최 / 근 / 연 / 구 / 소 / 식 연골조직재생을위한중간엽줄기세포의유전자조절 김병주 차의과학대학교의생명과학과줄기세포공학연구실 E-mail: kbz9861@cha.ac.kr 이수홍 차의과학대학교의생명과학과줄기세포공학연구실 E-mail: soohong@cha.ac.kr 서론최근인간의평균수명증가로인한고령화사회의진행으로퇴행성질환이급격하게증가함에따라 [1], 줄기세포를이용한세포치료연구가활발히진행되고있다. 특히, 줄기세포와조직공학이결합한세포공학융합기술은조직및장기의재생을위한재생의학분야에서굉장한관심을받고있다. 줄기세포공학의주요목표는조직재건을통해손상된조직과장기를대체하는것에있다 [2,3]. 이러한목적달성을위하여양질의줄기세포생산뿐만아니라생체재료개발등의다양한분야들을융합하여최적의산물을생산하는것이조직재생의성공여부를결정하는중요한열쇠가될수있을것이다. 최근에인간제대혈유래중간엽줄기세포 (UCB-MSC) 를이용하여세계최초로관절염무릎연골손상치료제인카티스템 R ( 메디포스트 ) 이줄기세포치료제로개발되었다. 하지만, 카티스템 R 은단순히중간엽줄기세포를배양한제품으로공여자또는미세환경의변화에따라세포의분화능 이다르게나타나고있기때문에이상적인줄기세포치료제를개발하기위해서는아직도많은연구가필요하다. 따라서줄기세포를포함하는세포치료제분야에서그치료효과를증진시키기위해성장인자, 생체재료및조직공학분야들과의융합연구가활발히진행되고있다 [4]. 하지만, 불행히도수많은연구결과들은과거에이어아직까지 in vitro내성공적인줄기세포배양을위한최적의조건을확립하는데한계점이있고, in vivo 환경또한표준화된방법을제시하지못하고있다. 줄기세포치료제중다분화능을갖는중간엽줄기세포는만능줄기세포에비해안정성이높고분화능이상대적으로제한적이어서자가이식또는동종이식치료제로주로사용되어오고있다 [5, 6]. 하지만여러공여자들로부터추출된중간엽줄기세포는여전히각기다른분화메커니즘을가지고있어중간엽줄기세포의분화표준화기술은꼭극복되고선행되어야할분야이다. 따라서, 본리뷰에서는중간엽줄기세포의전사인자조절및표면수용체의유전자조절을통한중간엽줄기세포의효과적인연골분화및표준화방안에관한기술을소개하고자한다. 01 분자세포생물학뉴스레터
molecular and cellular Biology Newsletter 전사인자들의발현중간엽줄기세포의연골분화유도을위한다양한기술들은생체내손상된연골의조직재생및기능회복을목적으로연구되고있다. 여러연골분화관련인자들중 Sox9은연골형성및발달에핵심적역할을하는전사인자로 Sox9 이억제되었을경우에는연골의주요성분인제2형질콜라겐 (col2) 과 Aggrecan의발현이감소된다 [7]. 이러한결과는 Sox9의단백질번역후변형 (post-translational modification) 으로인한것으로이미많은연구결과들에서검증되어왔다. Sox9의아미노산잔기중 181번 serine 의인산화로핵내축적되어제2형질콜라겐의전사활성을증가한다는기전이보고된바있다 [8]. 연골화에있어 Sox5와 Sox6의중요성도입증되었는데 Sox5와 Sox6가 knock-out된형질전환마우스는심각한연골형성이상증 (chondrodysplasia) 을보이고, 이로인해연골이미형성되거나태어나자마자죽는현상을보였다 [9]. 이러한이유는 Sox5와 Sox6가 Sox9의기능보조인자로서중간엽줄기세포의연골분화에대한잠재적요소이기때문일것이다. 한편, β-catenin은 Wingless (Wnt) 신호전달경로에관여하는핵심단백질로중간엽줄기세포의연골분화를저해시킬수있다. Wnt 신호증가는 Sox9과 Col2의발현이억제되고 Runx2와 Col10의발현을증가시킨다 [10]. 흥미롭게도 Akiyama의연구결과에의하면 Sox9은 β-catenin 의상호관련단백질로작용하여중간엽줄기세포의연골분화과정동안 negative 조절인자인 β-catenin의발현을억제하고프로테아좀의퇴화를유도하는것을보여주었다 [11]. 즉, 연골화는 Sox9과 Wnt/β-catenin 신호단백질사이의중요한상호작용에의해조절되는것이다. 최근, 관절연골세포에서 α-catenin은 β-catenin의전사활성을억제하는것으로밝혀졌다 [12]. 핵에서주로작용하는인자인 α -catenin은전사억제인자인 Gli3R가 β-catenin과결합하도록유도하여결국 β-catenin의전사적활성을억제한다. 이러한 α-catenin과 β-catenin의분자적결합에의한상호작용이연골분화를조절할수있다. 또한, Vinculin은세포골격과세포외기질 (ECM) 을이어 주는단백질로연골분화의또다른조절인자이다. 흥미로운점은이러한 vinculin의기능이억제되면연골세포에서 Sox9이나 col2의발현이감소되고 p38 MAPK 억제가일어나연골형성능이감소된다는점이다 [13]. 이러한결과들은연골분화와세포외기질 (ECM) 간에중요한상호관계가존재한다는것을보여주며중간엽줄기세포의연골세포분화에또다른중요한통찰방안을제시하고있다. 