Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 148-154 (2015) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2015.30.4.148 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 양파껍질열수추출물의 in vitro 및 in vivo 항염증효과 강보경 1, 김꽃봉우리 2, 안나경 1, 최연욱 1, 김민지 2, 박시우 1, 박원민 1, 김보람 1, 박지혜 1, 배난영 1, 안동현 1 * Anti-inflammatory Effect of Onion (Allium cepa) Peel Hot Water Extract in vitro and in vivo Bo-Kyeong Kang 1, Koth-Bong-Woo-Ri Kim 2, Na-Kyung Ahn 1, Yeon-Uk Choi 1, Min-ji Kim 2, Si-Woo Bark 1, Won-Min Pak 1, Bo-Ram Kim 1, Ji-Hye Park 1, Nan-Young Bae 1, and Dong-Hyun Ahn 1 * Received: 24 November 2014 / Revised: 30 March 2015 / Accepted: 2 April 2015 2015 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Onion (Allium cepa) is one of the flavonoids-rich materials in human diet and onion peel, which is the onion byproducts, contains over 20 times more quercetin than the flesh. In this study, to examine the anti-inflammatory effects of onion peel hot water extract (OPHWE), the cell viability, nitric oxide (NO), pro-inflammatory cytokines, such as interluekin-6 (IL- 6), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and IL-1β, were measured using the murine macrophage cell line RAW 264.7 cells. The Balb/c mice were used for an in vivo acute toxicity test and ICR mice were used for measurement of inhibition effects of croton oil-induced mouse ear edema. As a result, NO levels decreased in a dose-dependent manner. The production of IL-6, TNF-α, and IL-1β was suppressed by 38%, 41%, and 34% respectively, compared with that of the LPS only group, without any cytotoxicity. The edema formation in the ICR mouse ear was also reduced compared to that in control. Moreover, there were no mortalities occurred in mice administered 5,000 mg/kg body weight of OPHWE. These results suggest that OPHWE has considerable anti-inflammatory activities and 1 부경대학교식품공학과 / 식품연구소 1 Department of Food Science & Technology/Institute of Food Science, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea Tel: +82-51-629-5831, Fax: +82-51-629-5824 e-mail: dhahn@pknu.ac.kr 2 부경대학교수산과학연구소 2 Institute of Fisheries Sciences, Pukyong National University, Busan 619-911, Korea can be regarded as a potent candidate material to treat inflammatory diseases. Keywords: Onion peel hot water extract, Anti-inflammatory effect, Cytokine, Mouse ear edema 1. INTRODUCTION 염증반응이란외부로부터의침입이나조직손상시생체를방어하기위해일어나는필수적인방어기전으로, 작용및발생기간에따라급성염증반응과만성염증반응으로나눌수있다 [1]. 