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보안과제( ), 일반과제( o ) 17383-12172화의안451 의약품등안전관리 자외선차단성분의리스크프로파일링연구 Study of risk profiling of UV-filtering agents 단국대학교산학협력단 식품의약품안전청

별지제 11 호서식 용역연구개발과제최종보고서 과제번호 12172 화의안 451 단위과제명 과제명 국문 영문 4) 화장품 의약외품안전관리연구 자외선차단성분의리스크프로파일링연구 Study of risk profiling of UV-filtering agents 주관연구기관주관연구책임자 기관명 소재지 기관장 단국대학교산학협력단천안시동남구단대로 119 방성일 성명 소속및부서 전공 김규봉 단국대학교약학대학 독성학 총연구기간 2012 년 2 월 15 일 ~ 2012 년 11 월 30 일 ( 9.5 개월 ) 총연구개발비 80,000 천원 연구년차연구기간연구개발비 1 차년도 2012 년 2 월 15 일 ~ 2012 년 11 월 30 일 80,000 천원 2 차년도년월일 ~ 년월일천원 관계규정과모든지시사항을준수하면서이용역연구개발연구사업을성실히 수행하고자다음과같이용역연구개발과제최종보고서를제출합니다. 2012 년 11 월 30 일 주관연구책임자 : 김규봉 ( 서명또는인 ) 주관연구기관장 : 단국대학교산학협력단장 ( 직인 ) 식품의약품안전청장또는식품의약품안전평가원장귀하

편집순서 2 : 제출문 제출문 식품의약품안전청장 / 식품의약품안전평가원장귀하 이보고서를 자외선차단성분의리스크프로파일링연구 ( 단국대학교 산학협력단 / 김규봉 ) 과제의최종보고서로제출합니다. 2012. 11. 1 주관연구기관명 : 단국대학교산학협력단 주관연구책임자 : 김규봉 제 1 세부과제명 : 자외선차단성분, 벤조페논 -3 에대한위해평가연구 ( 제 1 세부연구기관 / 세부과제책임자 ) : 단국대학교약학대학 / 김규봉 제 2 세부과제명 : 호모살레이트에대한위해평가연구 ( 제 2 세부연구기관 / 세부과제책임자 ) : 성균관대학교약학대학 / 유선동 - 1 -

간지 편집순서 3 목 차 Ⅰ. 총괄연구개발과제요약문 1. 국문요약문 13 2. 영문요약문 16 Ⅱ. 총괄연구개발과제연구결과제1장총괄연구개발과제의연구목적및필요성 18 제2장총괄연구개발과제의연구내용및방법 29 제3장총괄연구개발과제의최종결과및고찰 49 제4장총괄연구개발과제의연구성과 85 제5장총괄주요연구변경사항 87 제6장총괄참고문헌 88 제7장총괄첨부서류 89 Ⅲ. 제1세부연구개발과제연구결과제1장세부연구개발과제의요약문 91 제2장세부연구개발과제의연구목적 93 제3장세부연구개발과제의연구내용및방법 99 제4장세부연구개발과제의최종결과및고찰 109 제5장세부참고문헌 159-2 -

Ⅲ. 제2세부연구개발과제연구결과제1장세부연구개발과제의요약문 169 제2장세부연구개발과제의연구목적 171 제3장세부연구개발과제의연구내용및방법 177 제4장세부연구개발과제의최종결과및고찰 187 제5장세부참고문헌 244 Ⅳ. 별첨별첨 1 245 별첨 2 283 별첨 3 324 별첨 4 325 별첨 5 326-3 -

Table 목차 Table 1. 자외선차단제의국내고시성분및허용함량 (KFDA, 2009) Table 2. 판매량기준상위 20개국내시판자외선차단제 Table 3. In vitro estrogenic and androgenic activities of various UV filtering agents Table 4. HPLC analysis of benzophenone-3 Table 5. LC-MS/MS analysis of benzophenone-3 in rat plasma Table 6. Composition of different formulations containing benzophenone-3 Table 7. Benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Table 8. Target plasma concentrations, benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of benzophenone-3 Table 9. HPLC analysis of homosalate Table 10. LC-MS/MS analysis of homosalate in rat plasma Table 11. Composition of different formulations containing homosalate Table 12. Homosalate concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Table 13. Target plasma concentrations, homosalate concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of homosalate Table 14. Accuracy and precision for the HPLC assay of benzophenone-3 (n=3 each) Table 15. Intra-day and inter-day accuracy and precision of benzophenone-3 assay Table 16. Amount of benzophenone-3 permeated through excised rat skins from each formulation containing 5% benzophenone-3 (μg/cm 2 ) Table 17. Permeation parameters of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation containing 5% benzophenone (w/w) (mean ± S.D.) Table 18. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers and receptor phase for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations Table 19. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4) - 4 -

Table 20. Mean concentrations and plasma-to-tissue partition coefficients (K p ) of benzophenone-3 in tissues determined under steady state conditions (n=4) Table 21. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) Table 22. 벤조페논-3의독성학적자료 Table 23. Accuracy and precision for the HPLC assay of homosalate (n=3 each) Table 24. Intra-day and inter-day accuracy and precision of homosalate assay Table 25. Pharmacokinetic parameters of homosalate after i.v. injection of homosalate at doses 1, 3, and 9 mg/kg in rats Table 26. Mean concentrations of homosalate in tissues determined under steady state conditions Table 27. Mean plasma-to-tissue partition coefficients (K p ) of homosalate calculated under steady state conditions Table 1-1. 자외선차단제의국내고시성분및허용함량 (KFDA, 2009) Table 1-2. In vitro estrogenic and androgenic activities of various UV filtering agents Table 1-3. HPLC analysis of benzophenone-3 Table 1-4. LC-MS/MS analysis of benzophenone-3 in rat plasma Table 1-5. Composition of different formulations containing benzophenone-3 Table 1-6. Benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Table 1-6. Target plasma concentrations, benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of benzophenone-3 Table 1-8. Accuracy and precision for the HPLC assay of benzophenone-3 (n=3 each) Table 1-9. Intra-day and inter-day accuracy and precision of benzophenone-3 assay Table 1-10. Amount of benzophenone-3 permeated through excised rat skins from each formulation containing 5% benzophenone-3 (μg/cm 2 ) Table 1-11. Permeation parameters of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation containing 5% benzophenone (w/w) (mean ± S.D.) Table 1-12. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers and receptor phase for - 5 -

vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations Table 1-13. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4) Table 1-14. Mean concentrations and plasma-to-tissue partition coefficients (K p ) of benzophenone-3 in tissues determined under steady state conditions (n=4) Table 1-15. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) Table 1-16. 벤조페논-3의독성학적자료 Table 2-1. 자외선차단제의국내고시성분및허용함량 (KFDA, 2009) Table 2-2. In vitro estrogenic and androgenic activities of various UV filtering agents Table 2-3. HPLC analysis of homosalate Table 2-4. LC-MS/MS analysis of homosalate in rat plasma Table 2-5. Composition of different formulations containing homosalate Table 2-6. Homosalate concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Table 2-7. Target plasma concentrations, homosalate concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of homosalate Table 2-8. Accuracy and precision for the HPLC assay of homosalate (n=3 each) Table 2-9. Intra-day and inter-day accuracy and precision of homosalate assay Table 2-10. Pharmacokinetic parameters of homosalate after i.v. injection of homosalate at doses 1, 3, and 9 mg/kg in rats Table 2-11. Mean concentrations of homosalate in tissues determined under steady state conditions Table 2-12. Mean plasma-to-tissue partition coefficients (K p ) of homosalate calculated under steady state conditions - 6 -

Figure 목차 Figure 1. 화학적자외선차단성분에의한 ps2 protein 증가율 Figure 2. Homosalate 의 UV absorbance spectrum Figure 3. Representative chromatogram of benzophenone-3 in receptor phase. Figure 4. Representative calibration curve for the determination benzophenone-3. Figure 5. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate. Figure 6. MRM chromatograms of (A) benzophenone-3 (BP3) and (B) nonivamide (NVM) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with BP3 (1 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (center), and plasma spiked with BP3 (1000 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (right). Figure 7. Representative calibration curve for the determination of benzophenone-3 in rat plasma (y= 0.00353x + 0.00461, r 2 =0.9999) Figure 8. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing benzophenone-3 (5 % w/w). Figure 9. Stability of benzophenone-3 in the receptor phase kept at 37 (n=4) Figure 10. Permeation profiles of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation ( ; Gel, ; Vaseline, ; Lotion, ; Oily solution) containing 5% benzophenone-3 (w/w) (mean ± S.E., n=6 each). Figure 11. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way ANOVA, post hoc; Tukey s test, p<0.05). Figure 12. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4). Figure 13. Plasma benzophenone-3 concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.99 mg/kg and 0.46 mg/kg/hr, respectively. Figure 14. Average concentrations of benzophenone-3 in tissues at steady state. Figure 15. Average plasma-to-tissue partition coefficients of benzophenone-3 in tissues calculated at steady state. - 7 -

Figure 16. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) Figure 17. Representative chromatogram of homosalate in receptor phase. Figure 18. Representative calibration curve for the determination of homosalate. Figure 19. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate. Figure 20. MRM chromatograms of (A) homosalate (HMS) and (B) octyl salicylate (OS) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with HMS (0.5 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (center), and plasma spiked with HMS (1000 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (right). Figure 21. Representative calibration curve for the determination of homosalate in rat plasma (y= 0.0219x + 0.00819, r 2 = 0.9994). Figure 22. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing homosalate (10 % w/w). Figure 23. Stability of homosalate in the receptor phase kept at 37 (n=4) Figure 24. Penetration of homosalate into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way ANOVA, post hoc; Tukey s test, p<0.05). Figure 25. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after i.v. injection at doses of 1,3, and 9 mg/kg (n=6, each). Figure 26. Plasma homosalate concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.65 mg/kg and 0.34 mg/kg/hr, respectively, for the low target plasma concentration (100 ng/ml, lower profile) and 1.3 mg/kg and 0.67 mg/kg/hr, respectively, for the high target plasma concentration (200 ng/ml, upper profile). Figure 27. Average concentrations of homosalate in tissues at steady state. *t-test (p<0.05, 100 vs 200 ng/ml target concentrations) Figure 28. Average plasma-to-tissue partition coefficients of homosalate in tissues calculated at steady state Figure 29. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after percutaneous administration of gel containing homosalate (dose 80 mg/kg, n=5). - 8 -

Figure 1-1. Effect of UV screens 4-MBC (10 μm), HMS (50 μm), BP-3 (10 μm), OMC (10 μm), OD-PABA (10 μm), B-MDM (10 μm), and E 2 (10 pm) on ps2 protein secretion by MCF-7 cells. Bars indicate mean ps2 protein concentration in culture medium (pg/ml) ± SEM; numbers inside the bars indicate the number of independent experiments). * p < 0.05, ** p < 0.001 (ANOVA followed by Bonferroni pairwise comparisons) as compared to controls that received chemical-free medium. Figure 1-2. Representative chromatogram of benzophenone-3 in receptor phase. Figure 1-3. Representative calibration curve for the determination benzophenone-3. Figure 1-4. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate. Figure 1-5. MRM chromatograms of (A) benzophenone-3 (BP3) and (B) nonivamide (NVM) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with BP3 (1 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (center), and plasma spiked with BP3 (1000 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (right). Figure 1-6. Representative calibration curve for the determination of benzophenone-3 in rat plasma (y= 0.00353x + 0.00461, r 2 =0.9999) Figure 1-7. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing benzophenone-3 (5 % w/w). Figure 1-8. Stability of benzophenone-3 in the receptor phase kept at 37 (n=4) Figure 1-9. Permeation profiles of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation ( ; Gel, ; Vaseline, ; Lotion, ; Oily solution) containing 5% benzophenone-3 (w/w) (mean ± S.E., n=6 each). Figure 1-10. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way ANOVA, post hoc; Tukey s test, p< 0.05). Figure 1-11. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4). Figure 1-12. Plasma benzophenone-3 concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.99 mg/kg and 0.46 mg/kg/hr, respectively. - 9 -

Figure 1-13. Average concentrations of benzophenone-3 in tissues at steady state. Figure 1-14. Average plasma-to-tissue partition coefficients of benzophenone-3 in tissues calculated at steady state. Figure 1-15. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) Figure 2-1. Effect of UV screens 4-MBC (10 μm), HMS (50 μm), BP-3 (10 μm), OMC (10 μm), OD-PABA (10 μm), B-MDM (10 μm), and E 2 (10 pm) on ps2 protein secretion by MCF-7 cells. Bars indicate mean ps2 protein concentration in culture medium (pg/ml) ± SEM; numbers inside the bars indicate the number of independent experiments). * p < 0.05, ** p < 0.001 (ANOVA followed by Bonferroni pairwise comparisons) as compared to controls that received chemical-free medium. Figure 2-2. Representative chromatogram of homosalate in receptor phase. Figure 2-3. Representative calibration curve for the determination of homosalate. Figure 2-4. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate Figure 2-5. MRM chromatograms of (A) homosalate (HMS) and (B) octyl salicylate (OS) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with HMS (0.5 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (center), and plasma spiked with HMS (1000 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (right). Figure 2-6. Representative calibration curve for the determination of homosalate in rat plasma (y= 0.0219x + 0.00819, r 2 = 0.9994). Figure 2-7. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing homosalate (10 % w/w). Figure 2-8. Stability of homosalate in the receptor phase kept at 37 (n=4) Figure 2-9. Penetration of homosalate into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way ANOVA, post hoc; Tukey s test, p<0.05). Figure 2-10. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after i.v. injection at - 10 -

doses of 1,3, and 9 mg/kg (n=6, each). Figure 2-11. Plasma homosalate concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.65 mg/kg and 0.34 mg/kg/hr, respectively, for the low target plasma concentration (100 ng/ml, lower profile) and 1.3 mg/kg and 0.67 mg/kg/hr, respectively, for the high target plasma concentration (200 ng/ml, upper profile). Figure 2-12. Average concentrations of homosalate in tissues at steady state. *t-test (p< 0.05, 100 vs 200 ng/ml target concentrations) Figure 2-13. Average plasma-to-tissue partition coefficients of homosalate in tissues calculated at steady state Figure 2-14. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after percutaneous administration of gel containing homosalate (dose 80 mg/kg, n=5). - 11 -

간지 편집순서 4 : 총괄연구과제의연구결과 총괄연구개발과제연구결과 색지로작성하여쉽게구분될수있도록함 - 12 -

편집순서 5 : 요약문 ( 국문 ) Ⅰ. 총괄연구개발과제요약문 국문요약문 과제명 자외선차단성분의리스크프로파일링연구 주관연구기관 단국대학교산학협력단 주관연구책임자 김규봉 연구기간 2012-02-15 ~ 2012-11-30 연구비 ( 원 ) 80,000,000 원 성명 소속 김규봉 단국대학교약학대학 유선동 성균관대학교약학대학 김지원 인제대학교 류성하 단국대학교 저자 조해란 인제대학교 김태환 성균관대학교약학대학 김민기 성균관대학교약학대학 추현욱 성균관대학교약학대학 신승우 성균관대학교약학대학 신범수 대구가톨릭대학교약학대학 자외선차단성분벤조페논-3와호모살레이트의노출도평가를통한위해도평가를실시하 여벤조페논-3와호모살레이트의리스크프로파일링을작성하고자하였다. 벤조페논-3와 호모살레이트의 in vivo에서노출도를측정하기위하여, 먼저 in vitro실험을통하여개략 적인피부투과도와가장피부투과도가좋은기제를선택하였다. 또한, 생체내벤조페논 -3와호모살레이트의성분분석을위하여 LC/MS/MS를이용한생체분석법도확립하였다. 연구결과, 벤조페논-3는 Franz diffusion cell method 를적용시 gel제가가장큰피부투 과속도를나타내었으며, 정맥투여시 multi-compartmental 특성을나타내었다. 벤조페논-3 를정맥내주입후혈중농도를 200 ng/ml로유지한후, 각조직장기에서의분포를분 석한결과, 신장, 대장, 폐에많이분포하였고, 표적장기로여겨지는고환에서가장낮은 분포를보였다. 벤조페논-3의동물에서피부를통한전신노출도평가결과, 상대생체이 용률이 4.2% 정도였다. 안전역이 230 정도로산출되어벤조페논-3의허용최대배합한도 5% 에서는안전하다고사료된다. 호모살레이트경우, 48시간까지 Franz diffusion cell method 의 receptor phase에서호모살레이트를검출할수없었으며, 48시간시점에 stratum corneum 과 epidermis/dermis 에잔존하는호모살레이트의양은 gel>vaseline>lotion>oily solution 의순이었다. 호모살레이트를랫드의피부에노출시생체이용률이 1.4% 정도로낮 았으며, 정맥주입후주요장기에서의분포는대장과소장에많이분포하였으며, 고환에서 - 13 -

가장적은분포를나타내었다. 호모살레이트는피부에오래머물며지속적으로방출되는경향을확인하여, 자외선차단제적용후가능한신속하게세척해내는것이안전한사용의한방법임을보여주었다. 안전역이 139 정도로산출되어호모살레이트의허용최대배합한도 10% 에서는안전하다고사료된다. 이러한결과는자외선차단성분중배합한도성분인벤조페논-3와호모살레이트의위해평가를통해정책결정기초자료를제공할수있다. 화장품원료에대한네거티브시스템의과학적근거마련의근거를제공한다. 위해요소에대한자체교육자료로활용하여위해성평가자들의기술적자질향상을통하여위해성평가및위해관리에보다능동적이고과학적인대응이가능하다. 중심단어위해평가자외선차단제자외선차단성분화장품원료 - 14 -

주관연구책임자의견 연구의범위 〇본연구는화장품의자외선차단성분중배합한도성분인벤조페논-3와호모살레이트의노출도평가를통한위해성평가를수행하는것임〇또한, 위해성평가를통하여벤조페논-3와호모살레이트의배합한도의타당성을평가하는것임. 연구의한계점 〇본연구는랫드에서의정맥내벤조페논-3와호모살레이트의투여시체내동태및조직분포결과와경피흡수시전신노출도를평가하여표적장기로알려진고환에서의노출정도를평가하고자하였다. 〇사람에게적용하려면랫드-사람간외삽이필요하나단년도과제수행으로는외삽까지의연구수행이불가능하였음 인용시주의사항 〇연구결과는랫드의경피노출을통한전신노출도를근거로벤조페논-3와호모살레이트의위해성평가를실시하였음. 따라서, 다른방법으로노출도평가시위해성평가결과가상이할수있음. 따라서, 인용시오류방지를위하여, 반드시관련전문가나연구책임자의자문을구하는것이바람직함. 주관부서연락처식품의약품안전평가원화장품연구팀 ( 043-719-4855 ) - 15 -

편집순서 6 : 요약문 ( 영문 ) Summary Study on risk profiling of UV-filtering agents Title of Project Institute Dankook University Industry A cademic Cooperation Foundation Project Leader Kim, Kyu-Bong Project Period 2012-02-15 ~ 2012-11-30 Project Budget 80,000,000 Name Institute K im, K yu-bong Dankook University Y oo, Sun Dong Sungkyunkwan University Shin, Beom Soo Catholic University of Daegu K im, Jiwon Inje University Authors Jo, Haeran Inje University Ryu, Sungha Dankook University Shin, Seung W oo Sungkyunkwan University K im, Tae Hwan Sungkyunkwan University Choo, Hyun W ook Sungkyunkwan University K im, M in Gi Sungkyunkwan University Benzophenone-3 (MP-3) and homosalate (HS), which are used as UV-filtering agents, were studied for risk assessment using exposure assessment and risk profiles are described. In vitro Franz diffussion cell permeation study was performed and gel formulation was the best vehicle for skin permeation. For basic pharmacokinetic profile, iv study was performed and PK parameters were determined for benzophenone-3 and homosalate. At Css (200 ng/mg) of the two UV filtering agents by iv infusion, benzophenone-3 and homoslate concentration in various tissues and organs were determined for tissue distribution. Interestingly, testes were the lowest concentration of the two agents implying existence of barrier system, even though testes are assumed to be target for benzophenenone-3 and homosalate. In vivo dermal absorption study showed bioavailabilities of 5% BP-3 and 10% HS gel formulation are 4.2% and 1.4% and MOSs (margin of safety) were estimated to be 230 and 139, respectively. These results suggested that the up to 5% BP-3 and 10% HS might be safe for UV-filtering agents. Key W ords Risk assessment Sun Screen UV filter Cosmetic Ingredient - 16 -

Opinion of Principal Investigator Scope 〇 This study was scoped to perform risk assessment of benzophenone-3 and homosalate, which are used as limited UV-filtering agents, using exposure assessment. 〇 And, this study was scoped to evaluate the safety of the limit quantity of benzophenone-3 and homosalate. Limitation 〇 This study was performed to assess the exposure of benzophenone-3 and homosalate to testes, the target through pharmacokinetic study of iv and dermal treatment. 〇 Extrapolation is needed to apply animal data to human, but one-year study could not make it possible. Direction For Citation 〇 The result was based on the exposure assessment using dermal absorption in rats. Different method might induce different result, therefore, anybody who likes to use or cite current results, should discuss or consult with related expertise and project leader. Supervisory Office NIFDS, Cosmetic Research Team (043-719-4855) - 17 -

Ⅱ. 총괄연구개발과제연구결과 제 1 장총괄연구개발과제의목적및필요성 1 총괄연구개발과제의목표 1.1 목표 자외선차단성분벤조페논 -3(benzophenone-3) 및호모살레이트 (homosalate) 에대한위해평가 1.2 연구의배경 자외선차단제는일상생할에서자외선을차단하여자외선으로부터우리몸 ( 피부 ) 을보호하는기능을갖는화장품이다. 그러나, 내분비계장애작용을나타내는등인간의건강에위해작용을나타냄으로사회적인문제가되고있다. 자외선차단제는햇볕에타는것을방지의목적으로, 선탠과선번을일으키지않는제품의선택이필요하고, 피부의자외선에대한민감도와자외선지수를고려하여자외선 A, B의차단효과를갖는적당한제품의선택이필요하다. 일상생활에서는자외선차단을목적으로피부에간편하게사용하는경우로, 실내생활 ( 창문을통한노출 ), 출 퇴근, 등 하교, 쇼핑, 세탁물을건조하는일등일상생활중에서는자외선 B와더불어자외선 A에노출되는기회가많다. 따라서자외선 A와 B 차단효과를갖는제품을자외선에대한피부민감도에따라선택하여사용하는것이좋다. 일반적으로는광과민증때문에의사로부터자외선차단화장품의사용을권장받고있는경우자외선차단제를사용하게된다. 선번을일으키지않고엷은갈색피부로만드는선탠을목적으로사용하는경우, 비교적낮은 SPF로자외선 A 차단효과가거의없는제품을선택하여서서히피부를햇빛에노출하면서선탠을하는것이바람직하다. 위해성평가 (risk assessment) 는일반적으로유해성규명 (hazard identification), 용량-반응상관성평가 (dose-response assessment), 노출평가 (exposure assessment), 위해성규명 (risk characterization) 을나뉘어진다. 각각의영역에서다양한과학적인연구및근거자료를산출한다. 그러나, 자외선차단제의경우, 다양한연구를통하여위해성평가가이루어져왔으나, 매우제한적인것이현실이다. 자외선차단제의위해성평가에서인체노출평가는중요한영역을차지함. 즉, 노출이 - 18 -

없을경우위해성도없다. 그러나, 노출이과다할경우위해성이높다는것은쉽게예측할수있다. 따라서, 정확한노출평가가필요하다. 일반적으로독성물질의인체노출은외적노출 (external exposure) 과내적노출 (internal exposure) 로분류가되는데, 외적노출은위해요소의관리차원에서중요하지만, 표적장기에서의내적노출은독성물질의독성과직접적으로연관이있어이를정확히평가하는것은매우중요하다. 그러므로, 자외선차단제성분의위해성평가를위하여인체노출평가를통한위해성평가의수행은국민의건강을위하여매우중요하다. 벤조페논-3 및호모살레이트와같은자외선차단제의위해성평가를위해서피부로흡수되는정도를평가하는노출평가는매우중요하다. 노출평가를통하여현재허용가능한최대원료배합비율의타당성여부를판단하는것은매우중요하다. 인체위해성평가는불가피한독성물질의노출에서건강한삶을보장하기위하여건강에위해가없는양으로규제하는과학적근거를마련하는것이다. 국민의건강한삶은보건의료비용을절감할수있으며, 건강한경제활동은생산성향상에기여할것으로예상된다. 또한, 화장품시장의안정적인성장을위하여자외선차단제의안전성논란을해소하는것은매우필요하다. 따라서, 본연구의중요성은벤조페논-3 및호모살레이트와같은자외선차단제의안전관리를위하여매우필요하다고사료된다. 사회 문화적측면에서본연구의중요성을살펴보자면, 자외선차단화장품은화장품법에 화장품중피부를곱게태워주거나자외선으로부터피부를보호하는데도움을주는제품 이라고정의되어있다. 즉강한햇볕을막아주어피부를곱게태워주거나자외선을차단또는산란시켜자외선으로부터피부를보호하는기능을가진화장품을말한다. 피부보호의기능을가진자외선차단제가오히려내분비계장애작용등독성을일으킬수있다고알려져사회적으로불안감이조성되고있다. 화장품시장, 특히기능성화장품시장은계속성장하는추세임. 기능성화장품중의하나인자외선차단제원료물질은안전성논란은화장품시장성장에걸림돌이될수있다. 따라서, 유해성논란이되고있는자외선차단제의위해성평가는매우필요하다. 자외선차단제는기능성화장품의일종으로그구성성분은화장품원료규격에수재되어있음. 또사용시허용함량은식품의약품안전청장고시로관리되어오고있다 (Table 1). 본연구에서사용된물질인벤조페논-3(benzophenone-3) 와호모살레이트 (homosalate) 는 295-315 nm의자외선을주로흡수하는 UVB 자외선흡수제에속하며, 자외선차단제품중약 45% 의제품에서다른자외선차단제와병용혹은단독으로사용되고있다. - 19 -

Table 1. 자외선차단제의국내고시성분및허용함량 (K FDA, 2009) 성분명 허용함량 글리세릴파바 0.5%~3% 드로메트리졸 0.5%~7% 디갈로일트리올리에이트 0.5%~5% 4-메칠벤질리덴캠퍼 0.5%~5% 멘틸안트라닐레이트 0.5%~5% 벤조페논-3 0.5%~5% 벤조페논-4 0.5%~5% 벤조페논-8 0.5%~3% 부틸메톡시디벤조일메탄 0.5%~5% 시녹세이트 0.5%~5% 에칠헥실트리아존 0.5%~5% 옥토크릴렌 0.5%~10% 에칠헥실디메칠파바 0.5%~8% 에칠헥실메톡시신나메이트 0.5%~7.5% 에칠헥실살리실레이트 0.5%~5% 파라아미노벤조익액시드 0.5%~5% 페닐벤즈이미다졸설포닉액시드 0.5%~4% 호모살레이트 0.5%~10% 징크옥사이드 25% 티타늄디옥사이드 25% 이소아밀 p-메톡시신나메이트 10% 비스-에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진 10% 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트 산으로써 10% 드로메트리졸트리실록산 15% 디에칠헥실부타미도트리아존 10% 폴리실리콘 -15 ( 디메치코디에칠벤잘말로네이트 ) 10% 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀 10% 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드및그염류 산으로써 10% 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트 10% 현재국내에서판매되고있는자외선차단제중판매량기준상위 20개품목은 Table 2 와같으며일부한방제제와물리적자외선차단제를제외한대다수의제품은 homosalate, benzophenone-3, 3-Octyl-Methoxycinnamate, 4-Methylbenzylidene camphor 등의화학적 자외선차단제를포함한다. - 20 -

Table 2. 판매량기준상위 20 개국내시판자외선차단제 순위 품명 제조사 1 에어쿠션선블록 EX 15g 아모레퍼시픽 2 선메이트데일리 70g 아모레퍼시픽 3 선케어 365-3 에이이펙터 70g LG생활건강 4 UV 퍼펙트롱래스팅 UVA/UVB 프로텍터 30g 로레알 5 메이크업선블록 70g 아모레퍼시픽 6 365 선크림 70g LG생활건강 7 선사이언스퍼펙트선블록블랙 EX 플러스 60g LG생활건강 8 선사이언스퍼펙트선블록레드 EX 플러스 60g LG생활건강 9 UV 엑스퍼트 GN 쉴드 랑콤 10 선메이트레포츠 70g 아모레퍼시픽 11 내추럴선블록 70g 아모레퍼시픽 12 퍼펙트선크림 80g 존슨앤존슨 13 울트라쉬어드라이터치선블록위드힐리오플렉스 88g LG생활건강 14 비책진자단비책선크림 70g LG생활건강 15 울트라쉬어스포츠선블록로션 100ml 존슨앤존슨 16 선케어 365 3-에이어드밴스드 70g LG생활건강 17 화이트젠선크림 60g 아모레퍼시픽 18 비책자단서크림 LG생활건강 19 퍼펙트 UV 선스크린 60ml 시세이도 20 프레쉬선로션 125ml 니베아 다수의화학적자외선차단성분에대하여내분비계교란작용중하나인 estrogenic activity 및 antiandrogenic activity 를판단하기위하여수행된연구결과, homosalate 는 MCF-7 cell line 과 MDA-kb2-cell line 에서매우유의적인 estrogenic 및 antiandrogenic activity 를나타내었다 (Schlumpf, 2004, Ma, 2003). 각각의 cell line 에서 EC 50 은 MCF-7 cell line 에서 1.56 μm, MDA-kb2-cell line 에서 5.57 μm 로나타났으며대표적인내분비계 교란자외선차단성분으로알려진 Benzophenone-3, 3-Octyl-Methoxycinnamate 그리고 4-Methylbenzylidene camphor (Nadeem et al., 2004) 에비하여동일용량에서현저히높은 활성을나타내었다. - 21 -

Table 3. In vitro estrogenic and androgenic activities of various UV filtering agents 또한화학적자외선차단성분들에대한 in vitro 실험결과 estrogen-regulated protein 인 ps2 protein 의농도가 4-Methylbenzylidene camphor, homosalate, benzophenone-3 군 에서유의적으로증가하였다 (Schlumpf et al., 2001). Figure 1. 화학적자외선차단성분에의한 ps2 protein 증가율 - 22 -

에스트로겐이자궁비대의주요원인임에기인하여 (O' Connor et al., 1996; Reel et al., 1996), homosalate 및다수의화학적자외선차단성분을랫드에단회경구투여후자궁비대반응시험 (Uterotrophic assay) 을수행한결과, 자궁비대효과는대조군과비교하여유의적인차이가없는것으로나타났다. 다만 homosalate 의체내축적의가능성을배제할수없고특히장기간적용하는자외선차단제의사용특성상단회투여를통한실험만으로는 in vivo에서 homosalate 의내분비계장해효과를입증하기는한계가있다. 벤조페논-3와호모살레이트는지속적으로에스트로겐성효과를나타낸다. 따라서, 내분비계장애작용을나타내는벤조페논-3와호모살레이트의노출도평가를통한위해성평가는매우중요하다. 1.3 연구의범위 (1) 총괄연구개발의추진체계 (2) 기제와생체시료에포함된호모살레이트와벤조페논 -3의미량분석법확립현재생체시료, 화장품이나환경중에존재하는호모살레이트와벤조페논-3의분석에대하여다양한보고가되어있다. 하지만본연구의대상개체인랫드의생체시료중벤조페논-3의분석에대한보고는전무한실정이다. 따라서본연구에서는랫드의생체시 - 23 -

료중벤조페논 -3 의농도를측정하는데적합한고감도의신뢰성있는 LC-MS/MS 분석 법을개발하였다. 또한, 호모살레이트에대한분석법도개발하였다. (3) 기제에따른호모살레이트와벤조페논-3의 in vitro 피부투과도평가벤조페논-3와호모살레이트의 in vivo 피부투과시험에사용할기제를선정하기위해서 Franz diffusion cell 방법으로 in vitro 피부투과도를평가하였다. 벤조페논-3와호모살레이트를포함하는기제로 vaseline base, oily solution, lotion, gel 등보편적으로피부적용에사용되는동시에서로다른특성을대표하는 4종의 formulations 를제조하여사용하였다. In vitro 피부투과시험에는 male Sprague-Dawley 계흰쥐의등피를적출하여사용하였으며평형상태에서벤조페논-3와호모살레이트의투과속도, 투과계수, 그리고시험종료시점에서피부에잔존하는벤조페논-3와호모살레이트의양을정량하여각기제에대한투과도를평가하였다. (4) 벤조페논-3와호모살레이트정맥투여시조직분포및체내동태확인벤조페논-3와호모살레이트의체내동태를규명하기위해서랫드에벤조페논-3와호모살레이트를정맥투여한후일정시간간격으로채혈하였다. 채혈한혈액을전처리하여 LC-MS/MS 분석법으로혈중벤조페논-3와호모살레이트의농도를정량하였고얻어진농도-시간데이터로부터혈중벤조페논-3와호모살레이트의약동학적특성을평가하였다. 정맥주사실험에서얻은벤조페논-3와호모살레이트의체내동태파라미터를활용해서목표하는혈장농도를얻는데필요한초회용량 ( 정맥주사용량 ) 과유지용량 ( 등속주입속도 ) 을산출하였다. 산출된투여속도로벤조페논-3를등속정맥주입한후정상상태 (steady-state) 에서조직분포특성을확인하였다. 랫드의경정맥과대퇴정맥에각각 polyethylene tube를삽관하였으며대퇴정맥을통하여 12시간동안벤조페논-3와호모살레이트를주입하였다. 혈중벤조페논-3가정상상태에도달했을때랫드를 sacrifice 한후각장기를취하여전처리하고 LC-MS/MS 방법으로시료중벤조페논-3 와호모살레이트의농도를측정하여조직분포를확인하였다. (5) 경피투여시벤조페논-3와호모살레이트의전신노출도평가경피투여시벤조페논-3와호모살레이트의전신노출도를 in vivo에서평가하였다. 시험에사용된제형은 in vitro 투과도평가시험에서투과도가가장높게나타난기제를선정하였으며 5% 함량으로제조하여랫드의 scapular 부위에적용하였다. 이후일정시 - 24 -

간간격으로경정맥을통하여채혈하였고채혈한혈액은전처리후 LC-MS/MS 방법으 로분석하였다. (6) 벤조페논-3와호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성검토벤조페논-3와호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성을검토하기위하여벤조페논-3와호모살레이트의체내동태특성, 조직분포도, 피부투과도및전신노출도자료로부터투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계를규명하였다. 얻어진자료와벤조페논-3와호모살레이트의 toxicity criteria 로부터위해도및최대배합한도의타당성을검토하였다. (7) 벤조페논 -3 와호모살레이트의위해도평가서작성 벤조페논 -3 와호모살레이트의위해도평가서를문헌과연구결과를바탕으로작성하 였다. 벤조페논 -3 와호모살레이트의물리화학적특성에서부터독성및노출량등안전 성관련제반사항을작성하여벤조페논 -3 의안전성관련정리자료로활용한다. (8) 국제워크숍을통한선진위해평가기술습득및정보교류 미국 CIR 의 Director 인 Ms. Lillian Gill 을초청하여 2012 년화장품위해평가국제워크 숍을성공리에개최하여선진위해평가기술을습득하며정보교류를하였다. - 25 -

2. 총괄연구개발과제의목표달성도 연구개발목표달성도 (%) 생체시료중벤조페논-3의정량을위한고감도 LC-MS/MS 분석법확립 Franz diffusion cell 을사용한기제에따른벤조페논-3의 in vitro 피부투과도평가정맥투여시벤조페논-3의조직분포특성과체내동태확인및투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계규명 100 100 100 경피투여시벤조페논 -3 의전신노출도평가 100 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성평가 100 생체시료중호모살레이트의정량을위한고감도 LC-MS/MS 분석법확립 Franz diffusion cell 을사용한기제에따른호모살레이트의 in vitro 피부투과도평가정맥투여시호모살레이트의조직분포특성과체내동태확인및투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계규명 100 100 100 경피투여시호모살레이트의전신노출도평가 100 호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성평가 100 3. 총괄국내 외기술개발현황 20세기중반부터오존층파괴에대한전세계적관심이늘어남에따라, 자외선에대한사회적경각심역시증가하여자외선차단제의사용빈도는계속해서증가하는추세이다. 1943 년, 자외선흡수제인 para aminobenzoic acid(paba) 가일광차단제로특허를얻게되면서자외선차단제발전에기폭제가되었으며, 이후폭발적수요에힘입어지속적발전을이루고있다. 자외선차단제는크게물리적산란작용에의해자외선을산란하는자외선산란제, 그리고자외선흡수제로분류된다. 자외선산란제는일반적으로티타늄디옥사이드 (TiO 2 ), 징 - 26 -

크옥사이드 (ZnO) 등의무기성자외선차단제를가리키며, 자외선과가시광선의반사, 파동의산란및분산등물리적방법을통해인체로의영향을감소시키는작용을한다 (Antoniou et al., 2008). 자외선흡수제는 PABA esters, salicylates, cinnamates, benzophenones, avobenzone, drometriazole trisiloxane 등특정파장의자외선을흡수하는유기화합물을지칭함. 고강도의자외선을고에너지상태로여기 (excitation) 한후, 이성질체화와같은광화학적과정을통해높은파장의자외선을방출하여열에너지로써소멸시키는작용을한다 (Antoniou et al., 2008). 자외선흡수제는크게자외선 A (320-400 nm) 흡수제, 자외선 B (290-320nm) 흡수제로분류됨. Homosalate 의흡수극대값은 305 nm로써자외선 B 흡수제에속한다. Figure 2. Homosalate 의 UV absorbance spectrum 자외선에지속적으로노출될경우, 면역결핍, 광노화, 피부홍반, 흑색종, 익상편및피부암등이발생할수있다 (Cooper et al., 1992; Matsumu and Ananthaswamy, 2004; Nolan et al., 2003; Davies et al., 2002). 자외선 A와 B 모두피부의생체분자에악영향을미치나특히자외선 B는흡수되어 pyrimidine base의 dimer 를형성한다. 생성된 cyclobutane pyrimidine dimer 와 pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct 는 mutation 을일으켜암형성에지대한역할을한다 (Cadet et al., 2005). 따라서최근에는광범위한흡수스펙트럼을갖고있어자외선 A와 B를모두 - 27 -

차단할수있는차단제가출시되고있다. 제품중자외선흡수제의함량이과도할경우, 진동및열에의한접촉성피부염을일으킬위험이있으므로, 국가별로그배합한도를엄격히규제하고있으며 (Table XX), 최근에는자외선차단성분의 microencapsulation 을이용해, 활성성분의직접적피부접촉을피해피부손상및알러지반응을감소시키는연구가진행되고있다 (Gogna et al., 2007; Patel et al., 2006). 또한 DNA fragment 인 Thymidine dinucleotide (ptt) 를투여한누드마우스에자외선을조사하였을때, 이로인해발생되는 mutation 및 DNA photoproduct 가대조군에비해현저히낮았으며 (Gilchrest and Eller, 2005), 이는새로운기전의자외선차단제에대한가능성을보여주고있다. 4. 총괄연구개발과정에서수집한국외과학기술정보 미국의질병통제본부 (CDC) 의생체내벤조페논-3의바이오모니터링의결과를살펴보면, 2003-2004 동안벤조페논-3의뇨배출량을측정한결과 (Calafat et al., 2008), 여성이남성보다벤조페논-3의뇨중농도가약간높았으며, 6세에서 8세사이의여성 90명을대상으로뇨를분석한결과, 벤조페논-3는 14.7 μg/l의평균치를보였다. 총벤조페논-3의뇨중농도는어른의샘플의 90% 정도에서검출이되었으며, 최고치는 3000 μg/l를보였다 (Ye et al., 2005). 10% 벤조페논-3 로션을바른단기간의연구에서, 남성과여성의평균뇨중농도는 140 및 60 μg/l로보고되었다 (Janjua et al., 2004). 뇨에서벤조페논-3가검출된다는것이벤조페논-3가인체에유해한반응을일으킨다는것을의미하지는않는다. 단지, 모니터링데이터를참조해서특정군에서벤조페논-3의노출량이일반군보다많은지에대한평가자료로활용되며, 특정군의건강관리에주의를기울이는역할이바람직하다. - 28 -

제 2 장총괄연구개발과제의내용및방법 1. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한벤조페논 -3 의분석법개발 가. In vitro 시료중벤조페논 -3 의정량을위한 HPLC/UVD 분석법 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험에서얻은시료중벤조페논 -3 의농도를정량하기위해서 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 확립된분석 법의검량범위는 0.05 50 μg/ml 이었으며분석조건을아래표에나타내었다. Table 4. HPLC analysis of benzophenone-3 Chemical and reagents Benzophenone-3 : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetonitrile, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments HPLC system Integrator Analytical Column Waters 2690 HPLC system with Waters 2487 Dual λ absorbance detector (Waters, Milford, MA, USA) Scientist (Micromath, Saint Louis, MO, USA) Luna C 18 column (250 x 4.60 mm i.d., 5 µm, Phenomenex, Torrence, CA, USA) Chromatographic conditions Mobile phase Acetonitrile : 0.1% acetic acid = 70 : 30 Calibration range 0.05 50 μg/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 1.2 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume Absorbance λ 20 μl 290 nm 벤조페논 -3 를메탄올에용해시켜서 1 mg/ml 농도의표준원액을제조하고이동상으로 희석하여벤조페논 -3 의농도가각각 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μg/ml 가되도록검량표 준시료를제조하여사용하였다. 분석결과산출된벤조페논 -3 의피크면적을가지고 - 29 -

weighted regression (1/x) 을적용하여작성하였다. 분석법의검증은 0.05-50 μg/ml 농도에서정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 으로표현하였다. 정확성은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성은각농도값의변동계수 (CV) 를이용하였다. 나. LC-M S/M S 를이용한생체시료내벤조페논-3의분석법개발 In vivo 노출도평가를위하여혈장및조직중벤조페논-3의농도를정량할수있는고감도의 LC-MS/MS 분석법을개발하였다. 분석에는혈장또는분쇄된조직시료를사용하였으며혈장의경우 ethyl acetate 를이용한추출법, 조직시료의경우 acetonitrile 을이용한단백질침전법으로전처리하였다. 검량선의작성은 blank sample 100 μl가담긴차광처리된 Eppendorf tube에 acetonitrile 로용해한벤조페논-3 표준용액을가하여혈장농도가 1, 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ng/ml 그리고분쇄된조직농도가 10, 20, 50, 10, 100, 500, 1000 ng/ml이되도록검량표준시료를제조하였다. 여기에 actonitrile 에용해한노니바마이드내부표준용액 ( 혈장분석용표준용액농도 = 100 ng/ml, 조직분석용표준용액농도 = 1000 ng/ml) 을가하였다. 혈장시료의경우그후추출용매로써 ethyl acetate 를 3 ml 가한후 1분간의 vortexing, N 2 dry 과정을거친후시료와동일부피의이동상을가하여용해하였다. 조직시료의경우침전용매로서 acetonitrile 을가하여총부피가원래시료량의 5배가되도록하였다. 이혼액을 1분간 vortexing 하고 10분간 4000 g에서원심분리한후상층액을분리한후그와동량의 acetonitrile 을가하여전처리과정을반복한후동량의 distilled water를가하여그혼액을 LC에주입하였다. 검량선은내부표준물질의피크면적에대한벤조페논-3의피크면적비를사용하여가중치 1/x를적용한 weighted linear regression 방법으로작성하였다. 동물실험에서얻어진시료는분석전까지 20 에서보관하였다. 분석직전시료를상온에방치하여녹인후처리하였으며전처리과정은상기한표준시료에대한전처리과정과동일하다. 시료에포함된벤조페논-3의농도계산은얻어진크로마토그램으로부터내부표준물질의피크면적에대한벤조페논-3의피크면적비를구하여검량선으로부터산출하였다. 분석법의검증은정량한계 (LLOQ: 1 ng/ml), 저농도QC (20 ng/ml), 중농도 (100 ng/ml) 그리고고농도 (900 ng/ml) QC시료를상기한검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성 (precision) 은각농도값의변동계수 - 30 -

(CV) 를이용하였다. 자세한분석조건은아래표에나타내었다. Table 5. LC-M S/M S analysis of benzophenone-3 in rat plasma Chemical and reagents Benzophenone-3 : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Formic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Methanol, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments LC-MS/MS system Integrator Analytical Column API 2000 coupled with Waters 2690 HPLC system (AB MDS Sciex, Toronto Canada) Analyst 1.4 (AB MDS Sciex, Toronto, Canada) Gemini C 18 column (50 x 2.10 mm i.d., 2.6 µm) Chromatographic conditions Mobile phase (plasma) Methanol : 0.05% formic acid = 85 : 15 Mobile phase (tissue homogenates) Acetonitrile : 0.05% formic acid = 80 : 20 Calibration range (plasma) 1-1000 ng/ml (r 2 > 0.999) Calibration range (tissue homogenates) 5 1000 ng/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 0.3 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume 10 μl M S/M S conditions Ion mode Mass transition ESI (positive), multi reaction monitoring 229.0 150.9 (benzophenone-3), 294.3 137.2 (nonivamide, Internal standard) Turbo gas temperature 370 C Sample preparation Plasma Tissue homogenates Liquid-liquid extraction with ethylacetate (3 ml) Two step protein precipitation with acetonitrile - 31 -

2. 기제에따른벤조페논 -3 의 in vitro 투과도평가 가. 벤조페논 -3 를함유하는제제의제조 기제에따른벤조페논-3 의투과도를확인하기위하여대표성을나타내는 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를문헌을참고하여제조하였다 (Chatelain et al., 2003, Mestres et al., 2010, Vilela et al., 2012). 각제제중벤조페논-3 의함량은시판자외선차단제중벤조페논-3 의배합한도 (5% w/w) 에기준하여제조하였으며각기제의구성은아래에나타내었다. Table 6. Composition of different formulations containing benzophenone-3 Vaseline Oily solution Lotion Gel Benzophenone-3 (5%) Benzophenone-3 (5%) Benzophenone-3 (5%) Benzophenone-3 (5%) Vaseline (95%) Miglyol (18.7%) Miglyol (18.7%) Miglyol (18.7%) - Mineral oil (72.3%) Neutrogena (75.8%) Carbomer 940 (1.1%) - Bees wax (4.0%) Surfactant (0.5%) Poloxamer 188 (2.0%) - - - - - - - - - - - - - - - EDTA Na (1.0%) Methyl paraben (1.0%) NaOH (10.0%) Surfactant (0.5%) DW (64.3%) 나. 벤조페논 -3 의용해도측정 Franz diffusion cell 을이용한벤조페논 -3 의피부투과도평가는 sink condition 이전제 되어야하므로 receptor phase 에서시험물질의용해도가중요한인자가된다. 본연구에 - 32 -

서는 sink condition 의확보를위해서 5% (v/v) Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에대한벤조페논-3의용해도를평가하였다. 아울러투과도시험에서 receptor phase 중벤조페논-3의안정성을확보하기위해서투과시험기간에서벤조페논-3의농도변화추이를확인하였다. 다. 피부투과시험방법 랫드피부의적출 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 의피부를적출하여시험에사용하였다. 랫드는 diethyl ether 로치사시켰으며등부위의털은전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모했다. 대략 5 5 cm면적으로피부를등부위에서적출한후피부가상하지않도록조심스럽게피하지방을제거하였다. 얻어진랫드피부는실험에사용할때까지 -20 에서유리판에잘펴서보관하였고보관기간은일주일을넘지않도록하였다. 기제에따른벤조페논-3의피부투과도측정벤조페논-3 를함유하는 4종의제제에대한벤조페논-3 의피부투과도를 Franz diffusion cell 방법으로측정하였다. Receptor phase로는 5%(v/v) Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액 (0.02 M) 을사용하였으며 600 rpm으로일정하게교반하면서항온순환펌프를 이용하여 37 ± 0.5 로온도를유지하였다. Receptor phase 와접촉하는피부의면적은약 1.766 cm2이었고 receptor phase의용량은 10 ml이었다. 보관한랫드피부를시험직전에상온에서서서히해동시키고 37 의 receptor phase 에약 1시간동안적신후 donor compartment 와 receptor compartment 사이에끼우고피부의표면은실온에노출시켰다. 그리고 donor compartment 를떼어낸후노출된피부의표면에각제제 200 mg을적용하고 donor compartment 를덮어고정시켰다. 제제적용후 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 시간에각각 0.2 ml의 receptor phase 를채취하고즉시동량의인산염완충액을보충하였다. 최종시료를채취한직후피부를 Franz diffusion cell 로부터분리하여 tape stripping method 로각질과진피층으로분리하여이부위에함유된벤조페논-3 농도및 receptor phase에서의농도를 HPLC-UV 분석법으로정량하였다. 경피흡수자료의분석 - 33 -

피부의단위면적당투과한벤조페논 -3 의양을시간에대한함수로나타낸아래식에따 라서투과 parameter 를산출하였다. J s = 1 A ( dq dt ) 이식에서 A 는투과가일어나는피부의면적 ( cm2 ), (dq/dt) 는평형상태에서단위시 간당피부를투과하는시험물질의양 ( μg /hr), J s 는평형상태에서의투과속도 ( μg / cm2 /hr) 를 나타낸다. 3. 랫드에서벤조페논 -3 의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시랫드에서벤조페논 -3 의체내동태 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 투여용액의제조지용성물질인벤조페논-3를정맥투여하기위하여 Tween 80:ethanol:PEG 400:saline (5:20:25:50, v/v%) 으로구성되는 o/w emulsion 을제조하여벤조페논-3를용해시켰다. 투여용량은 1 mg/kg 단일용량이었다. 각용량의투여시사용한벤조페논-3 용액의농도및투여용액의부피를아래에나타내었다. Table 7. Benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Dose (mg/kg) Benzophenone-3 concentration (mg/ml) Dosing volume (ml/kg) 1 0.5 2 벤조페논 -3 투여및시료채취 랫드에벤조페논 -3 를정맥주사하기 12 시간전사료를제거하여절식시켰다. 투여는 - 34 -

단일용량의 (1 mg/kg) 벤조페논-3를 penile venous injection 하였다. 벤조페논-3를정맥주사한후 8시간시점에서다시사료를공급하였다. 투여전및투여후 2, 5, 15, 30분, 1, 2, 4, 8, 12시간에채혈하였다. 각채혈시간마다 jugular vein에서 0.2 ml를채혈하였으며채취한혈액을 4000 g에서 10분동안원심분리하여얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용해서벤조페논-3의혈장농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. 투여용량에따른약동학적파라메터의비교는 SPSS (SPSS Inc, USA) 를이용하여통계학적차이를확인하였다. 나. 정맥주입시벤조페논 -3 의체내동태및조직분포 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서자유롭게사료와물을공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 수술 Male Sprague-Dawley rats에 Zoletil 50을 20 mg/kg 용량으로복강주사하여마취시킨후 jugular vein과 femoral vein에 polyethylene tubing (0.58 mm i.d., 0.96 mm o.d., Natume, Tokyo, Japan) 을삽관하였다. 수술후최소 2일간의회복기를둔후정맥주입시험을시행하였다. 벤조페논-3의정맥주입및시료채취벤조페논-3가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하는방법으로투여하였다. 초기정맥투여용량 (D L ) 의설정은단회정맥주사시험에서얻은분포용적 (Vd, ss = 10.1 L/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 등 - 35 -