수용체인자들의발현중간엽줄기세포의분화에관한많은최신연구결과들이발표되고있지만, 그분자적기전을바탕으로한명확한정의를내리기엔아직부족한부분이남아있다. 대부분의신호전달경로는표면수용체의리간드인식을통해개시되기때문에, 이들수용체에결합하는성장인자는분화에중요한역할을하는것으로잘알려져있다. TGF-β는잘알려진중간엽줄기세포의연골분화요소로 type I과 type II 라는두가지형태의특정한 serine/ threonine kinase 수용체를통해신호전달이활성화가된다. TGF-β superfamily는 TGF-β family, BMPs (bone morphogenetic proteins), GDFs (growth and differentiation factors), activin, Nodal 등여러성장인자들을포함하고있다. TGF-β 신호전달과정을살펴보면, TGF-β는우선 TGF-βRII에결합한후 TGF-βRI (ALK5 혹은 ALK1) 와이합체를만들고, 이후 Smad signal을활성화하게된다. 이러한과정에서 Smad 2/3 단백질은 TGF-βRI (ALK5) 에의해인산화되어연골화를유도하며, 반면 Smad1/5/8 단백질은 TGF-βRI (ALK1) 에의해인산화되어골화를유도하게된다. 이때, Smad2/3 과 Smad1/5/8은각각 Smad4와결합한 heteromers복합체형태로핵으로이동하여서로다른전사인자와표적유전자를활성화한다 [14, 15]. 중간엽줄기세포분화중이러한 TGF-β 수용체의중요성은형질전환마우스에서연골형성연구를통해입증되었다 [16]. TGF-βRII가제거된형질전환마우스는 TGF-β signal을인지하지못함으로써연골손상과연골세포비대화가연골발달의초기단계에서관찰되었고, 관절의퇴행으로골관절염이유도되었다 [17]. 이러 웹진 2015 ㅣ 6 02
최 / 근 / 연 / 구 / 소 / 식 한연구결과들은 TGF-β 수용체조절이중간엽줄기세포의연골분화 signaling cascades 조절에있어중요한역할을한다는것을보여준다. 혈소판유래성장인자 (PDGF) 는중간엽줄기세포의이동 (migration) 에관련된또다른성장인자이다. 동국대임군일교수팀은 PDGF 수용체 (PDGFR) 가높게발현되는중간엽줄기세포는골연골손상부위로보다빠르게이동하게된다고발표하여, PDGF 수용체 (PDGFR) 의중요성을보여주었다 [18]. 이러한연구결과들을바탕으로중간엽줄기세포의표면수용체조절을통한연골재생치료기전에대해좀더세밀한분석과심도있는연구를통해최종적으로는임상적적용이가능하도록노력해야할것이다. 여러인자의동시발현시스템 (2A) 1. 2A vector 2A bicistronic vector는하나의프로모터에두가지의다른유전자의동등한발현을유도하는시스템으로써하나의 mrna transcript로부터두가지 open reading frames 의 translation이가능하게된다. 이러한 2A bicistronic vector 시스템은단일유전자발현시스템에비해더효율적인발현을유도할수있지만어떤경우에는불안정한유전자전달효율증가로인해발현기작이생략되거나, 알수없는이유로인해비정상적인단백질이생성될가능성도있 1. 중간엽줄기세포내유전자전달을위한 2A vector 시스템의장점 (A) 전형적인유전자전달방법. (B) 2A bicistronic vector system 을이용한다양한유전자의동시발현 다. 그러므로, multiple cistronic vectors의정상적인단백질발현검증은신중히결정해야만한다. 바이러스를이용할경우에는 host genome과의결합으로내부독성또는염증반응을유도하게될수도있기때문에비-바이러스성벡터를이용할경우앞서제시한독성이나비용문제를해결할수있는장점을가지고있다. 특히, Microporation을이용할경우 60% 의유전자전달효율증진과 10% 의세포독성이감소한다는보고가있고 [19], 이러한방법은줄기세포의다른분화유도에도유용할것으로예상된다. 2. 2A vector 아직까지중간엽줄기세포의분화관련성장인자의기전경로에대해서는명확히밝혀진바는없다. 대부분의연구자들은손상된조직을복구하기위해, TGF-βs 또는관련성장인자의종류와농도조절만을시도해왔다. 최근연구에서는성장인자를중간엽줄기세포가얼마나수용할준비가되어있는지를확인하고자하는연구가진행되고있다. 사실, 처리된성장인자에의해중간엽줄기세포의표면수용체가신호전달을유발할만큼충분히발현되고있는지에대해서도보고된바가없다. 이미알려진바와같이중간엽줄기세포의이식은동물모델에서연골의재생을향상시킬수있는잠재성을가지고있지만, 중간엽줄기세포를이용한연골재생은여전히치료적적용에대하여한계점을가지고있다. 예를들어, 지방유래중간엽줄기세포는상대적으로대량획득이용이하여연골재생의세포치료제로서임상에적용하려는시도가진행되고있다. 그러나지방조직에서분리한중간엽줄기세포는각기다른 batch에따라즉공여자, 생화학적이질성및세포분리시손실에의한분화능의변화로각기다른수준의연골분화가변성을보이며결국에는여러가지모순된결과를산출하기도한다 [20, 21]. 이는중간엽줄기세포의세포치료제로서가이드라인부재와수용체조절을통한표준화된수득절차부재에의한불가피한결과로판단된다. 실제로골관절염환자의연골세포에서 TGF-β signal 전달에관련된 TGF-βRII와 TGF-βRI (ALK5) 의발현은감 03 분자세포생물학뉴스레터