급성염증반응은항원에의해대식세포 (macrophage) 가활성화됨에따라 cytokine, nitric oxide (NO) 를비롯한여러염증매개인자가분비되어이물질을제거한후조직재생의과정을통해종료되는것으로 [2], 증상으로는발열, 종창, 동통등이알려져있다 [3]. 이러한염증반응에서대식세포는숙주의방어와항상성유지에관여하는세포로, 그람음성균의세포벽성분인 lipopolysaccharide (LPS) 에의해활성화되어여러염증성매개인자를발현한다 [4]. 대식세포는염증반응시표면의수용체인 toll like-receptor 4 (TLR4) 를통해자극을수용하고, 전사인자인 nuclear factor-kappa B (NF-κB) 및 mitogen activated protein kinase (MAPK) 의활성화를거쳐염증성 cytokine 인 interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 IL-1β 의생산을증가시키며, 염증성효소인 inducible nitric oxide synthase (inos) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2) 를발현시켜박테리아를죽이거나, 종양을제거하는역할을하여생체방어기능을한다 [5-9]. 그러나
양파껍질열수추출물의 in vitro 및 in vivo 항염증효과 149 이러한 cytokine 및 NO 가병리적으로과도하게생성될시유전자변이나조직및신경손상을유발하여숙주에치명적인결과를초래할수있는것으로보고되고있다 [10]. 최근환경오염이나스트레스의증가와같은외부적요인에의해염증매개인자가과도하게발생됨으로써급성패혈성쇼크를비롯한만성염증및면역과민반응으로발전하여류마티스관절염, 암, 염증성장질환과같은여러질병의발병률이증가추세에있다 [1,11]. 따라서염증반응의조절은생체유지에매우중요한것으로여겨지고있으며, 염증반응으로부터생성되는 NO, cytokine 과같은매개물질의생성억제효과를통해항염증효과를확인할수있다 [12]. 양파 (Allium cepa) 는백합과에속하는 2 년생초본으로, 전세계적으로식품의향신조미료외에약재로도널리애용되어, 예로부터해열, 구충, 해독및종양치료에사용되어왔다 [13]. 양파의다양한생리활성을나타내는주요성분인 flavonoid 계성분에는 quercetin, quercitrin, rutin 등이있는데, 특히국내에서재배되는 yellow onion 은 quercetin 의함량이매우높은것으로알려져있다 [14]. 양파의 quercetin 은유방암억제, LDL 산화억제등의생리활성을가지는것으로알려져있으며, 이러한 quercetin 은양파의중심부보다는껍질부분으로갈수록함량이높아져, 양파과육및양파즙에는 0.01% 의함량을보이는반면, 양파껍질에서는 6.5% 을차지하는것으로보고된바있으며, 또한껍질부위에는식이섬유도가식부인과육 (0.4~0.5%) 에비해약 25~32% 로매우높은함량을가지는것으로나타났다 [15]. 양파는국내생산량의약 10% 가가공품으로이용되고있으며, 최근단체급식의위생화및소비자의신선식품선호등의추세로인해, 껍질과뿌리를제거한 1 차가공품의상태로유통되는경우가증가하고있어가공시발생하는껍질과뿌리가증가하고있으나이는사료로이용되거나폐기되고있는실정이다 [16]. 따라서양파가공부산물인양파껍질의생리활성기능을탐색하여새로운기능성식품소재로서의활용이가능해질것으로사료되며, 이는폐자원을이용한다는면에서의미가있다. 한편현재까지진행된연구로는양파과육및양파즙에대한연구가대부분이었으며, 껍질에대한생리활성연구로는항산화 [17], xanthine oxidase 저해활성 [18], 혈행개선 [19] 등에대한연구만이이루어져있어, 양파껍질이가지는항염증효과에대한연구는전무한실정이다. 본연구에서는유기용매추출이아닌열수추출법을이용하여양파껍질의추출물을제조하였는데, 이는추출시에제기되는잔류용매의독성문제를벗어나고, 아울러향후기능성차또는건강기능성식품소재로개발시경제적인이점이있을것으로사료되기때문이다 [20]. 따라서본연구에서는양파부산물의유효활용을위한일련의연구로써, 양파껍질열수추출 (OPHWE) 의항염증효과를탐색하고그이용가능성을제시하기위하여활성화된대식세포주 RAW 264.7 cell 을이용한 in vitro type 실험및마우스를이용한 in vivo type 의실험을진행하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 재료및추출본실험에사용한양파 (Allium cepa) 의껍질은경상북도영천농가에서구입하였으며, 껍질을분리하여담수로깨끗이수세하고동결건조및분말화후, 진공포장하여 -20 o C 에서저장하며사용하였다. 