속정맥주입속도는단회정맥주사시험에서얻은클리어런스 (Cl = 76.1 ml/min/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 투여용액은정맥투여시험에서와동일한방법으로제조하였다. 각군당투여된용액의농도, 부피, 벤조페논-3 투여량을아래표에나타내었다. 벤조페논-3의투여는수술후 2일간의회복기를둔후비절식상태에서수행하였다. Table 8. Target plasma concentrations, benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of benzophenone-3 Target Css (ng/ml) Loading bolus i.v. injection Conc (mg/ml) Dose (mg/kg) Vehicle vol (ml/kg) Conc (mg/ml) M aintenance i.v. infusion Dose (mg/kg/hr) Vehicle vol (ml/kg/hr) 200 0.494 0.9881 2 0.257 0.459 1.79 혈액시료는투여전및투여후 2, 4, 8, 12 hr 시점에서 jugular vein으로부터 0.2 ml 씩채혈하였다. 채혈이후즉시동량의 heparinized saline (50 IU/ml) 을보충해주었다. 채취한혈액은 4000 g에서 10 분간원심분리한후혈장을취하고 -20 에서분석시까지보관하였다. 정맥등속주입을시작한후 12 hr 시점에서채혈한후랫드를안락사시키고뇌, 심장, 폐, 간, 위, 소장, 대장, 비장, 신장, 고환등의조직을채취하였다. 일정한부피의식염수를각조직에가한후 homogenizer 를사용하여균질화하였다. 시료는분석시까지 -2 0 에서보관하였다. 정상상태에서벤조페논-3의혈장및조직농도는최종채혈시간인 12 hr의농도로표현하였으며조직분배계수 (K p ) 는정상상태에서벤조페논-3의혈장대비조직농도의비로산출하였다. 4. 경피투여시벤조페논 -3 의전신노출도평가 실험동물 실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) - 36 -

를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시 험전 1 주일간 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응 기를거치도록하였다. 벤조페논-3의투여및시료채취 In vivo 경피투여시험은 in vitro 벤조페논-3 피부투과도시험에서가장높은투과도를나타낸 gel formulation 에대하여수행하였다. Gel 기제중벤조페논-3의함유량은 5% 이었으며, 이전과동일한방법으로 miglyol, carbomer 940, poloxamer 188, EDTA Na, methyl paraben, NaOH, surfactant, DW 등을사용하여제조하였다. 경피투여시험직전랫드를 diethyl ether 로마취시킨다음등부위를대략 5 5 cm면적으로전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모하였다. 제모한랫드의피부를 ethanol 로조심스럽게닦아낸후 3 3 cm면적에 200 mg의 gel 을고르게펴서적용하였다. 이때경피에적용된벤조페논-3 의용량은 10 mg 이었다. 혈액시료는투여전및투여후 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간에채취하였다. 정해진시점에서 0.2 ml의혈액을 jugular vein으로부터채혈하고 4000 g에서 10분간원심분리한다음얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용하여벤조페논-3의혈중농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. 5. 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성평가 정맥투여후얻어진벤조페논-3의체내동태및조직분포자료그리고경피투과시험으로부터얻어진벤조페논-3의혈중농도자료로부터투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계를규명한다. 또한, 기존에보고된독성자료특히, 반복투여독성자료에서산출된 NOAEL를이용하여안전역 (Margin of Safety) 를다음과같이산출한다. 안전역 (Margin of Safety)=NOAEL/ 전신노출량 (Systemic exposure dose) - 37 -

위식은일반적으로유해물질의유해용량과노출용량간의비교를통하여현재의노출 이얼마만큼안전한지를개략적으로보여준다. 일반적으로식품이나화장품의경우, 100 이상이면노출수준이적절하다고판단한다. 벤조페논 -3 의최대배합한도인 5% 의타당성을검토한다. 6. 벤조페논 -3 의위해도평가서 (Risk profile) 작성 벤조페논 -3 의안전성관련각종문헌과본연구의결과를토대로벤조페논 -3 의위해도 평가서를작성하였다. 벤조페논 -3 의물리화학적특성에서부터독성및노출량등안전 성관련제반사항을작성하여벤조페논 -3 의안전성관련정리자료로활용한다. 7. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한호모살레이트의분석법개발 가. In vitro 시료중호모살레이트의정량을위한 HPLC/UVD 분석법 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험에서얻은시료중호모살레 이트의농도를정량하기위해서 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 확립된분 석법의검량범위는 0.1 100 μg/ml 이었으며분석조건을아래표에나타내었다. - 38 -

Table 9. HPLC analysis of homosalate Chemical and reagents Homosalate : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Methanol, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments HPLC system Integrator Analytical Column Waters 2690 HPLC system with Waters 2487 Dual λ absorbance detector (Waters, Milford, MA, USA) Scientist (Micromath, Saint Louis, MO, USA) Luna C 18 column (250 x 4.60 mm i.d., 5 µm, Phenomenex, Torrence, CA, USA) Chromatographic conditions Mobile phase methanol : 0.01% acetic acid = 90 : 10 Calibration range 0.05 100 μg/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 1.5 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume Absorbance λ 50 μl 306 nm 호모살레이트를메탄올에용해시켜서 1 mg/ml 농도의표준원액을제조하고이동상으로희석하여호모살레이트의농도가각각 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml가되도록검량표준시료를제조하여사용하였다. 분석결과산출된호모살레이트의피크면적을가지고 weighted regression (1/x) 을적용하여작성하였다. 분석법의검증은 0.1-100 μg/ml 농도에서정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 으로표현하였다. 정확성은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성은각농도값의변동계수 (CV) 를이용하였다. 나. 생체시료중호모살레이트의정량을위한 LC-M S/M S 분석법개발 In vivo 노출도평가를위해서혈장및조직중호모살레이트의농도를정량할수있 는고감도의 LC-MS/MS 분석법을개발하였다. 분석에는혈장또는분쇄된조직시료 를사용하였으며 acetonitrile 을가하여단백질침전법으로전처리하였다. 검량선의작성 - 39 -

은 blank sample 50 μl가담긴차광처리된 Eppendorf tube에 acetonitrile 로용해한호모살레이트표준용액을가하여호모살레이트혈장농도가 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ng/ml 그리고분쇄된조직농도가 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000 ng/ml이되도록검량표준시료를제조하였다. 여기에 acetonitrile 에용해한옥틸살리실레이트내부표준용액 ( 혈장분석용표준용액농도 = 100 ng/ml; 조직분석용표준용액농도 = 200 ng/ml) 과침전용매로서 actetonitrle 을가하여총부피가원래시료량의 5배가되도록하였다. 이혼액을 1분간 vortexing 하고 10분간 4000 g에서원심분리한후상층액을분리하였다. 혈장전처리시료의경우에는얻어진상층액을바로 LC에주입하였고분쇄된조직전처리시료의경우에는상층액에동량의 acetonitrile 을가하여다시한번전처리과정을반복한후 LC에주입하였다. 검량선은내부표준물질의피크면적에대한호모살레이트의피크면적비를사용하여가중치 1/x를적용한 weighted linear regression 방법으로작성하였다. 동물실험에서얻어진시료는분석전까지 20 에서보관하였다. 분석직전시료를상온에방치하여녹인후처리하였으며전처리과정은상기한표준시료에대한전처리과정과동일하였다. 시료에포함된호모살레이트의농도계산은얻어진크로마토그램으로부터내부표준물질의피크면적에대한호모살레이트의피크면적비를구하여검량선으로부터산출하였다. 분석법의검증은정량한계 (LLOQ: 0.5 ng/ml), 저농도 (20 ng/ml), 중농도 (100 ng/ml) 그리고고농도 (900 ng/ml) QC 시료를상기한검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성 (precision) 은각농도값의변동계수 (CV) 를이용하였다. 자세한분석조건을아래표에나타내었다. - 40 -

Table 10. LC-M S/M S analysis of homosalate in rat plasma Chemical and reagents Homosalate : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Formic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetonitrile, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments LC-MS/MS system Integrator Analytical Column API 4000 coupled with Agilent 1100 HPLC system (AB MDS Sciex, Toronto, Canada) Analyst 1.4 (AB MDS Sciex, Toronto, Canada) Kinetex C 18 column (50 x 2.10 mm i.d., 2.6 µm) Chromatographic conditions Mobile phase (plasma) acetonitrile : 0.05% formic acid = 82.5 : 17.5 Mobile phase (tissue homogenates) acetonitrile : 0.05% formic acid = 70 : 30 Calibration range (plasma) 0.5 1000 ng/ml (r 2 > 0.999) Calibration range (tissue homogenates) 5 2000 ng/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 0.2 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume 10 μl M S/M S conditions Ion mode Mass transition ESI (positive), multiple reaction monitoring 263.2 139.0 (homosalate), 251.2 139.0 (octyl salicylate, internal standard) Turbo gas temperature 350 C Sample preparation Plasma Tissue homogenates one-step protein precipitation with acetonitrile two-step protein precipitation with acetonitrile - 41 -

8. 기제에따른호모살레이트의 in vitro 투과도평가 가. 호모살레이트를함유하는제제의제조 기제에따른호모살레이트의투과도를확인하기위하여대표성을나타내는 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를문헌을참고하여제조하였다 (Chatelain et al., 2003, Mestres et al., 2010, Vilela et al., 2012). 각제제중호모살레이트의함량은시판자외선차단제중호모살레이트의배합한도 (10% w/w) 에기준하여제조하였으며각기제의구성은아래에나타내었다. Table 11. Composition of different formulations containing homosalate Vaseline Oily solution Lotion Gel Homosalate (10%) Homosalate (10%) Homosalate (10%) Homosalate (10%) Vaseline (90%) Miglyol (13.7%) Miglyol (13.7%) Miglyol (13.7%) - Mineral oil (72.3%) Neutrogena (75.8%) Carbomer 940 (1.1%) - Bees wax (4.0%) Surfactant (0.5%) Poloxamer 188 (2.0%) - - - - - - - - - - - - - - - EDTA Na (1.0%) Methyl paraben (1.0%) NaOH (10.0%) Surfactant (0.5%) DW (64.3%) 나. 호모살레이트의용해도측정 Franz diffusion cell 을이용한호모살레이트의피부투과도평가는 sink condition 이전 제되어야하므로 receptor phase 에서시험물질의용해도가중요한인자가된다. 본연구 - 42 -

에서는 sink condition 의확보를위해서 5% (v/v) Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에대한호모살레이트의용해도를평가하였다. 아울러투과도시험에서 receptor phase 중호모살레이트의안정성을확보하기위해서투과시험기간에서호모살레이트의농도변화추이를확인하였다. 다. 피부투과시험방법 랫드피부의적출 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 의피부를적출하여시험에사용하였다. 랫드는 diethyl ether 로치사시켰으며등부위의털은전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모했다. 대략 5 5 cm면적으로피부를등부위에서적출한후피부가상하지않도록조심스럽게피하지방을제거하였다. 얻어진랫드피부는실험에사용할때까지 -20 에서유리판에잘펴서보관하였고보관기간은일주일을넘지않도록하였다. 기제에따른호모살레이트의피부투과도측정 호모살레이트를함유하는 4 종의제제에대한호모살레이트의피부투과도를 Franz diffusion cell 방법으로측정하였다. Receptor phase 로는 5%(v/v) Tween 80 을함유하는 ph 7.4 인산염완충액 (0.02 M) 을사용하였으며 600 rpm 으로일정하게교반하면서항온순 환펌프를이용하여 37 ± 0.5 로온도를유지하였다. Receptor phase 와접촉하는피부의 면적은약 1.766 cm2이었고 receptor phase 의용량은 10 ml이었다. 보관한랫드피부를시험직전에상온에서서서히해동시키고 37 의 receptor phase 에약 1시간동안적신후 donor compartment 와 receptor compartment 사이에끼우고피부의표면은실온에노출시켰다. 그리고 donor compartment 를떼어낸후노출된피부의표면에각제제 200 mg을적용하고 donor compartment 를덮어고정시켰다. 제제적용후 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 시간에각각 0.2 ml의 receptor phase 를채취하고즉시동량의인산염완충액을보충하였다. 최종시료를채취한직후피부를 Franz diffusion cell 로부터분리하여 tape stripping method 로각질과진피층으로분리하여이부위에함유된호모살레이트농도및 receptor phase에서의농도를 HPLC-UV 분석법으로정량하였다. 경피흡수자료의분석 - 43 -

피부의단위면적당투과한호모살레이트의양을시간에대한함수로나타낸아래식에 따라서투과 parameter 를산출하였다. J s = 1 A ( dq dt ) 이식에서 A 는투과가일어나는피부의면적 ( cm2 ), (dq/dt) 는평형상태에서단위시 간당피부를투과하는시험물질의양 ( μg /hr), J s 는평형상태에서의투과속도 ( μg / cm2 /hr) 를 나타낸다. 9. 랫드에서호모살레이트의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시호모살레이트의체내동태 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 투여용액의제조지용성물질인호모살레이트를정맥투여하기위하여 Tween 80:ethanol:PEG 400:saline (5:20:25:50, v/v%) 으로구성되는 o/w emulsion 을제조하여호모살레이트를용해시켰다. 투여용량은 1, 3, 9 mg/kg의 3 용량이었다. 각용량의투여시사용한호모살레이트용액의농도및투여용액의부피를아래에나타내었다. Table 12. Homosalate concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Dose (mg/kg) Homosalate concentration (mg/ml) Dosing volume (ml/kg) 1 0.5 2 3 1.5 2 9 4.5 2-44 -

호모살레이트투여및시료채취랫드에호모살레이트를정맥주사하기 12시간전사료를제거하여절식시켰다. 투여는세용량의 (1, 3, 9 mg/kg) 호모살레이트를 penile venous injection 하였다. 호모살레이트를정맥주사한후 8시간시점에서다시사료를공급하였다. 투여전및투여후 2, 5, 15, 30, 60분, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36시간에채혈하였다. 각채혈시간마다 jugular vein에서 0.2 ml를채혈하였으며채취한혈액을 4000 g에서 10분동안원심분리하여얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용해서호모살레이트의혈장농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. 투여용량에따른약동학적파라메터의비교는 SPSS (SPSS Inc, USA) 를이용하여통계학적차이를확인하였다. 나. 정맥주입시호모살레이트의체내동태및조직분포 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서자유롭게사료와물을공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 수술 Male Sprague-Dawley rats에 Zoletil 50을 20 mg/kg 용량으로복강주사하여마취시킨후 jugular vein과 femoral vein에 polyethylene tubing (0.58 mm i.d., 0.96 mm o.d., Natume, Tokyo, Japan) 을삽관하였다. 수술후최소 2일간의회복기를둔후정맥주입시험을시행하였다. 호모살레이트의정맥주입및시료채취 호모살레이트가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주 사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하는방법으로투여하였 - 45 -

다. 초기정맥투여용량 (D L ) 의설정은단회정맥주사시험에서얻은분포용적 (Vd, ss = 6.47 L/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 100 and 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 등속정맥주입속도는단회정맥주사시험에서얻은클리어런스 (Cl = 55.8 ml/min/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 100 and 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 투여용액은정맥투여시험에서와동일한방법으로제조하였다. 각군당투여된용액의농도, 부피, 호모살레이트투여량을아래표에나타내었다. 호모살레이트의투여는수술후 2일간의회복기를둔후비절식상태에서수행하였다. Table 13. Target plasma concentrations, homosalate concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of homosalate Target C ss (ng/ml) Loading bolus i.v. injection Conc (mg/ml) Dose (mg/kg) Vehicle vol (ml/kg) Conc (mg/ml) M aintenance i.v. infusion Dose (mg/kg/hr) Vehicle vol (ml/kg/hr) 100 0.35 0.65 2 0.19 0.34 1.79 200 0.65 1.3 2 0.375 0.67 1.79 혈액시료는투여전및투여후 2, 4, 8, 12, 24 hr 시점에서 jugular vein으로부터 0.2 ml 씩채혈하였다. 채혈이후즉시동량의 heparinized saline (50 IU/ml) 을보충해주었다. 채취한혈액은 4000 g에서 10 분간원심분리한후혈장을취하고 -20 에서분석시까지보관하였다. 정맥등속주입을시작한후 24 hr 시점에서채혈한후랫드를안락사시키고뇌, 심장, 폐, 간, 위, 소장, 대장, 비장, 신장, 고환등의조직을채취하였다. 일정한부피의식염수를각조직에가한후 homogenizer 를사용하여균질화하였다. 시료는분석시까지 -2 0 에서보관하였다. 정상상태에서호모살레이트의혈장및조직농도는최종채혈시간인 24 hr의농도로표현하였으며조직분배계수 (K p ) 는정상상태에서호모살레이트의혈장대비조직농도의비로산출하였다. - 46 -

10. 경피투여시호모살레이트의전신노출도평가 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시험전 1주일간 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 호모살레이트의투여및시료채취 In vivo 경피투여시험은 in vitro 호모살레이트피부투과도시험에서가장높은투과도를나타낸 gel formulation 에대하여수행하였다. Gel 기제중호모살레이트의함유량은 10% 이었으며, 이전과동일한방법으로 miglyol, carbomer 940, poloxamer 188, EDTA Na, methyl paraben, NaOH, surfactant, DW 등을사용하여제조하였다. 경피투여시험직전랫드를 diethyl ether 로마취시킨다음등부위를대략 5 5 cm면적으로전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모하였다. 제모한랫드의피부를 ethanol 로조심스럽게닦아낸후 3 3 cm면적에 200 mg의 gel 을고르게펴서적용하였다. 이때경피에적용된호모살레이트의용량은 20 mg 이었다. 혈액시료는투여전및투여후 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간에채취하였다. 정해진시점에서 0.2 ml의혈액을 jugular vein으로부터채혈하고 4000 g에서 10분간원심분리한다음얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용하여호모살레이트의혈중농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. 11. 호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성평가 정맥투여후얻어진호모살레이트의체내동태및조직분포자료그리고경피투과시험 으로부터얻어진호모살레이트의혈중농도자료로부터투여용량 - 혈중농도 - 조직농도간의 상관관계를규명한다. 또한, 기존에보고된독성자료특히, 반복투여독성자료에서산출된 - 47 -

NOAEL 를이용하여안전역 (Margin of Safety) 를다음과같이산출한다. 안전역 (Margin of Safety)=NOAEL/ 전신노출량 (Systemic exposure dose) 위식은일반적으로유해물질의유해용량과노출용량간의비교를통하여현재의노출 이얼마만큼안전한지를개략적으로보여준다. 일반적으로식품이나화장품의경우, 100 이상이면노출수준이적절하다고판단한다. 이를통하여, 호모살레이트의최대배합한도인 10% 의타당성을검토한다. 12. 호모살레이트의위해도평가서 (Risk profile) 작성 호모살레이트의안전성관련각종문헌과본연구의결과를토대로호모살레이트의위해 도평가서를작성하였다. 호모살레이트의물리화학적특성에서부터독성및노출량등 안전성관련제반사항을작성하여호모살레이트의안전성관련정리자료로활용한다. - 48 -

제 3 장총괄연구개발과제의최종결과및고찰 1. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한벤조페논 -3 의분석법개발 가. In vitro 시료중벤조페논 -3 의정량을위한 HPLC/UVD 분석법확립 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험으로부터얻어진시료중벤조페논-3의정량은 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 벤조페논-3는확립된조건에서 6분에검출되었으며물질의분석에영향을주는간섭 peak 는관찰되지않았다. 검량범위내벤조페논-3의크로마토그램을아래에나타내었다. Figure 3. Representative chromatogram of benzophenone-3 in receptor phase. 상기한바와같은분석조건에서벤조페논 -3 의검량범위는 0.05 50 μg/ml 이었다. 해당검량선의전형적인계산식은 y = 128.94x 0.7359 (r 2 = 0.9999) 로우수한직선성 을나타내었다. - 49 -

7000 6000 y = 128.94x - 0.7359 R² = 0.9999 Response (peak area) 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 10 20 30 40 50 60 Benzophenone-3 concentration (µg/ml) Figure 4. Representative calibration curve for the determination benzophenone-3. 분석법의검증은 0.05 50 μg/ml 농도에서시행하였으며아래표에서보는바와같 이우수한정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 을나타내었다. Table 14. A ccuracy and precision for the HPLC assay of benzophenone-3 (n=3 each) Concentration ( μg/ml) A ccuracy (%) Precision (%) 0.05 100.7 0.2 0.1 97.7 0.7 0.5 99.5 0.3 1 100.3 0.1 5 99.9 0.1 10 100.1 0.1 50 100.0 0.0-50 -

나. LC-M S/M S 를이용한생체시료내벤조페논 -3 의분석법개발 정량을위한 MRM mass transition 은양자화된이온의감도와 product ion scan의감도를평가하여결정하였으며벤조페논-3과내부표준물질노니바마이드의 MRM mass transition 은각각 229.0 150.9 와 294.3 137.2 에서수행하였다. 벤조페논-3와내부표준물질의 product ion mass spectra 를아래그림에나타내었다. m/z 150.09 m/z 137.2 Figure 5. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate. Blank 혈장및표준혈장 (LLOQ 0.5 ng/ml, 1000 ng/ml) 을분석하여얻은크로마토그램을아래그림에나타내었다. 벤조페논-3과내부표준물질의 retention time은각각 4.5 와 3.5 분이었으며공혈장의크로마토그램에서는분석에영향을미치는방해 peak 는관찰되지않았다. - 51 -

(A) Figure 6. MRM chromatograms of (A) benzophenone-3 (BP3) and (B) nonivamide (NVM) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with BP3 (1 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (center), and plasma spiked with BP3 (1000 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (right). (B) 벤조페논 -3 검량표준시료 (1, 5, 10, 50, 100, 500, and 1000 ng/ml) 를 LC-MS/MS 로분 석하였을때얻어진검량선의전형적인계산식은 y = 0.0219x + 0.00819 (r=0.9999) 이었 다. 검량선은 1-1000 ng/ml 의농도범위에서양호한직선성을나타내었다. - 52 -

Figure 7. Representative calibration curve for the determination of benzophenone-3 in rat plasma (y= 0.00353x + 0.00461, r 2 =0.9999) LC-MS/MS 분석시혈장시료를정량한계 (LLOQ, 1 ng/ml), low QC (20 ng/ml), medium QC (450 ng/ml) 및 high QC (900 ng/ml) 농도에서상기의검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정밀성 (precision) 은벤조페논-3과내부표준물질의피크면적비의표준편차를평균값으로나눈비의백분율 (%) 로서구하였고, 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였다. Inter-day 와 intra-day 의판정기준은정량한계 (LLOQ) 의경우정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120% 인조건을만족하는농도로구하였으며, 나머지 low, medium, high QC의경우정밀성은 15% 이하그리고정확성은 85-115% 범위에위치하는지의여부를판정기준으로하였다. 아래표에혈장중 intra-day 정확성과정밀성, 그리고 inter-day 의정확성과정밀성을나타내었다. Intra-day 와 inter-day 모두판정기준을충족시켰으며이때얻어진정량한계 (LLOQ) 는 1 ng/ml이었다. - 53 -

Table 15. Intra-day and inter-day accuracy and precision of benzophenone-3 assay Concentration (ng/ml) Intra-day (n=5) Inter-day (n=5) Accuracy (%) Precision (%) Accuracy (%) Precision (%) 1 97.5 8.5 103.2 7.4 20 109.1 4.1 101.8 6.6 450 100.0 1.3 99.2 3.7 900 98.4 1.5 97.9 3.1-54 -

2. 기제에따른벤조페논 -3 의 in vitro 투과도평가 가. 벤조페논 -3 를함유하는제제의제조 기제에따른벤조페논-3 의투과도를확인하기위해서대표적인 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를제조하였다. 각제제에함유된벤조페논-3 의양은시판되는자외선차단제벤조페논-3 의배합한도 (5% w/w) 에기준하여제조하였다. In vitro 투과도시험조건에서벤조페논-3 는기제가적용되는 48시간동안안정한것으로확인되었다. 벤조페논-3를함유하는 vaseline base, oily solution, lotion, gel 제제가제조되어피부에적용되기전외관을아래에나타내었다. Vaseline Oily solution Lotion Gel Figure 8. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing benzophenone-3 (5 % w/w). 나. 벤조페논 -3 의용해도측정및안정성확보 Franz diffusion cell 을이용한벤조페논-3의 in vitro 피부투과도측정시일정한투과도의유지를위해서는 receptor phase에서 sink condition 의유지가필수적인조건이므로그에적합한용해도를확보하는조건의확립이중요하다. 따라서본실험을위하여확립한 receptor phase가일정량이상의벤조페논-3를용해하는지여부를확인하였다. Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에서벤조페논-3의용해도는 2.92 mg/ml로 - 55 -

써벤조페논-3의투과도측정을위한 in vitro 시험에서 sink condition 이유지됨을확인하였다. 또한시료채취가이루어지는투과시험기간동안벤조페논-3의안정성이유지되는지여부를확인하였다. 벤조페논-3를 receptor phase에용해시킨후 (10 μg/ml) 37 에서 48시간농도변화를측정한결과유의적인변화가없어그안정성이확인되었다. 경시변화에따른벤조페논-3의농도변화추이를아래에나타내었다. S ta bility (%) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 9. Stability of benzophenone-3 in the receptor phase kept at 37 (n=4) 다. 기제에따른피부투과도 벤조페논-3를함유한각기제적용후 receptor phase로도달하는벤조페논-3의양과그투과속도를아래에나타내었다. 벤조페논-3의피부투과도는 gel 적용군에서 0.25 ± 0.02 μg/cm 2 /hr로써타 3종의기제에비하여유의적으로크게나타났으며 lotion, vaseline, oily solution 적용군의경우유의적인차이를나타내지않았다. - 56 -

Table 16. Amount of benzophenone-3 permeated through excised rat skins from each formulation containing 5% benzophenone-3 (μg/cm 2 ) Time (hr) Vaseline Oily solution Lotion Gel 12 0.51 ± 0.09 0.25 ± 0.11 0.44 ± 0.15 1 ± 0.81 24 1.31 ± 0.27 1.14 ± 0.31 1.56 ± 0.52 2.45 ± 0.95 36 2.76 ± 0.42 2.17 ± 0.34 2.82 ± 0.5 5.31 ± 1.56 48 4.03 ± 0.58 3.82 ± 0.58 4.99 ± 0.45 8.49 ± 1.05 12 10 Amount permeated, µg/cm 2 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 10. Permeation profiles of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation ( ; Gel, ; Vaseline, ; Lotion, ; Oily solution) containing 5% benzophenone-3 (w/w) (mean ± S.E., n=6 each). - 57 -

Table 17. Permeation parameters of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation containing 5% benzophenone (w/w) (mean ± S.D.) Formulation Js (μg/cm 2 /hr) Vaseline 0.11 ± 0.06 Lotion 0.14 ± 0.03 Oily solution 0.11 ± 0.05 Gel * 0.25 ± 0.02 * Gel was significantly different from vaseline, lotion, oily solution, and lotion (1-way A NOVA, post hoc; Tukey s test, p< 0.05) 투과시험종료시점인 48시간에서각질층과각질을제외한피부에잔존하는벤조페논 -3의양을정량한결과 lotion 의경우에각각 3.28%, 3.43%, oily solution 의경우에각각 2.08%, 2.85%, vaseline 의경우에 2.13%, 1.02% 가잔존하였다. 이에비해서 gel의경우에는각각투여량의 16.99% 및 4.7% 의벤조페논-3가잔존하여타 3종의제제에비하여 gel 제제적용군에서유의적으로높게나타났다. Gel 기제적용시피부에잔존하는총량은투여량의 21.7% 로 4종의제제중가장높았다. 그결과 in vivo 경피투여시험에서벤조페논-3의전신노출도를측정하는대상제제로 gel 제형을선정하였다. Table 18. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers and receptor phase for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations Formulation Dermis and epidermis (%) Stratum corneum (%) Receptor phase (%) Total (%) Vaseline 2.1 ± 0.3 1 ± 0.5 0.071 ± 0.025 3.2 ± 0.7 Lotion 3.3 ± 0.9 3.4 ± 1.3 0.088 ± 0.02 6.7 ± 2 Oily solution 2.1 ± 0.6 2.8 ± 1.6 0.067 ± 0.023 4.9 ± 2 Gel 4.7 ± 1 17 ± 4.5 0.15 ± 0.045 21.7 ± 4.9-58 -

Benzophenone-3 (% of applied dose) 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 Vaseline (n=6) Oily solution (n=6) Lotion (n=6) Gel (n=6) * * 0.0 Epiderm + Derm Stratum Corneum (Strips) Liquid receptor Figure 11. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way ANOVA, post hoc; Tukey s test, p< 0.05). - 59 -

3. 랫드에서벤조페논 -3 의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시벤조페논 -3 의혈중체내동태 절식한랫드에벤조페논 -3 를 1 mg/kg 용량으로단회정맥투여한후얻어진벤조페논 -3 의평균혈중농도 - 시간곡선을아래에나타내었다. 정맥투여시벤조페논 -3 의시간에 따른농도추이는 multi-compartmental 특성을나타내었다. 1000 Benzophenone-3 concentration (ng/ml) 100 10 1 0 2 4 6 8 10 12 Time (hr) Figure 12. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4). 혈중농도-시간데이터를 non-compartmental 방법으로분석하여산출한약동학적파라메터의평균을아래에요약하였다. 이중소실반감기 (half life), 전신클리어런스 (Cl), 정상상태에서의분포용적 (Vd ss ) 등의파라메터들은벤조페논-3의정맥주입시초회투여용량및정맥주입속도를결정하는근거데이터로활용하였다. - 60 -

Table 19. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4) Parameters M ean ± S.D. t1/2 (hr) 3.6 ± 1.4 C0 (ng/ml) 577.8 ± 121.7 AUC (ng.hr/ml) 221.4 ± 26.1 Cl (ml/min/kg) 76.1 ± 9.3 Vdss (L/kg) 10.1 ± 2.8 나. 정맥주입시랫드에서벤조페논 -3 의체내동태및조직분포 랫드에서얻고자하는벤조페논-3의정상상태에서의혈장농도를 200 ng/ml로설정하여동시단회정맥주사및 12-hr 등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하였다. 이때얻은혈중농도-시간프로필을아래그림에나타내었다. 단회정맥투여시얻어진벤조페논-3의반감기는약 3.6 hr으로정상상태농도의 90% 에도달시간은약 10.8 hr으로예측되었다. 본실험에서는벤조페논-3가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 방법으로투여하였다. 따라서정맥주입시작 12 hr 이전에벤조페논-3의혈중농도가정상상태에도달한것으로추정되었다. 벤조페논-3 정맥주입후 12 hr에서 C ss = 200 ng/ml 목표군에서의실측농도는 180.5 ± 52.3 ng/ml 이었다. 따라서 12-hr i.v. infusion 시험에서얻어진결과가단회정맥주사시험에서얻어진결과와일관성이있게나타나 in vivo 시험의신뢰성을확인할수있었다. - 61 -

Benzophenone-3 concentration (ng/ml) 300 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 Time (hr) Css : 200 ng/ml Figure 13. Plasma benzophenone-3 concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.99 mg/kg and 0.46 mg/kg/hr, respectively. 정맥등속주입시작후 12 hr 시점에서혈장, 신장, 간, 비장, 폐, 심장, 고환, 위, 소장, 대장, 뇌에서측정된벤조페논-3의농도데이터및혈장-조직분배계수 (K p ) 를아래표에나타내었다. C ss = 200 ng/ml 목표군에서측정된혈장농도대비조직농도분배계수 (K p ) 는대장, 폐, 신장, 소장, 위, 뇌, 심장, 간, 비장, 고환의순으로나타났으며독성장기로추정되는고환으로의분포율은타장기조직에비하여매우낮게나타났다. - 62 -

Table 20. Mean concentrations and plasma-to-tissue partition coefficients (K p) of benzophenone-3 in tissues determined under steady state conditions (n=4) Tissues Concentration (ng/g) K p Plasma 180.5 ± 52.29 - Kidney 620.68 ± 297.7 4 ± 2.87 Liver 269.19 ± 52.14 1.54 ± 0.27 Spleen 155.71 ± 27.63 0.89 ± 0.13 Lung 710 ± 326.77 4.5 ± 2.87 Heart 363.14 ± 132.57 2.11 ± 0.87 Testis 136.74 ± 70.88 0.73 ± 0.16 Stomach 476.16 ± 99.72 2.7 ± 0.44 Small intestine 532.22 ± 296.66 2.92 ± 1.35 Large intestine 1174.44 ± 972.83 6.39 ± 5.77 Brain 352.75 ± 95.81 2.07 ± 0.81 Tissue concentration of benzophenone-3 (ng/g) 2500 Css : 200 ng/g (n=4) Benzophenone-3 concentration (ng/g) 2000 1500 1000 500 0 Plasma Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Brain Figure 14. A verage concentrations of benzophenone-3 in tissues at steady state. - 63 -

14 Plasma to tissue partition coefficient value (Kp) of benzophenone-3 Css : 200 ng/g (n=4) 12 Kp of benzophenone-3 10 8 6 4 2 0 Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Brain Figure 15. Average plasma-to-tissue partition coefficients of benzophenone-3 in tissues calculated at steady state. - 64 -

4. 경피투과에의한벤조페논 -3 의전신노출도평가 절식한랫드에벤조페논 -3 를 40 mg/kg 용량으로단회경피투여한후얻어진벤조페 논 -3 의평균혈중농도 - 시간곡선을아래에나타내었다. 벤조페논 -3 의시간에따른농도 추이는 4-8 시간까지흡수된후일정한속도로소실되는양상을보였다. 100 BP-3 concentration (ng/ml) 10 1 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 16. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) 얻어진벤조페논-3의혈중농도-시간데이터로부터약동학적파라메터를산출하였으며그값을아래표에나타내었다. 경피투과시산출된소실반감기는 21.9 hr으로써정맥투여시소실반감기인 3.6 hr에비하여매우길게나타났으며이는경피투과시흡수속도가소실속도에비하여느림으로써나타난 flip-flop 현상으로사료되며벤조페논-3가전신순환계로서서히흡수됨을의미한다. 24시간까지전신순환계로흡수된벤조페논-3의흡수율은상대생체이용률 (relative bioavailability) 로서 (relative bioavailability = 100. Dose. i.v. AUC transdermal /Dose. transdermal AUC i.v. ) 투여량대비 4.2 ± 0.8% 이었다. 다만자외 - 65 -

선차단제를바르고통상적으로 12 시간이내에세척한다고가정했을때의절대생체이 용률은대략 1-2% 내외 (>1.63% = 6.5. 12/48) 정도로추정해볼수있다. Table 21. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) Parameters M ean ± S.D. t 1/2 (hr) 21.9 ± 10.5 T max (hr) 4.4 ± 3.1 C max (ng/ml) 26.8 ± 4.1 AUC (ng.hr/ml) 373.8 ± 71.8 V z /F (L/kg) 1638.7 ± 386.2 Cl/F (ml/min/kg) 989.5 ± 445 F (%) 4.2 ± 0.8-66 -

5. 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성평가 벤조페논 -3 의위해도평가는독성과노출도를비교하여다음과같이계산되었다. 자외선차단제에서 UV-filter 로사용된 5% 의벤조페논 -3 를고려했을때, 피부흡수양 (5% formulation): 5.8% [ 생체이용률고려 mean (4.2%) + 2 SD (2*0.8%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : NOAEL (terato-rat): 18 g/day 60 kg 200 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 5/100 * 5.8/100) / 60 kg = 0.87 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 200/0.87 = 230 여기서, NOAEL은랫드의생식발생독성자료에서산출된 NOAEL값을근거로하였다 (Table ). 적용량의경우, 전신을도포할경우를가정하여하루 18 g적용을가정하였다. 따라서, 안전역이 230 배정도로확보되어벤조페논-3의허용최대배합한도 5% 에서는안전하다고사료된다. 한편, 표적장기인고환에서조직분포를살펴보면, 다른조직및장기보다벤조페논 -3 의분포 가상당히낮았다. 이는혈액 - 고환장벽 (BTB) 가존재함을알수있다. 따라서, 다른조직장기 보다안전한조직이라고판단된다. - 67 -

Table 22 벤조페논 -3 의독성학적자료 독성종류 동물종투여경로 투여 기간 (day) 투여용량 (mg/kg/day) 독성작용 (NOA EL mg/kg bw/day) 참고문 헌 Repeated dose toxicity Rat (F344/N) Dermal 14 0 200 (in acetone or lotion) 110 : liver/ kidney weight NOAEL M ale/female: 100/140 French, Sub-chroni c toxicity Rat (F344/N) Dermal 90 0-200 (in acetone) 12.5~200 : reticulocyte 200 : whole blood cell, Kidney weight NOAEL M ale/female: 200 2000 Reproductiv Mouse e toxicity (B6C3F1) Dermal 90 0-400 No toxicological effect NOAEL Male, female: 400 Daston et al,. 1993 Terato genecity Rat (Crl : W I(Han) W istar) Gavage 14 0-1000 200 : transient salivation 1000 : rate of foetuses/litter skeletal variations NOAEL M aternal, prenatal: 200 CW FG, 2005 Muta genicity Rat (SD) Gavage Once 5 0-5000 0 and 5000 No mutagenicity (In vitro, bone marrow chromosome aberration) Robinso n et al,. 1994-68 -

6. 벤조페논 -3 의위해도평가서 (Risk profile) 작성 벤조페논 -3 에대한위해도평가서를작성하였다 ( 별첨 1 참조 ). 7. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한호모살레이트의분석법개발 가. In vitro 시료중호모살레이트의정량을위한 HPLC/UVD 분석법확립 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험으로부터얻어진시료중호모살레이트의정량은 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 물질의특성상 peak 의모양은 double peak 로관찰되었으나두 peak 의비율이농도에따라변하지않았기때문에감도가뛰어난 12.5 min의 peak 를정량하였다. 물질의분석에영향을주는간섭 peak 는관찰되지않았다. 검량범위내호모살레이트의크로마토그램을아래에나타내었다. Figure 17. Representative chromatogram of homosalate in receptor phase. 상기한바와같은분석조건에서호모살레이트의검량범위는 0.1 100 μg/ml 이었다. 해당검량선의전형적인계산식은 y = 54.77x + 1.5832 (r 2 = 0.9999) 로우수한직선성을 나타내었다. - 69 -

6000 5000 y = 54.77x + 1.5832 R² = 0.9999 Response (peak area) 4000 3000 2000 1000 0 0 20 40 60 80 100 120 Homosalate concentration (µg/ml) Figure 18. Representative calibration curve for the determination of homosalate. 분석법의검증은 0.1 100 μg/ml 농도에서시행하였으며아래표에서보는바와같 이우수한정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 을나타내었다. Table 23. A ccuracy and precision for the HPLC assay of homosalate (n=3 each) Concentration ( μg/ml) A ccuracy (%) Precision (%) 0.1 92.8 2.2 0.5 93.6 5.9 1 99.0 2.4 5 100.2 0.3 10 101.3 1.0 50 100.1 0.3 100 100.1 0.1-70 -

나. 생체시료중호모살레이트의정량을위한 LC-M S/M S 분석법확립 정량을위한 MRM mass transition 은양자화된이온의감도와 product ion scan의감도를평가하여결정하였으며호모살레이트와내부표준물질옥틸살리실레이트의 MRM mass transition 은각각 263.2 139.0 와 251.2 139.0 에서수행하였다. 호모살레이트와내부표준물질의 product ion mass spectra 를아래그림에나타내었다. m/z 139.0 m/z 139.0 Figure 19. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate. Blank 혈장및표준혈장 (LLOQ 0.5 ng/ml, 1000 ng/ml) 을분석하여얻은크로마토그램을아래그림에나타내었다. 호모살레이트와내부표준물질의 retention time은각각 2.59 및 2.79 분이었으며분석에영향을미치는방해 peak 는공혈장의크로마토그램에서관찰되지않았다. - 71 -

(A) Figure 20. MRM chromatograms of (A) homosalate (HMS) and (B) octyl salicylate (OS) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with HMS (0.5 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (center), and plasma spiked with HMS (1000 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (right). (B) 호모살레이트검량표준시료 (0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 500, and 1000 ng/ml) 를 LC-MS/MS로분석하였을때얻어진검량선의전형적인계산식은 y = 0.0219x + 0.00819 (r 2 = 0.9994) 이었다. 검량선은 0.5-1000 ng/ml의농도범위에서양호한직선성을나타내었다. Figure 21. Representative calibration curve for the determination of homosalate in rat plasma (y= 0.0219x + 0.00819, r 2 = 0.9994). - 72 -

LC-MS/MS 분석시혈장시료를정량한계 (LLOQ, 0.5 ng/ml), low QC (20 ng/ml), medium QC (100 ng/ml) 및 high QC (900 ng/ml) 농도에서상기의검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정밀성 (precision) 은호모살레이트와내부표준물질의피크면적비의표준편차를평균값으로나눈비의백분율 (%) 로서구하였고, 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였다. Inter-day 와 intra-day 의판정기준은정량한계 (LLOQ) 의경우정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120% 인조건을만족하는농도로구하였으며, 나머지 low, medium, high QC의경우정밀성은 15% 이하그리고정확성은 85-115% 범위에위치하는지의여부를판정기준으로하였다. 아래표에혈장중 intra-day 정확성과정밀성, 그리고 inter-day 의정확성과정밀성을나타내었다. Intra-day 와 inter-day 모두판정기준을충족시켰으며이때얻어진정량한계 (LLOQ) 는 0.5 ng/ml이었다. Table 24. Intra-day and inter-day accuracy and precision of homosalate assay Concentration (ng/ml) Intra-day (n=5) Inter-day (n=5) Accuracy (%) Precision (%) Accuracy (%) Precision (%) 0.5 104.0 6.5 102.2 5.4 20 96.5 2.7 100.1 4.7 100 95.1 2.7 100.7 4.8 900 92.8 5.2 96.3 4.5-73 -

8. 기제에따른호모살레이트의 in vitro 투과도평가 가. 호모살레이트를함유하는제제의제조 기제에따른호모살레이트의투과도를확인하기위해서대표적인 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를제조하였다. 각제제에함유된호모살레이트의양은시판되는자외선차단제호모살레이트의배합한도 (10% w/w) 에기준하여제조하였다. In vitro 투과도시험조건에서호모살레이트는기제가적용되는 48시간동안안정한것으로확인되었다. 호모살레이트를함유하는 vaseline base, oily solution, lotion, gel 제제가제조되어피부에적용되기전외관을아래에나타내었다. Vaseline Oily solution Lotion Gel Figure 22. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing homosalate (10 % w/w). 나. 호모살레이트의용해도측정및안정성확보 Franz diffusion cell 을이용한호모살레이트의 in vitro 피부투과도측정시일정한 투과도의유지를위해서는 receptor phase 에서 sink condition 의유지가필수적인조건 이므로그에적합한용해도를확보하는조건의확립이중요하다. 따라서본실험을위하 - 74 -

여확립한 receptor phase가일정량이상의호모살레이트를용해하는지여부를확인하였다. Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에서호모살레이트의용해도를평가하였으며그결과 10 mg/ml 이상의용해도가확보되어호모살레이트의투과도측정을위한 in vitro 시험에서 sink condition 이유지됨을확인하였다. 또한시료채취가이루어지는투과시험기간동안호모살레이트의안정성이유지되는지여부를확인하였다. 호모살레이트를 receptor phase에용해시킨후 (10 μg/ml) 37 에서 48시간농도변화를측정한결과유의적인변화가없어그안정성이확인되었다. 경시변화에따른호모살레이트의농도변화추이를아래에나타내었다. S ta bility (%) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 23. Stability of homosalate in the receptor phase kept at 37 (n=4) 다. 기제에따른피부투과도 호모살레이트를함유하는 4 종의제제에대한호모살레이트의피부투과도를 Franz diffusion cell 방법으로 48 시간에걸쳐서측정한결과모든제제에서 receptor phase 에서 의호모살레이트의농도가 HPLC 분석감도 (0.1 μg/ml) 이하로검출되었다. 투과시험종 - 75 -

료시점인 48시간에서각질층과각질을제외한피부에잔존하는호모살레이트의양을정량한결과 lotion 의경우에각각 2.06% 및 1.77%, oily solution 의경우에각각 1.54% 및 1.47%, vaseline 의경우에 2.36% 및 2.14% 가잔존하였다. 이에비해서 gel의경우에는각각투여량의 14.73% 및 6.88% 의호모살레이트가잔존하여타 3종의제제에비하여 gel 제제적용군에서유의적으로높게나타났다. Gel 기제적용시피부에잔존하는총량은투여량의 21.6% 로 4종의제제중가장높았다. 그결과 in vivo 경피투여시험에서호모살레이트의전신노출도를측정하는대상제제로 gel 제형을선정하였다. Homosalate (% of applied dose) 20.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 Vaseline (n=6) Oily solution (n=6) Lotion (n=6) Gel (n=6) * * Epiderm + Derm Stratum Corneum (Strips) Liquid receptor Figure 24. Penetration of homosalate into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way A NOVA, post hoc; Tukey s test, p< 0.05). - 76 -

9. 랫드에서호모살레이트의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시호모살레이트의혈중체내동태 절식한랫드에호모살레이트를 1, 3, 9 mg/kg 용량으로단회정맥투여한후얻어진 호모살레이트의평균혈중농도 - 시간곡선을아래에나타내었다. 정맥투여시호모살레 이트의시간에따른농도추이는 multi-compartmental 특성을나타내었다. 10000 1000 Concentration (ng/ml) 100 10 1 0.1 0 6 12 18 24 30 36 Time (hr) Figure 25. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after i.v. injection at doses of 1,3, and 9 mg/kg (n=6, each). 혈중농도-시간데이터를 non-compartmental 방법으로분석하여산출한약동학적파라메터의평균을아래표에요약하였다. 호모살레이트를 1, 3, 9 mg/kg 용량으로정맥주사한후얻어진소실반감기 (t 1/2 ), 정상상태에서의분포용적 (Vd ss ), 전신클리어런스 (Cl), 곡선하면적 (AUC) 은각투여군간에유의적인차이를보이지않았다. 즉, 호모살레이트는정맥주사용량 1-9 mg/kg 범위에서체내동태가 1차속도론을따르는선형체내동태를나타내었다. 산출된수치들은정맥주입시호모살레이트의초회투여용량및 - 77 -

정맥주입속도를결정하는근거데이터로활용하였다. Table 25. Pharmacokinetic parameters of homosalate after i.v. injection of homosalate at doses 1, 3, and 9 mg/kg in rats Dose (mg/kg) t 1/2 (hr) AUC (ng.hr/ml) Vd ss (L/kg) Cl (ml/min/kg) 1 8.2 ± 4.2 371.5 ± 193.2 6.6 ± 5.2 53.1 ± 20.1 3 7.7 ± 1.4 774.9 ± 86.6 7.8 ± 1.4 65.2 ± 7.3 9 8.7 ± 4.0 3076.1 ± 302.4 5.0 ± 0.4 49.2 ± 5.0 나. 정맥주입시호모살레이트의혈중체내동태및조직분포 랫드에서얻고자하는호모살레이트의정상상태에서의혈장농도를 100 및 200 ng/ml로설정하여동시단회정맥주사및 24-hr 등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하였다. 이때얻은혈중농도-시간프로필을아래그림에나타내었다. 단회정맥투여시얻어진호모살레이트의반감기는약 8 hr으로정상상태농도의 90% 에도달시간은약 24 hr으로예측되었다. 본실험에서는호모살레이트가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 방법으로투여하였다. 따라서정맥주입시작 24 hr 이전에호모살레이트의혈중농도가정상상태에도달한것으로추정되었다. 호모살레이트정맥주입후 24 hr에서 C ss = 100 ng/ml 목표군에서의실측농도는 107.2 ± 7.2 ng/ml이었고 C ss = 200 ng/ml 목표군에서의실측농도는 209.3 ± 22.1 ng/ml 이었다. 따라서 24-hr i.v. infusion 시험에서얻어진결과가단회정맥주사시험에서얻어진결과와일관성이있게나타나 in vivo 시험의신뢰성을확인할수있었다. - 78 -

Homosalate concentration (ng/ml) 300 250 200 150 100 50 0 Css : 100 ng/ml Css : 200 ng/ml 0 4 8 12 16 20 24 Time (hr) Figure 26. Plasma homosalate concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.65 mg/kg and 0.34 mg/kg/hr, respectively, for the low target plasma concentration (100 ng/ml, lower profile) and 1.3 mg/kg and 0.67 mg/kg/hr, respectively, for the high target plasma concentration (200 ng/ml, upper profile). 정맥등속주입시작후 24 hr 시점에서혈장, 신장, 간, 비장, 폐, 심장, 고환, 위, 소장, 대장, 뇌에서측정된호모살레이트의농도데이터및혈장-조직분배계수 (K p ) 를아래표에나타내었다. C ss = 200 ng/ml 목표군에서측정된호모살레이트의농도는혈장, 신장, 비장, 폐, 심장, 위, 대장, 뇌에서 C ss = 100 ng/ml 군에비해높게나타났다. 간, 고환, 소장에서의차이는유의적이지않았다. 혈장농도대비조직농도분배계수 (K p ) 는모든조직에서투여용량에무관하여용량간에유의적인차이를나타내지않았다. 호모살레이트의 K p 값은소장, 대장, 위, 뇌의순으로높게나타났으며독성장기로추정되는고환에서는타장기조직에비하여매우낮았다. - 79 -

Table 26. Mean concentrations of homosalate in tissues determined under steady state conditions Tissues Target Css : 100 ng/g (n=6) Target Css : 200 ng/g (n=7) Plasma 107.2 ± 7.2 209.3 ± 22.1 Kidney 206.0 ± 51.3 510.2 ± 195.1 Liver 99.8 ± 15.3 206.0 ± 121.5 Spleen 116.8 ± 35.2 351.0 ± 158.0 Lung 153.6 ± 54.4 331.6 ± 144.0 Heart 220.2 ± 100.0 615.9 ± 166.1 Testis 33.27 ± 11.8 42.2 ± 18.3 Stomach 311.1 ± 84.4 758.4 ± 307.7 Small intestine 880.9 ± 471.6 1232.0 ± 562.4 Large intestine 505.6 ± 236.5 1288.2 ± 402.3 Brain 301.3 ± 91.2 638.2 ± 108.9 t-test (p<0.05, 100 ng/ml vs 200 ng/ml) Table 27. Mean plasma-to-tissue partition coefficients (K p ) of homosalate calculated under steady state conditions Tissues Target Css : 100 ng/g (n=6) Target Css : 200 ng/g (n=7) Kidney 1.9 ± 0.4 2.4 ± 0.8 Liver 0.9 ± 0.1 1.0 ± 0.5 Spleen 1.1 ± 0.3 1.7 ± 0.8 Lung 1.4 ± 0.5 1.6 ± 0.6 Heart 2.0 ± 0.9 2.9 ± 0.7 Testis 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.1 Stomach 2.9 ± 0.7 3.6 ± 1.4 Small intestine 8.3 ± 4.3 5.8 ± 2.2 Large intestine 4.8 ± 2.3 6.2 ± 1.8 Brain 2.8 ± 0.7 3.1 ± 0.4-80 -

2000 1800 1600 Tissue concentration of homosalate (ng/g) Css : 100 ng/g (n=6) Css : 200 ng/g (n=7) * Homosalate concentration (ng/g) 1400 1200 1000 800 600 * * * * * * 400 200 * 0 Plasma Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Figure 27. Average concentrations of homosalate in tissues at steady state. *t-test (p< 0.05, 100 vs 200 ng/ml target concentrations) Brain Plasma to tissue partition coefficient value (Kp) of homosalate 14 Css : 100 ng/g (n=6) Css : 200 ng/g (n=7) 12 10 Kp of homosalate 8 6 4 2 0 Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Figure 28. Average plasma-to-tissue partition coefficients of homosalate in tissues calculated at steady state Brain - 81 -