molecular and cellular Biology Newsletter 3. 중간엽줄기세포의표준화모델 2. TGF-β 수용체의 co-delivery 에의한연골분화능증진 (Reprinted from Kang et al., 2012 Journal of Controlled Release 160, 577-582) 소된반면 TGF-βRI (ALK1) 발현은증가되어있다. 따라서, TGF-β 수용체가중간엽줄기세포의 TGF-β signal의연골분화능을결정한다는것을입증하였다 [22]. 즉, 중간엽줄기세포의연골분화능은 TGF-β 단백질에직접적으로결합하는 TGF-βRII 수용체와 TGF-βRI (ALK5) 또는 TGF-βRI (ALK1) 중하나의수용체가결합하는형태에의해결정될수있다. 각기다른공여자들로부터분리된지방유래중간엽줄기세포는각기 TGF-βRII, TGF-βRI (ALK5), TGF-βRI (ALK1) 모두에서상이한발현패턴이관찰되었다. 예상과같이, 지방유래중간엽줄기세포의연골분화에서 TGF-β R 발현수준은연골분화시 Col2 및 Aggrecan 발현과상관관계가있음이증명되었다. 즉, TGF-βRII와 TGF-βRI (ALK5) 의발현은연골분화와연골조직재생에비례하였으나, TGF-βRI (ALK1) 의발현은반비례하였다. TGF-β 수용체발현정도는향후중간엽줄기세포치료제의연골분화및재생능을미리예측하는기준이될수있을것이다. 한편, 낮은 TGF-β 수용체발현을가진공여자의지방유래중간엽줄기세포에 2A vector 시스템을이용한 TGF-βRII와 TGF-βRI (ALK5) 의과발현유도는연골분화능과함께연골조직재생능을증가시키는것으로관찰되었다. 이는각기다른 TGF-β 수용체발현을갖는중간엽줄기세포의잠재 적인분화능을조절하여표준화하는중요한기술이될것이다. 현재, TGF-β 수용체의발현조절에의한중간엽줄기세포표준화프로토콜을마련하고있으며향후임상적적용에유용하게활용될수있을것으로사료된다. 결론및앞으로의전망여러공여자로부터분리된중간엽줄기세포는세포의표현형, 성장, 생존, 분화능등이일정하지않는문제가있어세포치료제로서사용되기에는많은어려움이있다. 본원고에서는중간엽줄기세포의연골분화를예측하고표준화하기위한유전자조절방법들에대해서소개하였다. 특히, 연골분화관련전사인자와표면수용체의두가지관점에서발현조절을서술하였으며또한, 그유전자들이동등한정량적발현을유도할수있는동시발현시스템 (2A) 에대해서도소개하였다. 이러한방법은줄기세포의다른분화영역에도충분히적용가능할것이다. 실제로중간엽줄기세포에서 TGF-β 수용체발현이연골세포분화및연골조직재생에밀접한상관관계를가지고있어, TGF-β 수용체발현정도는중간엽줄기세포의연골재생을미리예측하는수단으로, TGF-β 수용체발현조절은연골재생을표준화하는강력한도구로활용될것이다. 특히, 특정유전염기서열을인지하여그서열에서선택적으로 DNA 이중쇄절단을유도하는유전자가위기술, 생체재료를활용한조직공학기술등 웹진 2015 ㅣ 6 04
최 / 근 / 연 / 구 / 소 / 식 과병행한다면중간엽줄기세포치료제의임상적용을보다빠르게현실화시킬수있을것으로기대해본다. [ ] 1. Choi EH et al. Effect of nucleus pulposus cells having different phenotypes on chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells in a coculture system using porous membranes. Tissue Eng Part A 2011; 17: 2445-51. 2. Rustad KC, et al.strategies for organ level tissue engineering. Organogenesis 2010; 6: 151-7. 3. Lee K, Silva EA, Mooney DJ. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments. J R Soc Interface 2011; 8: 153-70. 4. McGonagle Detal.The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. J Anat 2010; 216: 279-91. 