건조된양파껍질분말에 10 배의증류수를가하고 100 o C 에서중탕하여 2 시간동안열수추출하였다. 추출액은여과한후 37 o C 에서감압농축기 (RE200, Yamoto Co., Tokyo, Japan) 로농축하였으며, 농축하여건조된시료는 -20 o C 에서보관하며실험에이용하였다. 양파껍질열수추출의수율은약 19.7% 이였다. 2.2. 실험동물생후 8 주령의수컷 ICR 마우스를오리엔트바이오 (Orient Co., Seongnam, Korea) 로부터구입하여귀부종및조직관찰실험에사용하였으며, 생후 10 주령의암컷 Balb/c 마우스를단기독성평가실험에이용하였다. 마우스는온도 20±2 o C, 습도 50±10%, 12 시간명암주기가유지되는동물사육실에서 1 주일간예비사육한후실험에사용하였다. 동물실험은부경대학교동물실험윤리위원회의승인을받아시행되었으며, 부경대학교동물실험윤리지침을준수하였다. 2.3. 세포배양마우스대식세포주인 RAW 264.7 세포는한국세포주은행 (KCLB 40071, Seoul, Korea) 에서분양받아사용하였으며, DMEM (GIBCO, Grand Island, NY, USA) 에 10% inactivated fetal bovine serum (FBS) (GE healthcare, Waukesha, WI, USA) 와 1% penicillin-streptomycin을첨가한배지를배양액으로 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 2.4. 세포생존율측정 Park 등 [21] 의방법을변형하여시료의세포생존도를 MTT assay 를통해살펴보았다. RAW 264.7 세포를 1 10 6 cells/ml 의농도로 96-well plate 에분주하고, 20 시간동안전배양후추출물을농도별 (0.1, 1, 10, 50, 100 µg/ml) 로첨가하여 37 o C, 5% CO 2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서 22 시간배양하였다. 배양후, 5 mg/ml 농도의 MTT 시약을첨가하여 2 시간재배양하고이를 4 o C, 2,000 rpm 에서 10 분간원심분리 (UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea) 하여상층액을제거하였다. 그후, 각 well 에 DMSO 를첨가하고이를 microplate reader (Model 550, Bio-rad, Richmond, CA, USA) 를이용하여 540 nm 에서흡광도를측정하였으며, 세포생존율을다음식에의해계산하였다. Cell viability (%) = sample 흡광도 / control 흡광도 100 2.5. Nitric Oxide 생성량측정세포로부터생성된 NO 의양은 Griess 반응 [22] 을이용하여
150 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 148-154 (2015) 배양액중에존재하는 NO 2 - 의형태로측정하였다. RAW 264.7 세포를 2.5 10 5 cells/ml 의농도로 24-well plate 에접종하고, 5% CO 2 incubator 에서 20 시간전배양하였다. 세포에 1 µg/ml 의 LPS 와추출물을농도별 (0.1, 1, 10, 50, 100 µg/ml) 로처리하여 24 시간재배양하였다. 배양액의상층액을얻은후, 상층액과 griess 시약 (1% sulfanilamide+0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1) 을 1:1 의비율로실온에서 10 분간반응시키고, microplate reader 를이용하여 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 세포배양액내 NO 의농도는 sodium nitrite (NaNO 2 ) 의농도별표준곡선과비교하여산출하였다. 2.6. Pro-inflammatory cytokine 분비량측정 Pro-inflammatory cytokine 분비억제효능을알아보기위하여, RAW 264.7 세포를 2.5 10 5 cells/ml 로 24-well plate 에접종하고 18 시간동안전배양하였다. 세포에 1 µg/ml 의 LPS 와추출물을처리하여 12 시간재배양하였다. 배양액내의 IL-6, TNF-α 및 IL-1β cytokine 의분비량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, USA) 를이용하여측정하였다. 