10. 경피투여시호모살레이트의전신노출도평가 호모살레이트의 in vivo 경피투여시험은 in vitro 피부투과도시험에서가장높은투과도를나타냈던 gel formulation 에대하여수행하였다. 호모살레이트를함유한 gel formulation 을랫드에경피투여 ( 호모살레이트적용량 20 mg) 한후얻어진평균혈장농도-시간곡선을아래그림에나타내었다. 30 Homosalate concentration (ng/ml) 25 20 15 10 5 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) Figure 29. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after percutaneous administration of gel containing homosalate (dose 80 mg/kg, n=5). Gel 제형을경피투여한후경시변화에따른호모살레이트의농도추이는 96시간이상일정한농도가유지되었다. 이는지용성물질인호모살레이트가피부층에오랜시간잔존하면서서서히흡수되어나타난현상으로사료되며 in vitro 피부투과도시험결과와일치하는양상을보였다. 24시간까지전신순환계로흡수된호모살레이트의흡수율은상대생체이용률 (relative bioavailability) 로서 (relative bioavailability = 100. Dose. i.v. AUC transdermal /Dose. transdermal AUC i.v. ) 투여량대비 1.4 ± 0.5% 이었다. 따라서전신순환계로흡수되는호모살레이트의양은 1.4% 이상일것으로추정된다. 다만자외선 - 82 -

차단제를바르고통상적으로 12 시간이내에세척한다고가정했을때의절대생체이용률 은대략 1% 내외 (>0.67% = 6.26. 12/96) 정도로추정해볼수있다. 11. 호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성평가 호모살레이트의위해도평가는독성과노출도를비교하여다음과같이계산되었다. 자외선차단제에서 UV-filter 로사용된 10% 의호모살레이트를고려했을때, 피부흡수양 (5% formulation): 2.4% [ 생체이용률고려 mean (1.4%) + 2 SD (2*0.5%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : 18 g/day 60 kg NOAEL (2 주반복투여독성 - 랫드 ): 100 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 10/100 * 2.4/100) / 60 kg = 0.72 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 100/0.72 = 139 여기서, NOAEL은랫드의 2주반복투여독성시험자료에서산출된 NOAEL값을근거로하였다. 적용량의경우, 전신을도포할경우를가정하여하루 18 g적용을가정하였다. 산출된안전역은 139배확보되어호모살레이트의허용최대배합한도 10% 에서는안전하다고사료된다. 한편, 표적장기인고환에서조직분포를살펴보면, 다른조직및장기보다벤조페논-3의분포가상당히낮았다. 이는혈액-고환장벽 (BTB) 가존재함을알수있다. 따라서, 다른조직장기보다안전한조직이라고판단된다. - 83 -

12. 호모살레이트의위해도평가서 (Risk profile) 작성 호모살레이트에대한위해도평가서를작성하였다 ( 별첨 2 참조 ). 13. 국제워크숍을통한선진위해평가기술습득및정보교류미국 CIR의 Director 인 Ms. Lillian Gill을초청하여 2012 년화장품위해평가국제워크숍을성공리에개최하여선진위해평가기술을습득하며정보교류를하였다. ( 별첨 3 참조 ). - 84 -

제 4 장총괄연구개발과제의연구성과 1 총괄활용성과 총괄과제명자외선차단성분의리스트프로파일링연구총괄과제책임자김규봉 / 단국대학교약학대학 / 독성학가. 정책활용 벤조페논-3 및호모살레이트를비롯한자외선차단제의위해성평가기술향상을통하여자외선차단제의위해관리기반마련 - 위해요소에대한자체교육자료로활용하여위해성평가자들의기술적자질향상을통하여위해성평가및위해관리에보다능동적이고과학적인대응이가능함 자외선차단제의안전한배합한도를위한정책적기초근거자료로활용 국가가국민의건강을위하여자외선차단제의위해성평가와이를토대로한위해관리에많은노력을하고있음을홍보하여국민의위해성소통 (risk communication) 을위한자료로활용가능나. 언론홍보및대국민교육 국가가국민의건강을위하여자외선차단제의위해성평가와이를토대로한위해관리에많은노력을하고있음을홍보하여국민의위해성소통 (risk communication) 을위한자료로활용가능다. 연구논문 번호논문제목저자명저널명게재연월권 ( 호 ) 페이지국내 / 국외 * SCI 여부 ** * 국내발간학술지인경우 국내, 국외발간학술지인경우 국외 로표기 ** SCI, SCIE, 비 SCI 로구분하여표기 - 85 -

라. 학술발표 번호발표제목발표형태발표자학회명 1 Pharmacokinetics and Permeation Skin of Homosalate in Rats 국내 / 국제 포스터유선동대한약학회국내 마. 지식재산권 번호출원 / 등록 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국 출원 ( 등록 ) 번호 ( 출원 ( 등록 ) 연월일 ) IPC 분류 2 총괄활용계획 벤조페논 -3 및호모살레이트를비롯한자외선차단제의위해성평가기술향상을통하여자외 선차단제의위해관리기반마련 자외선차단제의안전한배합한도를위한정책적기초근거자료로활용 국가가국민의건강을위하여자외선차단제의위해성평가와이를토대로한위해관리에 많은노력을하고있음을홍보하여국민의위해성소통 (risk communication) 을위한자료로 활용가능 - 86 -

제 5 장총괄주요연구변경사항 용역연구개발과제계획서 와 용역연구개발과제연차실적 계획서 비교하여변경된내용을명시 - 87 -

제 6 장총괄참고문헌 Chatelain et al., Skin penetration and sun protection factor of five UV filters: effect of the vehicle. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 16:28-35 (2003) Ma, R., Cotton, B., Lichtensteiger, W., Schlumpf, M., UV Filters with antagonistic action at androgen receptors in the MDA-kb2 cell transcriptional-activation assay. Toxicol. Sci. 74,43?50. (2003) Mestres et al., Benzophenone-3 entrapped in solid lipid microspheres: formulation and in vitro evaluation. I nt J Pharm 400:1-7 (2010) O Connor, J. C., Cook, J. C., Craven, S. C., Van Pelt, C. S., and Obourn, J. D. An in vivo battery for identifying endocrine modulators that are estrogenic or dopamine regulators. Fundam. Appl. Toxicol. 3, 182-195. (1996) Reel, J. R., Lamb, J. C., and Neal, B. H. Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34, 288-305. (1996) Schlumpf M, Schmid P, Durrer S, Conscience M, Maerkel K, Henseler M, Gruetter M, Herzog I, Reolon S, Ceccatelli R, Faass O, Stutz E, Jarry H, Wuttke W, Lichtensteiger W. Endocrine activity and developmental toxicity of cosmetic UV filters-an update. Toxicology. 205(1-2):113-22. (2004) Schlumpf, M., Cotton, B., Conscience, M., Haller, V., Steinmann, B., Lichtensteiger, W., In vitro and in vivo estrogenicity of UV screens. Environ. Health Perspect. 109, 239-244. (2001) Vilela et al., Effect of ultraviolet filters on skin superoxide dismutase activity in hairless mice after a single dose of ultraviolet radiation. Eur J Pharm Biopharm 80:387-92 (2012) - 88 -

제 7 장총괄첨부서류 [ 별첨 1] 벤조페논-3 위해도평가서 [ 별첨 2] 호모살레이트위해도평가서 [ 별첨 3] 국제워크숍을통한선진위해평가기술습득및정보교류 [ 별첨 4] 초청연자약력 [ 별첨 5] 학술대회발표승인공문 본첨부서류는최종보고서서식제일뒷편에첨부함 본연구개발과제의성과로기술된게재된학술지논문사본 ( 게재허가를받은경우게재증명서 ) 과지식재산권또는출원서사본을반드시첨부해야함 - 89 -

간지 편집순서 7 : 세부연구과제의연구결과 제 1 세부연구개발과제연구결과 세부연구개발과제명 : 벤조페논 -3 에대한위해평가연구 세부과제책임자 : 김규봉 / 단국대학교 / 독성학 - 90 -

Ⅲ. 제 1 세부연구개발과제연구결과 제 1 세부연구개발과제요약문 과제번호 12172 화의안 451 주관과제명세부과제명세부연구책임자 자외선차단성분의리스크프로파일링연구 벤조페논-3에대한위해평가연구 성 명 김규봉 생년월일 소속기관명 단국대학교약학대학 전자우편 전화번호 041-550-1443 연구목표 (400~600 자 ) 화학적자외선차단제인벤조페논-3에대한위해성평가가최종목표이다. 이를위한세부적목표로는 1) 동물실험을이용한벤조페논-3의피부로의노출도평가, 2) 필요한경우지속적노출시벤조페논-3의체내동태확인, 3) 알려진 toxicity criteria 와노출용량및노출도간의상호분석을통한위해도결정, 4) 배합한도 5% 의타당성검토이다. 또한, 국제적인위해평가네트워크형성을통한선진위해평가기술의습득이연구목표이다. 연구내용 (1000~1200 자 ) 벤조페논-3에대한위해평가 ( 피부투과도측정및약물동태의확인 ) 를위하여, 1) LC-MS/MS를이용한기제와생체시료에포함된벤조페논-3의미량분석법확립, 2) 기제에따른벤조페논-3의피부투과도평가, 3) 벤조페논-3 정맥투여시조직분포및체내동태확인, 4) 벤조페논-3 경피투과에의한전신노출도평가, 5) 경피투과에의한전신노출도와이를통한위해도평가, 6) 배합한도의타당성검토가주요한연구내용이다. 또한, 국제심포지움을통한선진위해평가기술습득및국제적위해평가정보교류가연구내용이다. - 91 -

연구성과 ( 응용분야및활용범위포함 ) (400~600 자 ) 벤조페논-3의동물에서피부를통한전신노출도평가결과, 상대생체이용률이 6.5% 정도였다. 정맥으로주입후주요장기에서벤조페논-3의분포를보면신장, 대장, 폐에많이분포하였고, 표적장기로여겨지는고환에서가장낮은분포를보였다. 안전역이 134 정도로확보되어벤조페논-3의허용최대배합한도 5% 에서는안전하다고사료된다. 한편, 표적장기인고환에서조직분포를살펴보면, 다른조직및장기보다벤조페논-3의분포가상당히낮았다. 이는혈액-고환장벽 (BTB) 가존재함을알수있다. 따라서, 다른조직장기보다안전한조직이라고판단된다. 연결과를바탕으로자외선차단성분중배합한도성분의위해평가를통해정책결정기초자료제공할수있다. 화장품원료에대한네거티브시스템의과학적근거마련의근거를제공한다. 위해요소에대한자체교육자료로활용하여위해성평가자들의기술적자질향상을통하여위해성평가및위해관리에보다능동적이고과학적인대응이가능하며, 국가가국민의건강을위하여자외선차단제의위해성평가와이를토대로한위해관리에많은노력을하고있음을홍보하여국민의위해성소통 (risk communication) 을위한자료로활용가능하다 세부참여연구원성명소속기관성명소속기관 김지원 인제대학교 조해란 인제대학교 류성하 단국대학교 남덕원 인제대학교 Keywords (5 개내외 ) 한글벤조페논-3 위해평가자외선차단제경피투과화장품원료영문 Benzophenone Risk Cosmetic Sunscreen Transdermal -3 assessment ingredient 연구목표, 연구내용, 연구성과를서술형으로기재함 연구성과는그간의연구결과및기대성과를서술함 - 92 -

제 2 장세부연구개발과제의연구목적 1. 세부연구개발과제의목적 가. 연구배경 자외선차단제는기능성화장품의일종으로그구성성분은화장품원료규격에수재되 어있으며사용시허용함량은식품의약품안전청장고시로관리되어오고있다. 각성 분의허용함량을아래표에나타내었다. Table 1-1. 자외선차단제의국내고시성분및허용함량 (K FDA, 2009) 성분명 허용함량 글리세릴파바 0.5%~3% 드로메트리졸 0.5%~7% 디갈로일트리올리에이트 0.5%~5% 4-메칠벤질리덴캠퍼 0.5%~5% 멘틸안트라닐레이트 0.5%~5% 벤조페논-3 0.5%~5% 벤조페논-4 0.5%~5% 벤조페논-8 0.5%~3% 부틸메톡시디벤조일메탄 0.5%~5% 시녹세이트 0.5%~5% 에칠헥실트리아존 0.5%~5% 옥토크릴렌 0.5%~10% 에칠헥실디메칠파바 0.5%~8% 에칠헥실메톡시신나메이트 0.5%~7.5% 에칠헥실살리실레이트 0.5%~5% 파라아미노벤조익액시드 0.5%~5% 페닐벤즈이미다졸설포닉액시드 0.5%~4% 호모살레이트 0.5%~10% 징크옥사이드 25% 티타늄디옥사이드 25% 이소아밀 p-메톡시신나메이트 10% 비스-에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진 10% 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트 산으로써 10% 드로메트리졸트리실록산 15% 디에칠헥실부타미도트리아존 10% 폴리실리콘 -15 ( 디메치코디에칠벤잘말로네이트 ) 10% 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀 10% 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드및그염류 산으로써 10% 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트 10% - 93 -

본과제의연구대상물질인 benzophenone-3 는 295-315 nm 의자외선을주로흡수 하는 UVB 자외선흡수제에속하며, 상당수의자외선차단제품에서다른자외선차단 제와병용혹은단독으로사용되고있다. 현재국내에서판매되고있는자외선차단제 중일부한방제제와물리적자외선차단제를제외한대다수의제품은 homosalate, benzophenone-3, 3-octyl-methoxycinnamate, 4-methylbenzylidene camphor 등의화학적자외선차단제를포함한다. 이러한화학적자외선차단성분에대하여내분비계교란작용중하나인 estrogenic activity 및 antiandrogenic activity 를판단하기위하여수행된연구결과, benzophenone-3 는 MCF-7 cell line과 MDA-kb2-cell line에서유의적인 estrogenic 및 antiandrogenic activity 를나타내었다 (Schlumpf, 2004; Ma, 2003). 각각 의 cell line에서 benzophenone-3 의 EC 50 은 MCF-7 cell line에서 3.73 μm, MDA-kb2-cell line에서 4.98 μm로나타났으며함께평가된다양한내분비계교란자외선차단성분중높은활성을나타내었다. 또한화학적자외선차단성분들에대한 in vitro 실험결과 estrogen-regulated protein 인 ps2 protein 의농도가 4-methylbenzylidene camphor, homosalate, benzophenone-3 군에서유의적으로증가하였다 (Schlumpf et al., 2001). Table 1-2. In vitro estrogenic and androgenic activities of various UV filtering agents 에스트로겐이자궁비대의주요원인임에기인하여 (O' Connor et al., 1996; Reel et al., 1996), benzophenone-3 및다수의화학적자외선차단성분을랫드에반복경구투여후자궁비대반응시험 (Uterotrophic assay) 을수행한결과, benzophenone-3 투여군에서자궁비대효과는대조군과비교하여유의적인차이가나타났다 (Schlumpf et al., 2001). - 94 -

또한 benzophenone-3 의체내축적의가능성을배제할수없고특히장기간적용하는 자외선차단제의사용특성상내분비계장애작용을나타내는벤조페논 -3 의노출도평가 를통한위해성평가는매우중요한의미를갖는다. Figure 1-1. Effect of UV screens 4-MBC (10 μm), HMS (50 μm), BP-3 (10 μm), OMC (10 μm), OD-PABA (10 μm), B-MDM (10 μm), and E 2 (10 pm) on ps2 protein secretion by MCF-7 cells. Bars indicate mean ps2 protein concentration in culture medium (pg/ml) ± SEM; numbers inside the bars indicate the number of independent experiments). * p < 0.05, ** p < 0.001 (ANOVA followed by Bonferroni pairwise comparisons) as compared to controls that received chemical-free medium. 나. 연구목적 본연구는현재자외선차단제성분으로널리사용되면서내분비계교란의심물질인벤조페논-3에대한위해성평가를목적으로수행되었다. 이를위하여설정한세부연구개발목표는 (1) LC-MS/MS를이용한기제와생체시료에포함된벤조페논-3의미량분석법확립, (2) Franz diffusion cell을사용한기제에따른벤조페논-3의 in vitro 피부투과도평가, (3) 벤조페논-3 정맥투여시조직분포및체내동태확인, (4) 벤조페논-3 경 - 95 -

피투과에의한전신노출도평가였다. 이상의세부연구를통하여얻어진결과를바탕으로투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계를규명하며, 이에근거하여벤조페논-3의위해도를평가하고배합한도의타당성을검토하는것을과제의최종목적으로세부연구를진행하였다. 다. 연구범위 (1) 세부연구개발의추진체계 (2) 기제와생체시료에포함된벤조페논-3의미량분석법확립현재생체시료, 화장품이나환경중에존재하는벤조페논-3의분석에대하여다양한보고가되어있다. 하지만본연구의대상개체인랫드의생체시료중벤조페논-3의분석에대한보고는전무한실정이다. 따라서본연구에서는랫드의생체시료중벤조페논 -3의농도를측정하는데적합한고감도의신뢰성있는 LC-MS/MS 분석법을개발하였다. - 96 -

(3) 기제에따른벤조페논-3의 in vitro 피부투과도평가벤조페논-3의 in vivo 피부투과시험에사용할기제를선정하기위해서 Franz diffusion cell 방법으로 in vitro 피부투과도를평가하였다. 벤조페논-3를포함하는기제로 vaseline base, oily solution, lotion, gel 등보편적으로피부적용에사용되는동시에서로다른특성을대표하는 4종의 formulations 를제조하여사용하였다. In vitro 피부투과시험에는 male Sprague-Dawley 계흰쥐의등피를적출하여사용하였으며평형상태에서벤조페논-3의투과속도, 투과계수, 그리고시험종료시점에서피부에잔존하는벤조페논-3의양을정량하여각기제에대한투과도를평가하였다. (4) 벤조페논-3 정맥투여시조직분포및체내동태확인벤조페논-3의체내동태를규명하기위해서랫드에벤조페논-3를정맥투여한후일정시간간격으로채혈하였다. 채혈한혈액을전처리하여 LC-MS/MS 분석법으로혈중벤조페논-3의농도를정량하였고얻어진농도-시간데이터로부터혈중벤조페논-3의약동학적특성을평가하였다. 정맥주사실험에서얻은벤조페논-3의체내동태파라미터를활용해서목표하는혈장농도를얻는데필요한초회용량 ( 정맥주사용량 ) 과유지용량 ( 등속주입속도 ) 을산출하였다. 산출된투여속도로벤조페논-3를등속정맥주입한후정상상태 (steady-state) 에서조직분포특성을확인하였다. 랫드의경정맥과대퇴정맥에각각 polyethylene tube를삽관하였으며대퇴정맥을통하여 12시간동안벤조페논-3를주입하였다. 혈중벤조페논-3 가정상상태에도달했을때랫드를 sacrifice 한후각장기를취하여전처리하고 LC-MS/MS 방법으로시료중벤조페논-3의농도를측정하여조직분포를확인하였다. (5) 경피투여시벤조페논-3의전신노출도평가경피투여시벤조페논-3의전신노출도를 in vivo에서평가하였다. 시험에사용된제형은 in vitro 투과도평가시험에서투과도가가장높게나타난기제를선정하였으며 5% 함량으로제조하여랫드의 scapular 부위에적용하였다. 이후일정시간간격으로경정맥을통하여채혈하였고채혈한혈액은전처리후 LC-MS/MS 방법으로분석하였다. (6) 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성검토 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성을검토하기위하여벤조페논 -3 의체 - 97 -

내동태특성, 조직분포도, 피부투과도및전신노출도자료로부터투여용량 - 혈중농도 - 조 직농도간의상관관계를규명하였다. 얻어진자료와벤조페논 -3 의 toxicity criteria 로부터 위해도및최대배합한도의타당성을검토하였다. 2. 세부연구개발과제의목표달성도 연구개발목표달성도 (%) 생체시료중벤조페논 -3 의정량을위한고감도 LC-MS/MS 분석법확립 100 Franz diffusion cell 을사용한기제에따른벤조페논-3의 in vitro 피부투과도평가정맥투여시벤조페논-3의조직분포특성과체내동태확인및투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계규명 100 100 경피투여시벤조페논 -3 의전신노출도평가 100 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성평가 100-98 -

제 3 장세부연구개발과제의내용및방법 1. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한벤조페논 -3 의분석법개발 가. In vitro 시료중벤조페논 -3 의정량을위한 HPLC/UVD 분석법 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험에서얻은시료중벤조페논 -3 의농도를정량하기위해서 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 확립된분석 법의검량범위는 0.05 50 μg/ml 이었으며분석조건을아래표에나타내었다. Table 1-3. HPLC analysis of benzophenone-3 Chemical and reagents Benzophenone-3 : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetonitrile, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments HPLC system Integrator Analytical Column Waters 2690 HPLC system with Waters 2487 Dual λ absorbance detector (Waters, Milford, MA, USA) Scientist (Micromath, Saint Louis, MO, USA) Luna C 18 column (250 x 4.60 mm i.d., 5 µm, Phenomenex, Torrence, CA, USA) Chromatographic conditions Mobile phase Acetonitrile : 0.1% acetic acid = 70 : 30 Calibration range 0.05 50 μg/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 1.2 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume Absorbance λ 20 μl 290 nm 벤조페논 -3 를메탄올에용해시켜서 1 mg/ml 농도의표준원액을제조하고이동상으로 희석하여벤조페논 -3 의농도가각각 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 μg/ml 가되도록검량표 준시료를제조하여사용하였다. 분석결과산출된벤조페논 -3 의피크면적을가지고 - 99 -

weighted regression (1/x) 을적용하여작성하였다. 분석법의검증은 0.05-50 μg/ml 농도에서정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 으로표현하였다. 정확성은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성은각농도값의변동계수 (CV) 를이용하였다. 나. LC-M S/M S 를이용한생체시료내벤조페논-3의분석법개발 In vivo 노출도평가를위하여혈장및조직중벤조페논-3의농도를정량할수있는고감도의 LC-MS/MS 분석법을개발하였다. 분석에는혈장또는분쇄된조직시료를사용하였으며혈장의경우 ethyl acetate 를이용한추출법, 조직시료의경우 acetonitrile 을이용한단백질침전법으로전처리하였다. 검량선의작성은 blank sample 100 μl가담긴차광처리된 Eppendorf tube에 acetonitrile 로용해한벤조페논-3 표준용액을가하여혈장농도가 1, 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ng/ml 그리고분쇄된조직농도가 10, 20, 50, 10, 100, 500, 1000 ng/ml이되도록검량표준시료를제조하였다. 여기에 actonitrile 에용해한노니바마이드내부표준용액 ( 혈장분석용표준용액농도 = 100 ng/ml, 조직분석용표준용액농도 = 1000 ng/ml) 을가하였다. 혈장시료의경우그후추출용매로써 ethyl acetate 를 3 ml 가한후 1분간의 vortexing, N 2 dry 과정을거친후시료와동일부피의이동상을가하여용해하였다. 조직시료의경우침전용매로서 acetonitrile 을가하여총부피가원래시료량의 5배가되도록하였다. 이혼액을 1분간 vortexing 하고 10분간 4000 g에서원심분리한후상층액을분리한후그와동량의 acetonitrile 을가하여전처리과정을반복한후동량의 distilled water를가하여그혼액을 LC에주입하였다. 검량선은내부표준물질의피크면적에대한벤조페논-3의피크면적비를사용하여가중치 1/x를적용한 weighted linear regression 방법으로작성하였다. 동물실험에서얻어진시료는분석전까지 20 에서보관하였다. 분석직전시료를상온에방치하여녹인후처리하였으며전처리과정은상기한표준시료에대한전처리과정과동일하다. 시료에포함된벤조페논-3의농도계산은얻어진크로마토그램으로부터내부표준물질의피크면적에대한벤조페논-3의피크면적비를구하여검량선으로부터산출하였다. 분석법의검증은정량한계 (LLOQ: 1 ng/ml), 저농도QC (20 ng/ml), 중농도 (100 ng/ml) 그리고고농도 (900 ng/ml) QC시료를상기한검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성 (precision) 은각농도값의변동계수 - 100 -

(CV) 를이용하였다. 자세한분석조건은아래표에나타내었다. Table 1-4. LC-M S/M S analysis of benzophenone-3 in rat plasma Chemical and reagents Benzophenone-3 : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Formic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Methanol, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments LC-MS/MS system Integrator Analytical Column API 2000 coupled with Waters 2690 HPLC system (AB MDS Sciex, Toronto Canada) Analyst 1.4 (AB MDS Sciex, Toronto, Canada) Gemini C 18 column (50 x 2.10 mm i.d., 2.6 µm) Chromatographic conditions Mobile phase (plasma) Methanol : 0.05% formic acid = 85 : 15 Mobile phase (tissue homogenates) Acetonitrile : 0.05% formic acid = 80 : 20 Calibration range (plasma) 1-1000 ng/ml (r 2 > 0.999) Calibration range (tissue homogenates) 5 1000 ng/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 0.3 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume 10 μl M S/M S conditions Ion mode Mass transition ESI (positive), multi reaction monitoring 229.0 150.9 (benzophenone-3), 294.3 137.2 (nonivamide, Internal standard) Turbo gas temperature 370 C Sample preparation Plasma Tissue homogenates Liquid-liquid extraction with ethylacetate (3 ml) Two step protein precipitation with acetonitrile - 101 -

2. 기제에따른벤조페논 -3 의 in vitro 투과도평가 가. 벤조페논 -3 를함유하는제제의제조 기제에따른벤조페논-3 의투과도를확인하기위하여대표성을나타내는 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를문헌을참고하여제조하였다 (Chatelain et al., 2003, Mestres et al., 2010, Vilela et al., 2012). 각제제중벤조페논-3 의함량은시판자외선차단제중벤조페논-3 의배합한도 (5% w/w) 에기준하여제조하였으며각기제의구성은아래에나타내었다. Table 1-5. Composition of different formulations containing benzophenone-3 Vaseline Oily solution Lotion Gel Benzophenone-3 (5%) Benzophenone-3 (5%) Benzophenone-3 (5%) Benzophenone-3 (5%) Vaseline (95%) Miglyol (18.7%) Miglyol (18.7%) Miglyol (18.7%) - Mineral oil (72.3%) Neutrogena (75.8%) Carbomer 940 (1.1%) - Bees wax (4.0%) Surfactant (0.5%) Poloxamer 188 (2.0%) - - - - - - - - - - - - - - - EDTA Na (1.0%) Methyl paraben (1.0%) NaOH (10.0%) Surfactant (0.5%) DW (64.3%) 나. 벤조페논 -3 의용해도측정 Franz diffusion cell 을이용한벤조페논 -3 의피부투과도평가는 sink condition 이전제 되어야하므로 receptor phase 에서시험물질의용해도가중요한인자가된다. 본연구에 - 102 -

서는 sink condition 의확보를위해서 5% (v/v) Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에대한벤조페논-3의용해도를평가하였다. 아울러투과도시험에서 receptor phase 중벤조페논-3의안정성을확보하기위해서투과시험기간에서벤조페논-3의농도변화추이를확인하였다. 다. 피부투과시험방법 랫드피부의적출 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 의피부를적출하여시험에사용하였다. 랫드는 diethyl ether 로치사시켰으며등부위의털은전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모했다. 대략 5 5 cm면적으로피부를등부위에서적출한후피부가상하지않도록조심스럽게피하지방을제거하였다. 얻어진랫드피부는실험에사용할때까지 -20 에서유리판에잘펴서보관하였고보관기간은일주일을넘지않도록하였다. 기제에따른벤조페논-3의피부투과도측정벤조페논-3 를함유하는 4종의제제에대한벤조페논-3 의피부투과도를 Franz diffusion cell 방법으로측정하였다. Receptor phase로는 5%(v/v) Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액 (0.02 M) 을사용하였으며 600 rpm으로일정하게교반하면서항온순환펌프를 이용하여 37 ± 0.5 로온도를유지하였다. Receptor phase 와접촉하는피부의면적은약 1.766 cm2이었고 receptor phase의용량은 10 ml이었다. 보관한랫드피부를시험직전에상온에서서서히해동시키고 37 의 receptor phase 에약 1시간동안적신후 donor compartment 와 receptor compartment 사이에끼우고피부의표면은실온에노출시켰다. 그리고 donor compartment 를떼어낸후노출된피부의표면에각제제 200 mg을적용하고 donor compartment 를덮어고정시켰다. 제제적용후 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 시간에각각 0.2 ml의 receptor phase 를채취하고즉시동량의인산염완충액을보충하였다. 최종시료를채취한직후피부를 Franz diffusion cell 로부터분리하여 tape stripping method 로각질과진피층으로분리하여이부위에함유된벤조페논-3 농도및 receptor phase에서의농도를 HPLC-UV 분석법으로정량하였다. 경피흡수자료의분석 - 103 -

피부의단위면적당투과한벤조페논 -3 의양을시간에대한함수로나타낸아래식에따 라서투과 parameter 를산출하였다. J s = 1 A ( dq dt ) 이식에서 A 는투과가일어나는피부의면적 ( cm2 ), (dq/dt) 는평형상태에서단위시 간당피부를투과하는시험물질의양 ( μg /hr), J s 는평형상태에서의투과속도 ( μg / cm2 /hr) 를 나타낸다. 3. 랫드에서벤조페논 -3 의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시랫드에서벤조페논 -3 의체내동태 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 투여용액의제조지용성물질인벤조페논-3를정맥투여하기위하여 Tween 80:ethanol:PEG 400:saline (5:20:25:50, v/v%) 으로구성되는 o/w emulsion 을제조하여벤조페논-3를용해시켰다. 투여용량은 1 mg/kg 단일용량이었다. 각용량의투여시사용한벤조페논-3 용액의농도및투여용액의부피를아래에나타내었다. Table 1-6. Benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Dose (mg/kg) Benzophenone-3 concentration (mg/ml) Dosing volume (ml/kg) 1 0.5 2 벤조페논 -3 투여및시료채취 랫드에벤조페논 -3 를정맥주사하기 12 시간전사료를제거하여절식시켰다. 투여는 - 104 -

단일용량의 (1 mg/kg) 벤조페논-3를 penile venous injection 하였다. 벤조페논-3를정맥주사한후 8시간시점에서다시사료를공급하였다. 투여전및투여후 2, 5, 15, 30분, 1, 2, 4, 8, 12시간에채혈하였다. 각채혈시간마다 jugular vein에서 0.2 ml를채혈하였으며채취한혈액을 4000 g에서 10분동안원심분리하여얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용해서벤조페논-3의혈장농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. 투여용량에따른약동학적파라메터의비교는 SPSS (SPSS Inc, USA) 를이용하여통계학적차이를확인하였다. 나. 정맥주입시벤조페논 -3 의체내동태및조직분포 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서자유롭게사료와물을공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 수술 Male Sprague-Dawley rats에 Zoletil 50을 20 mg/kg 용량으로복강주사하여마취시킨후 jugular vein과 femoral vein에 polyethylene tubing (0.58 mm i.d., 0.96 mm o.d., Natume, Tokyo, Japan) 을삽관하였다. 수술후최소 2일간의회복기를둔후정맥주입시험을시행하였다. 벤조페논-3의정맥주입및시료채취벤조페논-3가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하는방법으로투여하였다. 초기정맥투여용량 (D L ) 의설정은단회정맥주사시험에서얻은분포용적 (Vd, ss = 10.1 L/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 등 - 105 -

속정맥주입속도는단회정맥주사시험에서얻은클리어런스 (Cl = 76.1 ml/min/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 투여용액은정맥투여시험에서와동일한방법으로제조하였다. 각군당투여된용액의농도, 부피, 벤조페논-3 투여량을아래표에나타내었다. 벤조페논-3의투여는수술후 2일간의회복기를둔후비절식상태에서수행하였다. Table 1-7. Target plasma concentrations, benzophenone-3 concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of benzophenone-3 Target Css (ng/ml) Loading bolus i.v. injection Conc (mg/ml) Dose (mg/kg) Vehicle vol (ml/kg) Conc (mg/ml) M aintenance i.v. infusion Dose (mg/kg/hr) Vehicle vol (ml/kg/hr) 200 0.494 0.9881 2 0.257 0.459 1.79 혈액시료는투여전및투여후 2, 4, 8, 12 hr 시점에서 jugular vein으로부터 0.2 ml 씩채혈하였다. 채혈이후즉시동량의 heparinized saline (50 IU/ml) 을보충해주었다. 채취한혈액은 4000 g에서 10 분간원심분리한후혈장을취하고 -20 에서분석시까지보관하였다. 정맥등속주입을시작한후 12 hr 시점에서채혈한후랫드를안락사시키고뇌, 심장, 폐, 간, 위, 소장, 대장, 비장, 신장, 고환등의조직을채취하였다. 일정한부피의식염수를각조직에가한후 homogenizer 를사용하여균질화하였다. 시료는분석시까지 -2 0 에서보관하였다. 정상상태에서벤조페논-3의혈장및조직농도는최종채혈시간인 12 hr의농도로표현하였으며조직분배계수 (K p ) 는정상상태에서벤조페논-3의혈장대비조직농도의비로산출하였다. - 106 -

4. 경피투여시벤조페논 -3 의전신노출도평가 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시험전 1주일간 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 벤조페논-3의투여및시료채취 In vivo 경피투여시험은 in vitro 벤조페논-3 피부투과도시험에서가장높은투과도를나타낸 gel formulation 에대하여수행하였다. Gel 기제중벤조페논-3의함유량은 5% 이었으며, 이전과동일한방법으로 miglyol, carbomer 940, poloxamer 188, EDTA Na, methyl paraben, NaOH, surfactant, DW 등을사용하여제조하였다. 경피투여시험직전랫드를 diethyl ether 로마취시킨다음등부위를대략 5 5 cm면적으로전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모하였다. 제모한랫드의피부를 ethanol 로조심스럽게닦아낸후 3 3 cm면적에 200 mg의 gel 을고르게펴서적용하였다. 이때경피에적용된벤조페논-3 의용량은 10 mg 이었다. 혈액시료는투여전및투여후 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간에채취하였다. 정해진시점에서 0.2 ml의혈액을 jugular vein으로부터채혈하고 4000 g에서 10분간원심분리한다음얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용하여벤조페논-3의혈중농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. - 107 -

5. 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성평가 정맥투여후얻어진벤조페논-3의체내동태및조직분포자료그리고경피투과시험으로부터얻어진벤조페논-3의혈중농도자료로부터투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계를규명한다. 또한, 기존에보고된독성자료특히, 반복투여독성자료에서산출된 NOAEL를이용하여안전역 (Margin of Safety) 를다음과같이산출한다. 안전역 (Margin of Safety)=NOAEL/ 전신노출량 (Systemic exposure dose) 위식은일반적으로유해물질의유해용량과노출용량간의비교를통하여현재의노출 이얼마만큼안전한지를개략적으로보여준다. 일반적으로식품이나화장품의경우, 100 이상이면노출수준이적절하다고판단한다. 벤조페논 -3 의최대배합한도인 5% 의타당성을검토한다. 6. 벤조페논 -3 의위해도평가서 (Risk profile) 작성 벤조페논 -3 의안전성관련각종문헌과본연구의결과를토대로벤조페논 -3 의위해도 평가서를작성하였다. 벤조페논 -3 의물리화학적특성에서부터독성및노출량등안전 성관련제반사항을작성하여벤조페논 -3 의안전성관련정리자료로활용한다. - 108 -

제 4 장세부연구개발과제의결과및고찰 1. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한벤조페논 -3 의분석법개발 가. In vitro 시료중벤조페논 -3 의정량을위한 HPLC/UVD 분석법확립 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험으로부터얻어진시료중벤조페논-3의정량은 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 벤조페논-3는확립된조건에서 6분에검출되었으며물질의분석에영향을주는간섭 peak 는관찰되지않았다. 검량범위내벤조페논-3의크로마토그램을아래에나타내었다. Figure 1-2. Representative chromatogram of benzophenone-3 in receptor phase. 상기한바와같은분석조건에서벤조페논 -3 의검량범위는 0.05 50 μg/ml 이었다. 해당검량선의전형적인계산식은 y = 128.94x 0.7359 (r 2 = 0.9999) 로우수한직선성 을나타내었다. - 109 -

7000 6000 y = 128.94x - 0.7359 R² = 0.9999 Response (peak area) 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 10 20 30 40 50 60 Benzophenone-3 concentration (µg/ml) Figure 1-3. Representative calibration curve for the determination benzophenone-3. 분석법의검증은 0.05 50 μg/ml 농도에서시행하였으며아래표에서보는바와같 이우수한정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 을나타내었다. Table 1-8. Accuracy and precision for the HPLC assay of benzophenone-3 (n=3 each) Concentration ( μg/ml) A ccuracy (%) Precision (%) 0.05 100.7 0.2 0.1 97.7 0.7 0.5 99.5 0.3 1 100.3 0.1 5 99.9 0.1 10 100.1 0.1 50 100.0 0.0-110 -

나. LC-M S/M S 를이용한생체시료내벤조페논 -3 의분석법개발 정량을위한 MRM mass transition 은양자화된이온의감도와 product ion scan의감도를평가하여결정하였으며벤조페논-3과내부표준물질노니바마이드의 MRM mass transition 은각각 229.0 150.9 와 294.3 137.2 에서수행하였다. 벤조페논-3와내부표준물질의 product ion mass spectra 를아래그림에나타내었다. m/z 150.09 m/z 137.2 Figure 1-4. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate. Blank 혈장및표준혈장 (LLOQ 0.5 ng/ml, 1000 ng/ml) 을분석하여얻은크로마토그램을아래그림에나타내었다. 벤조페논-3과내부표준물질의 retention time은각각 4.5 와 3.5 분이었으며공혈장의크로마토그램에서는분석에영향을미치는방해 peak 는관찰되지않았다. - 111 -

(A) Figure 1-5. MRM chromatograms of (A) benzophenone-3 (BP3) and (B) nonivamide (NVM) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with BP3 (1 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (center), and plasma spiked with BP3 (1000 ng/ml) and NVM (1000 ng/ml) (right). (B) 벤조페논 -3 검량표준시료 (1, 5, 10, 50, 100, 500, and 1000 ng/ml) 를 LC-MS/MS 로분 석하였을때얻어진검량선의전형적인계산식은 y = 0.0219x + 0.00819 (r=0.9999) 이었 다. 검량선은 1-1000 ng/ml 의농도범위에서양호한직선성을나타내었다. - 112 -

Figure 1-6. Representative calibration curve for the determination of benzophenone-3 in rat plasma (y= 0.00353x + 0.00461, r 2 =0.9999) LC-MS/MS 분석시혈장시료를정량한계 (LLOQ, 1 ng/ml), low QC (20 ng/ml), medium QC (450 ng/ml) 및 high QC (900 ng/ml) 농도에서상기의검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정밀성 (precision) 은벤조페논-3과내부표준물질의피크면적비의표준편차를평균값으로나눈비의백분율 (%) 로서구하였고, 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였다. Inter-day 와 intra-day 의판정기준은정량한계 (LLOQ) 의경우정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120% 인조건을만족하는농도로구하였으며, 나머지 low, medium, high QC의경우정밀성은 15% 이하그리고정확성은 85-115% 범위에위치하는지의여부를판정기준으로하였다. 아래표에혈장중 intra-day 정확성과정밀성, 그리고 inter-day 의정확성과정밀성을나타내었다. Intra-day 와 inter-day 모두판정기준을충족시켰으며이때얻어진정량한계 (LLOQ) 는 1 ng/ml이었다. - 113 -

Table 1-9. Intra-day and inter-day accuracy and precision of benzophenone-3 assay Concentration (ng/ml) Intra-day (n=5) Inter-day (n=5) Accuracy (%) Precision (%) Accuracy (%) Precision (%) 1 97.5 8.5 103.2 7.4 20 109.1 4.1 101.8 6.6 450 100.0 1.3 99.2 3.7 900 98.4 1.5 97.9 3.1-114 -

2. 기제에따른벤조페논 -3 의 in vitro 투과도평가 가. 벤조페논 -3 를함유하는제제의제조 기제에따른벤조페논-3 의투과도를확인하기위해서대표적인 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를제조하였다. 각제제에함유된벤조페논-3 의양은시판되는자외선차단제벤조페논-3 의배합한도 (5% w/w) 에기준하여제조하였다. In vitro 투과도시험조건에서벤조페논-3 는기제가적용되는 48시간동안안정한것으로확인되었다. 벤조페논-3를함유하는 vaseline base, oily solution, lotion, gel 제제가제조되어피부에적용되기전외관을아래에나타내었다. Vaseline Oily solution Lotion Gel Figure 1-7. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing benzophenone-3 (5 % w/w). 나. 벤조페논 -3 의용해도측정및안정성확보 Franz diffusion cell 을이용한벤조페논-3의 in vitro 피부투과도측정시일정한투과도의유지를위해서는 receptor phase에서 sink condition 의유지가필수적인조건이므로그에적합한용해도를확보하는조건의확립이중요하다. 따라서본실험을위하여확립한 receptor phase가일정량이상의벤조페논-3를용해하는지여부를확인하였다. Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에서벤조페논-3의용해도는 2.92 mg/ml로 - 115 -

써벤조페논-3의투과도측정을위한 in vitro 시험에서 sink condition 이유지됨을확인하였다. 또한시료채취가이루어지는투과시험기간동안벤조페논-3의안정성이유지되는지여부를확인하였다. 벤조페논-3를 receptor phase에용해시킨후 (10 μg/ml) 37 에서 48시간농도변화를측정한결과유의적인변화가없어그안정성이확인되었다. 경시변화에따른벤조페논-3의농도변화추이를아래에나타내었다. S ta bility (%) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 1-8. Stability of benzophenone-3 in the receptor phase kept at 37 (n=4) 다. 기제에따른피부투과도 벤조페논-3를함유한각기제적용후 receptor phase로도달하는벤조페논-3의양과그투과속도를아래에나타내었다. 벤조페논-3의피부투과도는 gel 적용군에서 0.25 ± 0.02 μg/cm 2 /hr로써타 3종의기제에비하여유의적으로크게나타났으며 lotion, vaseline, oily solution 적용군의경우유의적인차이를나타내지않았다. - 116 -

Table 1-10. Amount of benzophenone-3 permeated through excised rat skins from each formulation containing 5% benzophenone-3 (μg/cm 2 ) Time (hr) Vaseline Oily solution Lotion Gel 12 0.51 ± 0.09 0.25 ± 0.11 0.44 ± 0.15 1 ± 0.81 24 1.31 ± 0.27 1.14 ± 0.31 1.56 ± 0.52 2.45 ± 0.95 36 2.76 ± 0.42 2.17 ± 0.34 2.82 ± 0.5 5.31 ± 1.56 48 4.03 ± 0.58 3.82 ± 0.58 4.99 ± 0.45 8.49 ± 1.05 12 10 Amount permeated, µg/cm 2 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 1-9. Permeation profiles of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation ( ; Gel, ; Vaseline, ; Lotion, ; Oily solution) containing 5% benzophenone-3 (w/w) (mean ± S.E., n=6 each). - 117 -

Table 1-11. Permeation parameters of benzophenone-3 through excised rat skin from each formulation containing 5% benzophenone (w/w) (mean ± S.D.) Formulation Js (μg/cm 2 /hr) Vaseline 0.11 ± 0.06 Lotion 0.14 ± 0.03 Oily solution 0.11 ± 0.05 Gel * 0.25 ± 0.02 * Gel was significantly different from vaseline, lotion, oily solution, and lotion (1-way A NOVA, post hoc; Tukey s test, p< 0.05) 투과시험종료시점인 48시간에서각질층과각질을제외한피부에잔존하는벤조페논 -3의양을정량한결과 lotion 의경우에각각 3.28%, 3.43%, oily solution 의경우에각각 2.08%, 2.85%, vaseline 의경우에 2.13%, 1.02% 가잔존하였다. 이에비해서 gel의경우에는각각투여량의 16.99% 및 4.7% 의벤조페논-3가잔존하여타 3종의제제에비하여 gel 제제적용군에서유의적으로높게나타났다. Gel 기제적용시피부에잔존하는총량은투여량의 21.7% 로 4종의제제중가장높았다. 그결과 in vivo 경피투여시험에서벤조페논-3의전신노출도를측정하는대상제제로 gel 제형을선정하였다. Table 1-12. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers and receptor phase for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations Formulation Dermis and epidermis (%) Stratum corneum (%) Receptor phase (%) Total (%) Vaseline 2.1 ± 0.3 1 ± 0.5 0.071 ± 0.025 3.2 ± 0.7 Lotion 3.3 ± 0.9 3.4 ± 1.3 0.088 ± 0.02 6.7 ± 2 Oily solution 2.1 ± 0.6 2.8 ± 1.6 0.067 ± 0.023 4.9 ± 2 Gel 4.7 ± 1 17 ± 4.5 0.15 ± 0.045 21.7 ± 4.9-118 -

Benzophenone-3 (% of applied dose) 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 Vaseline (n=6) Oily solution (n=6) Lotion (n=6) Gel (n=6) * * 0.0 Epiderm + Derm Stratum Corneum (Strips) Liquid receptor Figure 1-10. Penetration of benzophenone-3 into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way ANOVA, post hoc; Tukey s test, p< 0.05). - 119 -

3. 랫드에서벤조페논 -3 의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시벤조페논 -3 의혈중체내동태 절식한랫드에벤조페논 -3 를 1 mg/kg 용량으로단회정맥투여한후얻어진벤조페논 -3 의평균혈중농도 - 시간곡선을아래에나타내었다. 정맥투여시벤조페논 -3 의시간에 따른농도추이는 multi-compartmental 특성을나타내었다. 1000 Benzophenone-3 concentration (ng/ml) 100 10 1 0 2 4 6 8 10 12 Time (hr) Figure 1-11. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4). 혈중농도-시간데이터를 non-compartmental 방법으로분석하여산출한약동학적파라메터의평균을아래에요약하였다. 이중소실반감기 (half life), 전신클리어런스 (Cl), 정상상태에서의분포용적 (Vd ss ) 등의파라메터들은벤조페논-3의정맥주입시초회투여용량및정맥주입속도를결정하는근거데이터로활용하였다. - 120 -

Table 1-13. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 after i.v. injection at dose of 1 mg/kg in rats (n=4) Parameters M ean ± S.D. t1/2 (hr) 3.6 ± 1.4 C0 (ng/ml) 577.8 ± 121.7 AUC (ng.hr/ml) 221.4 ± 26.1 Cl (ml/min/kg) 76.1 ± 9.3 Vdss (L/kg) 10.1 ± 2.8 나. 정맥주입시랫드에서벤조페논 -3 의체내동태및조직분포 랫드에서얻고자하는벤조페논-3의정상상태에서의혈장농도를 200 ng/ml로설정하여동시단회정맥주사및 12-hr 등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하였다. 이때얻은혈중농도-시간프로필을아래그림에나타내었다. 단회정맥투여시얻어진벤조페논-3의반감기는약 3.6 hr으로정상상태농도의 90% 에도달시간은약 10.8 hr으로예측되었다. 본실험에서는벤조페논-3가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 방법으로투여하였다. 따라서정맥주입시작 12 hr 이전에벤조페논-3의혈중농도가정상상태에도달한것으로추정되었다. 벤조페논-3 정맥주입후 12 hr에서 C ss = 200 ng/ml 목표군에서의실측농도는 180.5 ± 52.3 ng/ml 이었다. 따라서 12-hr i.v. infusion 시험에서얻어진결과가단회정맥주사시험에서얻어진결과와일관성이있게나타나 in vivo 시험의신뢰성을확인할수있었다. - 121 -

Benzophenone-3 concentration (ng/ml) 300 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 Time (hr) Css : 200 ng/ml Figure 1-12. Plasma benzophenone-3 concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.99 mg/kg and 0.46 mg/kg/hr, respectively. 정맥등속주입시작후 12 hr 시점에서혈장, 신장, 간, 비장, 폐, 심장, 고환, 위, 소장, 대장, 뇌에서측정된벤조페논-3의농도데이터및혈장-조직분배계수 (K p ) 를아래표에나타내었다. C ss = 200 ng/ml 목표군에서측정된혈장농도대비조직농도분배계수 (K p ) 는대장, 폐, 신장, 소장, 위, 뇌, 심장, 간, 비장, 고환의순으로나타났으며독성장기로추정되는고환으로의분포율은타장기조직에비하여매우낮게나타났다. - 122 -

Table 1-14. Mean concentrations and plasma-to-tissue partition coefficients (K p) of benzophenone-3 in tissues determined under steady state conditions (n=4) Tissues Concentration (ng/g) K p Plasma 180.5 ± 52.29 - Kidney 620.68 ± 297.7 4 ± 2.87 Liver 269.19 ± 52.14 1.54 ± 0.27 Spleen 155.71 ± 27.63 0.89 ± 0.13 Lung 710 ± 326.77 4.5 ± 2.87 Heart 363.14 ± 132.57 2.11 ± 0.87 Testis 136.74 ± 70.88 0.73 ± 0.16 Stomach 476.16 ± 99.72 2.7 ± 0.44 Small intestine 532.22 ± 296.66 2.92 ± 1.35 Large intestine 1174.44 ± 972.83 6.39 ± 5.77 Brain 352.75 ± 95.81 2.07 ± 0.81 Tissue concentration of benzophenone-3 (ng/g) 2500 Css : 200 ng/g (n=4) Benzophenone-3 concentration (ng/g) 2000 1500 1000 500 0 Plasma Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Brain Figure 1-13. A verage concentrations of benzophenone-3 in tissues at steady state. - 123 -

14 Plasma to tissue partition coefficient value (Kp) of benzophenone-3 Css : 200 ng/g (n=4) 12 Kp of benzophenone-3 10 8 6 4 2 0 Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Brain Figure 1-14. Average plasma-to-tissue partition coefficients of benzophenone-3 in tissues calculated at steady state. - 124 -

4. 경피투과에의한벤조페논 -3 의전신노출도평가 절식한랫드에벤조페논 -3 를 40 mg/kg 용량으로단회경피투여한후얻어진벤조페 논 -3 의평균혈중농도 - 시간곡선을아래에나타내었다. 벤조페논 -3 의시간에따른농도 추이는 4-8 시간까지흡수된후일정한속도로소실되는양상을보였다. 100 BP-3 concentration (ng/ml) 10 1 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 1-15. Average concentration-time profiles of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) 얻어진벤조페논-3의혈중농도-시간데이터로부터약동학적파라메터를산출하였으며그값을아래표에나타내었다. 경피투과시산출된소실반감기는 21.9 hr으로써정맥투여시소실반감기인 3.6 hr에비하여매우길게나타났으며이는경피투과시흡수속도가소실속도에비하여느림으로써나타난 flip-flop 현상으로사료되며벤조페논-3가전신순환계로서서히흡수됨을의미한다. 24시간까지전신순환계로흡수된벤조페논-3의흡수율은상대생체이용률 (relative bioavailability) 로서 (relative bioavailability = 100. Dose. i.v. AUC transdermal /Dose. transdermal AUC i.v. ) 투여량대비 4.2 ± 0.8% 이었다. 다만자외 - 125 -

선차단제를바르고통상적으로 12 시간이내에세척한다고가정했을때의절대생체이 용률은대략 1-2% 내외 (>1.63% = 6.5. 12/48) 정도로추정해볼수있다. Table 1-15. Pharmacokinetic parameters of benzophenone-3 in rats after percutaneous administration of gel containing benzophenone-3 (dose 40 mg/kg, n=5) Parameters M ean ± S.D. t 1/2 (hr) 21.9 ± 10.5 T max (hr) 4.4 ± 3.1 C max (ng/ml) 26.8 ± 4.1 AUC (ng.hr/ml) 373.8 ± 71.8 V z /F (L/kg) 1638.7 ± 386.2 Cl/F (ml/min/kg) 989.5 ± 445 F (%) 4.2 ± 0.8-126 -