5. Jurgens WJ et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell Tissue Res 2008; 332: 415-26. 6. Henon PR. Human embryonic or adult stem cells: an overview on ethics and perspectives for tissue engineering. AdvExp Med Biol 2003; 534: 27-45. 7. Cha BH et al. Cartilage tissue formation from dedifferentiated chondrocytes by codelivery of BMP-2 and SOX-9 genes encoding bicistronic vector. Cell Transplant 2012. 8. Huang W, et al. Phosphorylation of SOX9 by cyclic AMP-dependent protein kinase A enhances SOX9's ability to transactivate a Col2a1 chondrocytespecific enhancer. Mol Cell Biol 2000; 20: 4149-58. 9. Smits Pet al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Dev Cell 2001; 1: 277-90. 10. Dong YF et al.wnt induction of chondrocyte hypertrophy through the Runx2 transcription factor. J Cell Physiol 2006; 208: 77-86. 11. Akiyama Het al. Interactions between Sox9 and beta-catenin control chondrocyte differentiation. Genes Dev 2004; 18: 1072-87. 12. Rhee Jet al. alpha-catenin inhibits betacatenin-t-cell factor/lymphoid enhancing factor transcriptional activity and collagen type II expression in articular chondrocytes through formation of Gli3R.alpha-catenin.beta-catenin ternary complex. J BiolChem 2012; 287: 11751-60. 13. Koshimizu T et al. Vinculin functions as regulator of chondrogenesis. J BiolChem 2012; 287: 15760-75. 14. Patil AS et al. An update on transforming growth factor-beta (TGF-beta): sources, types, functions and clinical applicability for cartilage/bone healing. J Cell Physiol 2011; 226: 3094-103. 15. Janssens K et al. Transforming growth factorbeta1 to the bone. Endocr Rev 2005; 26: 743-74. 16. Serra Ret al. Expression of a truncated, kinasedefective TGF-beta type II receptor in mouse skeletal tissue promotes terminal chondrocyte differentiation and osteoarthritis. J Cell Biol 1997; 139: 541-52. 17. Wang M et al. Recent progress in understanding molecular mechanisms of cartilage degeneration during osteoarthritis. Ann N Y AcadSci 2011; 1240: 61-9. 18. Lee JMet al. In vivo tracking of mesechymal stem cells using fluorescent nanoparticles in an osteochondral repair model. MolTher 2012; 20: 1434-42. 19. Lee SJet al. Enhancement of bone regeneration 05 분자세포생물학뉴스레터
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