이를위해 ELISA microplate 에 capture antibody 로 anti-mouse IL-6, TNF-α 및 IL-1β 를분주하여 4 o C 에서하룻밤동안 coating 하였으며, 이를 0.05% Tween 20 을포함하는 PBST (phosphate buffered saline tween-20) 으로세척하고 10% 의 FBS 가포함된 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 blocking 하였다. PBST 로세척후, 각배양상층액을분주하고실온에서 2 시간반응시켰다. 다시 PBST 로세척한후 biotinylated anti-mouse IL-6, TNF-α detection antibody 와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate 를첨가하여실온에서 1 시간반응시켰다. IL-1β 의경우, biotinylated anti-mouse IL-1β detection antibody 를첨가하고 1 시간반응후, streptavidin-horseradish peroxidase conjugate 를첨가하여 30 분반응시켰다. 그후, 이를다시 PBST 로세척한다음, OPD (σ-phenylenediamine) 용액을첨가하여실온에서 30 분암반응시켰다. 2 N H 2 SO 4 로반응을종료시킨후 microplate reader 를이용하여 490 nm 에서흡광도를측정하였다. 2.7. 귀부종측정및조직관찰 In vivo 모델을이용하여시료의항염증효과를검증하기위하여귀부종억제율을측정하고조직관찰을진행하였다. 각군당 5 마리의 ICR 마우스에추출물을 10, 50 및 250 mg/kg body weight 으로, prednisolone 을 10, 50 mg/kg body weight 으로 200 µl 씩경구투여하고, 1 시간후, 오른쪽귀에 2.5% croton oil 을 20 µl/ear 농도로도포하였다. Croton oil 을처리하고 5 시간후에귀두께를측정하였으며, croton oil 을처리한후두께의증가를부종의형성으로간주하였다. 조직관찰은각군당 2 마리의 ICR 마우스오른쪽귀에, 시료처리구의경우추출물을 100 mg/ml 농도로, prednisolone 처리구의경우 prednisolone 을 0.08 mg/ear 가되도록 20 µl 씩도포하였고, 15 분뒤, 5% croton oil 을 20 µl 씩도포하였다. 6 시간뒤, diethylether 로마취사시키고, 귀조직을절제하여 10% formaldehyde 에 72 시간고정하였다. 고정후파라핀블록을만들어박편을제조하고 hematoxylin-eosin (H&E) 및 toluidine-blue (TB) 염색을하여조직을관찰하였다. 2.8. 단기독성평가본연구에서 OPHWE 의안전성평가의일환으로, 식품의약품안전처고시제 2014-136 호 (2014 년 7 월 30 일개정 ) 의약품등의독성시험기준 [23] 에의거하여 OPHWE 의단회투여에의한급성경구독성평가를진행하였다. 각군당 5 마리의 Balb/c 마우스를실험시작전 4~6 시간정도절식시킨후에추출물을 300, 2,000 및 5,000 mg/kg body weight 농도로경구투여하였으며, 이후 6 시간동안비정상적인행동등의경과를관찰하였고 2 주까지사망여부를지속적으로관찰하였다. 2.9. 통계처리모든실험결과에대한유의차검정은 SAS software (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) 에서평균값을분산분석한후, Duncan's multiple range test 법에따라 p<0.05 수준에서검정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 양파껍질열수추출물의세포생존율 MTT assay 를통하여 OPHWE 의처리에따른 RAW 264.7 cell 의세포생존율을측정하였다. 그결과 (Fig. 1), OPHWE 의처리농도의존적으로세포증식능이증가하여세포독성을가지지않는것을확인하였다. 특히 100 µg/ml 의농도로처리시, 무처리구에비해약 1.4 배의증식률을보임을확인하였다. Yoon 등 [24] 의황금추출물및 Lee 와 Lim [25] 의여정실의항염증연구에서, 추출물에의해세포생존율이증가하였으며, 이에세포독성을가지지않는다고보고하였다. 따라 Fig. 1. Effect of onion peel hot water extract on cell viability of RAW 264.7 cells. a-c Means with different superscripts are significantly different (p<0.05).