5. 벤조페논 -3 의위해도평가및배합한도의타당성평가 벤조페논 -3 의위해도평가는독성과노출도를비교하여다음과같이계산되었다. 자외선차단제에서 UV-filter 로사용된 5% 의벤조페논 -3 를고려했을때, 피부흡수양 (5% formulation): 5.8% [ 생체이용률고려 mean (4.2%) + 2 SD (2*0.8%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : NOAEL (terato-rat): 18 g/day 60 kg 200 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 5/100 * 5.8/100) / 60 kg = 0.87 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 200/0.87 = 230 여기서, NOAEL은랫드의생식발생독성자료에서산출된 NOAEL값을근거로하였다 (Table ). 적용량의경우, 전신을도포할경우를가정하여하루 18 g적용을가정하였다. 따라서, 안전역이 230 배정도로확보되어벤조페논-3의허용최대배합한도 5% 에서는안전하다고사료된다. 한편, 표적장기인고환에서조직분포를살펴보면, 다른조직및장기보다벤조페논 -3 의분포 가상당히낮았다. 이는혈액 - 고환장벽 (BTB) 가존재함을알수있다. 따라서, 다른조직장기 보다안전한조직이라고판단된다. - 127 -

Table 1-16. 벤조페논 -3 의독성학적자료 독성종류 동물종투여경로 투여 기간 (day) 투여용량 (mg/kg/day) 독성작용 (NOA EL mg/kg bw/day) 참고문 헌 Repeated dose toxicity Rat (F344/N) Dermal 14 0 200 (in acetone or lotion) 110 : liver/ kidney weight NOAEL M ale/female: 100/140 French, Sub-chroni c toxicity Rat (F344/N) Dermal 90 0-200 (in acetone) 12.5~200 : reticulocyte 200 : whole blood cell, Kidney weight NOAEL M ale/female: 200 2000 Reproductiv Mouse e toxicity (B6C3F1) Dermal 90 0-400 No toxicological effect NOAEL Male, female: 400 Daston et al,. 1993 Terato genecity Rat (Crl : W I(Han) W istar) Gavage 14 0-1000 200 : transient salivation 1000 : rate of foetuses/litter skeletal variations NOAEL M aternal, prenatal: 200 CW FG, 2005 Muta genicity Rat (SD) Gavage Once 5 0-5000 0 and 5000 No mutagenicity (In vitro, bone marrow chromosome aberration) Robinso n et al,. 1994-128 -

6. 벤조페논 -3 의위해도평가서 (Risk profile) 작성 다음과같이벤조페논 -3 에대한위해도평가서를작성하였다. 벤조페논 -3 RISK PROFILE - 129 -

차례 제1장. 개요 1.1. 정의및용도 1.2. 물리 화학적특성 1.3. 안정성 1.4. 체내동태 제2장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 2.2. 노출평가 2.3. 독성 제 3 장. 참고문헌 - 130 -

제 1 장. 개요 1.1. 정의및용도 벤조페논-3 (CAS No 131-57-7: benzophenone-3, C 14 H 12 O 3 ) 은분자량 228.26 의노란색을띄는흰색이나크림색의파우더로자외선차단제제품에서단독으로사용되거나다른 UV 필터제와혼합하여 5% 까지사용된다. 또한, 다른종류의화장품제품들에서벤조페논-3은 0.05 0.5 % 사이의농도가광보호를위해포함된다. - 131 -

1.2. 물리 화학적특성 표 1. 벤조페논의물리 화학적특성 항목 내용 참고문헌 물질명 (INCI) 벤조페논-3 (Benzophenone-3) 3, 4, 5, 35, 53 IUPAC명 (2-Hydroxy-4-methoxyphenyl)-phenylmethanone 3, 4, 5, 35, 53 CAS No. 131-57-7 3, 4, 5, 35, 53 화학식 C 14H 12O 3 3, 4, 5, 35, 53 분자량 228.26 g/mol 4, 5, 35, 50, 51, 52 구조식 물리적성상 노란색을띄는흰색, 크림색파우더 35 녹는점 62 65 4, 5, 35, 50, 51, 52 끓는점 224 227 4, 5, 35, 50, 51, 52 밀도 1.32 g cm3 4, 5, 35, 50, 51, 52 증기압 - - ph - - 용해도 물 : 3.7x10-3 g/l(20 ) Glycerin: < 0.01% Ethanol: 6.0% 4, 5, 35 Acetone: > 20.0% Chloroform: > 20.0% Log Kow > 3.7 35 헨리상수 - 동의어 (synonyms) Oxybenzone (INN name) 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone (2-Hydroxy-4-methoxyphenyl)phenyl methanone 2-Benzoyl-5-methoxyphenol 35, 52 1.3. 안정성 유통기한 : 최소 2년 정제수에대한안정성 : 최소 97시간 * DMSO에대한안정성 : 최소 4시간 * 콘오일에대한안정성 : 최소 10일 ** 아세톤에대한안정성 : 최소 3주 *** 오일제형에대한안정성 : 최소 3주 *** - 132 -

* 최근에실시된광변이원성연구로결정 (GLP 상태에서실시한안정성연구의전체설명 ) ** GLP 상태에서실시된태아발달독성시험으로결정 *** 미국국제독성프로그램 (NTP) 의경구 & 피부연구로결정 ( 참고문헌. 5, 10, 12, 21, 35, 50) 1.4. 체내동태 1.4.1. 흡수 1.4.1.1. In vitro 진피 / 경피흡수 사람피부 벤조페논이 4.9% 포함되어있는화장품제형을정적피부투과장치에놓인사람피부의피질 ( 다른피험자들에게서얻은 6개의샘플들 ) 에 3 mg/ cm2양을적용했다. 3 ml 수용액 (ph 7.4) 은 1 % 소혈청알부민, 0.9% NaCl, 0.02% KCl과 0.04 % gentamycine 으로구성되있으며, 32 를유지한다. 피부수분증발 (TEWL) 은 Tewameter 로각위치마다기록했다. 16시간노출후에피부를씻고면봉으로닦았다. 수용액을모으고각질층함량을결정하기위해 16개 strippings 들을피부표면에적용하고그뒤에진피에서표피를분리했다. 분석은 UV 검출을사용하고등용매 RP-HPLC 2 을이용했다. 벤조페논 -3 의정량결과는다음과같다. 총적용량 : 147 μg / cm2 (3 mg cream/ cm2, 4.9% 벤조페논 -3) 각질층 : 표피 : 진피 : 수용체 : 8.5 ± 3.3 μg / cm2 0.3 ± 0.2 μg / cm2 0.4 ± 0.1 μg / cm2 1.0 ± 0.4 μg / cm2 세정액 : 85.7% ± 4.5% 회복률 : 98.4% ± 3.1% 이결과는각질층에서가장많은부분 (5.8 %) 을흡수한다고나타내지만, 약 0.5 % 는독자생 존가능한피부에서흡수됐고 0.7 % 는수용액에서분석됐다. - 133 -

몇몇다른연구들은벤조페논-3나벤조페논-3이포함된제품들을사용하여피부침투에관해서나특정관점에대해서 in vitro 연구했다. 새로운모델이거나수정된침투모델과다른분석방법뿐만아니라새로구성되거나다른제형들을연구하고비교했다. 다른실험군들은사람피부 ( 전층이나분열층 ) 와돼지피부 ( 전층이나피절 ) 인공막을사용했다. 그러므로벤조페논 -3 는피부흡수가낮고, 주로각질층에흡착되고특정제형 (o/w emulsion, w/o emulsion, gels, oils, creams) 들에서시간과흡수량에대해서흡수율에영향을줄수있다 는일반적인특정들을얻을수있었다 ( 참고문헌 9, 18, 19, 24, 40, 56, 57). 1.4.1.2. in vivo 진피 / 경피흡수 사람 2002-2003 년출판된임상연구들은모두 tape stripping, 방법론에대한문제점과적용기간, 분석방법, 흡수 / 흡착계산과사용된제형의구성성분이다르므로, 벤조페논-3의 in vivo 피부흡수에대한정량은불가능하다고했다. In vitro 연구들을토대로, 적용된벤조페논-3는각질층에가장많이흡착되어소량만이생물학적이용할수있다고정성적으로언급할수있다. 게다가, 제조 / 제형유형은피부흡수의정도에영향을준다 ( 참고문헌 9, 19, 56). Gonzalez 등은몸전체에 UV 방사능조사와 UV 방사능조사를하지않는것을반복적용한후, 벤조페논-3의피부흡수에대해서임상연구를하였다. 25명의피험자들에게벤조페논-3 이 4 % 포함된자외선차단제 2 mg/ cm2을그들의몸전체표면에 5일연속으로하루에 2번씩적용했다. 피험자당자외선차단제의양은 26-47g 사이의범위에서피험자마다다르게했다. 지원자들을 2개의그룹을나누고한그룹에 UV를유발했다. 적용 5일동안, 모든뇨를받고 UV 검출기가있는 HPLC로벤조페논-3의농도를분석했다. 시험결과뇨에배출된벤조페논-3의양은차이가이었다. 그러나, UV-조사는화합물의뇨배출에영향을미치지않았다. 뇨에서발견된벤조페논-3의평균값은 3.7 % (1.2 % - 8.7 %) 였다. 다른배출경로들은조사하지않았고이값은여전히벤조페논이피부에흡수되는총백분율을과소평가한다. 지원자들은적용후여러날벤조페논-3을배출했고분자의친유성관점이기대된다 ( 참고문헌 22). - 134 -

제 2 장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 주된노출원은자외선차단제를통한경피흡수이다. 2.2. 노출평가 자외선차단제에서 UV-filter 로사용된 5% 의 BP-3 피부흡수양 (5% formulation): 5.8% [ 생체이용률고려 mean (4.2%) + 2 SD (2*0.8%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : NOAEL (terato-rat): 18 g/day 60 kg 200 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 5/100 * 5.8/100) / 60 kg = 0.87 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 200/0.87 = 230 2.3. 독성 급성독성 만성독성 면역독성 신경독성 생식독성 발생독성 유전독성 발암성 광독성 - - - ( : 독성있음, -: 독성자료없음 ) 2.3.1. 급성독성 (A cute toxicity) LD 50 을구하기위한급성독성시험이여러실험동물종에서이루어졌는데그중랫드에서는경 구용량으로서 6000 mg/kg bw 이상의반수치사량을얻었고, 토끼피부에서 16,000 mg/kg bw - 135 -

이상의반수치사량을얻었다 ( 참고문헌 39). 랫드의경구용량에대한다른연구들에서는 11,600 mg/kg bw ( 참고문헌 45) 과 12,800 mg/kg bw 이상 ( 참고문헌 33) 의반수치사량을얻었다. 2.3.2. 피부자극성과부식성 2.3.2.1. 피부자극 토끼 1965 년연구에서, 벤조페논-3은토끼피부에서자극이없다고보고되었고 ( 실험한 6마리토끼에서모든 score 가 0이였다 ) 이결과는 1976 연구가뒷받침해준다. 1979 년연구는 Protective Eye Cream이라는자외선차단제 0.5 ml을 3마리의토끼피부에시험했고비자극성이나타났다 ( 모든 scores = 0) ( 참고문헌 1, 13, 46). 2.3.2.2. 점막자극 토끼 1965 년연구는토끼눈에대하여벤조페논-3은자극이없다고보고했다 ( 실험한 6마리동물에서모든 score가 0이였다 ). 이결과는 1953 년연구와 1976 년연구로더강하게뒷받침됐다. 1979 년연구는 Protective Eye Cream 이라는자외선차단제 0.1 ml을 3마리토끼에주입했고자극을찾을수없었다 ( 모든 score = 0) ( 참고문헌 1, 13, 39, 56). 2.3.2.3.. 자극성에대한결론 피부와점막에대한벤조페논-3의자극연구는오래전에연구된것이므로현재의가이드라인을따르지않는다. 그럼에도불구하고현재요구되는동물들보다더많은동물들을사용하고또한피부자극연구에서최악의상황을대표하는벗겨진피부에시험물질을적용하여유용한정보를제공한다. 모든결과들이서로일치하고동물의희생을고려해야하기때문에, 벤조페논-3에대한새로운피부나눈자극실험은적절하지않은것으로보인다. 그러므로벤조페논 -3은토끼의피부와눈에대해서잠재적자극이없다고간주된다. 2.3.3. 피부감작성 - 136 -

2.3.3.1. Magnusson Kligman Maximization test 기니피그 시험일자 : 1978 년 7월가이드라인 / 방법 : Maximization test according to Magnusson and Kligman (1969), precursor of Annex V to Dir. 67/548/EEC, Method B.6 and OECD Guideline 406 동물종 / 계통 : Guinea pig/hartley white 집단규모 : 대조군으로 30마리수컷, 실험군으로 20마리암컷시험물질 : Uvinul M-40 (Benzophenone-3) 용량 : 유도기 : 10%, 유발기 : 2.5% 경로 : 피내 ( 유도기 ) 와경피 ( 유발기 ) 배치 : - 순도 : - GLP: GLP 확립전연구하였음 용량범위를찾는연구에서 Petrolatum 과순수한화합물에서의 0.25%, 2.5%, 5%, 10% 농도를가진벤조페논-3을제모한동물의옆구리에적용했다. 이연구를토대로콘오일에녹인 5 % 벤조페논-3이나 50 % 수용성 Freund s complete adjuvant에있는 5% 벤조페논-3 0.05 ml을 10마리동물의제모된어깨부분에피부내주사하였다. 유도주사투여일주일후, petrolatum 에 10% 들어있는시험물질 0.1 ml로구성된 topical booster patch 를 48시간유발부위에폐쇄적용하였다. Booster 전에, 10% 수용성 sodium lauryl sulfate를모든동물들의유도부분에폐쇄하지않고적용하였다. 유발은 petrolatum 의 2.5% 시험물질 0.1 ml을사전에 24시간동안처리하지않은부위에폐쇄적용하였다. 적용부위들은패치제거후 24시간과 48시간에 score 하였다. 유발후 48시간대에서 20마리중 18마리에서어떠한효과도보이지않았고 20마리중 2마리는미약하게감지할수있는홍반이나타났다. 72시간에는 20마리중 1마리가피부반응을보이지않았고 20마리중 3마리에서거의보이지않는홍반이나타났다 ( 첫번째 reading과다른동물들 ). 유발에서대조군은피부자극을보이지않았지만, 양성대조군 (petrolatum 에 2% phenylacetaldehyde) 동물들은감작성유도에서명백한피부반응을보였다. 그러므로벤조페논-3은기니피그의 Magnusson Kligman Maximization test 에서피부감작성을유도하는어떠한잠재성이없다고보인다 ( 참고문헌 2). - 137 -

2.3.3.2. 국소림프절분석 마우스 시험일자 : 2005 년 9월가이드라인 / 방법 : Annex V to Dir. 67/548/EEC, Method B.42; OECD Guideline 429 종 / 계통 : Mouse, CBA/CaOlaHsd 집단규모 : 시험군과대조군당암컷 4마리시험물질 : Benzophenone-3 배치 101 순도 : 99.8% (GC-FID) 용량 : 0-12.5-25 - 50% (w/v) in dimethylformamide (DMF) 경로 : 귓볼뒷부분에표피 ( 국소적 ) 적용 GLP/QAU: Signed documents available 3가지그룹각각의 4마리암컷마우스에 dimethylformamide (DMF) 에녹인 12.5, 25, 50% (w/v) 농도의벤조페논-3을 3일연속으로각귓불 ( 왼쪽과오른쪽 ) 뒤에국소적용하였다. 4마리의대조군마우스에는용매 (DMF) 만처리하였다. 첫번째국소적용후 5일에마우스들의꼬리에방사성을표시한 thymidine ( 3 H-methylthymidine) 을정맥주사하였다. 정맥주사하고약 5시간후, 마우스들은희생시키고각그룹당귀의림프절을잘라내고담궜다. 림프절세포의단일세포현탁액은나중에세정하고 trichloroacetic acid로밤새배양한담궈진림프절로준비했다. 담궈진림프절세포의증식능력은 β-scintillation counter 로측정된 3 H-methyl thymidine의결합으로결정했다. 한개또는그이상의시험농도에대하여노출이대조군과동시비교하여 3HTdR 의결합에서 3배나그이상증가하면시험물질은자극지표 (S.I.) 로서 LLNA에서증감제로여겨진다. S.I. 3 을만드는것을요구하는시험물질의측정된농도는 EC3 값으로간주된다. 시험한모든동물들은연구하는동안생존했었다. 자극지표 1.64, 1.33, 1.61 은 DMF에서 12.5, 25, 50 % (w/v) 농도의시험물질로결정했다. 그러므로벤조페논-3은피부감작성역할을보이지않는다 ( 참고문헌 11). 2.3.4. 반복투여독성 (Repeated dose toxicity) - 138 -

2.3.4.1. 반복투여 (28 일 ) 경구 / 피부 / 흡입독성 랫드 / 마우스 A. 랫드와마우스에아급성노출 1953 년한논문에서는 7.2, 75, 789 mg/kg bw/day 용량의랫드 ( 군당 10 마리 ) 에대해서 27 일간 연구했다. 시험군의음식섭취와몸무게는대조군랫드에비해서증가되었다. 시험물질을섭 취한동물에서는사망과중요한병리학적변화는없었다 ( 참고문헌 24). 1) 랫드에서의 14 일경구독성 (1985-88) 성별과그룹당 5마리의 F344/N 랫드에게 2주동안식이로 0, 3,125, 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도의벤조페논-3을주었다. 음식물의시험물질제조용물질은안정성을위해분석했고적어도 3주간의안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고장기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 303 mg/kg bw/day: 수컷과암컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 576 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 1,132 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 2,236 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 3,868 mg/kg bw/day: 암컷과수컷에서음식섭취감소 ; 수컷에서체중감소 ; 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 피질과수질에서세뇨관의국소확장 결론 : NOAEL (14d-oral) = 295/311 mg/kg bw/day for the male/female ( 참고문헌 21). - 139 -

2) 마우스에서의 14 일경구독성 (1985-88) 성별과그룹당 5마리의 B6C3F1 마우스에게 2주동안식이로 0, 3,125, 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도의벤조페논-3을주었다. 음식물의시험물질제조용물질은안정성을위해분석했고적어도 3주간의안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고장기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 1,021 mg/kg bw/day: 수컷과암컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 2,041 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 4,430 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 8,648 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게감소 20,796 mg/kg bw/day: 체중감소 ; 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게감소 결론 : NOAEL (14d-oral) = 992/1050 mg/kg bw/day for the male/female mouse ( 참고문헌 21). B. 랫드와마우스에서의아급성피부노출 1) 랫드에서의 14 일피부독성 (1985-88) 성별과그룹당 5마리의 F344/N 랫드에게 2주동안한주에 5일씩용매로아세톤이나로션을사용하여 0, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/rat 농도의벤조페논-3을주었다. 0.25 ml/rat의일정한양을견갑간부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24시간과그후매주마다다듬었다. 아세톤과로션의제조용물질의안정성을분석하고최소 3주간의식이안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고장 - 140 -

기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 7.0 mg/kg bw/day: 이상반응이없었음. 13.6 mg/kg bw/day: 이상반응이없었음. 27.7. mg/kg bw/day: 암컷간무게가약간증가 54.9 mg/kg bw/day: 암컷간무게약간증가 110 mg/kg bw/day: 암컷간무게약간증가 ; 신장무게약간증가 결론 : NOAEL (14d-dermal) = 100/140 mg/kg bw/day for the male/female rat ( 참고문헌 21). 2) 랫드에서의 28 일피부독성 (1985-88) 1995 년논문에서는그룹당 6마리의 Sprague-Dawley 랫드에게 4주동안매일 2번씩 petroleum jelly base로제조된벤조페논-3을 0, 100 mg/kg bw/day 농도로주었다. 임상적증상과체중을포함한임상적연구들을모든동물들에서수행하였다. 혈액학과혈액생화학을위해혈액샘플들을투여시작하기전과 16일에채취하였다. 종료후, 동물들을희생시키고, 장기 ( 간, 신장, 고환 ) 무게를측정하고간, 신장, 고환과실험한부분과실험하지않은부분의피부를채취하고조직병리학적분석했다. 게다가, 적용 16일에 GSH 결정에대한혈액샘플을수집했다. 동물들을정상보다일찍죽지않았다. 체중, 상대적장기무게, 혈액학과혈액생화학결과들에대해서물질관련효과는없었다. 피부의물리적관찰에서물질관련변화는나타나지않았다. 간, 신장과고환의조직병리분석에서대조군과실험군동물사이의뚜렷한차이점은없었고적용하거나적용하지않은부위의피부에서이상은관찰되지않았다 ( 참고문헌 38). 3) 마우스에서 14 일피부독성 (1985-88) 성별과그룹당 5마리의 B6C3F1 마우스에게 2주동안한주에 5일씩용매로아세톤이나로션을사용하여 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 mg/mouse 농도의벤조페논-3을주었다. 0.25 ml/rat의일정한양을견갑간부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24시간과그후매주마다다듬었다. 아세톤과로션의제조용물질의안정성을분석하고최소 3주간 - 141 -

의식이안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들 은모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고 장기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 24.8 mg/kg bw/day: 없음 48.4 mg/kg bw/day: 없음 100 mg/kg bw/day: 없음 196 mg/kg bw/day: 암컷간무게증가 388 mg/kg bw/day: 암컷간무게증가 결론 : NOAEL (14d-dermal) = 382/432 mg/kg bw/day for the male/female mouse ( 참고문헌 21). 2.3.4.2. 아만성 (90 일 ) 경구 / 피부 / 흡입독성 랫드 / 마우스 A. 랫드와마우스에대한아만성경구섭취 1) 랫드에대한 90 일경구독성 (1972) 벤조페논-3 를성별과그룹당 12마리수컷과 12마리암컷랫드에게 13주동안약 0, 20, 100, 500, 1000 mg/kg bw/day 용량을실험했다. 동물들의임상적결과를관찰하고체중과음식섭취는매주관찰했다. 혈액학을위한혈액샘플들을 6주차와 12주차에채취하였다. 게다가, 종료후간효소활성과혈액생화학값들을성별과용량그룹당 6마리랫드에서관찰했다. 모든동물들을희생시키고육안관찰과장기들의무게를측정하고종합적인조직병리학분석을수행했다. 다음에효과들을설명했다 사망은나타나지않았다. - 142 -

20 mg/kg bw/day: 이상반응없음 100 mg/kg bw/day: 이상반응없음 500 mg/kg bw/day: 체중과체중증가량감소 ; 암컷에서 6주후헤모글로빈과백혈구감소 ( 림프구증가와호중구감소 ); 암컷에서 12주후빈혈, 림프구증가증과과립구수감소 ; 암수에서흉선과심장의절대무게감소 ; 암수에서뇌하수체, 흉선, 시장과부신의상대적무게감소 ; 암수의신장에서퇴행성사구체신염의초기단계 1000 mg/kg bw/day: 체중과체중증가량감소 ; 주름진모피와경직 ( 굳어짐 ) (4주내에가역가능한 ); 암컷에서 6주후헤모글로빈과백혈구감소 ( 림프구증가와호중구감소 ); 암컷에서 12주후빈혈, 림프구증가증과과립구수감소 ; 암수에서흉선, 심장, 뇌하수체, 폐, 비장, 부신과생식샘의절대무게감소 ; 암수에서뇌하수체, 흉선, 심장과부신의상대적무게감소 ; 암컷에서폐와비장의상대무게감소 ; 암컷에서갑상선상대무게증가 ; 암수의신장에서퇴행성사구체신염 결론 : NOAEL (90d-dermal) = 100 mg/kg bw/day for the male/female rats ( 참고문헌 33). 2) 랫드에대한 90 일경구독성 (1985-1988) 성별과그룹당 F344/N 랫드에게 13주동안식이섭취로벤조페논-3을 0; 3,125; 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도로주었다. 식이섭취를위한시험물질의제조용물질은안정성을ㅂㄴ석했고최소 3주동안섭취에대한안정성을증명했다. 임상적증상, 사망률, 체중과음식섭취를포함한임상적관찰을일정한간격으로모든동물에게수행했다. 혈액학과혈액생화학실험과뇨분석을위한샘플들은시험기간 12주차와 3일, 15일에채취했다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도를용량으로변환했다 ) 204 mg/kg bw/day: 색깔있는뇨 ; 간무게증가 411 mg/kg bw/day: 색깔있는뇨 ; 간무게증가 ; 혈청단백질농도이상 - 143 -

828 mg/kg bw/day: 색깔있는뇨 ; 간무게증가 ; 혈청단백질농도이상 1,702 mg/kg bw/day: 암수에서성장과체중증가량감소 ; 색깔있는뇨 ; 신장크기가커지고모양이비정상적이고표면이오돌토돌함 ; 암컷에서절대적상대적신장무게증가 ; 세뇨관팽창 ; 간무게증가 ; 혈소판수증가 ; 혈청단백질농도이상 3,458 mg/kg bw/day: 암수에서성장과체중증가량감소 ; 색깔있는뇨 ; 신장크기가커지고모양이비정상적이고표면이오돌토돌함 ; 암수에서신장의절대적상대적무게증가 ; 세뇨관팽창 ; 신간질에서섬유증에의한약간의염증 ; 간무게증가 ; 혈소판수증가 ; 혈청단백질이상 ; 수컷ㅇ서정자운동성감소, 암컷의발정주기증가 결론 : NOAEL (90d-oral) = 429/393 mg/kg bw/day for the male/female rats ( 참고문헌 21) 3) 마우스에서 90 일경구독성 (1985-88) 성별과그룹당 10마리의 B6C3F1 마우스에게 13주동안식이섭취로벤조페논-3을 0; 3,125; 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도로주었다. 식이섭취를위한시험물질의제조용물질은안정성을분석했고최소 3주동안섭취에대한안정성을증명했다. 임상적증상, 사망률, 체중과음식섭취를포함한임상적관찰을일정한간격으로모든동물에게수행했다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도를용량으로변환했다 ) 554 mg/kg bw/day: 이상반응없음 1,246 mg/kg bw/day: 간무게증가 2,860 mg/kg bw/day: 간무게증가 6,780 mg/kg bw/day: 암수에서체중증가량감소 ; 간무게증가 ; 최소간세포세포질공포화 ; 16,238 mg/kg bw/day: 암수에서체중증가량감소 ; 수컷에서최소신장병변 ; 간무게증가 ; 최소간세포세포질공포화 ; 수컷에서정자밀도감소와비정상적정자 - 144 -

증가 ; 암컷에서발정주기증가 연구자의결론 : NOAEL (90d-oral) = 1068/1425 mg/kg bw/day for the male/female mouse ( 참고문헌 21). B. 랫드와마우스에대한아만성피부섭취 1) 랫드에대한 90 일피부독성 (1985-88) 성별과그룹당 10마리의 F344/N 랫드에게 13주동안일주일에 5일씩아세톤에녹인 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 mg/kg bw/day 농도의벤조페논-3을주었다. 0.25 ml/rat의일정한양을견갑부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24시간과그후매주마다다듬었다. 아세톤의제조용물질의안정성을분석했다. 임상적증상, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은일정한간격으로모든동물에서시행하였다. 혈액학과혈액생화학실험과뇨분석을위한샘플들은시험기간 12주차와 3일, 15일에채취했다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0, 12.5, 50, 200 mg/kg bw/day 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도를용량으로변환했다 ): 12.5 mg/kg bw/day: 망상적혈구수감소 25 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 50 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 ; 혈소판수증가 100 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 ; 혈소판수증가 200 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 ; 혈소판수증가 ; 림프구증가증생성에의한전체혈액세포후증가 연구자의결론 : NOAEL (90d-dermal) = 200 mg/kg bw/day for the male/female rats ( 참고문 - 145 -

헌 21). 2) 마우스에서 90 일피부독성 성별과그룹당 10마리의 B6C3F1 마우스에게 13주동안일주일에 5일씩아세톤에녹인 0, 22.8, 45.5, 91, 182, 364 mg/kg bw/day 농도의벤조페논-3을주었다0.25 ml/rat의일정한양을견갑간부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24시간과그후매주마다다듬었다. 아세톤의제조용물질의안정성을분석했다. 임상적증상, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은일정한간격으로모든동물에서시행하였다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0, 22.8, 91, 182, 364 mg/kg bw/day 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 모든용량에서, 수컷랫드에서상대적신장무게가증가하고부고환의정자밀도가감소하였 다. 다른이상반응은관찰되지않았다. 결론 : NOAEL (90d-dermal) = 364 mg/kg bw/day for the male/female mice ( 참고문헌 21). 2.3.4.3. 반복투여독성에대한제출문의연구자들의전체결론 반복경구투여후전신독성은낮았고효과는현재국제적으로허용하는제한용량인 1000 mg/kg bw/day 범위안이거나그위용량에서주로관찰되었다. 음식섭취감소와무게증가량억제의형태에서전신독성의비특이적증상과견주어볼때, 확인된표적장기는특히고용량에서혈액생화학변화와관련있는신장과간이였다. 흔히대부분의민감한값들은간무게증가였다. 그러나, 어떠나조직병리학적연관성없이이효과는그차제로는이상반응을반영할수없고가역반응으로알려진적응할수있는대사반응으로여겨진다. 아만성경구투여후, 랫드의 3000 mg/kg bw/day 이상과마우스의 13000 mg/kg bw/day 이상의고용량에서선택적으로생식파라미터들의장애가보고됐다. 랫드와마우스에서 13주반복피부적용은각실험에서연구한최고농도까지물질과관련있는믿을수있는국소적이나전신적결과가없었다. 마지막으로, 경구투여후아만성독성의신뢰할만한 NOAEL값은랫드에서 6250 ppm - 146 -

(429/393 mg/kg bw/day in male/females) 과마우스에서 6250 ppm (1068/1425 mg/kg bw/day in males/females) 이였다. 각최대용량에서아만성피부적용에서신뢰할만한 NOAEL값은랫드에서 200 mg/kg bw/day와마우스에서 364 mg/kg bw/day 였다. 2.3.5. 면역독성 (Immunological toxicity) 독성자료없음 2.3.6. 신경독성 (Neurotoxicity) 독성자료없음 2.3.7. 생식 / 발생독성 (Reproductive / Development toxicity) 2.3.7.1. 생식독성선별시험 랫드 / 마우스 A. 경구생식독성선별시험 1) 랫드에대한 90 일경구독성종료후생식독성예비선별 성과그룹당 10마리의 R344/N 랫드에게 13주동안식이로벤조페논-3을 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도로주었다. 시험이종료했을때, 물질의잠재적생식독성을선별하기위해몇몇특정실험을시행했다. 수컷동물에대해서는고환, 부고환과꼬리무게, 정자의운동성과형태, 그리고꼬리조직당정자의수를관찰했다. 암컷에대해서는처녀검사시험과발정주기에대해서관찰했다. 효과들을다음에기록했다 ( 식이농도를용량을변환 ) 204 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 828 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 - 147 -

3,458 mg/kg bw/day: 수컷 : 오른쪽꼬리, 고환과정소상체관무게감소 ; 꼬리조직당정자 수감소 암컷 : 주기길이연장 결론 : NOAEL ( 생식 ) = 828 mg/kg bw/day ( 암수랫드 ) ( 참고문헌 17, 21) 2) 마우스에대한 90 일경구독성종료후생식독성예비선별 성과그룹당 10마리의 B6C3F1 마우스에게 13주동안벤조페논을 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도로식이섭취하였다. 실험종료후, 물질의잠재적생식독성을선별하기위해측정실험을하였다. 수컷에서는고환, 부고환과꼬리무게, 정자의운동성과형태, 그리고꼬리조직무게당세포수를관찰하고암컷에서는처녀검사시험과발정주기에대해서관찰했다. 효과들을다음에기록했다 ( 식이농도를용량을변환 ) 554 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 2,860 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 16,238 mg/kg bw/day: 수컷랫드에서꼬리조직당정자수가감소하고비정상정자발생증가 결론 : NOAEL ( 생식 ) = 2,860 mg/kg bw/day ( 암수랫드 ) ( 참고문헌 16, 20) 3) 마우스의연속교배를통한생식성평가 (RACB) (1991) 연속교배프로토콜 은미국국제독성학회프로그램에서사용되는시험디자인이다. 관련있 는 4 가지시험법 ( 아래그림 ) 으로구성되어있고시험하는모든화합물에대하여모두필수사 항은아니다. 수행된시험에서, 1 번실험은성별당 CD-1 마우스 8 마리에게벤조페논 -3 을 0; 1,000; 2,100; 4,700; 10,200; 15,700 mg/kg bw/day 농도로 14 일동안식이섭취로구성된다. 연속교배동안 - 148 -

( 실험 2), 성별당 20마리의그룹에 1,850; 3,950; 9,050 mg/kg bw/day 용량의시험물질을포함하는식이를주었고대조군은성별당 40마리의마우스에게보충물없이식이로주었다. 먹이를주는것은교배하기 1주일전에시작했고 21일동안계속주었다. 이기간동안마우스는 14주동안 ( 실험기간은 2-17주 ) 같이있었다. 5마리의새끼들이전체연구동안태어났다. 종료시험에는임상적증상, 체중, 음식섭취, 생식성과생식력파라미터와자손에대한발달종점을관찰했다. 성별에따른영향을결정하기위한 1주일교차교배시험 ( 시험 3) 은생식력장애가나타나지않았기때문에이연구에서는실시하지않았다. 마지막으로시험 4에서는, 실험 2의마지막자손을이용해서자식의발달에대해서연구했다. 이자손은교배까지키웠다 (72 ± 10일 ). 성성숙에서다른자손들의암수동물들을교배했다. 이상태에서의관찰은교미마개존재를확인하기위해추가한부모와동일했다. 체중을측정하고부검전에 12일질세척을하여발정주기를관찰했다. 수컷에서, 부고환의정자운동성, 정자의형태와정자수를측정했다. 실험이종료됐을때부검을했고, 장기무게를측정하고조직병리검사를위해보관했다 ( 특히생식장기 ). - 149 -

효과들을다음에기록했다 : 1,850 mg/kg bw/day: 실험 2 의 20 일동안 5 마리의어미사망 3,950 mg/kg bw/day: 자손수감소 ; 어미체중감소 ; 실험 2 의 20 일동안 5 마리의어미사망 9,050 mg/kg bw/day: 자손수감소 ; 어미체중감소 ; 실험 2 의 20 일동안 9 마리의어미사망 결론 : NOAEL ( 생식력 ) = 8600/9500 mg/kg bw/day ( 암수랫드 ) ( 참고문헌 8, 23) B. 피부생식독성선별검사 1993 년에발표된짧은논문은벤조페논-3을 0, 20, 100, 400 mg/kg bw/day 용량으로 13주반복피부적용후암컷 B6C3F1 마우스에대하여벤조페논-3의생식독성잠재성을평가했다. 생식장기무게, 꼬리의부고환정자농도, 운동성과비정상적정자그리고고환의정자세포농도를검사하고고환의조직검사를했다. 검사한생식성파라미터들에서체중증가량이나이상이보고되지않았으므로벤조페논-3의국소적용은 400 mg/kg bw/day 농도까지수컷 B6C3F1 마우스에대해서생식독성이없없다고보여진다. 결론 : NOAEL ( 생식 ) = 400 mg/kg bw/day ( 암수마우스 ) ( 참고문헌 14) 2.3.7.2. 최기형성 랫드 경구 시험일자 : 2004 년 11월 1-16일가이드라인 / 방법 : Annex V to Dir. 67/548/EEC, Method B.31; OECD Guideline 414 동물종 / 계통 : WI(Han) Wistar rat 집단크기 : 용량당교미된 25마리암컷시험물질 : Benzophenone-3 배치 : 101 순도 : 99.8% (GC-FID) 용량 : 0, 40, 200 and 1000 mg/kg bw/day 경로 : 경구 ( 위관영양법 ) GLP/QAU: Signed documents available - 150 -

벤조페논-3을콘오일에현탁시켜 40; 200; 1,000 mg/kg bw/day 용량으로위관영양법으로용량당교미된 25마리의암컷랫드에게교배후 6일동안투여했다. 표준용량으로 5 ml/kg bw을각용량당사용했다. 대조군으로는 25마리암컷랫드에게콘오일을동시에주었다. 음식섭취량과체중은실험기간동안일정하게기록했다. 건강상태는매일확인했다. 교배한 20일에모든암컷들을부검하고전체조직병리 ( 열리지않은자궁과채반의무게측정포함 ) 를검사했다. 각어미들에대해서, 황제수를측정하고삽입부위의분포 ( 재흡수로살아있고죽은태아구별 ) 을결정했다. 태아를자궁에서제거하고성별과무게측정등외부적관찰을했다. 그후에, 각새끼의태아절반은연조직결과와골격 ( 연골포함 ) 결과에대해나머지태아들을검사했다. 효과들을다음에기록했다 : 40 mg/kg bw/day: 어미, 임신변수나태아에대해서시험물질과관계있는효과없음 200 mg/kg bw/day: 투여바로직후 3/25 랫드들에서일시적타액분비 ; 임신파라미터들이나태아에대해서시험물질과관련있는효과없음 1,000 mg/kg bw/day: 투여직후일시적타액분비 ; 붉은색을띄는뇨 ; 음식섭취률과체중증가량감소 ; 골격변화 ( 다른두개골과경동맥궁의불완전골형성, 과잉 14번째갈비뼈 ) 로태아 / 새끼의비율이약간증가와전체변화의비율증가 ; 임신파라미터들에대해서시험물질과관련된효과없음. 그러므로벤조페논 -3 은최기형성영향을보이지않고어미와태아의발생독성에대한 NOAEL 은 200 mg/kg bw/day 이다 ( 참고문헌 10). 2.3.8. 변이원성 / 유전독성 (M utagenicity / Genotoxicity) 2.3.8.1. 변이원성 / 유전독성 in vitro 연구 1) In vitro 박테리아복귀돌연변이시험 (Ames test) 벤조페논 -3 의 Ames test 에관한결과들은많은연구들 (1980-1992) 에나와있다. 일반적으로 - 151 -

시험물질들은대사활성화 (S9 mix) 가있거나없는상태둘다에관해서복귀돌연변이실험을했다. TA97, TA98, TA100, TA1535 와 TA1537 계 Salmonella typhimurium 을사용하였고 S9이있거나없을상태에서다양한농도의벤조페논-3에노출시켰다. 양성대조군은시험법의민감도와유효성을설명하기위해포함했다. 박테리아독성은시험한계통 (TA97, TA98, TA100, TA1535 와 TA1537) 에서 333 μg /plate와 1000 μg /plate 이상의농도에서다양한정도가관찰됐다. 동일한논문에서, Salmonella typhimurium TA 97을추가실험을하였고 30% S9 햄스터 mix를사용했을때약한복귀돌연변이가보였다. 그러나, 각각의대조군과비교했을때 10% 햄스터나 10% 와 30% 랫드 S9 mix을사용한경우에는효과가보이지않았고복귀돌연변이체수의증가는용매대조군과비교해서 2배보다작았으며용량반응관계도없었다. 벤조페논-3은 3-333 μg /plate 사이의농도에서시험에사용된모든박테리아계통에대해서복귀돌연변이체유도에대해서음성으로보여졌다. 다른논문들 (TA 97을포함하지않음 ) 도 Ames test 에대해서벤조페논-3이음성이라고나타났다. 벤조페논-3이 S9 mix이있거나없는상태에서 Salmonella typhimurium계의염기쌍변화나유전자구조이동에의한유전자변이원성을유발시키지않는사실을고려해보면, 벤조페논-3은 Ames test에서비변이원성으로보여진다. 특정 S9 mix에서매우강한농도를사용한계통에서나타난약한양성반응은상관없다고보여진다 ( 참고문헌 7, 21, 28, 58). 2) 중국햄스터난소세포에대한염색체이상 In vitro 시험 미국국제독성프로그램보고서 (1992) 는중국햄스터난소세포를이용한세포유전학시험에서 Arcolor 1254 로유발시킨수컷 Sprague Dawley 랫드간의 S9이있을때벤조페논-3은자매염색분체교환 (5-50 μg /ml 범위의유효량 ) 과염색체이상 (20-45 μg /ml) 을유발한다고간략하게설명했다. 한시험은의심가는결과를도출했지만또다른연구에서는명백한음성이나타났다 ( 참고문헌 21). 2.3.8.2. 변이원성 / 유전독성 in vitro 연구 1) In vivo 소핵시험 ( 마우스에대한 90 일경구독성연구에대한추가시험 ) 미국국제독성학프로그램의보고서 (1992) 는마우스에대한 90 일독성연구에서말초혈액도 - 152 -

말을소핵의정색소성적혈구의빈도로분석했다. 벤조페논 -3 을경구로 16,238 mg/kg bw/day 농도까지투여한암수마우스에서증가하지않았다 ( 참고문헌 21). 2) in vivo 랫드골수염색체이상시험 1995 년의한논문은암수랫드에게단회나반복 (5일연속 ) 으로경구투여하여벤조페논-3의 in vivo 세포유전학잠재성을어떻게연구하는지에대해서나타내었다. 시험물질들은콘오일에녹였고 0; 500; 1,670; 5,000 mg/kg bw/day 용량으로단회투여하거나 0와 5000 mg/kg bw/day용량으로반복투여하였다. 녹혈을양성대조군물질로사용하고 20 mg/kg bw/day 용량으로단회투여하거나 5일연속으로반복으로경구투여했다. Bomodeoxyuridine 측정을위해이전에수행된세포주기동태연구들은벤조페논-3을 5,000 mg/kg bw/day 단회경구투여하거나 5일연속으로투여한후평균세대기간에영향을주기않기때문에, 골수세포수집시간대는단회투여후 8시간과 12시간그리고반복투여후에는 12시간으로설명했다. 골수세포도말을준비하고 fluorescence-plus Giemsa 로염색하여각동물당 50 metaphase spread 의총양을염색체이상에대해서측정했다. 또한, 분열지수를결정하고배수체와내재복제된세포들의비율을분석했다. 물질과관련된사망은발생하지않았다. 단회투여나 5일연속투여는세포주기를방해하지않았고평균세대기간에영향을주지않았다. 암수랫드의골수세포에서염색체이상의빈도는증가하지않았다. 성별차이는보이지않았다. 시험법의감도를확인하기위한양성대조군물질은염색체이상을일으켰다. 그러므로암수 Sprague-Dawley 랫드에게 5,000 mg/kg bw/day 용량까지단회투여나반복을하면염색체이상을유발시키지않으므로벤조페논-3은 in vivod서염색체의구조적이상잠재성이없다고보여진다 ( 참고문헌 41). 2.3.8.3. 변이원성 / 유전독성결론 박테리아와포유류의 in vitro 시험법으로벤조페논-3을연구했을때, 유전독성 / 변이원성잠재성은대사활성화가있거나없을때 Salmonella typhimurium계통의 3가지박테리아유전자돌연변이분석에서나타나지않았다. 흔치않게높은비율을가지는대화활성화후단일계통에서보고된영향은상관없다고여겨진다. - 153 -

포유류세포방법에서, 벤조페논 -3 은염색체구조적잠재성과대사활성화가없는상태에서 SCEs 를유도하는능력이없다고나타났다. 대사활성화가있을때, 구조적이상 SCE 비율의 증가와관련있는경미한농도나비농도를보고했다. In vivo 에서벤조페논 -3 은 13 주동안식이섭취후의마우스소핵시험과랫드에대한염색체 이상시험에서음성을나타냈다. 그러므로, in vitro 에서관찰된의심스러운효과는 in vivo 상황 에대해서연관성을가지않는다고보여진다. 2.3.9. 발암성 (Carcinogenecity) 독성자료없음 2.3.10. 광독성 (Phototoxicity) 2.3.10.1 광독성 1) In vitro 광독성 3T3 Neutral Red 흡수광독성시험 (3T3 NRU PT) 의 ECVAM 4 타당성연구에서, 벤조페논-3 은 in vitro 방법의정확성과재현성을확인하기위해 UV-filter로포함되었다. 3T3 NRU PT 시험에서시험물질의몇가지농도 ( 보통 8개 ) 로 60분간배양된 Balb/c 3T3 마우스섬유아세포를사용했다. 그후에, 세포들을 50분동안모의태양광에노출시켰다. 24시간후에 NRU (Neutral Red Uptake) 를측정하고각각의 EC 50 값은대조군과비교하여 NRU가 50% 감소된시험물질의농도로규정했다. 나중에광자극지수 (PIF) 를측정했다. PIF가 5이상이면, 시험물질은광독성이있다고여겨진다. 화학물질이 +UVA 경우에만세포독성이있고 UVA일때없을경우, 특정컴퓨터소프트웨어를사용해평균광효과 (MPE) 를계산했다. MEP경우, 완벽한농도반응곡선과비교를토대로한결과가 0.1 이상이면시험물질이광독성이있다고판단했다. In vitro 3T3 NRU PT 프로토콜에따라서시험한 11개에서, 벤조페논-3은 PIF 값이 2.7을넘고 MPE 값이 0.195 인한경우를제외하고는광독성에대한각각의기준아래였다 ( 참고문헌 48). - 154 -

벤조페논-3에대한또다른 3T3 NRU PT 시험에서도광독성이나타나지않았다. 이결과는각각사람의적혈구와양의적혈구를사용한광용혈시험과헤모글로빈광산화시험에의해서뒷받침된다. 두가지연구모두에서벤조페논-3은광독성잠재성이보이지않았다 ( 참고문헌 37, 39). 시험유기체의 Saccharomyces Cerecisiae 나 Escherichia Coli plasmid 를사용한또다른 in vitro 시험에서도벤조페논 -3 은광독성이보이지않았다 ( 참고문헌 31, 36). 2) 기니피그에대한 In vivo 광독성 5마리의 albino Hartley 기니피그에게 petrolatum 에 10% 녹아있는벤조페논-3을미리면도하거나털을뽑은두곳의등피부에 0.05 ml을적용했다. 적용부위중한곳에는알루미늄호일을덮었다. 30분후, 알루미늄호일로덮지않은부분에 60분간 UV-A를조사시켰다. 피부반응은조사후, 표준점수체계 (0-4 등급 ) 에따라서 24시간과 48시간에평가했다. 어떤농도, 적용부위와시간대에서피부반응은나타나지않았다 ( 참고문헌 34). 2.3.10.2. 광감작성 3T3 NRU PY 연구로는광독성과광감작성을구별할수없기때문에다양한물질의광알러지와광자극을구별하기위해새로제안된 in vitro 방법인사람혈청알부민광결합과히스티딘광산화시험법으로벤조페논-3을시험했다. 벤조페논-3은이연구에서광독성과광알러지반응이나타나지않았다 ( 참고문헌 34). 2.3.10.3. 광독성과광감작성 : 사람 발표되지않은논문들 (1978-1980) 에서벤조페논-3이 3.5% 까지포함된자외선차단제나다른화장품제품들에대한임상안전평가를하였다. 이논문들은벤조페논-1, -3, -4, -5, -9와 -11의안전평가에대한최종보고서 (J. American Coll. Toxicol. 2, 1983) 로평가되었다. 이결과에따르면벤조페논-3은화장품구성요소로사용할때광독성이나광알러지반응이나타나지않았다 ( 참고문헌 13, 20, 54) - 155 -

벤조페논 -3 을포함하여많은 UV-filter 를이용한많은광도포시험의결과를다음표에요약 했다. 연구기간 피험자수 국가코드 시험물질 양성반응 * Remark 참고문헌 1985-1990 187 USA Benzophenone-3 PABA** Pentyl dimethyl PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane 9 1 2 5 0 - 자외선차단제에대한대부분의반응은마지막 3 년동안관찰됐다. - 시간이지날수록벤조페논 -3 의알러지반응이증가하는경향이있다. 15 1990-1993 108 IT Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane Isopopropyl Dibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-methoxycinnamate 4-MBC 4 1 0 0 2 0 0 0 벤조페논 -3 에의한광접촉성피부염은증가확산되어더많이확인되고있다. 55 1982-1992 283 DK Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC 35 3 14 0 5 3 0 0 이전연구들과같이, 벤조페논-3은시험한피험자에대해서광접촉성피부염의주요원인이고광접촉성피부염은접촉성피부염보다더많이발생한다 53 1981 402 DE 1990-1996 355 SV Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC Benzophenone-3 PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate 4-MBC 9 2 2 13 32 4 10 5 15 2 6 8 3 0 대부분의광알러지반응은 UVA 범위에서발생한다그러므로일반적인자외선차단제에대한이상반응보고서는등기소에보고되어야한다. 광접촉성반응이접촉성반응보다훨씬더많았다 43 6 1990-1994 370 FR Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane 21 1 1 4 7 2 벤조페논 -3 에대한대부분의양성반응은 1993 년전에분석했다. 프랑스에서 UV-filer 는더이상자외선차단제에사용되지않고다른 30-156 -

Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC 0 1 화장품제품에서만사용된다. 2002 1 USA Benzophenone-3 1 벤조페논 -3 에대하여즉각적이고지연된과민성반응이발생했다. 32 1991-1997 1261 Cent ral EU Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC * 양성반응은광접촉성알러지로제한했다. 직접접촉알러지는계산하지않았다. 8 3 0 2 7 2 5 1 49 ** PABA = Para-amino Benzoic Acid 2.3.11. 에스트로젠잠재적영향시험 1) 22 일된미성숙암컷랫드에대해서벤조페논 -3 의자궁비대확인시험을수행했다. 화합물은 4 일연속으로경구투여하여 4 개의그룹으로실험했다. 대조군으로는 DES-SP 를사용했다. - 참기름에대하여 0, 500, 1000 mg/kg/day S38 용량 - 참기름에대하여 5 µg/kg/day 용량으로대조군 적절한대조군을포함시켰다. 프로토콜은 OECD 가이드라인에서요구하는프로토콜을따르지않았지만, GLP 상태에서실험했다. 약물투여는사춘기개시와가까운 26일까지투여했다. 통계적으로의미있는체중증가량감소는 0-1 일사이동안실험한동물군의 1000 mg/kg/day S38의용량에서관찰됐다. 양성대조군에서는자궁의무게 ( 절대적과상대적무게 ) 가눈에띄게증가했다. S38은자궁의성장을촉진시키지않았으므로에스트로겐활성이없다고보여진다. 업계에서는 UV-filter 에가능한 4가지자궁비대반응시험을만들었고 2가지는벤조페논-3 ( 경구투여 ) 과 OMC( 경구투여 ) 와함께 4-MBC ( 피하와경구투여 ) 로실험하였다. 4개의연구결과에서자궁비대반응이나타나지않았고 3가지 UV-filter 에대해서 1000 mg/kg/day까지용량 3-4 일연속으로미성숙암컷 Sprague-Dawley 나 Wistar 랫드에게투여했다. - 157 -

