하였는데, 최대희석배수는약양성을보이는경우로정의하였다. 그리고제시전, 후의역가를비교한결과제시전에는큰변 이를보였던검사실들이제시한방법에따라항체역가를측정한이후에는검사실간에변이를유의하게줄일수있었다고하였다. 17) 즉, 항체역가측정방법의표준화이외에도최대희석배수를결정하기위한응집강도에대한정의의표준화도검사실간변이를감소시키는데큰기여를한것으로사료되었다. 본연구에서는약양성까지간주하기를권장한 AuBuchon 등과는달리 AABB의지침에따라 1+ 이상의응집을보인경우를최대희석배수로정하여차이를보였다. 따라서최대희석배수를결정하기위한응집강도의정의에따라검사실의역가가달라질수있으므로역가측정에대한표준화를위해서국내에서도역가측정방법뿐만아니라최대희석배수에대한정의의제시도필요할것으로여겨진다. 요약 배경 : ABO 혈액형의동종응집소역가는 ABO 부적합골수이식또는장기이식에서의경과관찰및평가등에도움을주나, 검사법에따라영향을받을수있다. 최근미세원주응집법을이용한역가측정이보고되었기는하나, 고가라는단점이있으므로, 저자들은시험관을이용한동종응집소검사법에따른정상인들의역가분포를살펴보아검사법선택과역가판정에도움을주고자하였다. 방법 : 2009년 7월한달간아주대병원건강증진센터에서검진을받은 20세이상의건강한성인중혈액형별로남녀각각 10명씩선정하여, 총 60명을대상으로실온식염수법, 0.01 M DTT처리후항글로불린법과 DTT처리하지않은항글로불린법의 3가지방법을동시에시행하였다. 1+ 이상의응집강도를보인시험관의최대희석배수의 - 232 -
시험관법을이용한검사법에따른 ABO 동종응집소역가비교 역수를동종응집소역가로판정하였다. 결과 : 모든혈액형에서 DTT처리하지않은항글로불린법에의한동종응집소역가가가장높았으며 A와 B형의경우실온식염수법, O형의경우에는 DTT처리후항글로불린법에의한동종응집소역가가더높았다. 결론 : IgM과 IgG를특별히구별하여야하는경우가아니라면실온식염수법에비하여더민감하고, DTT처리후항글로불린법에비하여빠르고간편한 DTT처리하지않은항글로불린법이실용적인방법으로판단되었다. 참고문헌 1. Beadling WV, Cooling L. Immunohematology. In: McPherson RA, Pincus MR ed. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 21st ed. Philadelphia: Saunders Elseviver, 2007:623-60 2. Han KS, Park MH, Cho HI. Transfusion medicine. 3rd ed. Seoul: Korea Medical Publisher, 2006:165, 409 3. Song TJ, Lim CS, Park IS, Lee KN, Jung KH, Choi SY, et al. ABO blood type incompatible liver transplantation in a child. J Korean Surg Soc 1998;55:604-10 4. Shimmura H, Tanabe K, Ishikawa N, Tokumoto T, Takahashi K, Toma H. Role of anti-a/b antibody titers in results of ABOincompatible kidney transplantation. Transplantation 2000;70:1331-5 5. Lee SH, Kwon SW, Lee JH, Lee KH, Kim WK, Kim SH, et al. Isoagglutinin titer in major ABO incompatible bone marrow transplantation. Korean J Blood Transfus 1997;8:167-76 6. Kobayashi T, Saito K. A series of surveys on assay for anti-a/b antibody by Japanese ABO-incompatible transplantation committee. Xenotransplantation 2006;13:136-40 7. Kumlien G, Wilpert J, Säfwenberg J, Tydén G. Comparing the tube and gel techniques for ABO antibody titration, as performed in three European centers. Transplantation 2007;84(S12): S17-9 8. Kim YJ, Cho SA, Kim SY, Kim HH, Chang CL, Lee EY, et al. The usefulness of isoagglutinin titer measurement for ABO-mismatch organ transplantation patients, examined by Coombs method using gel test. Korean J Hematol 2008;43(S2):271 9.Knight RC. Measuring IgG anti-a/b titres using dithiothreitol (DTT). J Clin Pathol 1978; 31:283-7 10. Walker PS. Identification of antibodies to red cell antigens. In: Roback JD, Combs MR, Grossman BJ, Hillyer CD ed. Technical manual. 16th ed. Bethesda, Maryland: American Association of Blood Banks, 2008:483-4 11. Kim JS, Hyun RK, Lee HK, Kim DW. Evaluation of ABO isoagglutinin titers in Korean adults. Korean J Blood Transfus 1997;8:119-24 12.Redman M, Malde R, Contreras M. Comparison of IgM and IgG anti-a and anti-b levels in Asian, caucasian and negro donors in the north west thames region. Vox Sang 1990; 59:89-91 13. Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. ABO, Lewis, Ii and P groups. In: Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M ed. Blood transfusion in clinical medicine. 9th ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1993:148-203 14. Rosner ER, Pirofsky B, Sheth K. The influence of dialysis in 2-mercaptoethanol reduction of erythrocyte antibodies. Transfusion 1974;14: 47-50 15. Tanabe K. Interinstitutional Variation in the measurement of Anti-A/B antibodies: the Japanese ABO-incompatible transplantation - 233 -
대한수혈학회지 : 제 20 권제 3 호 committee survey. Transplantation 2007;84(S12): S13-6 16. Shirey RS, Cai W, Montgomery RA, Chhibber V, Ness PM, King KE. Streamlining ABO antibody titrations for monitoring ABO-incompatible kidney transplants. Transfusion 2009 [in press] 17. AuBuchon JP, de Wildt-Eggen J, Dumont LJ. Reducing the variation in performance of antibody titrations. Vox Sang 2008;95:57-65 - 234 -