양파껍질열수추출물의 in vitro 및 in vivo 항염증효과 151 Fig. 2. Inhibitory effect of onion peel hot water extract on the production of nitric oxide in RAW 264.7 cells. a-d Means with different superscripts Fig. 3. Inhibitory effect of onion peel hot water extract on the production of IL-6 in RAW 264.7 cells. a-e Means with different superscripts 서 OPHWE 가 100 µg/ml 의농도까지세포독성을가지지않음을확인하여본연구에서사용된 OPHWE 의최고농도는 RAW 264.7 cell 에독성을나타내지않는 100 µg/ml 로사용하였다. 3.2. RAW 264.7 세포의 NO 분비량측정그람음성세균의내독소 (endotoxin) 로알려진 LPS 를대식세포에처리하면, NO, 염증성 cytokine 과같은물질들이생성되어염증반응을조절하는병리학적반응이일어난다. 염증반응에서 NO 는 inducible nitric oxide synthase (inos) 에의해서생성되는것으로, 정상상태에서는방어작용과신경전달및혈관조절의기능을하지만, 고농도의 NO 생성은 peroxynitrite, nitrogen dioxide 와같은유해물질을생성하여염증자극제로서활성화된대식세포에서 NF-κB 의 DNA-binding 활성이상향조절되거나 [26], DNA 를손상시키고세포내유해산화물질의축적, DNA 손상으로만성염증및자가면역질환을초래한다 [7]. 또한 mitochondria 로부터 cytochrome C, apoptosis inducing factor 를방출시켜세포자연사를일으키기도한다 [10]. 따라서본연구에서는 OPHWE 의항염증효과를검토하고자, RAW 264.7 cell 에염증유발물질인 LPS 와함께 OPHWE 를다양한농도로첨가하여 NO 의생성억제효과를관찰하였다. 그결과 Fig. 2 와같이, OPHWE 는 LPS 에의한 NO 생성을유의수준으로억제하였으나, 농도에따른유의적인차이는보이지않았다 (p<0.05). 또한, OPHWE 를 100 µg/ ml 의농도로처리시약 37% 의억제효과를보여 IC 50 값이약 135.17 µg/ml 으로나타났으며, 이는민들레열수추출물의 NO 에대한 IC 50 값이 157.6 µg/ml 인것에비해우수한효과를보였다 [27]. 3.3. RAW 264.7 세포의 pro-inflammatory cytokine 분비량측정 OPHWE 의항염증효능을분석하기위해 RAW 264.7 cell 에 Fig. 4. Inhibitory effect of onion peel hot water extract on the production of TNF-α in RAW 264.7 cells. a-g Means with different superscripts LPS 로염증을유도한후시료를농도별 (0.1~100 µg/ml) 로처리하여염증성 cytokine 의분비량을 ELISA kit 를이용하여측정하였다 (Fig. 3~5). 마우스대식세포주인 RAW 264.7 cell 에 LPS 를처리하면, 대식세포의표면의수용체인 toll-like receptor 4 (TLR4) 가이를인식하고활성화되어염증매개물질을발현시키는데, 이때발생되는 pro-inflammatory cytokine 에는 IL-6, TNF-α 및 IL-1β 가있다 [6,8,9,12]. 본연구결과, OPHWE 의첨가에따라각 cytokine 의분비량이농도의존적인감소를보였으며, IL-6, TNF-α 및 IL-1β 는 LPS 단독처리한대조군에서각각 378.20±7.80, 1792.15±4.83, 67.30±8.67 pg/ml 의분비를보였으나, OPHWE 를 100 µg/ml 의농도로처리하였을때 233.50±5.85, 1043.82±6.76, 44.01±0.00 pg/ml 의분비를보여, 대조군대비각각 38%, 41%, 34% 의억제효과를보였다 (p<0.05). 이러한 cytokine 들중먼저 IL-6 는 B 세