4-MBC 연구에서만 OECD 가이드라인은따라서엄격하게실험했고 199 mg/kg/day 용량에서자궁의무게가확실히증가한 Schlumpf et al (2001) 의연구에서 4-MBC 는가장활성화한 UV-filter 로나타났지만자궁비대활성에대한증거는없었다. 같은연구에서 BP-3은 1.500 mg/kg/day의용량에서약한반응을보였지만업계에서실시한연구에서 1000 mg/kg/day의용량에서자궁비대효과를발견할수없었다. 1.500 mg/kg/day 용량은 OECD 가이드라인에서제시한최고용량보다더높은용량이므로음성결과가나타난걸로보인다. 그러므로벤조페논-3은 Schlumpf 등의연구와업계의결과들과비슷하다고여겨진다. 또한벤조페논-3에대한음성결과는필라델피아에서개최한 SOT 미팅의포스터발표부분에서 Baker 등 (2000) 에의해보고되었다. fot드에투여한벤조페논-3의약 1% 는 p-hydroxy-benzophenone 으로대사된다고이미알려져있고, p-hydroxy-benzophenone 은에스트로겐에영향이있을수도있다 ( 참고문헌 42). 또한, 10% 벤조페논-3이포함된자외선차단제와 10% 벤조페논-3이포함된다른자외선차단제가국소적용후인체에서흡수되고내인성생식호르몬농도에영향을주는지에대해서최근연구되었다. 맹검시험에서, 32명의건강한피험자 (15명의젊은남성과 17명의폐경기여성 ) 의전체몸에매일자외선차단제 10% (wt/wt) 가없거나 (1주일) 있는 (2주일) 기본크림제형 2 mg/ cm2국소적용했다. 벤조페논-3은흡수되었다. 여성에서최고혈장농도는 200 ng/ml 이고남성에서는 300 ng/ml 이였다. 여성의뇨에서는약 60 ng/ml이검출되었고남성의뇨에서는 140 ng/ml이검출되었다. 벤조페논이 10% 포함된자외선차단에의노출은연구한호르몬 (FSH, LH, SHBG, estradiol, inhibin B, testosterone) 중어떤것에도영향을주지않았다. 관찰된사소한변화는알려지고정상적인생물학적변화로여겨진다 ( 참고문헌 29). 게다가, 벤조페논-3이에스트로겐수용체 (ER) α와 β, 에스트로겐수용체동족수용체 1 (ERR1) 과아릴탄화수소수용체 (AhR) 의발현형태에영향을주는지에대해서암컷 Sprague-Dawley fot드에게매일 5일동안벤조페논-3을 250과 1,000 mg/kg bw의용량을위관영양법으로투여했다. 그결과, 벤조페논-3은자궁비대효과와 ER α 전사체발현억제효과가나타나지않았고자궁에서약긴나타나는 ER β의유전자발현도나타나지않았다. 이러한결과들은현재알려지지않은 uterus remians에대해서중요한기능적의미가있다. 자궁에서감소된 ER β는작은차이에대한지표가될수있고급증한 ER α에의한확산의활성도를높여준다. 자궁에대한 AhR의유전자발현은관찰되지않았다 ( 참고문헌 44). - 158 -

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제 5 장세부참고문헌 - Chatelain et al., Skin penetration and sun protection factor of five UV filters: effect of the vehicle. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 16:28-35 (2003) - Ma, R., Cotton, B., Lichtensteiger, W., Schlumpf, M., UV Filters with antagonistic action at androgen receptors in the MDA-kb2 cell transcriptional-activation assay. Toxicol. Sci. 74,43?50. (2003) - Mestres et al., Benzophenone-3 entrapped in solid lipid microspheres: formulation and in vitro evaluation. I nt J Pharm 400:1-7 (2010) - O Connor, J. C., Cook, J. C., Craven, S. C., Van Pelt, C. S., and Obourn, J. D. An in vivo battery for identifying endocrine modulators that are estrogenic or dopamine regulators. Fundam. Appl. Toxicol. 3, 182-195. (1996) - Reel, J. R., Lamb, J. C., and Neal, B. H. Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34, 288-305. (1996) - Schlumpf M, Schmid P, Durrer S, Conscience M, Maerkel K, Henseler M, Gruetter M, Herzog I, Reolon S, Ceccatelli R, Faass O, Stutz E, Jarry H, Wuttke W, Lichtensteiger W. Endocrine activity and developmental toxicity of cosmetic UV filters-an update. Toxicology. 205(1-2):113-22. (2004) - Schlumpf, M., Cotton, B., Conscience, M., Haller, V., Steinmann, B., Lichtensteiger, W., In vitro and in vivo estrogenicity of UV screens. Environ. Health Perspect. 109, 239-244. (2001) - Vilela et al., Effect of ultraviolet filters on skin superoxide dismutase activity in hairless mice after a single dose of ultraviolet radiation. Eur J Pharm Biopharm 80:387-92 (2012) - 167 -

간지 편집순서 7 : 세부연구과제의연구결과 제 2 세부연구개발과제연구결과 세부연구개발과제명 : 호모살레이트에대한위해평가연구 세부과제책임자 : 유선동 / 성균관대학교약학대학 / 약제학 ( 약물동태학 ) - 168 -

Ⅲ. 제 2 세부연구개발과제연구결과 제 2 세부연구개발과제요약문 과제번호 12172 화의안 451 주관과제명세부과제명세부연구책임자 자외선차단성분의리스크프로파일링연구 호모살레이트에대한위해평가연구 성 명 유선동 생년월일 소속기관명 성균관대학교약학대학 전자우편 전화번호 031-290-7757 연구목표 (400~600 자 ) 화학적자외선차단제인호모살레이트에대한위해성평가가최종목표이다. 이를위한세부적목표로는 1) 동물실험을이용한호모살레이트의피부로의노출도평가, 2) 필요한경우지속적노출시호모살레이트의체내동태확인, 3) 알려진 toxicity criteria 와노출용량및노출도간의상호분석을통한위해도결정, 4) 배합한도 10% 의타당성검토이다. 또한, 국제적인위해평가네트워크형성을통한선진위해평가기술의습득이연구목표이다. 연구내용 (1000~1200 자 ) 호모살레이트에대한위해평가 ( 피부투과도측정및약물동태의확인 ) 를위하여, 1) LC-MS/MS 를이용한기제와생체시료에포함된호모살레이트의미량분석법확립, 2) 기제에따른호모살레이트의피부투과도평가, 3) 호모살레이트정맥투여시조직분포및체내동태확인, 4) 호모살레이트경피투과에의한전신노출도평가, 5) 경피투과에의한전신노출도와이를통한위해도평가, 6) 배합한도의타당성검토가주요한연구내용이다. 또한, 국제심포지움을통한선진위해평가기술습득및국제적위해평가정보교류가연구내용이다. - 169 -

연구성과 ( 응용분야및활용범위포함 ) (400~600 자 ) 호모살레이트를랫드의피부에노출시생체이용률이 5.3% 정도로낮았으며, 정맥주입후주요장기에서의분포는대장과소장에많이분포하였으며, 고환에서가장적은분포를나타내었다. 호모살레이트는피부에오래머물며지속적으로방출되는경향을확인하여, 자외선차단제적용후가능한신속하게세척해내는것이안전한사용의한방법임을보여주었다. 산출된안전역은 36.6으로 100보다낮았다. 일반적으로이러한수치는안전약이충분히확보되지않는것으로여겨지지만, 호모살레이트의경우 1) 피부흡수량을생체이용률을적용하여매우가혹한조건을가정하였으며, 2) 호모살레이트는체내에서신속히분해한다는대사의특징, 3) 표적장기로여겨지는고환에서상대적으로매우낮은혈액-조직분배계수를가지는특성으로 36.6 의안전역으로도충분한안전역을확보했다고사료된다. 따라서, 호모살레이트의허용최대배합한도 10% 에서는안전하다고판단된다. 이러한결과는자외선차단성분중배합한도성분인호모살레이트의위해평가를통해정책결정기초자료를제공할수있다. 화장품원료에대한네거티브시스템의과학적근거마련의근거를제공한다. 위해요소에대한자체교육자료로활용하여위해성평가자들의기술적자질향상을통하여위해성평가및위해관리에보다능동적이고과학적인대응이가능하다. 세부참여연구원성명소속기관성명소속기관 유선동 성균관대학교약학대학 추현욱 성균관대학교약학대학 김태환 성균관대학교약학대학 신승우 성균관대학교약학대학 김민기 성균관대학교약학대학 신범수 대구가톨릭대학교약학대학 Keywords (5 개내외 ) 한글호모살레이트위해평가자외선차단제경피투과화장품원료 Risk Cosmetic 영문 Homosalate Sunscreen Transdermal assessment ingredient 연구목표, 연구내용, 연구성과를서술형으로기재함 연구성과는그간의연구결과및기대성과를서술함 - 170 -

제 2 장세부연구개발과제의연구목적 1. 세부연구개발과제의목적 가. 연구배경 자외선차단제는기능성화장품의일종으로그구성성분은화장품원료규격에수재되 어있으며사용시허용함량은식품의약품안전청장고시로관리되어오고있다 (Table 1). Table 2-1. 자외선차단제의국내고시성분및허용함량 (K FDA, 2009) 성분명 허용함량 글리세릴파바 0.5%~3% 드로메트리졸 0.5%~7% 디갈로일트리올리에이트 0.5%~5% 4-메칠벤질리덴캠퍼 0.5%~5% 멘틸안트라닐레이트 0.5%~5% 벤조페논-3 0.5%~5% 벤조페논-4 0.5%~5% 벤조페논-8 0.5%~3% 부틸메톡시디벤조일메탄 0.5%~5% 시녹세이트 0.5%~5% 에칠헥실트리아존 0.5%~5% 옥토크릴렌 0.5%~10% 에칠헥실디메칠파바 0.5%~8% 에칠헥실메톡시신나메이트 0.5%~7.5% 에칠헥실살리실레이트 0.5%~5% 파라아미노벤조익액시드 0.5%~5% 페닐벤즈이미다졸설포닉액시드 0.5%~4% 호모살레이트 0.5%~10% 징크옥사이드 25% 티타늄디옥사이드 25% 이소아밀 p-메톡시신나메이트 10% 비스-에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진 10% 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트 산으로써 10% 드로메트리졸트리실록산 15% 디에칠헥실부타미도트리아존 10% 폴리실리콘 -15 ( 디메치코디에칠벤잘말로네이트 ) 10% 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀 10% 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드및그염류 산으로써 10% 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트 10% 본과제의연구대상물질인 homosalate 는 295-315 nm 의자외선을주로흡수하는 UVB 자외선흡수제에속하며, 자외선차단제품중약 45% 의제품에서다른자외선 - 171 -

차단제와병용혹은단독으로사용되고있다. 현재국내에서판매되고있는자외선차 단제중일부한방제제와물리적자외선차단제를제외한대다수의제품은 homosalate, benzophenone-3, 3-octyl-methoxycinnamate, 4-methylbenzylidene camphor 등의화학적자외선차단제를포함한다. 이러한화학적자외선차단성분에대하여내분비계교란작용중하나인 estrogenic activity 및 antiandrogenic activity 를판단하기위하여수행된연구결과, homosalate 는 MCF-7 cell line과 MDA-kb2-cell line에서유의적인 estrogenic 및 antiandrogenic activity 를나타내었다 (Schlumpf, 2004, Ma, 2003). 각각 의 cell line에서 homosalate 의 EC 50 은 MCF-7 cell line에서 1.56 μm, MDA-kb2-cell line에서 5.57 μm로나타났으며대표적인내분비계교란자외선차단성분으로알려진 benzophenone-3, 3-octyl-methoxycinnamate 그리고 4-methylbenzylidene camphor 에비하여동일용량에서현저히높은활성을나타내었다. 또한화학적자외선차단성분들에대한 in vitro 실험결과 estrogen-regulated protein 인 ps2 protein 의농도가 4-methylbenzylidene camphor, homosalate, benzophenone-3 군에서유의적으로증가하였다 (Schlumpf et al., 2001). Table 2-2. 자외선차단제의국내고시성분및허용함량 (KFDA, 2009)In vitro estrogenic and androgenic activities of various UV filtering agents 에스트로겐이자궁비대의주요원인임에기인하여 (O' Connor et al., 1996; Reel et al., 1996), homosalate 및다수의화학적자외선차단성분을랫드에단회경구투여후자궁비대반응시험 (Uterotrophic assay) 을수행한결과, 자궁비대효과는대조군과비교하여유의적인차이가없는것으로나타났다. 다만 homosalate 의체내축적의가능성을배제 - 172 -

할수없고특히장기간적용하는자외선차단제의사용특성상단회투여를통한실험만으로는 in vivo에서 homosalate 의내분비계장해효과를입증하기는한계가있다. 따라서이전연구와별도로내분비계장애작용을나타내는벤조페논-3와호모살레이트의노출도평가를통한위해성평가는매우중요한의미를갖는다. Figure 2-1. Effect of UV screens 4-MBC (10 μm), HMS (50 μm), BP-3 (10 μm), OMC (10 μm), OD-PABA (10 μm), B-MDM (10 μm), and E 2 (10 pm) on ps2 protein secretion by MCF-7 cells. Bars indicate mean ps2 protein concentration in culture medium (pg/ml) ± SEM; numbers inside the bars indicate the number of independent experiments). * p < 0.05, ** p < 0.001 (ANOVA followed by Bonferroni pairwise comparisons) as compared to controls that received chemical-free medium. 나. 연구목적 본연구는현재자외선차단제성분으로널리사용되면서내분비계교란의심물질인호모살레이트에대한위해성평가를목적으로수행되었다. 이를위하여설정한세부연구개발목표는 (1) LC-MS/MS를이용한기제와생체시료에포함된호모살레이트의미량분석법확립, (2) Franz diffusion cell 을사용한기제에따른호모살레이트의 in vitro - 173 -

피부투과도평가, (3) 호모살레이트정맥투여시조직분포및체내동태확인, (4) 호모살레이트경피투과에의한전신노출도평가였다. 이상의세부연구를통하여얻어진결과를바탕으로투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계를규명하였으며, 이에근거하여호모살레이트의위해도를평가하고배합한도의타당성을검토하는것을과제의최종목적으로세부연구를진행하였다. 다. 연구범위 (1) 세부연구개발의추진체계 (2) 기제와생체시료에포함된호모살레이트의미량분석법확립 Homosalate 의농도분석에관한문헌으로는수질검사를위한물에서의호모살레이트의분석법 (Rodil et al., 2009), 기제를 tape로 stripping 하여제거한각질층에포함된호모살레이트의분석법 (Chaltelain et al., 2003) 그리고생체시료에포함된호모살레이트의분석법 (Sarveiya et al., 2004) 등이보고되어있다. 그러나기제에서확립된분석법은 - 174 -

본연구의활용에적합하지않고또한생체시료에서확립된분석법은정량한계가 100 ng/ml로분석감도가낮아서호모살레이트의체내동태를규명하기에부적합하다. 따라서본연구에서는생체시료중호모살레이트의농도를측정하는데적합한고감도의신뢰성있는 LC-MS/MS 분석법을개발하였다. (3) 기제에따른호모살레이트의 in vitro 피부투과도평가호모살레이트의 in vivo 피부투과시험에사용할기제를선정하기위해서 Franz diffusion cell 방법으로 in vitro 피부투과도를평가하였다. 호모살레이트를포함하는기제로 vaseline base, oily solution, lotion, gel 등보편적으로피부적용에사용되는동시에서로다른특성을대표하는 4종의 formulations 를제조하여사용하였다. In vitro 피부투과시험에는 male Sprague-Dawley 계흰쥐의등피를적출하여사용하였으며평형상태에서호모살레이트의투과속도, 투과계수, 그리고시험종료시점에서피부에잔존하는호모살레이트의양을정량하여각기제에대한투과도를평가하였다. (4) 호모살레이트의정맥투여시체내동태및조직분포확인호모살레이트의체내동태를규명하기위해서랫드에호모살레이트를정맥투여한후일정시간간격으로채혈하였다. 채혈한혈액을전처리하여 LC-MS/MS 분석법으로혈중호모살레이트의농도를정량하였고얻어진농도-시간데이터로부터혈중호모살레이트의약동학적특성을평가하였다. 정맥주사실험에서얻은호모살레이트의체내동태파라미터를활용해서목표하는혈장농도를얻는데필요한초회용량 ( 정맥주사용량 ) 과유지용량 ( 등속주입속도 ) 을산출하였다. 산출된투여속도로호모살레이트를등속정맥주입한후정상상태 (steady-state) 에서조직분포특성을확인하였다. 랫드의경정맥과대퇴정맥에각각 polyethylene tube를삽관하였으며대퇴정맥을통하여 24시간동안호모살레이트를주입하였다. 혈중호모살레이트가정상상태에도달했을때랫드를 sacrifice 한후각장기를취하여전처리하고 LC-MS/MS 방법으로시료중호모살레이트의농도를측정하여조직분포를확인하였다. (5) 경피투여시호모살레이트의전신노출도평가경피투여시호모살레이트의전신노출도를 in vivo에서평가하였다. 시험에사용된제형은 in vitro 투과도평가시험에서투과도가가장높게나타난기제를선정하였으며 10% 함량으로제조하여랫드의 scapular 부위에적용하였다. 이후일정시간간격으로 - 175 -

경정맥을통하여채혈하였고채혈한혈액은전처리후 LC-MS/MS 방법으로분석하였 다. (6) 호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성검토호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성을검토하기위하여호모살레이트의체내동태특성, 조직분포도, 피부투과도및전신노출도자료로부터투여용량-혈중농도- 조직농도간의상관관계를규명하였다. 얻어진자료와호모살레이트의 toxicity criteria 로부터위해도및최대배합한도의타당성을검토하였다. 2. 세부연구개발과제의목표달성도 연구개발목표달성도 (%) 생체시료중호모살레이트의정량을위한고감도 LC-MS/MS 분석법확립 Franz diffusion cell을사용한기제에따른호모살레이트의 in vitro 피부투과도평가정맥투여시호모살레이트의조직분포특성과체내동태확인및투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계규명 100 100 100 경피투여시호모살레이트의전신노출도평가 100 호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성평가 100-176 -

제 3 장세부연구개발과제의내용및방법 1. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한호모살레이트의분석법개발 가. In vitro 시료중호모살레이트의정량을위한 HPLC/UVD 분석법 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험에서얻은시료중호모살레 이트의농도를정량하기위해서 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 확립된분 석법의검량범위는 0.1 100 μg/ml 이었으며분석조건을아래표에나타내었다. Table 2-3. HPLC analysis of homosalate Chemical and reagents Homosalate : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Methanol, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments HPLC system Integrator Analytical Column Waters 2690 HPLC system with Waters 2487 Dual λ absorbance detector (Waters, Milford, MA, USA) Scientist (Micromath, Saint Louis, MO, USA) Luna C 18 column (250 x 4.60 mm i.d., 5 µm, Phenomenex, Torrence, CA, USA) Chromatographic conditions Mobile phase methanol : 0.01% acetic acid = 90 : 10 Calibration range 0.05 100 μg/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 1.5 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume Absorbance λ 50 μl 306 nm 호모살레이트를메탄올에용해시켜서 1 mg/ml 농도의표준원액을제조하고이동상으 로희석하여호모살레이트의농도가각각 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml 가되도록검 량표준시료를제조하여사용하였다. 분석결과산출된호모살레이트의피크면적을가지고 - 177 -

weighted regression (1/x) 을적용하여작성하였다. 분석법의검증은 0.1-100 μg/ml 농도에서정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 으로표현하였다. 정확성은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성은각농도값의변동계수 (CV) 를이용하였다. 나. 생체시료중호모살레이트의정량을위한 LC-M S/M S 분석법개발 In vivo 노출도평가를위해서혈장및조직중호모살레이트의농도를정량할수있 는고감도의 LC-MS/MS 분석법을개발하였다. 분석에는혈장또는분쇄된조직시료 를사용하였으며 acetonitrile 을가하여단백질침전법으로전처리하였다. 검량선의작성은 blank sample 50 μl가담긴차광처리된 Eppendorf tube에 acetonitrile 로용해한호모살레이트표준용액을가하여호모살레이트혈장농도가 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 ng/ml 그리고분쇄된조직농도가 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 2000 ng/ml이되도록검량표준시료를제조하였다. 여기에 acetonitrile 에용해한옥틸살리실레이트내부표준용액 ( 혈장분석용표준용액농도 = 100 ng/ml; 조직분석용표준용액농도 = 200 ng/ml) 과침전용매로서 actetonitrle 을가하여총부피가원래시료량의 5배가되도록하였다. 이혼액을 1분간 vortexing 하고 10분간 4000 g에서원심분리한후상층액을분리하였다. 혈장전처리시료의경우에는얻어진상층액을바로 LC에주입하였고분쇄된조직전처리시료의경우에는상층액에동량의 acetonitrile 을가하여다시한번전처리과정을반복한후 LC에주입하였다. 검량선은내부표준물질의피크면적에대한호모살레이트의피크면적비를사용하여가중치 1/x를적용한 weighted linear regression 방법으로작성하였다. 동물실험에서얻어진시료는분석전까지 20 에서보관하였다. 분석직전시료를상온에방치하여녹인후처리하였으며전처리과정은상기한표준시료에대한전처리과정과동일하였다. 시료에포함된호모살레이트의농도계산은얻어진크로마토그램으로부터내부표준물질의피크면적에대한호모살레이트의피크면적비를구하여검량선으로부터산출하였다. 분석법의검증은정량한계 (LLOQ: 0.5 ng/ml), 저농도 (20 ng/ml), 중농도 (100 ng/ml) 그리고고농도 (900 ng/ml) QC 시료를상기한검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였으며정밀성 (precision) 은각농도값의변동 - 178 -

계수 (CV) 를이용하였다. 자세한분석조건을아래표에나타내었다. Table 2-4. LC-M S/M S analysis of homosalate in rat plasma Chemical and reagents Homosalate : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Formic acid : Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA) Acetonitrile, distilled water (all HPLC grades) : JT Baker, Inc. (Phillipsburg, NJ, USA) Instruments LC-MS/MS system Integrator Analytical Column API 4000 coupled with Agilent 1100 HPLC system (AB MDS Sciex, Toronto, Canada) Analyst 1.4 (AB MDS Sciex, Toronto, Canada) Kinetex C 18 column (50 x 2.10 mm i.d., 2.6 µm) Chromatographic conditions Mobile phase (plasma) acetonitrile : 0.05% formic acid = 82.5 : 17.5 Mobile phase (tissue homogenates) acetonitrile : 0.05% formic acid = 70 : 30 Calibration range (plasma) 0.5 1000 ng/ml (r 2 > 0.999) Calibration range (tissue homogenates) 5 2000 ng/ml (r 2 > 0.999) Flow rate 0.2 ml/min Column oven temperature 30 C Injection volume 10 μl M S/M S conditions Ion mode Mass transition ESI (positive), multiple reaction monitoring 263.2 139.0 (homosalate), 251.2 139.0 (octyl salicylate, internal standard) Turbo gas temperature 350 C Sample preparation Plasma Tissue homogenates one-step protein precipitation with acetonitrile two-step protein precipitation with acetonitrile - 179 -

2. 기제에따른호모살레이트의 in vitro 투과도평가 가. 호모살레이트를함유하는제제의제조 기제에따른호모살레이트의투과도를확인하기위하여대표성을나타내는 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를문헌을참고하여제조하였다 (Chatelain et al., 2003, Mestres et al., 2010, Vilela et al., 2012). 각제제중호모살레이트의함량은시판자외선차단제중호모살레이트의배합한도 (10% w/w) 에기준하여제조하였으며각기제의구성은아래에나타내었다. Table 2-5. Composition of different formulations containing homosalate Vaseline Oily solution Lotion Gel Homosalate (10%) Homosalate (10%) Homosalate (10%) Homosalate (10%) Vaseline (90%) Miglyol (13.7%) Miglyol (13.7%) Miglyol (13.7%) - Mineral oil (72.3%) Neutrogena (75.8%) Carbomer 940 (1.1%) - Bees wax (4.0%) Surfactant (0.5%) Poloxamer 188 (2.0%) - - - - - - - - - - - - - - - EDTA Na (1.0%) Methyl paraben (1.0%) NaOH (10.0%) Surfactant (0.5%) DW (64.3%) 나. 호모살레이트의용해도측정 Franz diffusion cell 을이용한호모살레이트의피부투과도평가는 sink condition 이전 제되어야하므로 receptor phase 에서시험물질의용해도가중요한인자가된다. 본연구 - 180 -

에서는 sink condition 의확보를위해서 5% (v/v) Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에대한호모살레이트의용해도를평가하였다. 아울러투과도시험에서 receptor phase 중호모살레이트의안정성을확보하기위해서투과시험기간에서호모살레이트의농도변화추이를확인하였다. 다. 피부투과시험방법 랫드피부의적출 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 의피부를적출하여시험에사용하였다. 랫드는 diethyl ether 로치사시켰으며등부위의털은전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모했다. 대략 5 5 cm면적으로피부를등부위에서적출한후피부가상하지않도록조심스럽게피하지방을제거하였다. 얻어진랫드피부는실험에사용할때까지 -20 에서유리판에잘펴서보관하였고보관기간은일주일을넘지않도록하였다. 기제에따른호모살레이트의피부투과도측정 호모살레이트를함유하는 4 종의제제에대한호모살레이트의피부투과도를 Franz diffusion cell 방법으로측정하였다. Receptor phase 로는 5%(v/v) Tween 80 을함유하는 ph 7.4 인산염완충액 (0.02 M) 을사용하였으며 600 rpm 으로일정하게교반하면서항온순 환펌프를이용하여 37 ± 0.5 로온도를유지하였다. Receptor phase 와접촉하는피부의 면적은약 1.766 cm2이었고 receptor phase 의용량은 10 ml이었다. 보관한랫드피부를시험직전에상온에서서서히해동시키고 37 의 receptor phase 에약 1시간동안적신후 donor compartment 와 receptor compartment 사이에끼우고피부의표면은실온에노출시켰다. 그리고 donor compartment 를떼어낸후노출된피부의표면에각제제 200 mg을적용하고 donor compartment 를덮어고정시켰다. 제제적용후 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 시간에각각 0.2 ml의 receptor phase 를채취하고즉시동량의인산염완충액을보충하였다. 최종시료를채취한직후피부를 Franz diffusion cell 로부터분리하여 tape stripping method 로각질과진피층으로분리하여이부위에함유된호모살레이트농도및 receptor phase에서의농도를 HPLC-UV 분석법으로정량하였다. 경피흡수자료의분석 - 181 -

피부의단위면적당투과한호모살레이트의양을시간에대한함수로나타낸아래식에 따라서투과 parameter 를산출하였다. J s = 1 A ( dq dt ) 이식에서 A 는투과가일어나는피부의면적 ( cm2 ), (dq/dt) 는평형상태에서단위시 간당피부를투과하는시험물질의양 ( μg /hr), J s 는평형상태에서의투과속도 ( μg / cm2 /hr) 를 나타낸다. 3. 랫드에서호모살레이트의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시호모살레이트의체내동태 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 투여용액의제조지용성물질인호모살레이트를정맥투여하기위하여 Tween 80:ethanol:PEG 400:saline (5:20:25:50, v/v%) 으로구성되는 o/w emulsion 을제조하여호모살레이트를용해시켰다. 투여용량은 1, 3, 9 mg/kg의 3 용량이었다. 각용량의투여시사용한호모살레이트용액의농도및투여용액의부피를아래에나타내었다. Table 2-6. Homosalate concentrations in the dosing vehicle and the volume of the dosing vehicle administered Dose (mg/kg) Homosalate concentration (mg/ml) Dosing volume (ml/kg) 1 0.5 2 3 1.5 2 9 4.5 2-182 -

호모살레이트투여및시료채취랫드에호모살레이트를정맥주사하기 12시간전사료를제거하여절식시켰다. 투여는세용량의 (1, 3, 9 mg/kg) 호모살레이트를 penile venous injection 하였다. 호모살레이트를정맥주사한후 8시간시점에서다시사료를공급하였다. 투여전및투여후 2, 5, 15, 30, 60분, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36시간에채혈하였다. 각채혈시간마다 jugular vein에서 0.2 ml를채혈하였으며채취한혈액을 4000 g에서 10분동안원심분리하여얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용해서호모살레이트의혈장농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. 투여용량에따른약동학적파라메터의비교는 SPSS (SPSS Inc, USA) 를이용하여통계학적차이를확인하였다. 나. 정맥주입시호모살레이트의체내동태및조직분포 실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서자유롭게사료와물을공급하였다. 랫드는시험전 1주동안 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 수술 Male Sprague-Dawley rats에 Zoletil 50을 20 mg/kg 용량으로복강주사하여마취시킨후 jugular vein과 femoral vein에 polyethylene tubing (0.58 mm i.d., 0.96 mm o.d., Natume, Tokyo, Japan) 을삽관하였다. 수술후최소 2일간의회복기를둔후정맥주입시험을시행하였다. 호모살레이트의정맥주입및시료채취 호모살레이트가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주 사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하는방법으로투여하였 - 183 -

다. 초기정맥투여용량 (D L ) 의설정은단회정맥주사시험에서얻은분포용적 (Vd, ss = 6.47 L/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 100 and 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 등속정맥주입속도는단회정맥주사시험에서얻은클리어런스 (Cl = 55.8 ml/min/kg) 에목표하는정상상태에서의농도 (C ss, 100 and 200 ng/ml) 를곱하여산출하였다. 투여용액은정맥투여시험에서와동일한방법으로제조하였다. 각군당투여된용액의농도, 부피, 호모살레이트투여량을아래표에나타내었다. 호모살레이트의투여는수술후 2일간의회복기를둔후비절식상태에서수행하였다. Table 2-7. Target plasma concentrations, homosalate concentrations in the dosing vehicle, the volume of the dosing vehicle administered and the dosing regimens for the simultaneous i.v. injection plus infusion of homosalate Target C ss (ng/ml) Loading bolus i.v. injection Conc (mg/ml) Dose (mg/kg) Vehicle vol (ml/kg) Conc (mg/ml) M aintenance i.v. infusion Dose (mg/kg/hr) Vehicle vol (ml/kg/hr) 100 0.35 0.65 2 0.19 0.34 1.79 200 0.65 1.3 2 0.375 0.67 1.79 혈액시료는투여전및투여후 2, 4, 8, 12, 24 hr 시점에서 jugular vein으로부터 0.2 ml 씩채혈하였다. 채혈이후즉시동량의 heparinized saline (50 IU/ml) 을보충해주었다. 채취한혈액은 4000 g에서 10 분간원심분리한후혈장을취하고 -20 에서분석시까지보관하였다. 정맥등속주입을시작한후 24 hr 시점에서채혈한후랫드를안락사시키고뇌, 심장, 폐, 간, 위, 소장, 대장, 비장, 신장, 고환등의조직을채취하였다. 일정한부피의식염수를각조직에가한후 homogenizer 를사용하여균질화하였다. 시료는분석시까지 -2 0 에서보관하였다. 정상상태에서호모살레이트의혈장및조직농도는최종채혈시간인 24 hr의농도로표현하였으며조직분배계수 (K p ) 는정상상태에서호모살레이트의혈장대비조직농도의비로산출하였다. 4. 경피투여시호모살레이트의전신노출도평가 - 184 -

실험동물실험동물로 Sprague-Dawley 계랫드 (male, 체중 230 ± 20 g, Samtako Co., Ltd, Osan) 를사용하였고실험기간동안 plastic cage 에서사료와물을자유롭게공급하였다. 랫드는시험전 1주일간 23 ± 2, 습도 50 ± 10%, 12/12 hr light/dark cycle 의사육조건에서적응기를거치도록하였다. 호모살레이트의투여및시료채취 In vivo 경피투여시험은 in vitro 호모살레이트피부투과도시험에서가장높은투과도를나타낸 gel formulation 에대하여수행하였다. Gel 기제중호모살레이트의함유량은 10% 이었으며, 이전과동일한방법으로 miglyol, carbomer 940, poloxamer 188, EDTA Na, methyl paraben, NaOH, surfactant, DW 등을사용하여제조하였다. 경피투여시험직전랫드를 diethyl ether 로마취시킨다음등부위를대략 5 5 cm면적으로전기제모기 (Electric clipper Model 808, Daito Electric Co., Osaka, Japan) 로제모하였다. 제모한랫드의피부를 ethanol 로조심스럽게닦아낸후 3 3 cm면적에 200 mg의 gel 을고르게펴서적용하였다. 이때경피에적용된호모살레이트의용량은 20 mg 이었다. 혈액시료는투여전및투여후 6, 12, 24, 36, 48, 72, 96시간에채취하였다. 정해진시점에서 0.2 ml의혈액을 jugular vein으로부터채혈하고 4000 g에서 10분간원심분리한다음얻어진혈장을 20 에서분석시까지보관하였다. Data analysis Non-linear least squares regression program 인 WinNonlin (Pharsight, NC, USA) 을이용하여호모살레이트의혈중농도-시간데이터로부터 non-compartmental pharmacokinetic parameters 를산출하였다. - 185 -

5. 호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성평가 정맥투여후얻어진호모살레이트의체내동태및조직분포자료그리고경피투과시험으로부터얻어진호모살레이트의혈중농도자료로부터투여용량-혈중농도-조직농도간의상관관계를규명한다. 또한, 기존에보고된독성자료특히, 반복투여독성자료에서산출된 NOAEL를이용하여안전역 (Margin of Safety) 를다음과같이산출한다. 안전역 (Margin of Safety)=NOAEL/ 전신노출량 (Systemic exposure dose) 위식은일반적으로유해물질의유해용량과노출용량간의비교를통하여현재의노출 이얼마만큼안전한지를개략적으로보여준다. 일반적으로식품이나화장품의경우, 100 이상이면노출수준이적절하다고판단한다. 호모살레이트의최대배합한도인 5% 의타당성을검토한다. 6. 호모살레이트의위해도평가서 (Risk profile) 작성 호모살레이트의안전성관련각종문헌과본연구의결과를토대로호모살레이트의위해 도평가서를작성하였다. 호모살레이트의물리화학적특성에서부터독성및노출량등 안전성관련제반사항을작성하여호모살레이트의안전성관련정리자료로활용한다. - 186 -

제 4 장세부연구개발과제의결과및고찰 1. HPLC 및 LC-M S/M S 를이용한호모살레이트의분석법개발 가. In vitro 시료중호모살레이트의정량을위한 HPLC/UVD 분석법확립 시험에사용된 4 종류의기제및 in vitro 경피투과시험으로부터얻어진시료중호모살레이트의정량은 HPLC/UVD 분석법을확립하여사용하였다. 물질의특성상 peak 의모양은 double peak 로관찰되었으나두 peak 의비율이농도에따라변하지않았기때문에감도가뛰어난 12.5 min의 peak 를정량하였다. 물질의분석에영향을주는간섭 peak 는관찰되지않았다. 검량범위내호모살레이트의크로마토그램을아래에나타내었다. Figure 2-2. Representative chromatogram of homosalate in receptor phase. 상기한바와같은분석조건에서호모살레이트의검량범위는 0.1 100 μg/ml 이었다. 해당검량선의전형적인계산식은 y = 54.77x + 1.5832 (r 2 = 0.9999) 로우수한직선성을 나타내었다. - 187 -

6000 5000 y = 54.77x + 1.5832 R² = 0.9999 Response (peak area) 4000 3000 2000 1000 0 0 20 40 60 80 100 120 Homosalate concentration (µg/ml) Figure 2-3. Representative calibration curve for the determination of homosalate. 분석법의검증은 0.1 100 μg/ml 농도에서시행하였으며아래표에서보는바와같 이우수한정확성 (accuracy) 과정밀성 (precision) 을나타내었다. Table 2-8. A ccuracy and precision for the HPLC assay of homosalate (n=3 each) Concentration ( μg/ml) A ccuracy (%) Precision (%) 0.1 92.8 2.2 0.5 93.6 5.9 1 99.0 2.4 5 100.2 0.3 10 101.3 1.0 50 100.1 0.3 100 100.1 0.1-188 -

나. 생체시료중호모살레이트의정량을위한 LC-M S/M S 분석법확립 정량을위한 MRM mass transition 은양자화된이온의감도와 product ion scan의감도를평가하여결정하였으며호모살레이트와내부표준물질옥틸살리실레이트의 MRM mass transition 은각각 263.2 139.0 와 251.2 139.0 에서수행하였다. 호모살레이트와내부표준물질의 product ion mass spectra 를아래그림에나타내었다. m/z 139.0 m/z 139.0 Figure 2-4. The product ion mass spectra of protonated homosalate and octyl salicylate. Blank 혈장및표준혈장 (LLOQ 0.5 ng/ml, 1000 ng/ml) 을분석하여얻은크로마토그램을아래그림에나타내었다. 호모살레이트와내부표준물질의 retention time은각각 2.59 및 2.79 분이었으며분석에영향을미치는방해 peak 는공혈장의크로마토그램에서관찰되지않았다. - 189 -

(A) (B) Figure 2-5. MRM chromatograms of (A) homosalate (HMS) and (B) octyl salicylate (OS) obtained for the blank rat plasma (left), plasma spiked with HMS (0.5 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (center), and plasma spiked with HMS (1000 ng/ml) and OS (100 ng/ml) (right). 호모살레이트검량표준시료 (0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 500, and 1000 ng/ml) 를 LC-MS/MS로분석하였을때얻어진검량선의전형적인계산식은 y = 0.0219x + 0.00819 (r 2 = 0.9994) 이었다. 검량선은 0.5-1000 ng/ml의농도범위에서양호한직선성을나타내었다. - 190 -

Figure 2-6. Representative calibration curve for the determination of homosalate in rat plasma (y= 0.0219x + 0.00819, r 2 = 0.9994). LC-MS/MS 분석시혈장시료를정량한계 (LLOQ, 0.5 ng/ml), low QC (20 ng/ml), medium QC (100 ng/ml) 및 high QC (900 ng/ml) 농도에서상기의검체처리방법으로분석하였다. Intra-day 평가는하루에 5번시행하였고, inter-day 평가는 5일간반복시행하여분석하였다. 정밀성 (precision) 은호모살레이트와내부표준물질의피크면적비의표준편차를평균값으로나눈비의백분율 (%) 로서구하였고, 정확성 (accuracy) 은검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로구하였다. Inter-day 와 intra-day 의판정기준은정량한계 (LLOQ) 의경우정밀성이 20% 이하이고, 정확성이 80-120% 인조건을만족하는농도로구하였으며, 나머지 low, medium, high QC의경우정밀성은 15% 이하그리고정확성은 85-115% 범위에위치하는지의여부를판정기준으로하였다. 아래표에혈장중 intra-day 정확성과정밀성, 그리고 inter-day 의정확성과정밀성을나타내었다. Intra-day 와 inter-day 모두판정기준을충족시켰으며이때얻어진정량한계 (LLOQ) 는 0.5 ng/ml이었다. - 191 -

Table 2-9. Intra-day and inter-day accuracy and precision of homosalate assay Concentration (ng/ml) Intra-day (n=5) Inter-day (n=5) Accuracy (%) Precision (%) Accuracy (%) Precision (%) 0.5 104.0 6.5 102.2 5.4 20 96.5 2.7 100.1 4.7 100 95.1 2.7 100.7 4.8 900 92.8 5.2 96.3 4.5-192 -

2. 기제에따른호모살레이트의 in vitro 투과도평가 가. 호모살레이트를함유하는제제의제조 기제에따른호모살레이트의투과도를확인하기위해서대표적인 4종의제제 (vaseline base, oily solution, lotion, gel) 를제조하였다. 각제제에함유된호모살레이트의양은시판되는자외선차단제호모살레이트의배합한도 (10% w/w) 에기준하여제조하였다. In vitro 투과도시험조건에서호모살레이트는기제가적용되는 48시간동안안정한것으로확인되었다. 호모살레이트를함유하는 vaseline base, oily solution, lotion, gel 제제가제조되어피부에적용되기전외관을아래에나타내었다. Vaseline Oily solution Lotion Gel Figure 2-7. Typical vaseline, oily solution, lotion and gel formulations containing homosalate (10 % w/w). 나. 호모살레이트의용해도측정및안정성확보 Franz diffusion cell 을이용한호모살레이트의 in vitro 피부투과도측정시일정한 투과도의유지를위해서는 receptor phase 에서 sink condition 의유지가필수적인조건 이므로그에적합한용해도를확보하는조건의확립이중요하다. 따라서본실험을위하 - 193 -

여확립한 receptor phase가일정량이상의호모살레이트를용해하는지여부를확인하였다. Tween 80을함유하는 ph 7.4 인산염완충액에서호모살레이트의용해도를평가하였으며그결과 10 mg/ml 이상의용해도가확보되어호모살레이트의투과도측정을위한 in vitro 시험에서 sink condition 이유지됨을확인하였다. 또한시료채취가이루어지는투과시험기간동안호모살레이트의안정성이유지되는지여부를확인하였다. 호모살레이트를 receptor phase에용해시킨후 (10 μg/ml) 37 에서 48시간농도변화를측정한결과유의적인변화가없어그안정성이확인되었다. 경시변화에따른호모살레이트의농도변화추이를아래에나타내었다. S ta bility (%) 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 0 12 24 36 48 Time (hr) Figure 2-8. Stability of homosalate in the receptor phase kept at 37 (n=4) 다. 기제에따른피부투과도 호모살레이트를함유하는 4 종의제제에대한호모살레이트의피부투과도를 Franz diffusion cell 방법으로 48 시간에걸쳐서측정한결과모든제제에서 receptor phase 에서 의호모살레이트의농도가 HPLC 분석감도 (0.1 μg/ml) 이하로검출되었다. 투과시험종 - 194 -

료시점인 48시간에서각질층과각질을제외한피부에잔존하는호모살레이트의양을정량한결과 lotion 의경우에각각 2.06% 및 1.77%, oily solution 의경우에각각 1.54% 및 1.47%, vaseline 의경우에 2.36% 및 2.14% 가잔존하였다. 이에비해서 gel의경우에는각각투여량의 14.73% 및 6.88% 의호모살레이트가잔존하여타 3종의제제에비하여 gel 제제적용군에서유의적으로높게나타났다. Gel 기제적용시피부에잔존하는총량은투여량의 21.6% 로 4종의제제중가장높았다. 그결과 in vivo 경피투여시험에서호모살레이트의전신노출도를측정하는대상제제로 gel 제형을선정하였다. Homosalate (% of applied dose) 20.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 Vaseline (n=6) Oily solution (n=6) Lotion (n=6) Gel (n=6) * * Epiderm + Derm Stratum Corneum (Strips) Liquid receptor Figure 2-9. Penetration of homosalate into the skin layers for vaseline, oily solution, lotion, and gel formulations (mean ± S.D.). Gel was significantly different from vaseline, oily solution, and lotion (1-way A NOVA, post hoc; Tukey s test, p< 0.05). - 195 -

3. 랫드에서호모살레이트의체내동태및조직분포특성규명 가. 정맥주사시호모살레이트의혈중체내동태 절식한랫드에호모살레이트를 1, 3, 9 mg/kg 용량으로단회정맥투여한후얻어진 호모살레이트의평균혈중농도 - 시간곡선을아래에나타내었다. 정맥투여시호모살레 이트의시간에따른농도추이는 multi-compartmental 특성을나타내었다. 10000 1000 Concentration (ng/ml) 100 10 1 0.1 0 6 12 18 24 30 36 Time (hr) Figure 2-10. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after i.v. injection at doses of 1,3, and 9 mg/kg (n=6, each). 혈중농도-시간데이터를 non-compartmental 방법으로분석하여산출한약동학적파라메터의평균을아래표에요약하였다. 호모살레이트를 1, 3, 9 mg/kg 용량으로정맥주사한후얻어진소실반감기 (t 1/2 ), 정상상태에서의분포용적 (Vd ss ), 전신클리어런스 (Cl), 곡선하면적 (AUC) 은각투여군간에유의적인차이를보이지않았다. 즉, 호모살레이트는정맥주사용량 1-9 mg/kg 범위에서체내동태가 1차속도론을따르는선형체내동태를나타내었다. 산출된수치들은정맥주입시호모살레이트의초회투여용량및 - 196 -

정맥주입속도를결정하는근거데이터로활용하였다. Table 2-10. Pharmacokinetic parameters of homosalate after i.v. injection of homosalate at doses 1, 3, and 9 mg/kg in rats Dose (mg/kg) t 1/2 (hr) AUC (ng.hr/ml) Vd ss (L/kg) Cl (ml/min/kg) 1 8.2 ± 4.2 371.5 ± 193.2 6.6 ± 5.2 53.1 ± 20.1 3 7.7 ± 1.4 774.9 ± 86.6 7.8 ± 1.4 65.2 ± 7.3 9 8.7 ± 4.0 3076.1 ± 302.4 5.0 ± 0.4 49.2 ± 5.0 나. 정맥주입시호모살레이트의혈중체내동태및조직분포 랫드에서얻고자하는호모살레이트의정상상태에서의혈장농도를 100 및 200 ng/ml로설정하여동시단회정맥주사및 24-hr 등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 하였다. 이때얻은혈중농도-시간프로필을아래그림에나타내었다. 단회정맥투여시얻어진호모살레이트의반감기는약 8 hr으로정상상태농도의 90% 에도달시간은약 24 hr으로예측되었다. 본실험에서는호모살레이트가정상상태에도달하는시간을단축시키기위해서동시에단회정맥주사및등속정맥주입 (simultaneous i.v. injection plus infusion) 방법으로투여하였다. 따라서정맥주입시작 24 hr 이전에호모살레이트의혈중농도가정상상태에도달한것으로추정되었다. 호모살레이트정맥주입후 24 hr에서 C ss = 100 ng/ml 목표군에서의실측농도는 107.2 ± 7.2 ng/ml이었고 C ss = 200 ng/ml 목표군에서의실측농도는 209.3 ± 22.1 ng/ml 이었다. 따라서 24-hr i.v. infusion 시험에서얻어진결과가단회정맥주사시험에서얻어진결과와일관성이있게나타나 in vivo 시험의신뢰성을확인할수있었다. - 197 -

Homosalate concentration (ng/ml) 300 250 200 150 100 50 0 Css : 100 ng/ml Css : 200 ng/ml 0 4 8 12 16 20 24 Time (hr) Figure 2-11. Plasma homosalate concentration-time profiles following simultaneous i.v. bolus injection plus infusion. The i.v. bolus loading dose and the i.v. infusion rate were 0.65 mg/kg and 0.34 mg/kg/hr, respectively, for the low target plasma concentration (100 ng/ml, lower profile) and 1.3 mg/kg and 0.67 mg/kg/hr, respectively, for the high target plasma concentration (200 ng/ml, upper profile). 정맥등속주입시작후 24 hr 시점에서혈장, 신장, 간, 비장, 폐, 심장, 고환, 위, 소장, 대장, 뇌에서측정된호모살레이트의농도데이터및혈장-조직분배계수 (K p ) 를아래표에나타내었다. C ss = 200 ng/ml 목표군에서측정된호모살레이트의농도는혈장, 신장, 비장, 폐, 심장, 위, 대장, 뇌에서 C ss = 100 ng/ml 군에비해높게나타났다. 간, 고환, 소장에서의차이는유의적이지않았다. 혈장농도대비조직농도분배계수 (K p ) 는모든조직에서투여용량에무관하여용량간에유의적인차이를나타내지않았다. 호모살레이트의 K p 값은소장, 대장, 위, 뇌의순으로높게나타났으며독성장기로추정되는고환에서는타장기조직에비하여매우낮았다. - 198 -

Table 2-11. Mean concentrations of homosalate in tissues determined under steady state conditions Tissues Target Css : 100 ng/g (n=6) Target Css : 200 ng/g (n=7) Plasma 107.2 ± 7.2 209.3 ± 22.1 Kidney 206.0 ± 51.3 510.2 ± 195.1 Liver 99.8 ± 15.3 206.0 ± 121.5 Spleen 116.8 ± 35.2 351.0 ± 158.0 Lung 153.6 ± 54.4 331.6 ± 144.0 Heart 220.2 ± 100.0 615.9 ± 166.1 Testis 33.27 ± 11.8 42.2 ± 18.3 Stomach 311.1 ± 84.4 758.4 ± 307.7 Small intestine 880.9 ± 471.6 1232.0 ± 562.4 Large intestine 505.6 ± 236.5 1288.2 ± 402.3 Brain 301.3 ± 91.2 638.2 ± 108.9 t-test (p<0.05, 100 ng/ml vs 200 ng/ml) Table 2-12. Mean plasma-to-tissue partition coefficients (K p ) of homosalate calculated under steady state conditions Tissues Target Css : 100 ng/g (n=6) Target Css : 200 ng/g (n=7) Kidney 1.9 ± 0.4 2.4 ± 0.8 Liver 0.9 ± 0.1 1.0 ± 0.5 Spleen 1.1 ± 0.3 1.7 ± 0.8 Lung 1.4 ± 0.5 1.6 ± 0.6 Heart 2.0 ± 0.9 2.9 ± 0.7 Testis 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.1 Stomach 2.9 ± 0.7 3.6 ± 1.4 Small intestine 8.3 ± 4.3 5.8 ± 2.2 Large intestine 4.8 ± 2.3 6.2 ± 1.8 Brain 2.8 ± 0.7 3.1 ± 0.4-199 -

2000 1800 1600 Tissue concentration of homosalate (ng/g) Css : 100 ng/g (n=6) Css : 200 ng/g (n=7) * Homosalate concentration (ng/g) 1400 1200 1000 800 600 * * * * * * 400 200 * 0 Plasma Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Figure 2-12. Average concentrations of homosalate in tissues at steady state. *t-test (p< 0.05, 100 vs 200 ng/ml target concentrations) Brain Plasma to tissue partition coefficient value (Kp) of homosalate 14 Css : 100 ng/g (n=6) Css : 200 ng/g (n=7) 12 10 Kp of homosalate 8 6 4 2 0 Kidney Liver Spleen Lung Heart Testis Stomach Small intestine Large intestine Figure 2-13. Average plasma-to-tissue partition coefficients of homosalate in tissues calculated at steady state Brain - 200 -

4. 경피투여시호모살레이트의전신노출도평가 호모살레이트의 in vivo 경피투여시험은 in vitro 피부투과도시험에서가장높은투과도를나타냈던 gel formulation 에대하여수행하였다. 호모살레이트를함유한 gel formulation 을랫드에경피투여 ( 호모살레이트적용량 20 mg) 한후얻어진평균혈장농도-시간곡선을아래그림에나타내었다. 30 Homosalate concentration (ng/ml) 25 20 15 10 5 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Time (hr) Figure 2-14. Average concentration-time profiles of homosalate in rats after percutaneous administration of gel containing homosalate (dose 80 mg/kg, n=5). Gel 제형을경피투여한후경시변화에따른호모살레이트의농도추이는 96시간이상일정한농도가유지되었다. 이는지용성물질인호모살레이트가피부층에오랜시간잔존하면서서서히흡수되어나타난현상으로사료되며 in vitro 피부투과도시험결과와일치하는양상을보였다. 24시간까지전신순환계로흡수된호모살레이트의흡수율은상대생체이용률 (relative bioavailability) 로서 (relative bioavailability = 100. Dose. i.v. AUC transdermal /Dose. transdermal AUC i.v. ) 투여량대비 1.4 ± 0.5% 이었다. 따라서전신순환계로흡수되는호모살레이트의양은 1.4% 이상일것으로추정된다. 다만자외선 - 201 -

차단제를바르고통상적으로 12 시간이내에세척한다고가정했을때의절대생체이용률 은대략 1% 내외 (>0.67% = 6.26. 12/96) 정도로추정해볼수있다. 5. 호모살레이트의위해도평가및배합한도의타당성평가 호모살레이트의위해도평가는독성과노출도를비교하여다음과같이계산되었다. 자외선차단제에서 UV-filter 로사용된 10% 의호모살레이트를고려했을때, 피부흡수양 (5% formulation): 2.4% [ 생체이용률고려 mean (1.4%) + 2 SD (2*0.5%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : 18 g/day 60 kg NOAEL (2 주반복투여독성 - 랫드 ): 100 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 10/100 * 2.4/100) / 60 kg = 0.72 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 100/0.72 = 139 여기서, NOAEL은랫드의 2주반복투여독성시험자료에서산출된 NOAEL값을근거로하였다. 적용량의경우, 전신을도포할경우를가정하여하루 18 g적용을가정하였다. 산출된안전역은 139배확보되어호모살레이트의허용최대배합한도 10% 에서는안전하다고사료된다. 한편, 표적장기인고환에서조직분포를살펴보면, 다른조직및장기보다벤조페논-3의분포가상당히낮았다. 이는혈액-고환장벽 (BTB) 가존재함을알수있다. 따라서, 다른조직장기보다안전한조직이라고판단된다. - 202 -

6. 호모살레이트의위해도평가서 (Risk profile) 작성 다음과같이호모살레이트에대한위해도평가서를작성하였다. 호모살레이트 RISK PROFILE - 203 -

차례 제 1 장. 개요 1.1. 정의및용도 1.2. 물리 화학적특성 1.3. 체내동태 1.4. 분석법 1.5. 위해등급 제 2 장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 2.2. 노출평가 2.3. 독성 제 3 장. 참고문헌 - 204 -

제 1 장. 개요 1.1. 정의및용도 호모살레이트 (CAS No 118-56-9: homosalate. C 16 H 22 O 3 ) 는분자량 262.02 의옅은노란색을띄는액체로 UV 필터로널리사용되는유기화합물이다. Salicylic acid와 cyclohexanol 유도체인 3,3,5-trimethylcyclohexanol 로형성된 ester 형태이다 salicylic acid는 295 315 nm 범위의자외선을흡수하고일광노출에의해피부를보호한다. 소수성 cyclohexanol 은물에용해되는것을막는다. 호모살레이트에대한인체의직접적인노출은호모살레이트가포함된자외선차단제를비롯한다른화장품제품들에대한접촉을통해서일어난다. - 205 -

1.2. 물리 화학적특성 표 1. 호모살레이트의물리 화학적특성 항목 내용 참고문헌 물질명 (INCI) 호모살레이트 (Homosalate) 21, 46, 47 IUPAC명 21, 46, 47 CAS No. 118-56-9 21, 46, 47 화학식 C 16 H 22 O 3 46, 47 분자량 262.02 g/mol 46, 47 구조식 42, 47 물리적성상 옅은노란색을띄는액체 45, 47 녹는점 - 끓는점 165 밀도 (S.G) 1.049-1.053 42 증기압 - ph - 용해도 isopropyl myristate, ethanol (20 ): miscible 물, propylene glycol (20 ): immiscible 46, 48 Log P ow 5.82 & 6.16 42 헨리상수 - 동의어 (synonyms) Benzoic acid, 2-hydroxy-, 3,3,5-trimethylcyclohexyl ester Cyclohexanol, 3,3,5-trimethyl-, salicylate Homomenthyl salicylate m-homomenthyl salicylate Metahomomenthyl salicylate Salicylic acid, 3,3,5-trimethylcyclohexyl ester Salicylic acid, m-homomenthyl ester 3,3,5-Trimethylcyclohexyl 2-hydroxybenzoate 3,3,5-Trimethylcyclohexyl salicylate 21, 46, 47-206 -

1.3. 안정성과광안정성 유통기한 : 2 3 년 ( 참고문헌 46, 49) 광안정성호모살레이트의광안정성은 Suntest CPS Heraeus Xenon lamp (irradiance: 40 W/ m2 (24 min = 1 MED)) 을사용하여연구하는물질을흡수하는 photo-labile UV-A의존재로관찰하였다. Homosalate 가 5 % 포함된 30 mg의에멀전을유리 plate에 10 cm2면적으로펼치고 30분간건조하여시원한상태 (20 ) 에서 5, 10, 15, 20 MED로노출시켰다. 샘플들은 25 ml 에탄올에담근후 UV 분광광도법과크로마토그래피 (HPLC) 를이용하여분석하였다. 호모살레이트의함량은 0-2.7 % 범위에서감소하였으므로이러한상태에서안정한것으로보여진다 ( 참고문헌 23, 48, 50). 게다가 isopropanol 과 cyclohexane 뿐만아니라 mineral oil과 ethanol/water 에희석한용액에서도광안정성을보였다 ( 참고문헌 44). 1.4. 체내동태 1.4.1 흡수 (A bsorption) 1.4.1.1 피부를통한흡수 in vitro 1) 사람피부 Guideline: OECD 428 (Draft, 2000); OECD Guidance Document 28 (2004); Basic criteria for in vitro assessment of cosmetic ingredients (SCCNFP/0750/03, October 2003); Diembeck et al., 1999 Test System: Human skin Substance: 10% Homosalate in a standard sun screen Batch: Non labelled: 4095213 (purity: 99.88% (GLC)) Radiolabelled: CFQ 14329, specific activity: 54 mci/mmol Purity: Non labelled: 99.88% (GLC) radiochemical purity: 99.8% (HPLC) - 207 -

Dose: approx. 3.4 mg dose formulation/0.64 cm2 (corresponding toapprox. 0.5 mg Homosalate/cm2) Skin preparation: Fresh dermatomed human skin from abdominal surgery from 3 female donors Mean thickness (n=6): Donor 1: 397±30 μm Donor 2: 357±13 μm Donor 3: 519±90 μm Skin temperature: 32 C Test chamber: Flow-through automated diffusion cells (PermeGear Inc, Riegelsville, PA/USA) Receptor fluid: DMEM and Ham s F 12 culture medium (3:1) supplemented with hegf, hydrocortisone, gentamycin, glutamine and 10% FCS Solubility: 12 μg/ml in receptor fluid Route: topical application Exposure time: 24 h GLP: in compliance 10 % 표준자외선차단제로 Homosalate 의 in vitro 에서의피부침투를조사했다. 수술을통해얻은사람의피부분절을처리하고연속확산세포를통해발랐다. 온도는주위습도에서 32 를정기적으로확인했다. Receptor fluid를약 1.6 ml/h 속도로끌어올렸다. 완전한제형을시작하루전에준비했다. 재형의균질성과방사능농도를분석했다. 0.64 cm2당약 3.4 mg 농도의자외선차단제제형 ( 약 0.5 mg Homosalate/ cm2 ) 를적용했다. 24시간동안노출시켰다. 노출시키는동안 receptor fluid 샘플을일정간격으로채취했다. 노출 24시간후, 부드러운비누용액과면봉을사용해피부표면을씻었다. 각각의피부는 Dsquame를사용하여 tape stripped 을 10회하였다. 진피조각이있는 tape strip을담궜다. 전체균형을 receptor fluid와피부표면세정, receptor 와 donor compartment 세정, tape strips 그리고 digested skin을사용해결정했다. 방사능은 LBK/Wallac S1414 scintillation counter 로결정했다. 결과 사람피부에서의진피흡수는다음과같다. - 208 -

그룹 A B C 제형에포함된호모살레이트 (%) 10.1 10.1 10.1 용량 ( μg / cm2 ) 544.9 548.0 541.2 생체검사수 6 6 6 24 시간후수용액침투 1.36 μg / cm2 0.25 % of dose 0.87 μg / cm2 0.16 % of dose 0.66 μg / cm2 0.12 % of dose Flux constant ( μgxcm2 /h) 0.077 0.057 0.039 지연시간 6.5 7.0 7.6 전체흡수율 (% of dose) 1.4 0.9 0.9 전체흡수f량 # ( μg / cm2 ) 7.63 4.93 4.87 # total absorption as amount in receptor fluid including wash and skin membrane excluding tape strips 결론 10 % Homosalate 가포함된표준자외선차단제제형을적용한후, Homosalate 의흡수에대한평균 flux constant 는 0.058 μg / cm2이였다. 전체흡수평균은 5.81 μg / cm2에해당하는적용양의 1.1 % 였다. 회복평균은 92.4 % 였다. 가장높은흡수는 A그룹에서가장높은흡수율인 2.0 % (10.9 μg / cm2 ) 와함께 1.4±0.4 % (7.63±2.18 μg / cm2 ) 를보였다 ( 참고문헌 11). 2) 랫드피부 Guideline: OECD 428 (Draft, 2000); OECD Guidance Document 28 (2004); Basic criteria for in vitro assessment of cosmetic ingredients (SCCNFP/0750/03, October 2003); Diembeck et al., 1999 Test System: Rat skin (Sprague-Dawley) Substance: 10% Homosalate in a standard sun screen Batch: Non labelled: 4095213 (purity: 99.88% (GLC)) Radiolabelled: CFQ 14329, specific activity: 54 mci/mmol Purity: Non labelled: 99.88% (GLC) radiochemical purity: 99.8% (HPLC) Dose: approx. 3.4 mg dose formulation/0.64 cm2 (corresponding to approx. 0.5 mg Homosalate/cm2) - 209 -

Skin preparation: Fresh punched out rat skin from 3 female Sprague-Dawley rats Mean thickness (n=6): Rat 1: 669±47 μm Rat 2: 755±73 μm Rat 3: 763±89 μm Skin temperature: 32 C Test chamber: Flow-through automated diffusion cells (PermeGear Inc, Riegelsville, PA/USA) Route: topical application Receptor fluid: MEM (Minimal Essential Medium) supplemented with gentamycin, glutamine and 10% FCS Solubility: 12 μg/ml in receptor fluid Exposure time: 24 h GLP: in compliance 10 % Homosalate 가포함한표준자외선차단제제형을랫드시험하였다. 3마리암컷 Sprague-Dawley 랫드피부를 gentamycin, glutamine과 10 % FCS로보충된 MEM ( 최소필수배지 ) 로구성된 receptor fluid를제외하고위에설명된사람에대한실험과동일한과정으로실험하였다. 결과 랫드의독자생존가능한피부에서진피의흡수결과는다음과같다. 그룹 D E F 제형에포함된호모살레이트 (%) 10.1 10.1 10.1 용량 ( μg / cm2 ) 535.9 535.9 535.9 생체검사수 6 6 6 24 시간후수용액침투 7.12 μg / cm2 1.33 % of dose 19.37 μg / cm2 3.62 % of dose 18.50 μg / cm2 3.45 % of dose Flux constant ( μg x cm2 /h) 0.412 0.997 1.012 지연시간 6.8 4.6 5.7 전체흡수율 (% of dose) 7.4 7.7 11.0-210 -

전체흡수량 # ( μg / cm2 ) 39.66 41.26 58.95 # total absorption as amount in receptor fluid including wash and skin membrane excluding tape strips 결론 10 % Homosalate 가포함된표준자외선차단제제형을적용한후, Homosalate 의흡수에대한평균 flux constant 는 0.807 μg / cm2이였다. 전체흡수평균은 46.62 μg / cm2에해당하는적용양의 8.7 % 였다. 회복평균은 93.1 % 였다 ( 참고문헌 11). 1.4.1.2. in vivo 피부흡수 현재 in vivo에서의피부침투연구에대해과학적이거나규제력을지닌유효성이없다. 오직 Homosalate 를이용한몇몇연구들이출판되었고 open literature 에서가능했다. Tape stripping 방법은 Chatelain et al. (2003) 과 Sarveiya et al. (2004) 에서사용되었다. 두가지연구둘다에서피부를통한침투는최소였고대다수는각질층에남는다고보고하였다. 게다가, Chatelain et al. (2003) 은적용된제형에관해서차이점을관찰했다. 각질층에침투된전체양은 petrolatum jelly 제형보다 O/W 에멀젼에서더높았다. 마지막으로, in vitro 결과로피부침투에대한양적결론은질적결론을제외하고불가능했고각질층은 greatest fraction 을흡수했고오직적은양만흡수되고온몸에생물학적으로이용할수있다고여겨진다 ( 참고문헌 5, 14, 43). 1.4.1.3. 피부흡수에대한결론현재의가이드라인요구사항과 GLP 상태에서실시된 in vitro로사람과랫드의피부흡수를비교한최근연구는피절에서자외선차단제를포함한 10 % Homosalate 의적용이랫드에서는평균 8.7 % (46.62 μg/ cm2에상응하는 ) 이고사람에서는평균 1.1 % (5.81 μg/ cm2에상응하는 ) 를이끈다고나타냈다. 평균회복률은 92.4 % 였다. 가장높은흡수율은가장높은흡수율인 2.0 % 가있는그룹 A에서 1.4 ± 0.4 % (7.63 ± 2.18 μg/ cm2 ) 에서나타냈다. 게다가, 전체흡수율에기반하여사람피부는랫드피부에비해서약 8배적었다. 1.4.2. 대사 (M etabolism) - 211 -

호모살레이트는피부, 혈장, 간을비롯한다른조직들에서에스테르가수분해효소에의해빠르 고완벽하게 salicylic acid 과 trimethylcyclohexanol 로대사된다 ( 참고문헌 42). 제 2 장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 주요노출원은자외선차단제이며경피노출이주요한노출경로이다. 2.2. 노출평가 피부노출에대해서만안전성평가를하였다. 피부흡수양 (5% formulation): 2.4% [ 생체이용률고려 mean (1.4%) + 2 SD (2*0.5%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : 18 g/day 60 kg NOAEL (2 주반복투여독성 - 랫드 ): 100 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 10/100 * 2.4/100) / 60 kg = 0.72 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 100/0.72 = 139 독성동태결과가불가능한암수랫드에대한 14 일예비실험에서얻은 NOAEL 값이다 - 212 -

2.3. 독성 급성독성 만성독성 면역독성 신경독성 생식독성 발생독성 유전독성 발암성 광독성 - - - ( : 독성있음, -: 독성자료없음 ) 2.3.1. 급성독성 (A cute toxicity) 2.3.1.1 급성경구독성 1) Guideline: / Species/strain: Rat/FDRL Group size: 3 males and 2 females per dose level Test substance: Homosalate (Homomethyl salicylate) Batch: R-5269-D Purity: / Doses: 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0 ml/ kg bw Observation: 14 days GLP: / 암수 FDRL 랫드에 Homosalate 를 0.5; 1.0; 4.0; 8.0 ml/kg bw 용량을위관영양법으로경구투여하였다. 체중은 0일과 14일에측정하였다. 병리학적측면은 14일동안죽고생존한랫드에서관찰하였다. 그결과어떠한농도에서도사망한랫드는없었고 0.5-2.0 ml/kg bw 사이의농도에서임상적반응도없었다. 모든동물들은체중이증가하였다. 4.0 ml/kg bw 농도에서랫드의 1/5은부드러운변을보였고, 8.0 ml/kg bw에서 1/5은설사와감기증상이나타나고수척해보였으며요실금증상이보였다. 부검에서비특이적발견은각각의용량에서단한마리만발견됐다. 그러므로 Homosalate 의급성경구독성 (LD50) 은 FDRL 수컷과암컷랫드에서 > 8.0 ml/kg 이였다 ( 참고문헌 38) 2) Guideline: / Species/strain: Rat / no information on strain - 213 -

Group size: 10 animals Test substance: Homosalate (Homomethyl salicylate) Batch: no information available Purity: / Doses: 5000 mg / kg bw Observation: no information available (more than 6 days, vide infra) GLP: / 10마리의랫드에 Homosalate 를단회용량으로 5000 mg/kg bw를경구투여한다른시험에서는관찰기간동안 10마리중마리가 6일에사망하였다. 어떤용량에서도사망과임상적증상이보이지않았다. 부검에서급성중독의비특이적발견은한마리에서만나타났다. 이실험에서 Homosalate 의급성경구독성 (LD50) 은랫드에서 > 5000 mg/kg 였다 ( 참고문헌 41). 2.3.1.2. 급성피부독성 Guideline: / Species/strain: Rabbit/albino (strain not cited) Group size: 10 animals Test substance: Homosalate (Homomenthyl salicylate) Batch: no information available Purity: no information available Doses: 5000 mg/kg bw dermal Observation: no information available GLP: no (study performed prior to implementation of GLP) 10마리의토끼피부에 Homosalate 를단일용량으로 5000 mg/kg bw 투여하였다. 실험결과, 사망은보이지않았지만토끼의 4/10 이나 6/10 에서경미한발적이나타났고 7/10 이나 3/10 에서경미하거나일반적인부종으로발생한피부자극증상이있었다. 그러므로 Homosalate 의급성피부독성 (LD50) 은토끼에서 > 5000 mg/kg 였다 ( 참고문헌 41). - 214 -

2.3.2. 피부자극과부식성 2.3.2.1. 피부자극 실험동물에대한 Homosalate 의피부자극가능성연구와일치하는가이드라인이없다. 그러나, Homosalate 의피부자극특징은암수기니피그를이용하여수정된 Harber et al. (1982, 1987) 의프로토콜을이용한연구와암컷 BALB/C 마우스의귀붓기연구내에서시험되었다. 이러한연구에서 Homosalate 는기니피그와마우스에서피부자극가능성을보이지않았다 ( 참고문헌 19, 20). 2.3.2.2. 점막자극 Guideline: Eye irritation study according to the method of Draize et al. (1959) comparable to OECD405 Species: Rabbit/New Zealand White Group: 3 male animals Substance: sunscreen containing 12% Homosalate Batch: No information available Purity: Neat sunscreen Dose: 0.1 ml instillation in the conjunctival sac of the right eye GLP: in compliance 3마리의수컷 New Zealand White 토끼에서 Homosalate 가 12 % 포함된자외선차단제의잠재적자극효과를연구하였다. 자외선차단제 0.1 ml을토끼의오른쪽눈의결막낭에적용하였다. 왼쪽눈은처리하지않고대조군으로사용했다. 테스트물질을씻어내지않고 1, 24, 48, 72 시간에각막, 홍채, 그리고결막에대한자극반응을위해보조등을추가하여실험하였다. 결과는 Draize et al (1959) 을따라측정하였다. 24시간결과에서, 자외선차단제를적용한눈과적용하지않은눈에 fluorescein 용액을사용하여실험하였고, 남은테스트물질은물리적셀라인으로부드럽게씻어냈다. 그결과, 자외선차단제를적용한눈에서어떤시간대에서도토끼의각막에영향이없었다. 자외선차단제의노출은 1시간 scoring interval 에서 2/3이홍채염이나타났지만 24시간이내에완벽히회복되었다. 발적, 붓기, 그리고분비물이있는결막염은 1 시 - 215 -

간사이에모든토끼에서나타났지만나중에발생정도와쓰라림이개선되었다. 72시간에는결막반응인없었다. 그러므로 Homosalate 가 12 % 포함된자외선차단제제형은이연구상태에서약간의눈자극을이끄는것으로보여진다 ( 참고문헌 45). 2.3.3. 피부민감성 2.3.3.1. 인체감작성시험 Guideline/Method: Human Maximization test according to Draize, 1966 Species: Human Group size: 25 volunteers: 7 males, 18 females Test substance: Homosalate Batch: not cited Route: Occlusive epicutaneous application Scoring system: Scoring scale of Draize GLP: not in compliance 건강한 25명의피험자에대한인체피부감작성시험으로 Homosalate 의잠재적민감성을시험하였다. Neat test 물질을동일한부위에각시간마다밀폐요법으로 48시간동안적용하였다. 적용전에, 노출부위는 24시간동안 2.5 % 수용성 SLS을폐쇄적으로전처리하였다. 10일후에, challenge patch 를다른부위에밀폐상태로 48시간동안적용했다. 각 challenge 부위는 5 10 % 수용성 SLS로 1시간동안폐쇄적으로전처리하였다. Patch 제거하고 24시간후에 challenge 부위를살피고등급을매겼다. 25명의피험자들은어떠한 challenge reading 에서도피부자극과민감성반응이나타나지않았다. 그러므로 Homosalate 는남녀피험자에서의감작성시험에서민감성반응을일으키지않는것으로보인다 ( 참고문헌 35). 2.3.3.2. 인체누적첩포시험 Guideline/Method: Approved study protocol and standard operating procedures by the - 216 -

NewEnglandInstitutionalReviewBoard(NEIRB)2005 Species: Human Group size: a) c) 236 induced volunteers and 209 completed Test substance: a) SPF-30 sunscreen (formula #769-187, Homosalate content:10%) b)spf-45sunscreen(formula#769-190,homosalatecontent:15%) c)spf-30sunscreen(formula#769-193,homosalatecontent:10%) Batch: a) batch #0015C-P (white cream) b)batch#0015c-v(whitecream) c)batch#0015c-m(whitecream) Route: Semi-occlusive epicutaneous application Scoring system: Modified scoring scale of the International Contact Dermatitis Research Group System (Fisher, Alexander A., Contact Dermatitis, Lea & Febiger, 1986, 26) GLP: in compliance GLP 상태에서 236 명의남녀피험자에대하여 Homosalate 가 10 % 나 15 % 포함된 3 가지다른 자외선차단제를 NEIRM 연구프로토콜에따라인체누적첩포시험을실시하였다. 유도기 : 유도기동안, 지원자왼쪽등부분에약 0.2 g의시험물질을적용하고건조시켰다. webril/adhesive 패치를반폐쇄적으로덮고 24시간동안피부에적용했다. 그후, 패치를제거하고피부를확인했다. 패치제거는시험기간동안의 24시간휴지기나일주일동안의 48시간휴지기에실시하였다. 9개의연속된유도패치들은 3주가넘어서끝났다. 휴지기 : 마지막유도패치는적용없이 2주간의휴지기에실시하였다. 유발기 : 휴지기후에, webril/adhesive 패치를실험하지않은피험자의왼쪽등부분에 0.2 g의시험물질을적용하고 24시간동안반폐쇄적으로고정시켰다. 제거후, 적용부위를패치붙인후 24, 48, 72, 96 시간대에대해서확인했다. 끝난시험은피험자의 scoring 에참여하는공인인증된피부과의사의감독하게시행하였다. 결과 27 명은시험물질반응때문에실험을끝까지하지못하였다. 유도기동안각시험자들은 SPF-30 이나 45 수치의자외선차단제적용후, 일시적으로무시해도될정도의홍반을보였 - 217 -

지만, 유발기에서는어떠한지원자도시험한피부부분에피부이상이없었다. 다른 SPF-30 자외선차단제를이용한시험에서피험자들은유도기동안피부이상이없었지만한피험자만 24, 72, 96 시간을제외하고 48시간에서낮은단계의반응을보였다. 그러므로시험에사용된 10 % 나 15% 의 Homosalate 가포함된자외선차단제제품들은남녀피험자에서의 RIPT 연구상에서자극이나민감성에대한유도는없었다 ( 참고문헌 28, 31, 34). 그외, 다른인체누적첩포시험결과들은다음과같다. 시험법 시험물질 피험자수 A pplication Remark 반폐쇄 결과 참고문헌 RIPT SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) 236 명유도, 209 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 28 유발기 : 반응없음반폐쇄 RIPT SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H 236 명유도, 209 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 29 유발기 : 반응없음반폐쇄 RIPT SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) 236 명유도, 209 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 34 RIPT MT#2101420 (10% H) 112 명유도, 102 명완료 유발기 : 반응없음반폐쇄 유도기와반응없음폐쇄 유발기에서 피부자극이나민감성에대한가능성없음 6 RIPT Lotion 3 (12% H) 203 명유도, 202 명완료 유도기 : 마지막유도기동안부분적발적 피부자극이나민감성에대한가능성없음 7 유발기 : 반응없음반폐쇄 RIPT U02195.05 (283221, 10% H) 240 명유도, 210 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 15, 22 RIPT MT# 2047459 600 명유도, 600 명완료 유발기 : 반응없음폐쇄에관한정보없음 유도기와반응없음 유발기에서 피부자극이나민감성에대한가능성없음 37 RIPT U03036.01 (283267, 10% H) 219 명유도, 211 명완료 폐쇄 유도기 : 1 명의 2 등급의 반응은물질에의한자연적발생으로여겨짐. 16, 39-218 -

RIPT U03036.03 (283273, 10% H) 219 명유도, 211 명완료 일시적홍반과 1 명의 3 등급의발적 / 부종 유발기 : 반응없음폐쇄 유도기 : 1 명의 2 등급의일시적홍반과 1 명의 3 등급의발적 / 부종 유발기 : 반응없음 폐쇄 피부자극이나민감성에대한가능성없음유도기동안 2명의피험자에서만중간정도의누적자극 피부자극이나민감성에대하여임상적으로밀접한가능성없음. 17, 40 RIPT 2 자외선차단로션 (each 15% H) SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H) 221 명유도, 215 명완료 유도기 : 낮은용량에서몇몇일시적반응 유발기 : 낮은용량에서 1 명반응 14일동안 (3x/week) 6 x폐쇄 (48 h/72 h week/weekend) 피부자극이나민감성에대한가능성없음 51 CIT SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) 28 명유도, 26 명완료 누적자극에대한가능성없음 25 SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) H = Homosalate; CIT = cumulative irritation test; RIPT = repeated insult patch test 2.3.4. 반복투여독성 (Repeated dose toxicity) Guideline: / Species/strain: Rat Group size: 5 animals/sex/group Test substance: Homosalate Batch: / Purity: / Doses: 0, 100, 300, 1000 mg/kg bw Route of exposure: gavage Observation: 2 weeks exposure period GLP: not in compliance - 219 -

암수랫드에게 2주동안위관영양법으로 0, 100, 300, 100 mg/kg bw농도의호모살레이트를투여하였다. 수컷에서약간의체중증가량억제와 100 mg/ kg bw 농도에서의식효감소를제외하고다른그룹에서는몸무게데이터가음식섭취나식효와관련이없었다. 혈액학과병리학에서는어떤용량에서도치료와관련된연관성이없다고나타났다. APTT 와 PT 증가는 300 mg/kg bw 이상농도의수컷과 1000 mg/kg bw 농도의암컷랫드에서관찰됐다. Bilirubinds 은 100 mg/kg bw 이상농도의수컷과 300 mg/kg bw 농도의암컷에서감소했지만, triglyceride 는 1000 mg./kg bw 농도의암수모두에서증가했다. 그러나이러한효과들은이상반응 (Bilirubin) 이나잠재적이상반응 (triglyceride) 으로여겨지지않는다. 그러므로 300 mg/kg bw 농도의수컷과 1000 mg/kg bw 농도의암컷에서의응고효과때문에랫드에대한 14일반복독성은 100 mg/kg bw를무독성량으로추정하였다 ( 참고문헌 24). 2.3.5. 면역독성 (Immunological toxicity) - 자료없음 2.3.6. 신경독성 (Neurotoxicity) - 자료없음 2.3.7. 생식 / 발생독성 (Reproductive / Development toxicity) 호모살레이트자체의생식 발생독성에대한자료는없지만, Robert (2005) 가설명한호모살레이트의대사경로와그의연구에따르면대사체인 salicylic acid의최기성에대해서광범위하게연구되고있다. 호모살레이트대사체인 trimethylcyclohexanol 로대사되는 isophorone 에서시행한최기성시험이음성이였다. 또한 trimethylcyclohexanol 와구조가비슷한 menthol에대한생식독성과최기성도음성을나타냈다 ( 참고문헌 43). 2.3.8. 변이원성 / 유전독성 (M utagenicity / Genotoxicity) 2.3.8.1. 복귀돌연변이시험 - 220 -

Guideline/method: OECD 471 (Ninth Addendum, 21 July 1997) Test system: Salmonella typhimurium, strain TA98, TA100, TA102, TA1535, TA1537 Replicates: triplicate plates, two independent assays Test substance: Homosalate Batch: 4095213 Purity: 99.88 area % salicylic acid-3,3,5-trimethyl-cyclohexylester Concentrations: Range-finding experiment (±S9 mix): 3, 10, 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate ExperimentI -S9 mix: 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate +S9 mix:3, 10, 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate Experiment II (±S9mix): 10, 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate Solvent: DMSO Positive Controls: - S9 mix: TA 100, TA 1535: sodium azide, 10 μg/plate TA98, TA1537: 4-nitro-o-phenylene-diamine, 10 μg/plate in TA98, 50 μg/plate in TA1537, TA102: methyl methane sulfonate, 5 μl/plate + S9 mix: all strains: 2-aminoanthracene, 2.5 μg/plate (TA98, TA100, TA1535, TA537), 10 μg/plate TA 102 GLP: in compliance 직접배양법 ( 시험 Ⅰ) 과전배양법 ( 시험 Ⅱ) 에따라서대사활성화 (S9 mix) 존재상태와비존재상태에대한박테리아의복귀돌연변이시험으로변이원성이시험되었다. 3 μg /plate에서 5000 μg /plate 농도범위의시험물질 (DMSO에용해 ) 을 Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100, TA102, TA1535 와 TA1537 에노출시켰다. 실험결과, 시험 Ⅰ의대사활성화존재하에 TA98의 5000 μg /plate농도와 TA100의 2500 μg /plate 이상의농도에서생육저해에의한박테리아독성이나타났고 TA1537 과 TA100 의 2500 μg /plate (+S9 mix) 이상의농도와 TA100 의 1000-5000 μg /plate (+S9 mix) 나 5000 μg /plate (-S9 mix) 에서복귀돌연변이체의수가감소하였다. 시험물질은대사활성화가존재하거나비존재하는상태에서시험된어떤농도에서도균주의복귀돌연변이콜로니수를증가시키지않았다. 그러므로호모살레이트는박테리아독성농도까지대사활성화유무에서유전자변이원성이유발되지않았으므로 Salmonella typhimurium 시험에서변이원성이없다고보여진다 ( 참고문헌 13). - 221 -

Harworth et al (1983) 에설명된전배양법으로대사활성화 (S9 mix) 유무하에 Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100과 TA1535 균주에 0, 10, 33, 100, 333, 1000, 3333, 10000 μg /plate (DMSO) 농도의호모살레이트에대한변이원성을시험한연구에서는어떤균주와어떤농도에서도호모살레이트는변이원성을보이지않았다 ( 참고문헌 36, 52) Ames et al. (1975) 에따른표준직접배양법에서 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 와 TA1537 균주에대해서호모살레이트는대사활성하 (S9 mix) 존재상태와비존재 상태에서도돌연변이가관찰되지않았다 ( 참고문헌 4). 2.3.8.2. 중국햄스터난소세포에대한염색체이상시험 Guideline/method: OECD 473 (ninth addendum, 21 July 1997) Test system: Chinese Hamster V79 cell line Test substance: Homosalate Batch: 4095213 Purity: 99.88 area % salicylic acid-3,3,5-trimethyl-cyclohexylester Concentrations: Experiment I -S9 mix: 4h exposure,18h harvest: 5.0; 10.0; 20.0 μg/ml +S9 mix:4h exposure, 18h harvest: 12.5; 25.0; 50.0 μg/ml Experiment II -S9 mix: 18h exposure, 18h harvest: 1.6; 3.1; 6.3 μg/ml -S9 mix: 28h exposure, 28h harvest: 6.3 μg/ml +S9 mix: 4h exposure, 28h harvest: 6.3; 12.5; 25.0 μg/ml Solvent: Ethanol Positive controls: Without S9 mix: Ethylmethane sulfonate, 200-300 μg/ml With S9 mix: Cyclophosphamide, 1.4 μg/ml GLP: in compliance 중국햄스터난소세포에대한 in vitro 실험으로호모살레이트가구조적염색체이상을유발하는지를평가하였다. 시험물질은대사활성화 (S9 mix) 가존재하는상태와그렇지않은상태에서시행하였다. 시험물질을에탄올에녹여대사활성화가없는상태에서는 4, 18 그리고 28시간동안배양시켰고, 대사활성화가있는상태에서는 4시간동안세포배양하였다. 콜레미드를시험시작후각각 15.5 시간과 25.5 시간에배지에첨가하고 2.5 시간후에세포를슬라이드에옮 - 222 -

겨서빙초산혼합액으로고정시키고김사염색을하였다. 세포유전적손상에대하여배지당중기판에펼친 100 well을측정하고배지당 500 중기판에서배수세포의수를측정하였다. 독성에대한범위측정예비실험에서시작후 24시간의독성세포수를유전독성에대한지표로측정하였다. 19.5 μg /plate와 2500 μg /plate 사이의농도를적용했다. 결과범위측정시험에서, S9 mix가없는상태의 19.5 μg /plate 이상농도와 S9 mix가있는상태의 78.1 μg /plate 이상의농도에서시험 4시간후에명확한독성효과가관찰됐다. 또한, S9 mix가없는상태에서 19.5 μg /plate 이상의농도를 24시간연속으로처리하였을때강한독성이나타났다. 배양배지에서시험물질의침전은 S9이없는상태의 156.3 μg /plate 이상의농도와 S9 이있는상태에서의 312.5 μg /plate 이상의농도에서나타났다. ph값이나침투압과관련있는영향은관찰되지않았다. 본연구에서는시험시작 4시간후시험물질의침전이 50 μg /plate와그이상의농도에서 18시간간격에서시험 Ⅰ에서 S9 mix가있을때관찰됐다. 다른모든실험에서는시험물질처리후침전은나타나지않았다. 세포독성은대사활성화유무하의모든실험에서관찰되었지만, 18시간과 28시간연속적으로처리한후 S9 mix가없는실험 Ⅱ에서확실한세포독성을나타낸농도는세포유전적손상을측정할수없었다. 두개의독립된실험에서, 구조적염색체이상이있는세포수에대한생물학적으로관련있는증가는관찰되지않았다. 실험 Ⅱ에서 S9 mix가없는상태에서 2개의확실한증가 ( 각각 2.5% 와 2%) 가관찰되었지만, 이것은누적된대조군범위 (0.0 4.0% 이상세포, 갭제외 ) 내에있고관련성이없다고보여진다. 대조군의발생과비교하여중기배수체의발생에대한상관성있는증가는보이지않았다. 그러므로호모살레이트는세포독성농도까지시험했을때중국햄스터의 V79 세포에서대사활성화유무에상관없이염색체이상유발이없다고보인다 ( 참고문헌 10). 2.3.9. 발암성 (Carcinogenecity) - 자료없음 2.3.10. 광독성 (Phototoxicity) - 223 -

2.3.10.1. 사람에대한광독성 / 광알러지시험 1) 사람에대한광독성시험 Guideline/Method: Approved study protocol and standard operating procedures by the New England Institutional Review Board (NEIRB) 2005 Species: Human Group size: a) - c) 20 volunteers Test substance: a) SPF-30 sunscreen (formula #769-187, Homosalate content: 10%) b) SPF-45 sunscreen (formula#769-190, Homosalate content: 15%) c) SPF-30 sunscreen (formula#769-193, Homosalate content: 10%) Batch: a) batch #0015C-P (white cream) b) batch #0015C-V (white cream) c) batch #0015C-M (white cream) Route: Semi-occlusive epicutaneous application Light source: UV-A irradiation by four Philips F40BL fluorescent tubes with a peak output at 369 nm and half-power bandwidth of 15 16 nm. UV dosage: UV-A intensity: 3.3 4.4 mw/cm2; duration: about 17 min (total dose of 4.0 ± 0.4 J). Scoring system: Modified scoring scale of the International Contact Dermatitis Research Group System (Fisher, Alexander A., Contact Dermatitis, Lea & Febiger, 1986, 26). GLP: in compliance 다른물질사이에호모살레이트가 10% 나 15% 포함된 3가지다른자외선차단제의광독성을승인된 NEIRB 프로토콜에따라 GLP 상태에서 20명의남녀피험자에대해서측정하였다. Webil/adhesive 패치를반폐쇄적으로사용하고약 0.2 g을각패치에적용했다. 방사선조사부분의패치는등에적용하고방사선을조사하지않은물질은등앞부분에적용하고옷이나패치로빛에대해서보호하였다. 게다가전체시험기간동안, 피험자들은태양광노출에대하여방사선을조사하지않은부분을보호했다시험일정 : 1일에약 24시간동안복제한패치를덧대었다. 2일에패치들을제거하고방사선을 - 224 -

조사한부분에서패치적용후약 24시간후에확인하고 score 을매겼다. 이부분은 UV-A로조사후에측정하였다. 방사선을조사하지않은부분은보호하고방사선조사과정후측정하였다. 3-4일에방사선조사부분과조사하지않은부분의피부반응을패치적용후약 48시간과 72시간에측정하였다. 시험완료는면허가있는피부과의사의감독하게이루어졌다. 결과시험한자외선차단제가접촉한부위나처리하지않은부분에서방사선조사가있거나없는상태둘다에서피부반응은나타나지않았다. 그러므로호모살레이트가 10% 나 15% 포함된자외선차단제는이시험상태에서는피부광독성을일으키지않는다 ( 참고문헌 26, 29, 33). 2) 사람에대한광알러지시험 Guideline/Method: Approved study protocol and standard operating procedures by the New England Institutional Review Board (NEIRB) 2005 Species: Human Group size: a) - c) 29 volunteers induced, 28 volunteers completed Test substance: a) SPF-30 sunscreen (formula #769-187, Homosalate content: 10%) b) SPF-45 sunscreen (formula #769-190, Homosalate content: 15%) c) SPF-30 sunscreen (formula #769-193, Homosalate content :10%) Batch: a) batch #0015C-P (white cream) b)batch#0015c-v(whitecream) c)batch#0015c-m(whitecream) Route: Semi-occlusive epicutaneous application Irradiation: UV-A and UV-B for induction and UV-A for challenge, each irradiation about 24 hours post-patching Light source: UV-A irradiation by four Philips F40BL fluorescent tubes with a peak output at 369 nm and half-power bandwidth of 15 16 nm. UV-B irradiation by customm adelight source with a peak out put at 313 nm and half-power band width of 30nm. UV dosage: UV-A intensity: 3.3 4.4 mw/cm2; duration: about 17 min (total dose of 4.0 ± 0.4 J). - 225 -

UV-B intensity: 1.0 0.2 mw/cm², The UV-B irradiation was based on each volunteers skin type and minimal erythema dose (MED) as determined prior the first irradiation. Scoring system: Modified scoring scale of the International Contact Dermatitis Research Group System (Fisher, Alexander A., Contact Dermatitis, Lea & Febiger, 1986, 26). GLP: in compliance 다른물질사이에서호모살레이트가 10% 나 15% 포함된세가지자외선차단제의사람에대한광알러지유도를연구하였다. 남녀피험자들은승인된 NEIRB 프로토콜에따라서 GLP상태에서실험하였다. 유도기 : webil/adhesive 패치을반폐쇄적으로사용하였다. 약 0.2 g의시험물질을각패지에적용하였다. 방사선조사된된부분의패치를등윗부분부착하고추가적으로시험물질이없는대조군부위에도방사선은조사하였다. 방사선이조사되지않은부분은등의반대편에부착하였고옷이나망토로빛을차단하였으며시험기간동안피험자들은태양광노출에대하여방사선이조사되지않은부분을보호하였다. 첫 3주동안, 일주에두번씩패치들을패치가부착된총 6 부위의동일한부분에부착하였다. 패치들은약 24시간동안피부에남겨놨다. 제거후, 피부를검사하고 score 하고 UV-A와 UV-B를조사하고다시 score 하였다. 방사선을조사하지않은부분은보호하고조사후확인하고 score하였다. 각 UV 조사는각패치후 24시간동안실시하였다. 휴지기 : 마지막패치유도다음에적용하지않고 2주간휴식기간을가졌다. 유발기 : 휴지기간후에, 피험자들에게어떤반응이있는지질문하였다. 유발기에서, 등아래부분을유발시험과방사선을조사한대조부분을위한최초장소로사용하였다. 방사선을조사하지않은유발패치는반대편에적용하였다. 유발패치들은약 24시간동안최초장소에적용하였다. 그후에, 패치들을제거하고그부분을 score 하고 UV-A 조사후다시 score 하였다. 방사선조사동안, 비방사선조사부분은보호하고방사선조사과정후 score 하였다. 통틀어, 적용부위들은패치적용후 24, 48, 72, 92 시간에 score 하였다. 결과 유도기동안단한명의피험자만방사선이조사되고시험물질을처리한부분에서낮은단계의 - 226 -

일시적피부반응이나타났지만이반응은방사선을조사하고시험물질을처리하지않은대조부분에서도나타났다. 방사선을조사하지않은시험물질에서는피부반응이나타나지않았다. 유발기에서는시험물질을처리하지않고방사선을조사한부위를제외하고시험물질을처리하거나그렇지않은부분의방사선조사부분이나비방사선조사부분에서피부반응이보이지않았다. 그러므로호모살레이트가 10% 나 15% 포함된세가지자외선차단제는광알러지나피부민감성을나타내지않는다 ( 참고문헌 27, 30, 32). 다음은사람에대한광독성자료를요약한것이다. 시험법시험물질피험자수 PT PT PT PT PA PA PA SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H) SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) U03127.03 (283285/1, 10% H) SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H) SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) Application Remark 결론 Ref. 20 명반폐쇄광독성유발없음 26 20 명반폐쇄광독성유발없음 29 20 명반폐쇄광독성유발없음 33 24 명폐쇄광독성유발없음 9, 18 29 명유발 28 명완료 29 명유발 28 명완료 29 명유발 28 명완료 반폐쇄 반폐쇄 반폐쇄 폐쇄 광알러지나피부민감성유발없음 광알러지나피부민감성유발없음 광알러지나피부민감성유발없음 27 30 32 PA U03127.03 (283285/1, 10% H) 29 명유발 28 명완료 피부자극이나누적피부자극반응없음. 1/27 만부수적으로기존의과잉자극감수성나타났음. 광알러지나피부민감성유발없음 8, 18 PT = phototoxicity test; PA = photoallergy test (SCCP COLIPA n S12, 2007) - 227 -

2.3.10.2. Neutral red uptake (NRU) 광독성시험 Guideline: OECD 432 (2004) Test system: Balb/c 3T3 fibroblasts (ATCC, Manassas, VA, USA) Test substance: Homosalate Batch: No information supplied Dose levels: Range-finding: 0.291 1000 μg/ml (8 dose levels, approx. 1/2 steps) Main assay: 1.63-100 μg/ml (8 dose levels, approx. 1/4 steps) Positive control: Chlorpromazine: Range-finding: 0.156-100 μg/ml (12 dose levels, approx. 1/2 steps) Main assay: 0.156 9.53 μg/ml (8 dose levels, approx. 1/2 steps) Solvent: first DMSO for stock solutions, afterwards with HBSS for dilution Irradiation: UV-A 1.7 mw/cm2 for 50 minutes resulting in UV-A dose of 5 J/cm2 GLP: in compliance 배양플라스크가 50-80% confluent 됐을때, Balb/c 3T3 세포들을 96-well microtiter plate에계대배양하였다. 처리전에배양배지 (DMEM) 을제거하고세포들을미리따뜻하게해준 Hank s Balanced Salt Solution (HBSS) 으로씻어냈다. 시험물질을 HBSS 용액을사용해 8개의농도로희석시키고세포들을첨가했다. 60분배양후, 세포들을모의태양광 (Dermalight SOL 3) 에 50분간노출시켰다 (UV-A 광도 : 1.7 mw/ cm2, UV-A 농도 : 5 J/ cm2 ). 노출후, 세포들을씻어내고 24시간후에 550 nm (OD550) 에서 plate reader 로 Neutral red 의흡수를측정하였다. 잠재적광독성예측은광저해요소 (PIF) 와평균광효과 (MPE) 를측정하여결정했다. 시험물질을처리하지않은대조배양과비교하여 NRU의 50% 감소를유발시키는시험물질의농도각각의 IC50 값들은나타냈다. 결과는다음표와같다. IC50 값요약 시험물질 IC 50( μg /ml) HBBS 의 ph ( 가장높은용량 ) 광독성 (+UVA) 13.554 Homosalate 예비실험 세포독성 (-UVA) 15.825 7.5-228 -

시험 2# 광독성 (+UVA) 13.077 세포독성 (-UVA) 16.742 7.0 시험 3# 광독성 (+UVA) 11.874 세포독성 (-UVA) 13.098 7.5 예비시험 광독성 (+UVA) 1.3948 세포독성 (-UVA) 22.983 7.5 Chlorpromazine 시험 2# 광독성 (+UVA) 1.6485 세포독성 (-UVA) 22.711 7.0 광독성 (+UVA) 1.4614 시험 3# 세포독성 (-UVA) 25.315 # 시험1은양성대조군의결과의유효성이없다고판단되어보고하지않았다. 7.5 평균광효과 (MPE) 와광저해효소 (PIF) 요약 시험물질 MPE 1 PIF 2 예비실험시험 2 시험 3 예비실험시험 2 시험 3 Homosalate 0.011 0.014 0.005 1.169 1.281 1.103 Chlorpromazine 0.539 0.529 0.464 16.483 13.782 17.336 평균광효과 : MPE < 0.1 광독성없음 0.1 MPE 0.150 광독성가능성있음 MPE 0.0150 광독성 광저해요소 : PIF < 2.0 광독성없음 2.0 PIF 5.0 광독성가능성있음 PIF 5.0 광독성 각시험결과에서 PIF 와 MPE 에대한호모살레이트값은광독성기준보다낮았다. 그러므로 호모살레이트는 Balb/c 3T3 섬유아세포에대하여인공태양광의존재하에서광독성이없다고 보여진다 ( 참고문헌 12). 2.3.10.3. 광감작성 in vivo. Guideline/method: Modified method according to the Harber et al. (1982, 1987) Species/strain: Guinea pig/dunkin Hartley - 229 -

Group size: 5 20 animals/group Test substance: Homosalate (source: Humco Chemical, Memphis, TN, USA) Purity: > 95% (HPLC) Batch: No information available Route: Occlusive epicutaneous induction and challenge in Hill Top Chambers Carrier: Induction: Methanol Challenge: Acetone Dose level: Induction: 1% in methanol Challenge: 1% in acetone Light source: Bank of 6 fluorescent black light lamps (Sylvania F20T12/BL) Irradiation: 10 J/cm2 UV-A Positive control: Musk Ambrette; tetrachlorosalicylanilide) GLP: Not in compliance 암수 guinea pig 를사용하는 Harber et al. (1982, 1987) 의프로토콜에따라서시험물질의광 감작성을평가하였다. 본연구전에, UV-A 조사가있거나없는상태에서피부에자극이없는농도를결정하기위해초기자극연구를수행하였다. 4개의농도 (2/animal) 를허리부분의왼쪽과오른쪽부분에 Hill Top Chambers 패치를사용하여시험하였다. 패치들은 2시간동안 rubber dental dam으로밀폐하였다. 그후에, 패치들을제거하고 UV-A (10 J/ cm2 ) 노출을위하여오른쪽 dental dam에구멍을냈다. 패치부분들은자극후 24시간과 48시간에 0-3 범우로등급을매겼다. 본연구에서는목덜미부분의제모된피부에 2주동안일주일에 3번씩즉, 총 6번유발시켰다. 처음노출에서, Freund s complete adjuvant로 4번피내주사를하였다. 그후, 그부분을시험물질과사용한용매나아무런처리를하지않고 Hill Top Chambers 를적용하여셀로판테이프로 strip하였다. 패치들은 2시간동안밀폐시킨후제거하여시험물질, 시험한용매나아무것도처리하지않은부분에방사선 (10 J/ cm2 ) 을조사하였다. 6번의유발후, 10-14 일간휴지기를가졌다. 유발기에서, 모든동물들에목덜미부분의제모된피부에대하여방사선을조사하거나하지않고시험물질이나시험용매를처리하였다. 오른쪽과왼쪽의패치부분들을 24시간밀폐후제거하고 dental dam 부분에구멍을내서방사선 (10 J/ cm2 ) 을조사하였다. 24시간과 48시간후에피부변화등급을매겼다. 결과는다음표에요약하였다. - 230 -

기니피그에대한호모살레이트의감작성, 광자극성과광알러지성에대한결과 시험 반응 / 결과 가혹등급 d 유도 a 유발 b 발생 c 24h 48h H+UV-A H+UV-A 0/20 0.1 0.0 H+UV-A H 0/20 0.1 0.0 Sham H+UV-A 0/5 0.2 0.1 Sham H 0/5 0.0 0.0 Sham Acetone + UV-A 0/5 0.0 0.0 Sham Acetone 0/5 0.0 0.0. Methanol + UV-A Acetone + UV-A 0/10 0.0 0.0 Methanol + UV-A Acetone 0/10 0.0 0.0 H = Homosalate; UV-A = 노출당 10 J/ cm2 a = 1% 메탄올이나메탄올 ; b = 1% 아세톤이나아세톤 ; c = 24/48 시간에서전체시험당반응 ( 1) 수 ; d= 시험한전체동물로나눈피부등급합 호모살레이트와마찬가지로, 두가지다른자외선차단제 (p-aminobenzoic acid 와 4-isopropyldibenzoylmethane) 와인체에서광알러지, 광독성과접촉성감작을유발시킨다고알려진 2가지광알러지원 ( 인공사향 (MA) 와 tetrachlorosalicylanilide (TCSA)) 도시험하였다. 예상대로, TCSA와 MA에서광알러지반응이나타났다. 자외선차단제로수행한연구에서 p-aminobenzoic acid는광알러지가나타났지만호모살레이트와 4-isopropyldibenzoylmethane 는광알러지반응이나타나지않았다. 그러므로암수기니피그에대한 Harber et al. (1872, 1987) 연구에따른시험상태에서호모살레이트는광알러지, 접촉성알러지, 광독성이나자극이없다고보여진다 ( 참고문헌 19). 2.3.10.4. 마우스의귀부종광알러지시험. - 231 -

Guideline/method: Optimized method according to Brown et al. (1986), Granstein et al. (1983), Maguire and Kaidbey (1982) and Takigawa and Miyachi (1982) Species/strain: Mouse/BALB/c Group size: 6-8 animals/group Test substance: Homosalate (source: Witco Corp., Humco Chemical Division, Memphis, TN, USA, purity:> 95%) Batch: No information available Route: Epicutaneous induction on the back and epicutaneous challenge on right/left ear Carrier: Acetone or acetone/corn oil (4:1) but not specified for Homosalate Dose level: Induction: 10% Challenge: 5% Light source: UV-A: Bank of 8 fluorescent black light lamps (Sylvania F40/350BL) UV-B: Bank of 8 fluorescent light lamps (PhilipsF40UVB) Irradiation: UV-A: 10 J/cm2 UV-B: 30 J/cm2 Ear thickness measmt: Hand-held dial micrometer (Oditest gauge, model D-10000 The Dyer Co. Lancaster PA, USA) GLP: Not in compliance 암컷 BALB/c mice를이용한방법들 (Brown et al. (1986), Granstein et al. (1983), Maguire & Kaidbey (1982) 와 Takigawa & Miyachi (1982)) 로호모살레이트의광알러지뿐만아니라접촉성감작성과광독성에대하여시험하였다. 유도기 : 군당 6-8마리동물들에 cyclophosphamide (200 mg/kg bw) 을복강주사하였다. 광알러지와접촉성알러지대조군과사용된용매 / 방사선조사대조군의피부에시험물질이나용매 50 μl을 0, 1 2일에유도시험으로적용하였다. 광독성그룹의쥐에는유도기동안시험하지않았다. 그후, 마우스들을방사선상자에넣었다. 적용하고 30-60 분후, 적용한부위를깨끗이닦아냈다. 접촉성알러지마우스들다시케이지로옮겼다. 광알러지군과사용된용매 / 방사선조사대조군에먼저 UV-A (10 J/ cm2 ) 방사선을조사하고뒤이어 UV-B (30 J/ cm2 ) 를조사하였다. 유발기 : 귀두께측정의기준치는처음유도후 7일에각마우스에대해서수행하였다. 유발기동안, 용매에녹은시험물질이나용매 8 μl을양쪽귀에적용하였다. 30-60 분후에, 귀를닦아 - 232 -