152 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 148-154 (2015) 며, Cho 등 [31] 은 quercetin 이 LPS 로유도한 RAW 264.7 cell 의염증반응에서 NF-κB 및 MAP kinase 를억제하여항염효과를가진다고보고하였다. 따라서본연구에서나타난 OPHWE 의항염증효과는 OPHWE 에다량함유된 quercetin 에의한효과로사료된다. Fig. 5. Inhibitory effect of onion peel hot water extract on the production of IL-1β in RAW 264.7 cells. a-d Means with different superscripts 포가형질세포로분화되는단계에작용하여급성염증반응과만성염증반응의연결고리로작용하는주요전염증성 cytokine 이다 [12]. 다음으로 TNF-α 는활성화된대식세포나비만세포에서분비되는것으로, 대식세포의 TNF-α 수용체에결합하여염증매개전사인자인 NF-κB 를활성화시켜 IL- 6, TNF-α, inos 및 COX-2 를발현시키는기작을통해염증반응을주도하며, 국소적발생시발열, 부종, 발적, 통증등의일반적염증반응의증상을유발하나, 전신적인증가시모세혈관의누출및혈전발생등을통해심각한조직손상을유발하며, 패혈증, 염증성장질환과같은자가면역질환, 헬리코박터위장염, 요로감염등을유발하는것으로알려져있다 [12,28]. 또한 IL-1β 는활성화된단핵구, 대식세포, 수지상세포및 B 세포에서발현되는것으로, 염증반응초기에나타나발열을비롯한급성기반응을나타내고, 말초의호중구증가에관여하는내인성발열인자이다 [29]. 본연구결과 OPHWE 가이러한세가지 cytokine 모두에대하여억제효과를가지고있는것을확인하였다. 파, 마늘, 양파와함께 Allium 속의일종인삼채 (Allium hookeri) 의항염증효과에대한보고 [10] 에따르면, 삼채뿌리추출물을 300 µg/ml 으로처리시, IL-6 에대하여약 30% 의감소효과를보였으며, 이를통해 OPHWE 가더욱우수한항염증효과를가짐을확인하였다. 자연으로부터얻어지는식물성 flavonoid 는다양한연구에서그생리활성효과가입증되어왔으며, Perez-Vizcaino 와 Duarte [29] 의연구에따르면 28 가지채소와 9 가지과일중양파에 quercetin 의양이가장많은것으로밝혀졌다. 양파껍질은양파에비하여약 10~100 배의 flavonoid 를함유하고있으며, 주요 flavonoid 는 quercetin 으로, 주로당과결합한 quercetin glucoside 형태로많이존재하는데 quercetin-4- glucoside 와 quercetin-2,4-diglucoside 가그 80% 를차지할정도로대표적인형태이다 [29]. Lee 등 [30] 은양파껍질열수추출물의혈중지질개선효과에대한연구에서양파껍질열수추출물에 quercetin 이다량함유되어있는것으로보고하였으 3.4. 귀부종억제효과및조직관찰위에서살펴본 OPHWE 의 in vitro type 실험에서의나타난항염증효과를 in vivo type 으로평가하기위해 croton oil 유도귀부종실험을진행하였다. 일반적으로급성염증질환시다양한면역인자들의활성화와함께혈관의확장, 혈관투과성인자및호중성백혈구의활성화, 비만세포의조직침윤등이나타나며, 그에따라혈류량의증가와함께통증, 발열, 부종등의증상이유발된다. 따라서특정약리물질의항염효과를알아보기위하여인위적으로급성염증을유도하여염증반응에대한시료의효과를측정하는연구가많이이루어지고있다 [32]. Croton oil 에의한귀부종실험은급성염증에대한시료의항염효과를살펴보기위한대표적인실험모델이며, 본연구에서 positive control 으로사용된 prednisolone 은 croton oil 유도염증반응을효과적으로억제하는것으로알려진 corticosteroid 합성항염증제이다 [33]. 본연구에서는 OPHWE 의항염효과를살펴보기위하여 OPHWE 를 10, 50, 250 mg/kg body weight 의농도로경구투여한후 croton oil 을적용하여급성부종을일으켜, 국소적염증세포의침윤과피부조직의부종에대한 OPHWE 의억제효과를 prednisolone 과비교관찰하고자하였다. 그결과 (Fig. 6), control 구와비교하여 OPHWE 의모든처리농도에서유의적으로귀두께가감소함을확인하였으며, 특히 250 mg/kg body weight 의농도에서 positive control 인 prednisolone 50 mg/kg body weight 와동일한수준의효과를가짐을확인하였다. 이는조직관찰결과에서도나타났는데, OPHWE 를 100 mg/ml 농도로도포한후 croton oil 을도포하였을때, prednisolone 0.8 mg/ear 처리구와유사한정도로, 귀조직의경피및진피두 Fig. 6. Inhibition of onion peel hot water extract against croton oilinduced mouse ear edema (n=5). a-c Means with different superscripts