내고 UV-A (10 J/ cm2 ) 와 UV-B (30 J/ cm2 ) 를조사시켰다. 귀두께측정은유발기후 24 시간에 hand-held dial micrometer 로측정하고기준치에따른변화를확인했다. 결과 10 % 물질로유도하고 5% 물질로유발시킨암컷 BALB/c 마우스에대한호모살레이트의감작성, 광자극성과광알러지성연구는유발후 24시간에기준치 (mmx10-2 ) 변화로귀부종을나타냈다. 접촉성광알러지군 : -0.1 ± 0.6 mm x 10-2 접촉성알러지군 : -0.3 ± 0.4 mm x 10-2 용매방사선군 : -0.1 ± 0.4 mm x 10-2 광독성군 : -0.2 ± 0.5 mm x 10-2 시험결과, 호모살레이트는광알러지, 접촉성알러지나광독성이나타나지않았다 ( 참고문헌 20). 2.3.11 에스트로젠잠재적영향시험 1) in vitro Guideline/method: Mechanistic study on oestrogen receptor binding properties according to a modified protocol of Bosel and Shain (1974) Test system: Human recombinant oestrogen receptor (ER), -subtype (PanVera, Madison, WI; USA) Replicates: Two separate experiments with triplicate concentration levels Test substance: Homosalate Batch: 50446454 Purity: 99.6% Concentrations: 100, 1000, 10000, 100000 nm Solvent: DMSO Positive Controls: Genistein: 0.03 100 nm - 233 -

Estradiol: 10-10000 nm GLP: Not in compliance 에스트로겐수용체 (ER) 와호모살레이트의상호작용은수용체인 α-subtype 과리간드인방사선동위원소가있는에스트라디올의인체재조합에스트로겐수용체로수용체결합분석으로연구하였다. ER 친화력강한에스트라디올 (0.03 100 mm) 과 ER 친화력이약한제니스테인 (10 1000 nm) 을양성대조군물질로사용했다. Boesel 과 Shain (1974) 의연구에따라수정한방법으로시험하였다. BSA와 2% DMSO (± 시험화합물 ) 이들어있는분석완충액 100 μl와 4.8 mm의방사선동위원소가있는에스트라디올 50 μl을 microtiter plate well에서섞었다. 4 에서밤새진탕배양한후, 분석완충액에활성탄현탁액을첨가했다. 혼합후활성탄을원심분리기로침전시키고상층액의 50 μl을액체섬광계수기 ( 3 H활성도 ) 로분석했다. ER-리간드혼합물이포함된 50 μl과섬광칵테일 200 μl을혼합하고샘플이평형을이루면 10분동안분석기로방사능을측정하였다. 수용체결합은불특정결합으로수정했다. 시험물질의존재하에방사선동위원소가있는에스트라디올의결합은비존재결합과관련이있었다. IC 50 값은측정할수있는경우에측정했다. 결과 100000 nm의적용가능한최고농도에서에스트로겐수용체에대한호모살레이트의친화도는관찰되지않았다. 시험물질이있을때방사선동위원소가있는리간드에스트라디올결합양은대조군과비슷했다. 그러므로호모살레이트는기술적으로가능한 100000 nm의최고농도까지사람의제조합된에스트로겐수용체에대해서친화도가없다고보여진다 ( 참고문헌 3). 2) in vivo Guideline/method: Uterotrophic assay in immature rats according to OECD Validation Work and OECD Protocol (Draft, 2000) Species/strain: Rat/Wistar ((HsdCpb:WU) Group size: 6 animals/sex/group Test substance: Homosalate Batch: 507 57115 Purity: 89.64% - 234 -

Dose levels: 0, 200, 1000 mg/kg bw Vehicle: Corn oil Positive control: Ethinylestradiol (EE); 0.3 and 1.0 μg/kg bw Route: Subcutaneous (sc.) Exposure period: 3 consecutive days GLP: in compliance 미성숙랫드에대한자궁비대반응시험으로호모살레이트의에스트로젠잠재적영향을연구했다. 6마리의미성숙암컷 Wistar 랫드각각에게 200 mg/kg bw와 1000 mg/kg bw 농도로콘오일에녹인시험물질을연이어 3일동안하루에한번씩피하주사하였다. 실험은미성숙랫드가 19가 19일지났을때 3일순화후시작하였다. 대조군으로, 각각 6마리의랫드들을약물처리를하지않았고추가군으로 6마리의랫드에게콘오일을주었다. Ethinylestradiol 을양성대조군물질로선택하고 6마리의랫드에게같은일정으로 0.3 과 1.0 μg /kg bw의용량으로피하주사하였다. 임상적증상, 사망률, 체중과음식섭취량같은임상적실험을수행하였다. 실험이종료되었을때, 모든동물들을희생시켜서육안검사를하고자궁무게를측정하였다. 결과사망과일반적인건강상태에대한영향도없었다. 체중과음식섭취는대조군과비슷했다. 200 과 1000 mg/kg bw 용량의호모살레이트피하주사후자궁무게에대한영향도없었다. 그러므로미성숙암컷 Wistar 랫드에대해서 1000 mg/kg bw 용량까지호모살레이트의 3일연속반복피하주사투여는자궁비대반응시험에서에스트로젠잠재적영향이보이지않는다 ( 참고문헌 1). 2.3.12. 안드로겐잠재적영향시험 Guideline/method: Mechanistic study on androgen receptor binding properties according to a modified protocol of Bosel and Shain (1974) Test system: Rat recombinant fusion protein to thioredoxin containing the hinge region and ligand binding domain of the androgen receptor (AR, PanVera, Madison, WI; USA) Replicates: Two separate experiments with triplicate concentration levels - 235 -

Test substance: Homosalate Batch: 50446454 Purity: 99.6% Concentrations: 100, 1000, 10000, 100000 nm Solvent: DMSO Positive Controls. Dihydrotestosterone: 0.1-300 nm Androstendione: 30 100000 nm GLP: not in compliance Published: No 수용체원인안드로겐수용체와방사성동위원소가있는 methyltrienolone (R 1881) 리간드의경첩영역과리간드결합액이있는랫드의재조합융합단백질을이용한수용체결합분석으로호모살레이트와안드로겐수용체 (AR) 의상호작용에대해시험하였다. AR과친화력이강한 dihydrotestosterone (0.1 300 nm) 과 AR과친화력이약한 androstendione (30 100000 nm) 을양성대조군물질로사용했다. 분석완충액에 γ-globulin 과 2% DMSO (± 시험물질 ) 가포함된분석완충액 100 μl과 8 nm 방사선동위원소가있는 R1881 용액 50 μl을 microtiter plate well에혼합했다. 4 에서밤새진탕배양한후, 활성탄현탁액을첨가하여섞은후원심분리하여활성탄을침전시키고상등액 50 μl을액체섬광계수기 ( 3 H활성도 ) 로분석했다. AR- 리간드혼합물이포함된상등액 50 μl과 200 μl섬광칵테일을섞은후샴플이평행이되면 10분간분석기로방사능을측정했다. 시험물질이있을때방사선동위원소가있는 R1881 의결합은없는상태에서의결합과관계가있었다. IC 50 은측정할수있는경우에측정했다. 결과호모살레이트는표준안드로겐과비교하여안드로겐수용체 (AR) 과약한친화도를보이고기술적으로얻을수있는가장높은농도인 100000 nm의농도에서용량반응관계가없었으므로, 안드로겐수용체의결합역과의특정상호작용에대한증상이없다고보여진다 ( 참고문헌2) - 236 -

제 3 장. 참고문헌 1. Bayer (2002a) Neo Heliopan HMS, Uterotrophic assay in immature rats, Pharmaceutical Business Group, Report No. PH 31927, Bayer, Wuppertal, Germany, unpublished data, 08 April 2002. 2. Bayer (2002b) Neo Heliopan HMS, In vitro studies on its androgen receptor binding properties, Research Toxicology, Report No. PH 32215, Bayer, Wuppertal, Germany, unpublished data, 23 July 2002. 3. Bayer (2002c) Neo Heliopan HMS, In vitro studies on its estrogen receptor binding properties, Research Toxicology, Report No. PH 32216, Bayer, Wuppertal, Germany, unpublished data, 23 July 2002 4. Bonin A. M., Arlauskas A. P., Angus D. S., Baker R. S. U., Gallagher C. R., Greenoak G., Lane Brown M. M., Meher-Homji K. M. and Reeve V. (1982) UV-absorbing and other sunprotecting substances: genotoxicity of 2-ethylhexyl P-methoxycinnamate, Mutation Res., 105, 303-308 5. Chatelain E., Gabard B and Surber C. (2003) Skin penetration and sun protection factor of five UV filters: Effect of the vehicle, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 16, 28-35 6. Clinical Research Laboratories (CRL, 2003) Repeated insult patch test, MT#2101420 (10% Homosalate), Clinical Study No. CRL67703-8, Clinical Research Laboratories Inc., Piscataway, NJ, USA, unpublished data, 29 July 2003 7. Concordia Research Laboratories (2001) Human repeated insult patch test, Five formulations (Lotion 3 = 12% Homosalate sunscreen), 200 Subjects, Study No. PLO-041 A, Concordia Research Laboratories Inc., Cedar Knolls, NJ, USA unpublished data, 04 May 2001-237 -

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50. Symrise (2005d) Protocol for photostability test, Internal Memo 51. TKL Research (2003) Repeated insult patch study, 15% HMS sunscreen, TKL Study No. DS101803/102003-1, TKL Research Inc., Paramus, NJ, USA, unpublished data, 20 August 2003 52. Zeiger E., Anderson B., Haworth S., Lawlor T., Mortelmans K. and Speck W. (1987) Salmonella mutagenicity tests: III. Results from testing 255 chemicals, Environ. Mutagen, 9 (Suppl. 9), 1 110, - 243 -

제 5 장세부참고문헌 - Chatelain et al., Skin penetration and sun protection factor of five UV filters: effect of the vehicle. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol 16:28-35 (2003) - Ma, R., Cotton, B., Lichtensteiger, W., Schlumpf, M., UV Filters with antagonistic action at androgen receptors in the MDA-kb2 cell transcriptional-activation assay. Toxicol. Sci. 74,43?50. (2003) - Mestres et al., Benzophenone-3 entrapped in solid lipid microspheres: formulation and in vitro evaluation. I nt J Pharm 400:1-7 (2010) - O Connor, J. C., Cook, J. C., Craven, S. C., Van Pelt, C. S., and Obourn, J. D. An in vivo battery for identifying endocrine modulators that are estrogenic or dopamine regulators. Fundam. Appl. Toxicol. 3, 182-195. (1996) - Reel, J. R., Lamb, J. C., and Neal, B. H. Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34, 288-305. (1996) - Schlumpf M, Schmid P, Durrer S, Conscience M, Maerkel K, Henseler M, Gruetter M, Herzog I, Reolon S, Ceccatelli R, Faass O, Stutz E, Jarry H, Wuttke W, Lichtensteiger W. Endocrine activity and developmental toxicity of cosmetic UV filters-an update. Toxicology. 205(1-2):113-22. (2004) - Schlumpf, M., Cotton, B., Conscience, M., Haller, V., Steinmann, B., Lichtensteiger, W., In vitro and in vivo estrogenicity of UV screens. Environ. Health Perspect. 109, 239-244. (2001) - Vilela et al., Effect of ultraviolet filters on skin superoxide dismutase activity in hairless mice after a single dose of ultraviolet radiation. Eur J Pharm Biopharm 80:387-92 (2012) - 244 -

[ 별첨 1] 벤조페논 -3 RISK PROFILE - 245 -

차례 제1장. 개요 1.1. 정의및용도 1.2. 물리 화학적특성 1.3. 안정성 1.4. 체내동태 제2장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 2.2. 노출평가 2.3. 독성 제 3 장. 참고문헌 - 246 -

제 1 장. 개요 1.1. 정의및용도 벤조페논-3 (CAS No 131-57-7: benzophenone-3, C 14 H 12 O 3 ) 은분자량 228.26 의노란색을띄는흰색이나크림색의파우더로자외선차단제제품에서단독으로사용되거나다른 UV 필터제와혼합하여 5% 까지사용된다. 또한, 다른종류의화장품제품들에서벤조페논-3은 0.05 0.5 % 사이의농도가광보호를위해포함된다. - 247 -

1.2. 물리 화학적특성 표 1. 벤조페논의물리 화학적특성 항목 내용 참고문헌 물질명 (INCI) 벤조페논-3 (Benzophenone-3) 3, 4, 5, 35, 53 IUPAC명 (2-Hydroxy-4-methoxyphenyl)-phenylmethanone 3, 4, 5, 35, 53 CAS No. 131-57-7 3, 4, 5, 35, 53 화학식 C 14H 12O 3 3, 4, 5, 35, 53 분자량 228.26 g/mol 4, 5, 35, 50, 51, 52 구조식 물리적성상 노란색을띄는흰색, 크림색파우더 35 녹는점 62 65 4, 5, 35, 50, 51, 52 끓는점 224 227 4, 5, 35, 50, 51, 52 밀도 1.32 g cm3 4, 5, 35, 50, 51, 52 증기압 - - ph - - 용해도 물 : 3.7x10-3 g/l(20 ) Glycerin: < 0.01% Ethanol: 6.0% 4, 5, 35 Acetone: > 20.0% Chloroform: > 20.0% Log Kow > 3.7 35 헨리상수 - 동의어 (synonyms) Oxybenzone (INN name) 2-hydroxy-4-methoxybenzophenone (2-Hydroxy-4-methoxyphenyl)phenyl methanone 2-Benzoyl-5-methoxyphenol 35, 52 1.3. 안정성 유통기한 : 최소 2년 정제수에대한안정성 : 최소 97시간 * DMSO에대한안정성 : 최소 4시간 * 콘오일에대한안정성 : 최소 10일 ** 아세톤에대한안정성 : 최소 3주 *** 오일제형에대한안정성 : 최소 3주 *** - 248 -

* 최근에실시된광변이원성연구로결정 (GLP 상태에서실시한안정성연구의전체설명 ) ** GLP 상태에서실시된태아발달독성시험으로결정 *** 미국국제독성프로그램 (NTP) 의경구 & 피부연구로결정 ( 참고문헌. 5, 10, 12, 21, 35, 50) 1.4. 체내동태 1.4.1. 흡수 1.4.1.1. In vitro 진피 / 경피흡수 사람피부 벤조페논이 4.9% 포함되어있는화장품제형을정적피부투과장치에놓인사람피부의피질 ( 다른피험자들에게서얻은 6개의샘플들 ) 에 3 mg/ cm2양을적용했다. 3 ml 수용액 (ph 7.4) 은 1 % 소혈청알부민, 0.9% NaCl, 0.02% KCl과 0.04 % gentamycine 으로구성되있으며, 32 를유지한다. 피부수분증발 (TEWL) 은 Tewameter 로각위치마다기록했다. 16시간노출후에피부를씻고면봉으로닦았다. 수용액을모으고각질층함량을결정하기위해 16개 strippings 들을피부표면에적용하고그뒤에진피에서표피를분리했다. 분석은 UV 검출을사용하고등용매 RP-HPLC 2 을이용했다. 벤조페논 -3 의정량결과는다음과같다. 총적용량 : 147 μg / cm2 (3 mg cream/ cm2, 4.9% 벤조페논 -3) 각질층 : 표피 : 진피 : 수용체 : 8.5 ± 3.3 μg / cm2 0.3 ± 0.2 μg / cm2 0.4 ± 0.1 μg / cm2 1.0 ± 0.4 μg / cm2 세정액 : 85.7% ± 4.5% 회복률 : 98.4% ± 3.1% 이결과는각질층에서가장많은부분 (5.8 %) 을흡수한다고나타내지만, 약 0.5 % 는독자생 존가능한피부에서흡수됐고 0.7 % 는수용액에서분석됐다. - 249 -

몇몇다른연구들은벤조페논-3나벤조페논-3이포함된제품들을사용하여피부침투에관해서나특정관점에대해서 in vitro 연구했다. 새로운모델이거나수정된침투모델과다른분석방법뿐만아니라새로구성되거나다른제형들을연구하고비교했다. 다른실험군들은사람피부 ( 전층이나분열층 ) 와돼지피부 ( 전층이나피절 ) 인공막을사용했다. 그러므로벤조페논 -3 는피부흡수가낮고, 주로각질층에흡착되고특정제형 (o/w emulsion, w/o emulsion, gels, oils, creams) 들에서시간과흡수량에대해서흡수율에영향을줄수있다 는일반적인특정들을얻을수있었다 ( 참고문헌 9, 18, 19, 24, 40, 56, 57). 1.4.1.2. in vivo 진피 / 경피흡수 사람 2002-2003 년출판된임상연구들은모두 tape stripping, 방법론에대한문제점과적용기간, 분석방법, 흡수 / 흡착계산과사용된제형의구성성분이다르므로, 벤조페논-3의 in vivo 피부흡수에대한정량은불가능하다고했다. In vitro 연구들을토대로, 적용된벤조페논-3는각질층에가장많이흡착되어소량만이생물학적이용할수있다고정성적으로언급할수있다. 게다가, 제조 / 제형유형은피부흡수의정도에영향을준다 ( 참고문헌 9, 19, 56). Gonzalez 등은몸전체에 UV 방사능조사와 UV 방사능조사를하지않는것을반복적용한후, 벤조페논-3의피부흡수에대해서임상연구를하였다. 25명의피험자들에게벤조페논-3 이 4 % 포함된자외선차단제 2 mg/ cm2을그들의몸전체표면에 5일연속으로하루에 2번씩적용했다. 피험자당자외선차단제의양은 26-47g 사이의범위에서피험자마다다르게했다. 지원자들을 2개의그룹을나누고한그룹에 UV를유발했다. 적용 5일동안, 모든뇨를받고 UV 검출기가있는 HPLC로벤조페논-3의농도를분석했다. 시험결과뇨에배출된벤조페논-3의양은차이가이었다. 그러나, UV-조사는화합물의뇨배출에영향을미치지않았다. 뇨에서발견된벤조페논-3의평균값은 3.7 % (1.2 % - 8.7 %) 였다. 다른배출경로들은조사하지않았고이값은여전히벤조페논이피부에흡수되는총백분율을과소평가한다. 지원자들은적용후여러날벤조페논-3을배출했고분자의친유성관점이기대된다 ( 참고문헌 22). - 250 -

제 2 장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 주된노출원은자외선차단제를통한경피흡수이다. 2.2. 노출평가 자외선차단제에서 UV-filter 로사용된 5% 의 BP-3 피부흡수양 (5% formulation): 5.8% [ 생체이용률고려 mean (4.2%) + 2 SD (2*0.8%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : NOAEL (terato-rat): 18 g/day 60 kg 200 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 5/100 * 5.8/100) / 60 kg = 0.87 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 200/0.87 = 230 2.3. 독성 급성독성 만성독성 면역독성 신경독성 생식독성 발생독성 유전독성 발암성 광독성 - - - ( : 독성있음, -: 독성자료없음 ) 2.3.1. 급성독성 (A cute toxicity) LD 50 을구하기위한급성독성시험이여러실험동물종에서이루어졌는데그중랫드에서는 경구용량으로서 6000 mg/kg bw 이상의반수치사량을얻었고, 토끼피부에서 16,000 mg/kg - 251 -

bw 이상의반수치사량을얻었다 ( 참고문헌 39). 랫드의경구용량에대한다른연구들에서는 11,600 mg/kg bw ( 참고문헌 45) 과 12,800 mg/kg bw 이상 ( 참고문헌 33) 의반수치사량을얻었 다. 2.3.2. 피부자극성과부식성 2.3.2.1. 피부자극 토끼 1965 년연구에서, 벤조페논-3은토끼피부에서자극이없다고보고되었고 ( 실험한 6마리토끼에서모든 score 가 0이였다 ) 이결과는 1976 년연구가뒷받침해준다. 1979 년연구는 Protective Eye Cream이라는자외선차단제 0.5 ml을 3마리의토끼피부에시험했고비자극성이나타났다 ( 모든 scores = 0) ( 참고문헌 1, 13, 46). 2.3.2.2. 점막자극 토끼 1965 년연구는토끼눈에대하여벤조페논-3은자극이없다고보고했다 ( 실험한 6마리동물에서모든 score가 0이였다 ). 이결과는 1953 년연구와 1976 년연구로더강하게뒷받침됐다. 1979 년연구는 Protective Eye Cream 이라는자외선차단제 0.1 ml을 3마리토끼에주입했고자극을찾을수없었다 ( 모든 score = 0) ( 참고문헌 1, 13, 39, 56). 2.3.2.3.. 자극성에대한결론 피부와점막에대한벤조페논-3의자극연구는오래전에연구된것이므로현재의가이드라인을따르지않는다. 그럼에도불구하고현재요구되는동물들보다더많은동물들을사용하고또한피부자극연구에서최악의상황을대표하는벗겨진피부에시험물질을적용하여유용한정보를제공한다. 모든결과들이서로일치하고동물의희생을고려해야하기때문에, 벤조페논-3에대한새로운피부나눈자극실험은적절하지않은것으로보인다. 그러므로벤조페논 -3은토끼의피부와눈에대해서잠재적자극이없다고간주된다. - 252 -

2.3.3. 피부감작성 2.3.3.1. Magnusson Kligman Maximization test 기니피그 시험일자 : 1978 년 7월가이드라인 / 방법 : Maximization test according to Magnusson and Kligman (1969), precursor of Annex V to Dir. 67/548/EEC, Method B.6 and OECD Guideline 406 동물종 / 계통 : Guinea pig/hartley white 집단규모 : 대조군으로 30마리수컷, 실험군으로 20마리암컷시험물질 : Uvinul M-40 (Benzophenone-3) 용량 : 유도기 : 10%, 유발기 : 2.5% 경로 : 피내 ( 유도기 ) 와경피 ( 유발기 ) 배치 : - 순도 : - GLP: GLP 확립전연구하였음 용량범위를찾는연구에서 Petrolatum 과순수한화합물에서의 0.25%, 2.5%, 5%, 10% 농도를가진벤조페논-3을제모한동물의옆구리에적용했다. 이연구를토대로콘오일에녹인 5 % 벤조페논-3이나 50 % 수용성 Freund s complete adjuvant에있는 5% 벤조페논-3 0.05 ml을 10마리동물의제모된어깨부분에피부내주사하였다. 유도주사투여일주일후, petrolatum 에 10% 들어있는시험물질 0.1 ml로구성된 topical booster patch 를 48시간유발부위에폐쇄적용하였다. Booster 전에, 10% 수용성 sodium lauryl sulfate를모든동물들의유도부분에폐쇄하지않고적용하였다. 유발은 petrolatum 의 2.5% 시험물질 0.1 ml을사전에 24시간동안처리하지않은부위에폐쇄적용하였다. 적용부위들은패치제거후 24시간과 48시간에 score 하였다. 유발후 48시간대에서 20마리중 18마리에서어떠한효과도보이지않았고 20마리중 2마리는미약하게감지할수있는홍반이나타났다. 72시간에는 20마리중 1마리가피부반응을보이지않았고 20마리중 3마리에서거의보이지않는홍반이나타났다 ( 첫번째 reading과다른동물들 ). 유발에서대조군은피부자극을보이지않았지만, 양성대조군 (petrolatum 에 2% phenylacetaldehyde) 동물들은감작성유도에서명백한피부반응을보였다. 그러므로벤조페논-3은기니피그의 Magnusson Kligman Maximization test 에서피부감작성 - 253 -

을유도하는어떠한잠재성이없다고보인다 ( 참고문헌 2). 2.3.3.2. 국소림프절분석 마우스 시험일자 : 2005 년 9월가이드라인 / 방법 : Annex V to Dir. 67/548/EEC, Method B.42; OECD Guideline 429 종 / 계통 : Mouse, CBA/CaOlaHsd 집단규모 : 시험군과대조군당암컷 4마리시험물질 : Benzophenone-3 배치 101 순도 : 99.8% (GC-FID) 용량 : 0-12.5-25 - 50% (w/v) in dimethylformamide (DMF) 경로 : 귓볼뒷부분에표피 ( 국소적 ) 적용 GLP/QAU: Signed documents available 3가지그룹각각의 4마리암컷마우스에 dimethylformamide (DMF) 에녹인 12.5, 25, 50% (w/v) 농도의벤조페논-3을 3일연속으로각귓불 ( 왼쪽과오른쪽 ) 뒤에국소적용하였다. 4마리의대조군마우스에는용매 (DMF) 만처리하였다. 첫번째국소적용후 5일에마우스들의꼬리에방사성을표시한 thymidine ( 3 H-methylthymidine) 을정맥주사하였다. 정맥주사하고약 5시간후, 마우스들은희생시키고각그룹당귀의림프절을잘라내고담궜다. 림프절세포의단일세포현탁액은나중에세정하고 trichloroacetic acid로밤새배양한담궈진림프절로준비했다. 담궈진림프절세포의증식능력은 β-scintillation counter 로측정된 3 H-methyl thymidine의결합으로결정했다. 한개또는그이상의시험농도에대하여노출이대조군과동시비교하여 3HTdR 의결합에서 3배나그이상증가하면시험물질은자극지표 (S.I.) 로서 LLNA에서증감제로여겨진다. S.I. 3 을만드는것을요구하는시험물질의측정된농도는 EC3 값으로간주된다. 시험한모든동물들은연구하는동안생존했었다. 자극지표 1.64, 1.33, 1.61 은 DMF에서 12.5, 25, 50 % (w/v) 농도의시험물질로결정했다. 그러므로벤조페논-3은피부감작성역할을보이지않는다 ( 참고문헌 11). - 254 -

2.3.4. 반복투여독성 (Repeated dose toxicity) 2.3.4.1. 반복투여 (28 일 ) 경구 / 피부 / 흡입독성 랫드 / 마우스 A. 랫드와마우스에아급성노출 1953 년한논문에서는 7.2, 75, 789 mg/kg bw/day 용량의랫드 ( 군당 10 마리 ) 에대해서 27 일 연구간연구했다. 시험군의음식섭취와몸무게는대조군랫드에비해서증가되었다. 시험물 질을섭취한동물에서는사망과중요한병리학적변화는없었다 ( 참고문헌 24). 1) 랫드에서의 14 일경구독성 (1985-88) 성별과그룹당 5마리의 F344/N 랫드에게 2주동안식이로 0, 3,125, 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도의벤조페논-3을주었다. 음식물의시험물질제조용물질은안정성을위해분석했고적어도 3주간의안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고장기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 303 mg/kg bw/day: 수컷과암컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 576 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 1,132 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 2,236 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 3,868 mg/kg bw/day: 암컷과수컷에서음식섭취감소 ; 수컷에서체중감소 ; 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 피질과수질에서세뇨관의국소확장 결론 : NOAEL (14d-oral) = 295/311 mg/kg bw/day for the male/female ( 참고문헌 21). - 255 -

2) 마우스에서의 14 일경구독성 (1985-88) 성별과그룹당 5마리의 B6C3F1 마우스에게 2주동안식이로 0, 3,125, 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도의벤조페논-3을주었다. 음식물의시험물질제조용물질은안정성을위해분석했고적어도 3주간의안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고장기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 1,021 mg/kg bw/day: 수컷과암컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게증가 2,041 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 4,430 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 8,648 mg/kg bw/day: 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게감소 20,796 mg/kg bw/day: 체중감소 ; 간세포의세포질액포존재와관련된암컷과수컷에서간무게증가 ; 수컷에서신장무게감소 결론 : NOAEL (14d-oral) = 992/1050 mg/kg bw/day for the male/female mouse ( 참고문헌 21). B. 랫드와마우스에서의아급성피부노출 1) 랫드에서의 14 일피부독성 (1985-88) 성별과그룹당 5마리의 F344/N 랫드에게 2주동안한주에 5일씩용매로아세톤이나로션을사용하여 0, 1.25, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/rat 농도의벤조페논-3을주었다. 0.25 ml/rat의일정한양을견갑간부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24시간과그후매주마다다듬었다. 아세톤과로션의제조용물질의안정성을분석하고최소 3주간의식이안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은 - 256 -

모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고장 기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 7.0 mg/kg bw/day: 이상반응이없었음. 13.6 mg/kg bw/day: 이상반응이없었음. 27.7. mg/kg bw/day: 암컷간무게가약간증가 54.9 mg/kg bw/day: 암컷간무게약간증가 110 mg/kg bw/day: 암컷간무게약간증가 ; 신장무게약간증가 결론 : NOAEL (14d-dermal) = 100/140 mg/kg bw/day for the male/female rat ( 참고문헌 21). 2) 랫드에서의 28 일피부독성 (1985-88) 1995 년논문에서는그룹당 6마리의 Sprague-Dawley 랫드에게 4중동안매일 2번씩 petroleum jelly base로제조된벤조페논-3을 0, 100 mg/kg bw/day 농도로주었다. 임상적증상과체중을포함한임상적연구들을모든동물들에서수행하였다. 혈액학과혈액생화학을위해혈액샘플들을투여시작하기전과 16일에채취하였다. 종료후, 동물들을희생시키고, 장기 ( 간, 신장, 고환 ) 무게를측정하고간, 신장, 고환과실험한부분과실험하지않은부분의피부를채취하고조직병리학적분석했다. 게다가, 적용 16일에 GSH 결정에대한혈액샘플을수집했다. 동물들을정상보다일찍죽지않았다. 체중, 상대적장기무게, 혈액학과혈액생화학결과들에대해서물질관련효과는없었다. 피부의물리적관찰에서물질관련변화는나타나지않았다. 간, 신장과고환의조직병리분석에서대조군과실험군동물사이의뚜렷한차이점은없었고적용하거나적용하지않은부위의피부에서이상은관찰되지않았다 ( 참고문헌 38). 3) 마우스에서 14 일피부독성 (1985-88) 성별과그룹당 5 마리의 B6C3F1 마우스에게 2 주동안한주에 5 일씩용매로아세톤이나로션 을사용하여 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 mg/mouse 농도의벤조페논 -3 을주었다. 0.25 ml/rat 의일 정한양을견갑간부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24 시 - 257 -

간과그후매주마다다듬었다. 아세톤과로션의제조용물질의안정성을분석하고최소 3주간의식이안정성을증명했다. 임상적소견, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은모든동물에서시행하였다. 처치기간동안, 모든동물들은희생되었고, 육안으로관찰하고장기들은무게를제고종합적인조직병리를수행했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도는용량으로바꿨다 ): 24.8 mg/kg bw/day: 없음 48.4 mg/kg bw/day: 없음 100 mg/kg bw/day: 없음 196 mg/kg bw/day: 암컷간무게증가 388 mg/kg bw/day: 암컷간무게증가 결론 : NOAEL (14d-dermal) = 382/432 mg/kg bw/day for the male/female mouse ( 참고문헌 21). 2.3.4.2. 아만성 (90 일 ) 경구 / 피부 / 흡입독성 랫드 / 마우스 A. 랫드와마우스에대한아만성경구섭취 1) 랫드에대한 90 일경구독성 (1972) 벤조페논-3 를성별과그룹당 12마리수컷과 12마리암컷랫드에게 13주동안약 0, 20, 100, 500, 1000 mg/kg bw/day 용량을실험했다. 동물들의임상적결과를관찰하고체중과음식섭취는매주관찰했다. 혈액학을위한혈액샘플들을 6주차와 12주차에채취하였다. 게다가, 종료후간효소활성과혈액생화학값들을성별과용량그룹당 6마리랫드에서관찰했다. 모든동물들을희생시키고육안관찰과장기들의무게를측정하고종합적인조직병리학분석을수행했다. 다음에효과들을설명했다 - 258 -

사망은나타나지않았다. 20 mg/kg bw/day: 이상반응없음 100 mg/kg bw/day: 이상반응없음 500 mg/kg bw/day: 체중과체중증가량감소 ; 암컷에서 6주후헤모글로빈과백혈구감소 ( 림프구증가와호중구감소 ); 암컷에서 12주후빈혈, 림프구증가증과과립구수감소 ; 암수에서흉선과심장의절대무게감소 ; 암수에서뇌하수체, 흉선, 시장과부신의상대적무게감소 ; 암수의신장에서퇴행성사구체신염의초기단계 1000 mg/kg bw/day: 체중과체중증가량감소 ; 주름진모피와경직 ( 굳어짐 ) (4주내에가역가능한 ); 암컷에서 6주후헤모글로빈과백혈구감소 ( 림프구증가와호중구감소 ); 암컷에서 12주후빈혈, 림프구증가증과과립구수감소 ; 암수에서흉선, 심장, 뇌하수체, 폐, 비장, 부신과생식샘의절대무게감소 ; 암수에서뇌하수체, 흉선, 심장과부신의상대적무게감소 ; 암컷에서폐와비장의상대무게감소 ; 암컷에서갑상선상대무게증가 ; 암수의신장에서퇴행성사구체신염 결론 : NOAEL (90d-dermal) = 100 mg/kg bw/day for the male/female rats ( 참고문헌 33). 2) 랫드에대한 90 일경구독성 (1985-1988) 성별과그룹당 F344/N 랫드에게 13주동안식이섭취로벤조페논-3을 0; 3,125; 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도로주었다. 식이섭취를위한시험물질의제조용물질은안정성을분석했고최소 3주동안섭취에대한안정성을증명했다. 임상적증상, 사망률, 체중과음식섭취를포함한임상적관찰을일정한간격으로모든동물에게수행했다. 혈액학과혈액생화학실험과뇨분석을위한샘플들은시험기간 12주차와 3일, 15일에채취했다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도를용량으로변환했다 ) 204 mg/kg bw/day: 색깔있는뇨 ; 간무게증가 - 259 -

411 mg/kg bw/day: 색깔있는뇨 ; 간무게증가 ; 혈청단백질농도이상 828 mg/kg bw/day: 색깔있는뇨 ; 간무게증가 ; 혈청단백질농도이상 1,702 mg/kg bw/day: 암수에서성장과체중증가량감소 ; 색깔있는뇨 ; 신장크기가커지고모양이비정상적이고표면이오돌토돌함 ; 암컷에서절대적상대적신장무게증가 ; 세뇨관팽창 ; 간무게증가 ; 혈소판수증가 ; 혈청단백질농도이상 3,458 mg/kg bw/day: 암수에서성장과체중증가량감소 ; 색깔있는뇨 ; 신장크기가커지고모양이비정상적이고표면이오돌토돌함 ; 암수에서신장의절대적상대적무게증가 ; 세뇨관팽창 ; 신간질에서섬유증에의한약간의염증 ; 간무게증가 ; 혈소판수증가 ; 혈청단백질이상 ; 수컷ㅇ서정자운동성감소, 암컷의발정주기증가 결론 : NOAEL (90d-oral) = 429/393 mg/kg bw/day for the male/female rats ( 참고문헌 21) 3) 마우스에서 90 일경구독성 (1985-88) 성별과그룹당 10마리의 B6C3F1 마우스에게 13주동안식이섭취로벤조페논-3을 0; 3,125; 6,250; 12,500; 25,000; 50,000 ppm 농도로주었다. 식이섭취를위한시험물질의제조용물질은안정성을분석했고최소 3주동안섭취에대한안정성을증명했다. 임상적증상, 사망률, 체중과음식섭취를포함한임상적관찰을일정한간격으로모든동물에게수행했다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도를용량으로변환했다 ) 554 mg/kg bw/day: 이상반응없음 1,246 mg/kg bw/day: 간무게증가 2,860 mg/kg bw/day: 간무게증가 6,780 mg/kg bw/day: 암수에서체중증가량감소 ; 간무게증가 ; 최소간세포세포질공포화 ; 16,238 mg/kg bw/day: 암수에서체중증가량감소 ; 수컷에서최소신장병변 ; 간무게증가 ; 최 - 260 -

소간세포세포질공포화 ; 수컷에서정자밀도감소와비정상적정자 증가 ; 암컷에서발정주기증가 연구자의결론 : NOAEL (90d-oral) = 1068/1425 mg/kg bw/day for the male/female mouse ( 참고문헌 21). B. 랫드와마우스에대한아만성피부섭취 1) 랫드에대한 90 일피부독성 (1985-88) 성별과그룹당 10마리의 F344/N 랫드에게 13주동안일주일에 5일씩아세톤에녹인 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 mg/kg bw/day 농도의벤조페논-3을주었다0.25 ml/rat의일정한양을견갑간부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24시간과그후매주마다다듬었다. 아세톤의제조용물질의안정성을분석했다. 임상적증상, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은일정한간격으로모든동물에서시행하였다. 혈액학과혈액생화학실험과뇨분석을위한샘플들은시험기간 12주차와 3일, 15일에채취했다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0, 12.5, 50, 200 mg/kg bw/day 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 다음에효과들을설명했다 ( 식이농도를용량으로변환했다 ): 12.5 mg/kg bw/day: 망상적혈구수감소 25 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 50 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 ; 혈소판수증가 100 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 ; 혈소판수증가 200 mg/kg bw/day: 암컷에서용량비의존적으로상대적신장무게증가 ; 망상적혈구수감소 ; 혈소판수증가 ; 림프구증가증생성에의한전체혈액세포후증가 - 261 -

연구자의결론 : NOAEL (90d-dermal) = 200 mg/kg bw/day for the male/female rats ( 참고문 헌 21). 2) 마우스에서 90 일피부독성 성별과그룹당 10마리의 B6C3F1 마우스에게 13주동안일주일에 5일씩아세톤에녹인 0, 22.8, 45.5, 91, 182, 364 mg/kg bw/day 농도의벤조페논-3을주었다0.25 ml/rat의일정한양을견갑간부의고정된표준부위 (10%) 에적용했다. 표준부위는처음도포전에 24시간과그후매주마다다듬었다. 아세톤의제조용물질의안정성을분석했다. 임상적증상, 사망률, 몸무게와음식섭취를포함한임상적연구들은일정한간격으로모든동물에서시행하였다. 정자의형태 / 운동성과질세포검사는 0, 22.8, 91, 182, 364 mg/kg bw/day 농도에서수행했다. 실험종료시점에, 모든동물을희생하고육안적관찰과장기의무게를측정하고종합적인조직병리학적검사를했다. 모든용량에서, 수컷랫드에서상대적신장무게가증가하고부고환의정자밀도가감소하였 다. 다른이상반응은관찰되지않았다. 결론 : NOAEL (90d-dermal) = 364 mg/kg bw/day for the male/female mice ( 참고문헌 21). 2.3.4.3. 반복투여독성에대한제출문의연구자들의전체결론 반복경구투여후전신독성은낮았고효과는현재국제적으로허용하는제한용량인 1000 mg/kg bw/day 범위안이거나그위용량에서주로관찰되었다. 음식섭취감소와무게증가량억제의형태에서전신독성의비특이적증상과견주어볼때, 확인된표적장기는특히고용량에서혈액생화학변화와관련있는신장과간이였다. 흔히대부분의민감한값들은간무게증가였다. 그러나, 어떠나조직병리학적연관성없이이효과는그차제로는이상반응을반영할수없고가역반응으로알려진적응할수있는대사반응으로여겨진다. 아만성경구투여후, 랫드의 3000 mg/kg bw/day 이상과마우스의 13000 mg/kg bw/day 이상의고용량에서선택적으로생식파라미터들의장애가보고됐다. 랫드와마우스에서 13주반복피부적용은각실험에서연구한최고농도까지물질과관련있는믿을수있는국소적이나전신적결과가없었다. - 262 -

마지막으로, 경구투여후아만성독성의신뢰할만한 NOAEL값은랫드에서 6250 ppm (429/393 mg/kg bw/day in male/females) 과마우스에서 6250 ppm (1068/1425 mg/kg bw/day in males/females) 이였다. 각최대용량에서아만성피부적용에서신뢰할만한 NOAEL값은랫드에서 200 mg/kg bw/day와마우스에서 364 mg/kg bw/day 였다. 2.3.5. 면역독성 (Immunological toxicity) 독성자료없음 2.3.6. 신경독성 (Neurotoxicity) 독성자료없음 2.3.7. 생식 / 발생독성 (Reproductive / Development toxicity) 2.3.7.1. 생식독성선별시험 랫드 / 마우스 A. 경구생식독성선별시험 1) 랫드에대한 90 일경구독성종료후생식독성예비선별 성과그룹당 10마리의 R344/N 랫드에게 13주동안식이로벤조페논-3을 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도로주었다. 시험이종료했을때, 물질의잠재적생식독성을선별하기위해몇몇특정실험을시행했다. 수컷동물에대해서는고환, 부고환과꼬리무게, 정자의운동성과형태, 그리고꼬리조직당정자의수를관찰했다. 암컷에대해서는처녀검사시험과발정주기에대해서관찰했다. 효과들을다음에기록했다 ( 식이농도를용량을변환 ) 204 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 - 263 -

828 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 3,458 mg/kg bw/day: 수컷 : 오른쪽꼬리, 고환과정소상체관무게감서 ; 꼬리조직당정자수감소암컷 : 주기길이연장 결론 : NOAEL ( 생식 ) = 828 mg/kg bw/day ( 암수랫드 ) ( 참고문헌 17, 21) 2) 마우스에대한 90 일경구독성종료후생식독성예비선별 성과그룹당 10마리의 B6C3F1 마우스에게 13주동안벤조페논을 0; 3,125; 12,500; 50,000 ppm 농도로식이섭취하였다. 실험종료후, 물질의잠재적생식독성을선별하기위해측정실험을하였다. 수컷에서는고환, 부고환과꼬리무게, 정자의운동성과형태, 그리고꼬리조직무게당세포수를관찰하고암컷에서는처녀검사시험과발정주기에대해서관찰했다. 효과들을다음에기록했다 ( 식이농도를용량을변환 ) 554 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 2,860 mg/kg bw/day: 연구된생식성파라미터사이에편차없음 16,238 mg/kg bw/day: 수컷랫드에서꼬리조직당정자수가감소하고비정상정자발생증가 결론 : NOAEL ( 생식 ) = 2,860 mg/kg bw/day ( 암수랫드 ) ( 참고문헌 16, 20) 3) 마우스의연속교배를통한생식성평가 (RACB) (1991) 연속교배프로토콜 은미국국제독성학회프로그램에서사용되는시험디자인이다. 관련있 는 4 가지시험법 ( 아래그림 ) 으로구성되어있고시험하는모든화합물에대하여모두필수사 항은아니다. 수행된시험에서, 1 번실험은성별당 CD-1 마우스 8 마리에게벤조페논 -3 을 0; 1,000; 2,100; 4,700; 10,200; 15,700 mg/kg bw/day 농도로 14 일동안식이섭취로구성된다. 연속교배동안 - 264 -

( 실험 2), 성별당 20마리의그룹에 1,850; 3,950; 9,050 mg/kg bw/day 용량의시험물질을포함하는식이를주었고대조군은성별당 40마리의마우스에게보충물없이식이로주었다. 먹이를주는것은교배하기 1주일전에시작했고 21일동안계속주었다. 이기간동안마우스는 14주동안 ( 실험기간은 2-17주 ) 같이있었다. 5마리의새끼들이전체연구동안태어났다. 종료시험에는임상적증상, 체중, 음식섭취, 생식성과생식력파라미터와자손에대한발달종점을관찰했다. 성별에따른영향을결정하기위한 1주일교차교배시험 ( 시험 3) 은생식력장애가나타나지않았기때문에이연구에서는실시하지않았다. 마지막으로시험 4에서는, 실험 2의마지막자손을이용해서자식의발달에대해서연구했다. 이자손은교배까지키웠다 (72 ± 10일 ). 성성숙에서다른자손들의암수동물들을교배했다. 이상태에서의관찰은교미마개존재를확인하기위해추가한부모와동일했다. 체중을측정하고부검전에 12일질세척을하여발정주기를관찰했다. 수컷에서, 부고환의정자운동성, 정자의형태와정자수를측정했다. 실험이종료됐을때부검을했고, 장기무게를측정하고조직병리검사를위해보관했다 ( 특히생식장기 ). - 265 -

효과들을다음에기록했다 : 1,850 mg/kg bw/day: 실험 2 의 20 일동안 5 마리의어미사망 3,950 mg/kg bw/day: 자손수감소 ; 어미체중감소 ; 실험 2 의 20 일동안 5 마리의어미사망 9,050 mg/kg bw/day: 자손수감소 ; 어미체중감소 ; 실험 2 의 20 일동안 9 마리의어미사망 결론 : NOAEL ( 생식력 ) = 8600/9500 mg/kg bw/day ( 암수랫드 ) ( 참고문헌 8, 23) B. 피부생식독성선별검사 1993 년에발표된짧은논문은벤조페논-3을 0, 20, 100, 400 mg/kg bw/day 용량으로 13주반복피부적용후암컷 B6C3F1 마우스에대하여벤조페논-3의생식독성잠재성을평가했다. 생식장기무게, 꼬리의부고환정자농도, 운동성과비정상적정자그리고고환의정자세포농도를검사하고고환의조직검사를했다. 검사한생식성파라미터들에서체중증가량이나이상이보고되지않았으므로벤조페논-3의국소적용은 400 mg/kg bw/day 농도까지수컷 B6C3F1 마우스에대해서생식독성이없없다고보여진다. 결론 : NOAEL ( 생식 ) = 400 mg/kg bw/day ( 암수마우스 ) ( 참고문헌 14) 2.3.7.2. 최기형성 랫드 경구 시험일자 : 2004 년 11월 1-16일가이드라인 / 방법 : Annex V to Dir. 67/548/EEC, Method B.31; OECD Guideline 414 동물종 / 계통 : WI(Han) Wistar rat 집단크기 : 용량당교미된 25마리암컷시험물질 : Benzophenone-3 배치 : 101 순도 : 99.8% (GC-FID) 용량 : 0, 40, 200 and 1000 mg/kg bw/day 경로 : 경구 ( 위관영양법 ) - 266 -

GLP/QAU: Signed documents available 벤조페논-3을콘오일에현탁시켜 40; 200; 1,000 mg/kg bw/day 용량으로위관영양법으로용량당교미된 25마리의암컷랫드에게교배후 6일동안투여했다. 표준용량으로 5 ml/kg bw을각용량당사용했다. 대조군으로는 25마리암컷랫드에게콘오일을동시에주었다. 음식섭취량과체중은실험기간동안일정하게기록했다. 건강상태는매일확인했다. 교배한 20일에모든암컷들을부검하고전체조직병리 ( 열리지않은자궁과채반의무게측정포함 ) 를검사했다. 각어미들에대해서, 황제수를측정하고삽입부위의분포 ( 재흡수로살아있고죽은태아구별 ) 을결정했다. 태아를자궁에서제거하고성별과무게측정등외부적관찰을했다. 그후에, 각새끼의태아절반은연조직결과와골격 ( 연골포함 ) 결과에대해나머지태아들을검사했다. 효과들을다음에기록했다 : 40 mg/kg bw/day: 어미, 임신변수나태아에대해서시험물질과관계있는효과없음 200 mg/kg bw/day: 투여바로직후 3/25 랫드들에서일시적타액분비 ; 임신파라미터들이나태아에대해서시험물질과관련있는효과없음 1,000 mg/kg bw/day: 투여직후일시적타액분비 ; 붉은색을띄는뇨 ; 음식섭취률과체중증가량감소 ; 골격변화 ( 다른두개골과경동맥궁의불완전골형성, 과잉 14번째갈비뼈 ) 로태아 / 새끼의비율이약간증가와전체변화의비율증가 ; 임신파라미터들에대해서시험물질과관련된효과없음. 그러므로벤조페논 -3 은최기형성영향을보이지않고어미와태아의발생독성에대한 NOAEL 은 200 mg/kg bw/day 이다 ( 참고문헌 10). 2.3.8. 변이원성 / 유전독성 (M utagenicity / Genotoxicity) 2.3.8.1. 변이원성 / 유전독성 in vitro 연구 1) In vitro 박테리아복귀돌연변이시험 (Ames test) - 267 -

벤조페논-3의 Ames test 에관한결과들은많은연구들 (1980-1992) 에나와있다. 일반적으로시험물질들은대사활성화 (S9 mix) 가있거나없는상태둘다에관해서복귀돌연변이실험을했다. TA97, TA98, TA100, TA1535 와 TA1537 계 Salmonella typhimurium 을사용하였고 S9이있거나없을상태에서다양한농도의벤조페논-3에노출시켰다. 양성대조군은시험법의민감도와유효성을설명하기위해포함했다. 박테리아독성은시험한계통 (TA97, TA98, TA100, TA1535 와 TA1537) 에서 333 μg /plate와 1000 μg /plate 이상의농도에서다양한정도가관찰됐다. 동일한논문에서, Salmonella typhimurium TA 97을추가실험을하였고 30% S9 햄스터 mix를사용했을때약한복귀돌연변이가보였다. 그러나, 각각의대조군과비교했을때 10% 햄스터나 10% 와 30% 랫드 S9 mix을사용한경우에는효과가보이지않았고복귀돌연변이체수의증가는용매대조군과비교해서 2배보다작았으며용량반응관계도없었다. 벤조페논-3은 3-333 μg /plate 사이의농도에서시험에사용된모든박테리아계통에대해서복귀돌연변이체유도에대해서음성으로보여졌다. 다른논문들 (TA 97을포함하지않음 ) 도 Ames test 에대해서벤조페논-3이음성이라고나타났다. 벤조페논-3이 S9 mix이있거나없는상태에서 Salmonella typhimurium계의염기쌍변화나유전자구조이동에의한유전자변이원성을유발시키지않는사실을고려해보면, 벤조페논-3은 Ames test에서비변이원성으로보여진다. 특정 S9 mix에서매우강한농도를사용한계통에서나타난약한양성반응은상관없다고보여진다 ( 참고문헌 7, 21, 28, 58). 2) 중국햄스터난소세포에대한염색체이상 In vitro 시험 미국국제독성프로그램보고서 (1992) 는중국햄스터난소세포를이용한세포유전학시험에서 Arcolor 1254 로유발시킨수컷 Sprague Dawley 랫드간의 S9이있을때벤조페논-3은자매염색분체교환 (5-50 μg /ml 범위의유효량 ) 과염색체이상 (20-45 μg /ml) 을유발한다고간략하게설명했다. 한시험은의심가는결과를도출했지만또다른연구에서는명백한음성이나타났다 ( 참고문헌 21). 2.3.8.2. 변이원성 / 유전독성 in vitro 연구 1) In vivo 소핵시험 ( 마우스에대한 90 일경구독성연구에대한추가시험 ) - 268 -

미국국제독성학프로그램의보고서 (1992) 는마우스에대한 90 일독성연구에서말초혈액도 말을소핵의정색소성적혈구의빈도로분석했다. 벤조페논 -3 을경구로 16,238 mg/kg bw/day 농도까지투여한암수마우스에서증가하지않았다 ( 참고문헌 21). 2) in vivo 랫드골수염색체이상시험 1995 년의한논문은암수랫드에게단회나반복 (5일연속 ) 으로경구투여하여벤조페논-3의 in vivo 세포유전학잠재성을어떻게연구하는지에대해서나타냈다. 시험물질들은콘오일에녹였고 0; 500; 1,670; 5,000 mg/kg bw/day 용량으로단회투여하거나 0와 5000 mg/kg bw/day용량으로반복투여하였다. 녹혈을양성대조군물질로사용하고 20 mg/kg bw/day 용량으로단회투여하거나 5일연속으로반복으로경구투여했다. Bomodeoxyuridine 측정을위해이전에수행된세포주기동태연구들은벤조페논-3를 5,000 mg/kg bw/day 단회경구투여하거나 5일연속으로투여한후평균세대기간에영향을주기않기때문에, 골수세포수집시간대는단회투여후 8시간과 12시간그리고반복투여후에는 12시간으로설명했다. 골수세포도말을준비하고 fluorescence-plus Giemsa 로염색하여각동물당 50 metaphase spread 의총양을염색체이상에대해서측정했다. 또한, 분열지수를결정하고배수체와내재복제된세포들의비율을분석했다. 물질과관련된사망은발생하지않았다. 단회투여나 5일연속투여는세포주기를방해하지않았고평균세대기간에영향을주지않았다. 암수랫드의골수세포에서염색체이상의빈도는증가하지않았다. 성별차이는보이지않았다. 시험법의감도를확인하기위한양성대조군물질은염색체이상을일으켰다. 그러므로암수 Sprague-Dawley 랫드에게 5,000 mg/kg bw/day 용량까지단회투여나반복을하면염색체이상을유발시키지않으므로벤조페논-3은 in vivo에서염색체의구조적이상잠재성이없다고보여진다 ( 참고문헌 41). 2.3.8.3. 변이원성 / 유전독성결론 박테리아와포유류의 in vitro 시험법으로벤조페논-3을연구했을때, 유전독성 / 변이원성잠재성은대사활성화가있거나없을때 Salmonella typhimurium계통의 3가지박테리아유전자돌연변이분석에서나타나지않았다. 흔치않게높은비율을가지는대화활성화후단일계통에서보고된영향은상관없다고여겨진다. - 269 -