양파껍질열수추출물의 in vitro 및 in vivo 항염증효과 153 Fig. 7. Photomicrograph of transverse sections of mice ears (n=2) sensitized with topical application of 5% croton oil (v/v) in acetone (a-c) or vehicle acetone (d, non-inflamed), stained with (A) hematoxylin-eosin and (B) toluidine-blue and examined under light microscopy (magnification: 200 ). Treatments: vehicle 2% Tween 80 (a), prednisolone 0.08 mg/ear (b) and onion peel hot water extract 100 mg/ml, 20 µl/ear (c). The numbers 1 and 2 in (A) indicate dermis and epidermis, respectively and the arrow in (B) means infiltration of mast cells. 께의발달을억제한것을확인하였다 (Fig. 7(A)). 또한조직내비만세포의침윤을확인한결과 (Fig. 7(B)), OPHWE 의처리가염증반응에서비만세포의염증부위로의침윤을억제한것을확인하였다. 3.5. 단기독성평가앞선일련의실험에서 OPHWE 가 in vitro 및 in vivo type 실험모두에대하여항염증효과를가지는것을입증하였다. 이에대해그독성과부작용을살펴보고향후새로운기능성식품소재의개발을위한가능성을확보하기위해 Balb/c mice 를이용하여단회경구투여독성시험을실시하였다. OPHWE 를 300, 2,000 및 5,000 mg/kg 농도로 200 µl 씩경구투여한후 2 주간행동변화및치사율을관찰하였다 (Table 1). 경구투여후 4 시간동안이상행동은관찰되지않았으며, 2 주간이틀간격으로치사율을살펴본결과모든시험군에서사망동물이발견되지않았다. 또한대조군에비해특이적인소견이관찰되지않았다. 따라서 OPHWE 의고농도투여가마우스치사율에영향을주지않는것을확인하였으며, 이와유사한연구결과로 Kim 등 [34] 은감나무껍질의단회경구투여독성연구에서, 투여후 2 주간의관찰기간중이상행동및사망동물이관찰되지않아독성이없는것으로보고하였다. OECD test guideline 420 [35] 에따르면, 마우스에 2,000 mg/ kg 의시료를투여시사망하는개체가없는경우무독성으로인정하므로본연구에서는 OPHWE 의안전성을확인할수 있었다. 이에따라안전한기능성식재료및새로운건강기능식품의원료로써의 OPHWE 의이용이가능할것으로사료된다. 4. CONCLUSION 본연구에서는양파껍질의항염증효과를알아보기위하여 in vitro 및 in vivo type 의실험을진행하였다. 먼저양파껍질열수추출물 (OPHWE) 이세포독성을가지는지에대해알아보기위해 MTT assay 를진행한결과, 모든첨가농도에서대식세포증식능이 control 에비해유의적으로증가하여세포독성을가지지않는것을확인하였다. 세포독성을가지지않는농도 (0.1, 1, 10, 50, 100 µg/ml) 에서의염증억제효과를살펴본결과, OPHWE 를 100 µg/ml 로처리시 NO, IL-6, TNF-α 및 IL-1β 에대하여각각 37%, 38%, 41%, 34% 의억제효과를보임을확인하였다. 또한 croton oil 유도마우스귀부종실험에서경피및진피두께의발달과염증부위로의 mast cell 침윤을현저히억제함을확인하였으며, 급성경구독성평가에서경구독성을유발하지않는것을확인하였다. 본결과에서 OPHWE 의적용이 in vitro 뿐만아니라 in vivo 마우스염증모델에서도항염증효과를가짐을확인하여, OPHWE 가염증치료제의소재로써의활용가치가충분할것으로사료된다. Table 1. Mortality of mice treated orally with onion peel hot water extract Days after treatment 0 2 4 6 8 10 12 14 Control 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 300 mg/kg body weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2,000 mg/kg body weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5,000 mg/kg body weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
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