포유류세포방법에서, 벤조페논 -3 은염색체구조적잠재성과대사활성화가없는상태에서 SCEs 를유도하는능력이없다고나타났다. 대사활성화가있을때, 구조적이상 SCE 비율의 증가와관련있는경미한농도나비농도를보고했다. In vivo 에서벤조페논 -3 은 13 주동안식이섭취후의마우스소핵시험과랫드에대한염색체 이상시험에서음성을나타냈다. 그러므로, in vitro 에서관찰된의심스러운효과는 in vivo 상황 에대해서연관성을가지않는다고보여진다. 2.3.9. 발암성 (Carcinogenecity) 독성자료없음 2.3.10. 광독성 (Phototoxicity) 2.3.10.1 광독성 1) In vitro 광독성 3T3 Neutral Red 흡수광독성시험 (3T3 NRU PT) 의 ECVAM 4 타당성연구에서, 벤조페논-3 은 in vitro 방법의정확성과재현성을확인하기위해 UV-filter로포함되었다. 3T3 NRU PT 시험에서시험물질의몇가지농도 ( 보통 8개 ) 로 60분간배양된 Balb/c 3T3 마우스섬유아세포를사용했다. 그후에, 세포들을 50분동안모의태양광에노출시켰다. 24시간후에 NRU (Neutral Red Uptake) 를측정하고각각의 EC 50 값은대조군과비교하여 NRU가 50% 감소된시험물질의농도로규정했다. 나중에광자극지수 (PIF) 를측정했다. PIF가 5이상이면, 시험물질은광독성이있다고여겨진다. 화학물질이 +UVA 경우에만세포독성이있고 UVA일때없을경우, 특정컴퓨터소프트웨어를사용해평균광효과 (MPE) 를계산했다. MEP경우, 완벽한농도반응곡선과비교를토대로한결과가 0.1 이상이면시험물질이광독성이있다고판단했다. In vitro 3T3 NRU PT 프로토콜에따라서시험한 11개에서, 벤조페논-3은 PIF 값이 2.7을넘고 MPE 값이 0.195 인한경우를제외하고는광독성에대한각각의기준아래였다 ( 참고문헌 - 270 -

48). 벤조페논-3에대한또다른 3T3 NRU PT 시험에서도광독성이나타나지않았다. 이결과는각각사람의적혈구와양의적혈구를사용한광용혈시험과헤모글로빈광산화시험에의해서뒷받침된다. 두가지연구모두에서벤조페논-3은광독성잠재성이보이지않았다 ( 참고문헌 37, 39). 시험유기체의 Saccharomyces Cerecisiae 나 Escherichia Coli plasmid 를사용한또다른 in vitro 시험에서도벤조페논 -3 은광독성이보이지않았다 ( 참고문헌 31, 36). 2) 기니피그에대한 In vivo 광독성 5마리의 albino Hartley 기니피그에게 petrolatum 에 10% 녹아있는벤조페논-3을미리면도하거나털을뽑은두곳의등피부에 0.05 ml을적용했다. 적용부위중한곳에는알루미늄호일을덮었다. 30분후, 알루미늄호일로덮지않은부분에 60분간 UV-A를조사시켰다. 피부반응은조사후, 표준점수체계 (0-4 등급 ) 에따라서 24시간과 48시간에평가했다. 어떤농도, 적용부위와시간대에서피부반응은나타나지않았다 ( 참고문헌 34). 2.3.10.2. 광감작성 3T3 NRU PY 연구로는광독성과광감작성을구별할수없기때문에다양한물질의광알러지와광자극을구별하기위해새로제안된 in vitro 방법인사람혈청알부민광결합과히스티딘광산화시험법으로벤조페논-3을시험했다. 벤조페논-3은이연구에서광독성과광알러지반응이나타나지않았다 ( 참고문헌 34). 2.3.10.3. 광독성과광감작성 : 사람 발표되지않은논문들 (1978-1980) 에서벤조페논-3이 3.5% 까지포함된자외선차단제나다른화장품제품들에대한임상안전평가를하였다. 이논문들은벤조페논-1, -3, -4, -5, -9와 -11의안전평가에대한최종보고서 (J. American Coll. Toxicol. 2, 1983) 로평가되었다. 이결과에따르면벤조페논-3은화장품구성요소로사용할때광독성이나광알러지반응이나타나 - 271 -

지않았다 ( 참고문헌 13, 20, 54) 벤조페논 -3 을포함하여많은 UV-filter 를이용한많은광도포시험의결과를다음표에요약 했다. 연구기간 피험자수 국가코드 시험물질 양성반응 * Remark 참고문헌 1985-1990 187 USA Benzophenone-3 PABA** Pentyl dimethyl PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane 9 1 2 5 0 - 자외선차단제에대한대부분의반응은마지막 3 년동안관찰됐다. - 시간이지날수록벤조페논 -3 의알러지반응이증가하는경향이있다. 15 1990-1993 108 IT Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane Isopopropyl Dibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-methoxycinnamate 4-MBC 4 1 0 0 2 0 0 0 벤조페논 -3 에의한광접촉성피부염은증가확산되어더많이확인되고있다. 55 1982-1992 283 DK Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC 35 3 14 0 5 3 0 0 이전연구들과같이, 벤조페논-3은시험한피험자에대해서광접촉성피부염의주요원인이고광접촉성피부염은접촉성피부염보다더많이발생한다 53 1981 402 DE 1990-1996 1990-1994 355 SV 370 FR Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC Benzophenone-3 PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate 4-MBC Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl 9 2 2 13 32 4 10 5 15 2 6 8 3 0 21 1 1 4 대부분의광알러지반응은 UVA 범위에서발생한다그러므로일반적인자외선차단제에대한이상반응보고서는등기소에보고되어야한다. 광접촉성반응이접촉성반응보다훨씬더많았다 벤조페논 -3 에대한대부분의양성반응은 1993 년전에분석했다. 프랑스에서 UV-filer 는 43 6 30-272 -

Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC 7 2 0 1 더이상자외선차단제에사용되지않고다른화장품제품에서만사용된다. 2002 1 USA Benzophenone-3 1 벤조페논 -3 에대하여즉각적이고지연된과민성반응이발생했다. 32 1991-1997 1261 Cent ral EU Benzophenone-3 PABA Octyl Dimethyl PABA Butyl Methoxy-Dibenzoylmethane IsopopropylDibenzoylmethane Ethylhexyl-p-methoxycinnam ate Isoamyl-p-methoxycinnamate 4-MBC * 양성반응은광접촉성알러지로제한했다. 직접접촉알러지는계산하지않았다. 8 3 0 2 7 2 5 1 49 ** PABA = Para-amino Benzoic Acid 2.3.11. 에스트로젠잠재적영향시험 1) 22 일된미성숙암컷랫드에대해서벤조페논 -3 의자궁비대확인시험을수행했다. 화합물은 4 일연속으로경구투여하여 4 개의그룹으로실험했다. 대조군으로는 DES-SP 를사용했다. - 참기름에대하여 0, 500, 1000 mg/kg/day S38 용량 - 참기름에대하여 5 µg/kg/day 용량으로대조군 적절한대조군을포함시켰다. 프로토콜은 OECD 가이드라인에서요구하는프로토콜을따르지않았지만, GLP 상태에서실험했다. 약물투여는사춘기개시와가까운 26일까지투여했다. 통계적으로의미있는체중증가량감소는 0-1 일사이동안실험한동물군의 1000 mg/kg/day S38의용량에서관찰됐다. 양성대조군에서는자궁의무게 ( 절대적과상대적무게 ) 가눈에띄게증가했다. S38은자궁의성장을촉진시키지않았으므로에스트로겐활성이없다고보여진다. 업계에서는 UV-filter 에가능한 4가지자궁비대반응시험을만들었고 2가지는벤조페논-3 ( 경구투여 ) 과 OMC( 경구투여 ) 와함께 4-MBC ( 피하와경구투여 ) 로실험하였다. 4개의연구결과에서자궁비대반응이나타나지않았고 3가지 UV-filter 에대해서 1000 mg/kg/day까지용량 - 273 -

3-4 일연속으로미성숙암컷 Sprague-Dawley 나 Wistar 랫드에게투여했다. 4-MBC 연구에서만 OECD 가이드라인을따라서엄격하게실험했고 199 mg/kg/day 용량에서자궁의무게가확실히증가한 Schlumpf et al (2001) 의연구에서 4-MBC 는가장활성화한 UV-filter 로나타났지만자궁비대활성에대한증거는없었다. 같은연구에서 BP-3은 1.500 mg/kg/day의용량에서약한반응을보였지만업계에서실시한연구에서 1000 mg/kg/day의용량에서자궁비대효과를발견할수없었다. 1.500 mg/kg/day 용량은 OECD 가이드라인에서제시한최고용량보다더높은용량이므로음성결과가나타난걸로보인다. 그러므로벤조페논-3은 Schlumpf 등의연구와업계의결과들과비슷하다고여겨진다. 또한벤조페논-3에대한음성결과는필라델피아에서개최한 SOT 미팅의포스터발표부분에서 Baker 등 (2000) 에의해보고되었다. fot드에투여한벤조페논-3의약 1% 는 p-hydroxy-benzophenone 으로대사된다고이미알려져있고, p-hydroxy-benzophenone 은에스드로겐에영향이있을수도있다 ( 참고문헌 42). 또한, 10% 벤조페논-3이포함된자외선차단제와 10% 벤조페논-3이포함된다른자외선차단제가국소적용후인체에서흡수되고내인성생식호르몬농도에영향을주는지에대해서최근연구되었다. 맹검시험에서, 32명의건강한피험자 (15명의젊은남성과 17명의폐경기여성 ) 의전체몸에매일자외선차단제 10% (wt/wt) 가없거나 (1주일) 있는 (2주일) 기본크림제형 2 mg/ cm2국소적용했다. 벤조페논-3은흡수되었다. 여성에서최고혈장농도는 200 ng/ml 이고남성에서는 300 ng/ml 이였다. 여성의뇨에서는약 60 ng/ml이검출되었고남성의뇨에서는 140 ng/ml이검출되었다. 벤조페논이 10% 포함된자외선차단에의노출은연구한호르몬 (FSH, LH, SHBG, estradiol, inhibin B, testosterone) 중어떤것에도영향을주지않았다. 관찰된사소한변화는알려지고정상적인생물학적변화로여겨진다 ( 참고문헌 29). 게다가, 벤조페논-3이에스트로겐수용체 (ER) α와 β, 에스트로겐수용체동족수용체 1 (ERR1) 과아릴탄화수소수용체 (AhR) 의발현형태에영향을주는지에대해서암컷 Sprague-Dawley fot드에게매일 5일동안벤조페논-3을 250과 1,000 mg/kg bw의용량을위관영양법으로투여했다. 그결과, 벤조페논-3은자궁비대효과와 ER α 전사체발현억제효과가나타나지않았고자궁에서약간나타나는 ER β의유전자발현도나타나지않았다. 이러한결과들은현재알려지지않은 uterus remians에대해서중요한기능적의미가있다. 자궁에서감소된 ER β는작은차이에대한지표가될수있고급증한 ER α에의한확산의활성도를높여준다. 자궁에대한 AhR의유전자발현은관찰되지않았다 ( 참고문헌 44). - 274 -

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[ 별첨 2] 호모살레이트 RISK PROFILE - 283 -

차례 제1장. 개요 1.1. 정의및용도 1.2. 물리 화학적특성 1.3. 체내동태 1.4. 분석법 1.5. 위해등급 제2장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 2.2. 노출평가 2.3. 독성 제 3 장. 참고문헌 - 284 -

제 1 장. 개요 1.1. 정의및용도 호모살레이트 (CAS No 118-56-9: homosalate. C 16 H 22 O 3 ) 는분자량 262.02 의옅은노란색을띄는액체로 UV 필터로널리사용되는유기화합물이다. Salicylic acid와 cyclohexanol 유도체인 3,3,5-trimethylcyclohexanol 로형성된 ester 형태이다 salicylic acid는 295 315 nm 범위의자외선을흡수하고일광노출에의해피부를보호한다. 소수성 cyclohexanol 은물에용해되는것을막는다. 호모살레이트에대한인체의직접적인노출은호모살레이트가포함된자외선차단제를비롯한다른화장품제품들에대한접촉을통해서일어난다. - 285 -

1.2. 물리 화학적특성 표 1. 호모살레이트의물리 화학적특성 항목 내용 참고문헌 물질명 (INCI) 호모살레이트 (Homosalate) 21, 46, 47 IUPAC명 21, 46, 47 CAS No. 118-56-9 21, 46, 47 화학식 C 16 H 22 O 3 46, 47 분자량 262.02 g/mol 46, 47 구조식 42, 47 물리적성상 옅은노란색을띄는액체 45, 47 녹는점 - 끓는점 165 밀도 (S.G) 1.049-1.053 42 증기압 - ph - 용해도 isopropyl myristate, ethanol (20 ): miscible 물, propylene glycol (20 ): immiscible 46, 48 Log P ow 5.82 & 6.16 42 헨리상수 - 동의어 (synonyms) Benzoic acid, 2-hydroxy-, 3,3,5-trimethylcyclohexyl ester Cyclohexanol, 3,3,5-trimethyl-, salicylate Homomenthyl salicylate m-homomenthyl salicylate Metahomomenthyl salicylate Salicylic acid, 3,3,5-trimethylcyclohexyl ester Salicylic acid, m-homomenthyl ester 3,3,5-Trimethylcyclohexyl 2-hydroxybenzoate 3,3,5-Trimethylcyclohexyl salicylate 21, 46, 47-286 -

1.3. 안정성과광안정성 유통기한 : 2 3 년 ( 참고문헌 46, 49) 광안정성호모살레이트의광안정성은 Suntest CPS Heraeus Xenon lamp (irradiance: 40 W/ m2 (24 min = 1 MED)) 을사용하여연구하는물질을흡수하는 photo-labile UV-A의존재로관찰하였다. Homosalate 가 5 % 포함된 30 mg의에멀전을유리 plate에 10 cm2면적으로펼치고 30분간건조하여시원한상태 (20 ) 에서 5, 10, 15, 20 MED로노출시켰다. 샘플들은 25 ml 에탄올에담근후 UV 분광광도법과크로마토그래피 (HPLC) 를이용하여분석하였다. 호모살레이트의함량은 0-2.7 % 범위에서감소하였으므로이러한상태에서안정한것으로보여진다 ( 참고문헌 23, 48, 50). 게다가 isopropanol 과 cyclohexane 뿐만아니라 mineral oil과 ethanol/water 에희석한용액에서도광안정성을보였다 ( 참고문헌 44). 1.4. 체내동태 1.4.1 흡수 (A bsorption) 1.4.1.1 피부를통한흡수 in vitro 1) 사람피부 Guideline: OECD 428 (Draft, 2000); OECD Guidance Document 28 (2004); Basic criteria for in vitro assessment of cosmetic ingredients (SCCNFP/0750/03, October 2003); Diembeck et al., 1999 Test System: Human skin Substance: 10% Homosalate in a standard sun screen Batch: Non labelled: 4095213 (purity: 99.88% (GLC)) Radiolabelled: CFQ 14329, specific activity: 54 mci/mmol Purity: Non labelled: 99.88% (GLC) radiochemical purity: 99.8% (HPLC) - 287 -

Dose: approx. 3.4 mg dose formulation/0.64 cm2 (corresponding toapprox. 0.5 mg Homosalate/cm2) Skin preparation: Fresh dermatomed human skin from abdominal surgery from 3 female donors Mean thickness (n=6): Donor 1: 397±30 μm Donor 2: 357±13 μm Donor 3: 519±90 μm Skin temperature: 32 C Test chamber: Flow-through automated diffusion cells (PermeGear Inc, Riegelsville, PA/USA) Receptor fluid: DMEM and Ham s F 12 culture medium (3:1) supplemented with hegf, hydrocortisone, gentamycin, glutamine and 10% FCS Solubility: 12 μg/ml in receptor fluid Route: topical application Exposure time: 24 h GLP: in compliance 10 % 표준자외선차단제로 Homosalate 의 in vitro 에서의피부침투를조사했다. 수술을통해얻은사람의피부분절을처리하고연속확산세포를통해발랐다. 온도는주위습도에서 32 를정기적으로확인했다. Receptor fluid를약 1.6 ml/h 속도로끌어올렸다. 완전한제형을시작하루전에준비했다. 재형의균질성과방사능농도를분석했다. 0.64 cm2당약 3.4 mg 농도의자외선차단제제형 ( 약 0.5 mg Homosalate/ cm2 ) 를적용했다. 24시간동안노출시켰다. 노출시키는동안 receptor fluid 샘플을일정간격으로채취했다. 노출 24시간후, 부드러운비누용액과면봉을사용해피부표면을씻었다. 각각의피부는 Dsquame를사용하여 tape stripped 을 10회하였다. 진피조각이있는 tape strip을담궜다. 전체균형을 receptor fluid와피부표면세정, receptor 와 donor compartment 세정, tape strips 그리고 digested skin을사용해결정했다. 방사능은 LBK/Wallac S1414 scintillation counter 로결정했다. 결과 사람피부에서의진피흡수는다음과같다. - 288 -

그룹 A B C 제형에포함된호모살레이트 (%) 10.1 10.1 10.1 용량 ( μg / cm2 ) 544.9 548.0 541.2 생체검사수 6 6 6 24 시간후수용액침투 1.36 μg / cm2 0.25 % of dose 0.87 μg / cm2 0.16 % of dose 0.66 μg / cm2 0.12 % of dose Flux constant ( μgxcm2 /h) 0.077 0.057 0.039 지연시간 6.5 7.0 7.6 전체흡수율 (% of dose) 1.4 0.9 0.9 전체흡수양 # ( μg / cm2 ) 7.63 4.93 4.87 # total absorption as amount in receptor fluid including wash and skin membrane excluding tape strips 결론 10 % Homosalate 가포함된표준자외선차단제제형을적용한후, Homosalate 의흡수에대한평균 flux constant 는 0.058 μg / cm2이였다. 전체흡수평균은 5.81 μg / cm2에해당하는적용양의 1.1 % 였다. 회복평균은 92.4 % 였다. 가장높은흡수는 A그룹에서가장높은흡수율인 2.0 % (10.9 μg / cm2 ) 와함께 1.4±0.4 % (7.63±2.18 μg / cm2 ) 를보였다 ( 참고문헌 11). 2) 랫드피부 Guideline: OECD 428 (Draft, 2000); OECD Guidance Document 28 (2004); Basic criteria for in vitro assessment of cosmetic ingredients (SCCNFP/0750/03, October 2003); Diembeck et al., 1999 Test System: Rat skin (Sprague-Dawley) Substance: 10% Homosalate in a standard sun screen Batch: Non labelled: 4095213 (purity: 99.88% (GLC)) Radiolabelled: CFQ 14329, specific activity: 54 mci/mmol Purity: Non labelled: 99.88% (GLC) Radiochemical purity: 99.8% (HPLC) Dose: approx. 3.4 mg dose formulation/0.64 cm2 (corresponding to approx. 0.5 mg Homosalate/cm2) - 289 -

Skin preparation: Fresh punched out rat skin from 3 female Sprague-Dawley rats Mean thickness (n=6): Rat 1: 669±47 μm Rat 2: 755±73 μm Rat 3: 763±89 μm Skin temperature: 32 C Test chamber: Flow-through automated diffusion cells (PermeGear Inc, Riegelsville, PA/USA) Route: topical application Receptor fluid: MEM (Minimal Essential Medium) supplemented with gentamycin, glutamine and 10% FCS Solubility: 12 μg/ml in receptor fluid Exposure time: 24 h GLP: in compliance 10 % Homosalate 가포함한표준자외선차단제제형을랫드시험하였다. 3마리암컷 Sprague-Dawley 랫드피부를 gentamycin, glutamine과 10 % FCS로보충된 MEM ( 최소필수배지 ) 로구성된 receptor fluid를제외하고위에설명된사람에대한실험과동일한과정으로실험하였다. 결과 랫드의독자생존가능한피부에서진피의흡수결과는다음과같다. 그룹 D E F 제형에포함된호모살레이트 (%) 10.1 10.1 10.1 용량 ( μg / cm2 ) 535.9 535.9 535.9 생체검사수 6 6 6 24 시간후수용액침투 7.12 μg / cm2 1.33 % of dose 19.37 μg / cm2 3.62 % of dose 18.50 μg / cm2 3.45 % of dose Flux constant ( μg x cm2 /h) 0.412 0.997 1.012 지연시간 6.8 4.6 5.7 전체흡수율 (% of dose) 7.4 7.7 11.0-290 -

전체흡수량 # ( μg / cm2 ) 39.66 41.26 58.95 # total absorption as amount in receptor fluid including wash and skin membrane excluding tape strips 결론 10 % Homosalate 가포함된표준자외선차단제제형을적용한후, Homosalate 의흡수에대한평균 flux constant 는 0.807 μg / cm2이였다. 전체흡수평균은 46.62 μg / cm2에해당하는적용양의 8.7 % 였다. 회복평균은 93.1 % 였다 ( 참고문헌 11). 1.4.1.2. in vivo 피부흡수 현재 in vivo에서의피부침투연구에대해과학적이거나규제력을지닌유효성이없다. 단지 Homosalate 를이용한몇몇연구들이출판되었고 open literature 에서가능했다. Tape stripping 방법은 Chatelain et al. (2003) 과 Sarveiya et al. (2004) 에서사용되었다. 두가지연구둘다에서피부를통한침투는최소였고대다수는각질층에남는다고보고하였다. 게다가, Chatelain et al. (2003) 은적용된제형에관해서차이점을관찰했다. 각질층에침투된전체양은 petrolatum jelly 제형보다 O/W 에멀젼에서더높았다. 마지막으로, in vitro 결과로피부침투에대한양적결론은질적결론을제외하고불가능했고각질층은 greatest fraction 을흡수했고오직적은양만흡수되고온몸에생물학적으로이용할수있다고여겨진다 ( 참고문헌 5, 14, 43). 1.4.1.3. 피부흡수에대한결론현재의가이드라인요구사항과 GLP 상태에서실시된 in vitro로사람과랫드의피부흡수를비교한최근연구는피절에서자외선차단제를포함한 10 % Homosalate 의적용이랫드에서는평균 8.7 % (46.62 μg/ cm2에상응하는 ) 이고사람에서는평균 1.1 % (5.81 μg/ cm2에상응하는 ) 를이끈다고나타냈다. 평균회복률은 92.4 % 였다. 가장높은흡수율은가장높은흡수율인 2.0 % 가있는그룹 A에서 1.4 ± 0.4 % (7.63 ± 2.18 μg/ cm2 ) 에서나타냈다. 게다가, 전체흡수율에기반하여사람피부는랫드피부에비해서약 8배적었다. 1.4.2. 대사 (M etabolism) - 291 -

호모살레이트는피부, 혈장, 간을비롯한다른조직들에서에스테르가수분해효소에의해빠르 고완벽하게 salicylic acid 과 trimethylcyclohexanol 로대사된다 ( 참고문헌 42). 제 2 장. 위해평가 2.1. 노출원및노출경로 주요노출원은자외선차단제이며경피노출이주요한노출경로이다. 2.2. 노출평가 피부노출에대해서만안전성평가를하였다. 피부흡수양 (5% formulation): 2.4% [ 생체이용률고려 mean (1.4%) + 2 SD (2*0.5%)] 적용양 ( 자외선차단제 ): 일반사람체중 : 18 g/day 60 kg NOAEL (2 주반복투여독성 - 랫드 ): 100 mg/kg bw/day 전신노출용량 (SED) = (18 g/day * 10/100 * 2.4/100) / 60 kg = 0.72 mg/kg bw/day 안전역 (M os) = NOA EL / SED = 100/0.72 = 139 독성동태결과가불가능한암수랫드에대한 14 일예비실험에서얻은 NOAEL 값이다 - 292 -

2.3. 독성 급성독성 만성독성 면역독성 신경독성 생식독성 발생독성 유전독성 발암성 광독성 - - ( : 독성있음, -: 독성자료없음 ) 2.3.1. 급성독성 (A cute toxicity) 2.3.1.1 급성경구독성 1) Guideline: / Species/strain: Rat/FDRL Group size: 3 males and 2 females per dose level Test substance: Homosalate (Homomethyl salicylate) Batch: R-5269-D Purity: / Doses: 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0 ml/ kg bw Observation: 14 days GLP: / 암수 FDRL 랫드에 Homosalate 를 0.5; 1.0; 4.0; 8.0 ml/kg bw 용량을위관영양법으로경구투여하였다. 체중은 0일과 14일에측정하였다. 병리학적측면은 14일동안죽고생존한랫드에서관찰하였다. 그결과어떠한농도에서도사망한랫드는없었고 0.5-2.0 ml/kg bw 사이의농도에서임상적반응도없었다. 모든동물들은체중이증가하였다. 4.0 ml/kg bw 농도에서랫드 1/5 은부드러운변을보였고, 8.0 ml/kg bw에서 1/5은설사와감기증상이나타나고수척해보였으며요실금증상이보였다. 부검에서비특이적발견은각각의용량에서단한마리만발견됐다. 그러므로 Homosalate 의급성경구독성 (LD50) 은 FDRL 수컷과암컷랫드에서 > 8.0 ml/kg 이였다 ( 참고문헌 38) 2) Guideline: / Species/strain: Rat / no information on strain - 293 -

Group size: 10 animals Test substance: Homosalate (Homomethyl salicylate) Batch: no information available Purity: / Doses: 5000 mg / kg bw Observation: no information available (more than 6 days, vide infra) GLP: / 10마리의랫드에 Homosalate 를단회용량으로 5000 mg/kg bw를경구투여한다른시험에서는관찰기간동안 10마리중마리가 6일에사망하였다. 어떤용량에서도사망과임상적증상이보이지않았다. 부검에서급성중독의비특이적발견은한마리에서만나타났다. 이실험에서 Homosalate 의급성경구독성 (LD50) 은랫드에서 > 5000 mg/kg 였다 ( 참고문헌 41). 2.3.1.2. 급성피부독성 Guideline: / Species/strain: Rabbit/albino (strain not cited) Group size: 10 animals Test substance: Homosalate (Homomenthyl salicylate) Batch: no information available Purity: no information available Doses: 5000 mg/kg bw dermal Observation: no information available GLP: no (study performed prior to implementation of GLP) 10마리의토끼피부에 Homosalate 를단일용량으로 5000 mg/kg bw 투여하였다. 실험결과, 사망은보이지않았지만토끼의 4/10 이나 6/10 에서경미한발적이나타났고 7/10 이나 3/10 에서경미하거나일반적인부종으로발생한피부자극증상이있었다. 그러므로 Homosalate 의급성피부독성 (LD50) 은토끼에서 > 5000 mg/kg 였다 ( 참고문헌 41). - 294 -

2.3.2. 피부자극과부식성 2.3.2.1. 피부자극 실험동물에대한 Homosalate 의피부자극가능성연구와일치하는가이드라인이없다. 그러나, Homosalate 의피부자극특징은암수기니피그를이용하여수정된 Harber et al. (1982, 1987) 의프로토콜에연구와암컷 BALB/C 마우스의귀붓기연구내에서시험되었다. 이러한연구에서 Homosalate 는기니피그와마우스에서피부자극가능성을보이지않았다 ( 참고문헌 19, 20). 2.3.2.2. 점막자극 Guideline: Eye irritation study according to the method of Draize et al. (1959) comparable to OECD 405 Species: Rabbit/New Zealand White Group: 3 male animals Substance: sunscreen containing 12% Homosalate Batch: No information available Purity: Neat sunscreen Dose: 0.1 ml instillation in the conjunctival sac of the right eye GLP: in compliance 3마리의수컷 New Zealand White 토끼에서 Homosalate 가 12 % 포함된자외선차단제의잠재적자극효과를연구하였다. 자외선차단제 0.1ml 을토끼의오른쪽눈의결막낭에적용하였다. 왼쪽눈은처리하지않고대조군으로사용했다. 테스트물질을씻어내지않고 1, 24, 48, 72 시간에각막, 홍채, 그리고결막에대한자극반응을위해보조등을추가하여실험하였다. 결과는 Draize et al (1959) 을따라측정하였다. 24시간결과에서, 자외선차단제를적용한눈과적용하지않은눈에 fluorescein 용액을사용하여실험하였고, 남은테스트물질은물리적셀라인으로부드럽게씻어냈다. 그결과, 자외선차단제를적용한눈에서어떤시간대에서도토끼의각막에영향이없었다. 자외선차단제의노출은 1시간 scoring interval 에서 2/3이홍채염이나 - 295 -

타났지만 24시간이내에완벽히회복되었다. 발적, 붓기, 그리고분비물이있는결막염은 1 시간사이에모든토끼에서나타났지만나중에발생정도와쓰라림이개선되었다. 72시간에는결막반응인없었다. 그러므로 Homosalate 가 12 % 포함된자외선차단제제형은이연구상태에서약간의눈자극을이끄는것으로보여진다참고문헌 45). 2.3.3. 피부민감성 2.3.3.1. 인체감작성시험 Guideline/Method: Human Maximization test according to Draize, 1966 Species: Human Group size: 25 volunteers: 7 males, 18 females Test substance: Homosalate Batch: not cited Route: Occlusive epicutaneous application Scoring system: Scoring scale of Draize GLP: not in compliance 건강한 25명의피험자에대한인체피부감작성시험으로 Homosalate 의잠재적민감성을시험하였다. Neat test 물질을동일한부위에각시간마다밀폐요법으로 48시간동안적용하였다. 적용전에, 노출부위는 24시간동안 2.5 % 수용성 SLS을폐쇄적으로전처리하였다. 10일후에, challenge patch 를다른부위에밀폐상태로 48시간동안적용했다. 각 challenge 부위는 5 10 % 수용성 SLS로 1시간동안폐쇄적으로전처리하였다. Patch 제거하고 24시간후에 challenge 부위를살피고등급을매겼다. 25명의피험자들은어떠한 challenge reading 에서도피부자극과민감성반응이나타나지않았다. 그러므로 Homosalate 는남녀피험자에서의감작성시험에서민감성반응을일으키지않는것으로보인다 ( 참고문헌 35). 2.3.3.2. 인체누적첩포시험 - 296 -

Guideline/Method: Approved study protocol and standard operating procedures by the NewEnglandInstitutionalReviewBoard(NEIRB)2005 Species: Human Group size: a) c) 236 induced volunteers and 209 completed Test substance: a) SPF-30 sunscreen (formula #769-187, Homosalate content: 10%) b) SPF-45 sunscreen (formula #769-190, Homosalate content: 15%) c) SPF-30 sunscreen (formula #769-193, Homosalate content: 10%) Batch: a) batch #0015C-P (white cream) b) batch #0015C-V (white cream) c) batch #0015C-M (white cream) Route: Semi-occlusive epicutaneous application Scoring system: Modified scoring scale of the International Contact Dermatitis Research Group System (Fisher, Alexander A., Contact Dermatitis, Lea & Febiger, 1986, 26) GLP: in compliance GLP 상태에서 236 명의남녀피험자에대하여 Homosalate 가 10 % 나 15 % 포함된 3 가지다른 자외선차단제를 NEIRM 연구프로토콜에따라인체누적첩포시험을실시하였다. 유도기 : 유도기동안, 지원자왼쪽등부분에약 0.2 g의시험물질을적용하고건조시켰다. webril/adhesive 패치를반폐쇄적으로덮고 24시간동안피부에적용했다. 그후, 패치를제거하고피부를확인했다. 패치제거는시험기간동안의 24시간휴지기나일주일동안의 48시간휴지기에실시하였다. 9개의연속된유도패치들은 3주가넘어서끝났다. 휴지기 : 마지막유도패치는적용없이 2주간의휴지기에실시하였다. 유발기 : 휴지기후에, webril/adhesive 패치를실험하지않은피험자의왼쪽등부분에 0.2 g의시험물질을적용하고 24시간동안반폐쇄적으로고정시켰다. 제거후, 적용부위를패치붙인후 24, 48, 72, 96 시간대에대해서확인했다. 끝난시험은피험자의 scoring 에참여하는공인인증된피부과의사의감독하게시행하였다. 결과 27 명은시험물질반응때문에실험을끝까지하지못하였다. 유도기동안각시험자들은 - 297 -

SPF-30 이나 45 수치의자외선차단제적용후, 일시적으로무시해도될정도의홍반을보였지만, 유발기에서는어떠한지원자도시험한피부부분에피부이상이없었다. 다른 SPF-30 자외선차단제를이용한시험에서피험자들은유도기동안피부이상이없었지만한피험자만 24, 72, 96 시간을제외하고 48시간에서낮은단계의반응을보였다. 그러므로시험에사용된 10 % 나 15% 의 Homosalate 가포함된자외선차단제제품들은남녀피험자에서의 RIPT 연구상에서자극이나민감성에대한유도는없었다 ( 참고문헌 28, 31, 34). 그외, 다른인체누적첩포시험결과들은다음과같다. 시험법 시험물질 피험자수 A pplication Remark 반폐쇄 결과 참고문헌 RIPT SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) 236 명유도, 209 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 28 유발기 : 반응없음반폐쇄 RIPT SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H 236 명유도, 209 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 29 유발기 : 반응없음반폐쇄 RIPT SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) 236 명유도, 209 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 34 RIPT MT#2101420 (10% H) 112 명유도, 102 명완료 유발기 : 반응없음반폐쇄 유도기와반응없음폐쇄 유발기에서 피부자극이나민감성에대한가능성없음 6 RIPT Lotion 3 (12% H) 203 명유도, 202 명완료 유도기 : 마지막유도기동안부분적발적 피부자극이나민감성에대한가능성없음 7 유발기 : 반응없음반폐쇄 RIPT U02195.05 (283221, 10% H) 240 명유도, 210 명완료 유도기 : 1 명의낮은용량에서일시적반응 피부자극이나민감성에대한가능성없음 15, 22 RIPT MT# 2047459 600 명유도, 600 명완료 유발기 : 반응없음폐쇄에관한정보없음 유도기와반응없음 유발기에서 피부자극이나민감성에대한가능성없음 37 RIPT U03036.01 219 명유도, 폐쇄반응은물질에 16, 39-298 -

RIPT (283267, 10% H) 211 명완료 U03036.03 (283273, 10% H) 219 명유도, 211 명완료 유도기 : 1 명의 2 등급의일시적홍반과 1 명의 3 등급의발적 / 부종 유발기 : 반응없음폐쇄 유도기 : 1 명의 2 등급의일시적홍반과 1 명의 3 등급의발적 / 부종 유발기 : 반응없음 폐쇄 의한자연적발생으로여겨짐. 피부자극이나민감성에대한가능성없음유도기동안 2명의피험자에서만중간정도의누적자극 피부자극이나민감성에대하여임상적으로밀접한가능성없음. 17, 40 RIPT 2 자외선차단로션 (each 15% H) SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H) 221 명유도, 215 명완료 유도기 : 낮은용량에서몇몇일시적반응 유발기 : 낮은용량에서 1 명반응 14일동안 (3x/week) 6 x폐쇄 (48 h/72 h week/weekend) 피부자극이나민감성에대한가능성없음 51 CIT SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) 28 명유도, 26 명완료 누적자극에대한가능성없음 25 SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) H = Homosalate; CIT = cumulative irritation test; RIPT = repeated insult patch test 2.3.4. 반복투여독성 (Repeated dose toxicity) Guideline: / Species/strain: Rat Group size: 5 animals/sex/group Test substance: Homosalate Batch: / Purity: / Doses: 0, 100, 300, 1000 mg/kg bw Route of exposure: gavage Observation: 2 weeks exposure period GLP: not in compliance - 299 -

암수랫드에게 2주동안위관영양법으로 0, 100, 300, 100 mg/kg bw농도의호모살레이트를투여하였다. 수컷에서약간의체중증가량억제와 100 mg/ kg bw 농도에서의식효감소를제외하고다른그룹에서는몸무게데이터가음식섭취나식효와관련이없었다. 혈액학과병리학에서는어떤용량에서도치료와관련된연관성이없다고나타났다. APTT 와 PT 증가는 300 mg/kg bw 이상농도의수컷과 1000 mg/kg bw 농도의암컷랫드에서관찰됐다. Bilirubinds 은 100 mg/kg bw 이상농도의수컷과 300 mg/kg bw 농도의암컷에서감소했지만, triglyceride 는 1000 mg./kg bw 농도의암수모두에서증가했다. 그러나이러한효과들은이상반응 (Bilirubin) 이나잠재적이상반응 (triglyceride) 으로여겨지지않는다. 그러므로 300 mg/kg bw 농도의수컷과 1000 mg/kg bw 농도의암컷에서의응고효과때문에랫드에대한 14일반복독성은 100 mg/kg bw를무독성량으로추정하였다 ( 참고문헌 24). 2.3.5. 면역독성 (Immunological toxicity) - 자료없음 2.3.6. 신경독성 (Neurotoxicity) - 자료없음 2.3.7. 생식 / 발생독성 (Reproductive / Development toxicity) 호모살레이트자체의생식 발생독성에대한자료는없지만, Robert (2005) 가설명한호모살레이트의대사경로와그의연구에따르면대사체인 salicylic acid의최기성에대해서광범위하게연구되고있다. 호모살레이트대사체인 trimethylcyclohexanol 로대사되는 isophorone 에서시행한최기성시험이음성이였다. 또한 trimethylcyclohexanol 와구조가비슷한 menthol에대한생식독성과최기성도음성을나타냈다 ( 참고문헌 43). 2.3.8. 변이원성 / 유전독성 (M utagenicity / Genotoxicity) 2.3.8.1. 복귀돌연변이시험 - 300 -

Guideline/method: OECD 471 (Ninth Addendum, 21 July 1997) Test system: Salmonella typhimurium, strain TA98, TA100, TA102, TA1535, TA1537 Replicates: triplicate plates, two independent assays Test substance: Homosalate Batch: 4095213 Purity: 99.88 area % salicylic acid-3,3,5-trimethyl-cyclohexylester Concentrations: Range-finding experiment (±S9 mix): 3, 10, 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate Experiment I -S9 mix: 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate +S9 mix:3, 10, 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate Experiment II (±S9mix): 10, 33, 100, 333, 1000, 2500, 5000 μg/plate Solvent: DMSO Positive Controls: - S9 mix: TA 100, TA 1535: sodium azide, 10 μg/plate TA98, TA1537: 4-nitro-o-phenylene-diamine, 10 μg/plate in TA98, 50 μg/plate in TA1537, TA102: methyl methane sulfonate, 5 μl/plate + S9 mix: all strains: 2-aminoanthracene, 2.5 μg/plate (TA98, TA100, TA1535, TA537), 10 μg/plate TA 102 GLP: in compliance 직접배양법 ( 시험 Ⅰ) 과전배양법 ( 시험 Ⅱ) 에따라서대사활성화 (S9 mix) 존재상태와비존재상태에대한박테리아의복귀돌연변이시험으로변이원성이시험되었다. 3 μg /plate에서 5000 μg /plate 농도범위의시험물질 (DMSO에용해 ) 을 Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100, TA102, TA1535 와 TA1537 에노출시켰다. 실험결과, 시험 Ⅰ의대사활성화존재하에 TA98의 5000 μg /plate농도와 TA100의 2500 μg /plate 이상의농도에서생육저해에의한박테리아독성이나타났고 TA1537 과 TA100 의 2500 μg /plate (+S9 mix) 이상의농도와 TA100 의 1000-5000 μg /plate (+S9 mix) 나 5000 μg /plate (-S9 mix) 에서복귀돌연변이체의수가감소하였다. 시험물질은대사활성화가존재하거나비존재하는상태에서시험된어떤농도에서도균주의복귀돌연변이콜로니수를증가시키지않았다. 그러므로호모살레이트는박테리아독성농도까지대사활성화유무에서유전자변이원성이유발되지않았으므로 Salmonella typhimurium 시험에서변이원성이없다고보여진다 ( 참고문헌 13). - 301 -

Harworth et al (1983) 에설명된전배양법으로대사활성화 (S9 mix) 유무하에 Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100과 TA1535 균주에 0, 10, 33, 100, 333, 1000, 3333, 10000 μg /plate (DMSO) 농도의호모살레이트에대한변이원성을시험한연구에서는어떤균주와어떤농도에서도호모살레이트는변이원성을보이지않았다 ( 참고문헌 36, 52) Ames et al. (1975) 에따른표준직접배양법에서 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 와 TA1537 균주에대해서호모살레이트는대사활성하 (S9 mix) 존재상태와비존재 상태에서도돌연변이가관찰되지않았다 ( 참고문헌 4). 2.3.8.2. 중국햄스터난소세포에대한염색체이상시험 Guideline/method: OECD 473 (ninth addendum, 21 July 1997) Test system: Chinese Hamster V79 cell line Test substance: Homosalate Batch: 4095213 Purity: 99.88 area % salicylic acid-3,3,5-trimethyl-cyclohexylester Concentrations: Experiment I -S9 mix: 4h exposure,18h harvest: 5.0; 10.0; 20.0 μg/ml +S9 mix:4h exposure, 18h harvest: 12.5; 25.0; 50.0 μg/ml Experiment II -S9 mix: 18h exposure, 18h harvest: 1.6; 3.1; 6.3 μg/ml -S9 mix: 28h exposure, 28h harvest: 6.3 μg/ml +S9 mix: 4h exposure, 28h harvest: 6.3; 12.5; 25.0 μg/ml Solvent: Ethanol Positive controls: Without S9 mix: Ethylmethane sulfonate, 200-300 μg/ml With S9 mix: Cyclophosphamide, 1.4 μg/ml GLP: in compliance 중국햄스터난소세포에대한 in vitro 실험으로호모살레이트가구조적염색체이상을유발하는지를평가하였다. 시험물질은대사활성화 (S9 mix) 가존재하는상태와그렇지않은상태에서시행하였다. 시험물질을에탄올에녹여대사활성화가없는상태에서는 4, 18 그리고 28시간동안배양시켰고, 대사활성화가있는상태에서는 4시간동안세포배양하였다. 콜레미드를시 - 302 -

험시작후각각 15.5 시간과 25.5 시간에배지에첨가하고 2.5 시간후에세포를슬라이드에옮겨서빙초산혼합액으로고정시키고김사염색을하였다. 세포유전적손상에대하여배지당중기판에펼친 100 well을측정하고배지당 500 중기판에서배수세포의수를측정하였다. 독성에대한범위측정예비실험에서시작후 24시간의독성세포수를유전독성에대한지표로측정하였다. 19.5 μg /plate와 2500 μg /plate 사이의농도를적용했다. 결과범위측정시험에서, S9 mix가없는상태의 19.5 μg /plate 이상농도와 S9 mix가있는상태의 78.1 μg /plate 이상의농도에서시험 4시간후에명확한독성효과가관찰됐다. 또한, S9 mix가없는상태에서 19.5 μg /plate 이상의농도를 24시간연속으로처리하였을때강한독성이나타났다. 배양배지에서시험물질의침전은 S9이없는상태의 156.3 μg /plate 이상의농도와 S9 이있는상태에서의 312.5 μg /plate 이상의농도에서나타났다. ph값이나침투압과관련있는영향은관찰되지않았다. 본연구에서는시험시작 4시간후시험물질의침전이 50 μg /plate와그이상의농도에서 18시간간격에서시험 Ⅰ에서 S9 mix가있을때관찰됐다. 다른모든실험에서는시험물질처리후침전은나타나지않았다. 세포독성은대사활성화유무하의모든실험에서관찰되었지만, 18시간과 28시간연속적으로처리한후 S9 mix가없는실험 Ⅱ에서확실한세포독성을나타낸농도는세포유전적손상을측정할수없었다. 두개의독립된실험에서, 구조적염색체이상이있는세포수에대한생물학적으로관련있는증가는관찰되지않았다. 실험 Ⅱ에서 S9 mix가없는상태에서 2개의확실한증가 ( 각각 2.5% 와 2%) 가관찰되었지만, 이것은누적된대조군범위 (0.0 4.0% 이상세포, 갭제외 ) 내에있고관련성이없다고보여진다. 대조군의발생과비교하여중기배수체의발생에대한상관성있는증가는보이지않았다. 그러므로호모살레이트는세포독성농도까지시험했을때중국햄스터의 V79 세포에서대사활성화유무에상관없이염색체이상유발이없다고보인다 ( 참고문헌 10). 2.3.9. 발암성 (Carcinogenecity) - 자료없음 2.3.10. 광독성 (Phototoxicity) - 303 -

2.3.10.1. 사람에대한광독성 / 광알러지시험 1) 사람에대한광독성시험 Guideline/Method: Approved study protocol and standard operating procedures by the New England Institutional Review Board (NEIRB) 2005 Species: Human Group size: a) - c) 20 volunteers Test substance: a) SPF-30 sunscreen (formula #769-187, Homosalate content: 10%) b) SPF-45 sunscreen (formula #769-190, Homosalate content: 15%) c) SPF-30 sunscreen (formula #769-193, Homosalate content: 10%) Batch: a) batch #0015C-P (white cream) b) batch #0015C-V (white cream) c) batch #0015C-M (white cream) Route: Semi-occlusive epicutaneous application Light source: UV-A irradiation by four Philips F40BL fluorescent tubes with a peak output at 369 nm and half-power bandwidth of 15 16 nm. UV dosage: UV-A intensity: 3.3 4.4 mw/cm2; duration: about 17 min (total dose of 4.0 ± 0.4 J). Scoring system: Modified scoring scale of the International Contact Dermatitis Research Group System (Fisher, Alexander A., Contact Dermatitis, Lea & Febiger, 1986, 26). GLP: in compliance 다른물질사이에호모살레이트가 10% 나 15% 포함된 3가지다른자외선차단제의광독성을승인된 NEIRB 프로토콜에따라 GLP 상태에서 20명의남녀피험자에대해서측정하였다. Webil/adhesive 패치를반폐쇄적으로사용하고약 0.2 g을각패치에적용했다. 방사선조사부분의패치는등에적용하고방사선을조사하지않은물질은등앞부분에적용하고옷이나패치로빛에대해서보호하였다. 게다가전체시험기간동안, 피험자들은태양광노출에대하여방사선을조사하지않은부분을보호했다 - 304 -

시험일정 : 1일에약 24시간동안복제한패치를덧대었다. 2일에패치들을제거하고방사선을조사한부분에서패치적용후약 24시간후에확인하고 score 을매겼다. 이부분은 UV-A로조사후에측정하였다. 방사선을조사하지않은부분은보호하고방사선조사과정후측정하였다. 3-4일에방사선조사부분과조사하지않은부분의피부반응을패치적용후약 48시간과 72시간에측정하였다. 시험완료는면허가있는피부과의사의감독하게이루어졌다. 결과시험한자외선차단제가접촉한부위나처리하지않은부분에서방사선조사가있거나없는상태둘다에서피부반응은나타나지않았다. 그러므로호모살레이트가 10% 나 15% 포함된자외선차단제는이시험상태에서는피부광독성을일으키지않는다 ( 참고문헌 26, 29, 33). 2) 사람에대한광알러지시험 Guideline/Method: Approved study protocol and standard operating procedures by the New England Institutional Review Board (NEIRB) 2005 Species: Human Group size: a) - c) 29 volunteers induced, 28 volunteers completed Test substance: a) SPF-30 sunscreen (formula #769-187, Homosalate content: 10%) b) SPF-45 sunscreen (formula #769-190, Homosalate content: 15%) c) SPF-30 sunscreen (formula #769-193, Homosalate content :10%) Batch: a) batch #0015C-P (white cream) b) batch #0015C-V(white cream) c) batch #0015C-M(white cream) Route: Semi-occlusive epicutaneous application Irradiation: UV-A and UV-B for induction and UV-A for challenge, each irradiation about 24 hours post-patching Light source: UV-A irradiation by four Philips F40BL fluorescent tubes with a peak output at 369 nm and half-power bandwidth of 15 16 nm. UV-B irradiation by customm adelight source with a peak out put at 313 nm and half-power band width of 30nm. UV dosage: UV-A intensity: 3.3 4.4 mw/cm2; duration: about 17 min (total dose of 4.0-305 -

± 0.4 J). UV-B intensity: 1.0 0.2 mw/cm², The UV-B irradiation was based on each volunteers skin type and minimal erythema dose (MED) as determined prior the first irradiation. Scoring system: Modified scoring scale of the International Contact Dermatitis Research Group System (Fisher, Alexander A., Contact Dermatitis, Lea & Febiger, 1986, 26). GLP: in compliance 다른물질사이에서호모살레이트가 10% 나 15% 포함된세가지자외선차단제의사람에대한광알러지유도를연구하였다. 남녀피험자들은승인된 NEIRB 프로토콜에따라서 GLP상태에서실험하였다. 유도기 : webil/adhesive 패치을반폐쇄적으로사용하였다. 약 0.2 g의시험물질을각패지에적용하였다. 방사선조사된된부분의패치를등윗부분부착하고추가적으로시험물질이없는대조군부위에도방사선은조사하였다. 방사선이조사되지않은부분은등의반대편에부착하였고옷이나망토로빛을차단하였으며시험기간동안피험자들은태양광노출에대하여방사선이조사되지않은부분을보호하였다. 첫 3주동안, 일주에두번씩패치들을패치가부착된총 6 부위의동일한부분에부착하였다. 패치들은약 24시간동안피부에남겨놨다. 제거후, 피부를검사하고 score 하고 UV-A와 UV-B를조사하고다시 score 하였다. 방사선을조사하지않은부분은보호하고조사후확인하고 score하였다. 각 UV 조사는각패치후 24시간동안실시하였다. 휴지기 : 마지막패치유도다음에적용하지않고 2주간휴식기간을가졌다. 유발기 : 휴지기간후에, 피험자들에게어떤반응이있는지질문하였다. 유발기에서, 등아래부분을유발시험과방사선을조사한대조부분을위한최초장소로사용하였다. 방사선을조사하지않은유발패치는반대편에적용하였다. 유발패치들은약 24시간동안최초장소에적용하였다. 그후에, 패치들을제거하고그부분을 score 하고 UV-A 조사후다시 score 하였다. 방사선조사동안, 비방사선조사부분은보호하고방사선조사과정후 score 하였다. 통틀어, 적용부위들은패치적용후 24, 48, 72, 92 시간에 score 하였다. 결과 - 306 -

유도기동안단한명의피험자만방사선이조사되고시험물질을처리한부분에서낮은단계의일시적피부반응이나타났지만이반응은방사선을조사하고시험물질을처리하지않은대조부분에서도나타났다. 방사선을조사하지않은시험물질에서는피부반응이나타나지않았다. 유발기에서는시험물질을처리하지않고방사선을조사한부위를제외하고시험물질을처리하거나그렇지않은부분의방사선조사부분이나비방사선조사부분에서피부반응이보이지않았다. 그러므로호모살레이트가 10% 나 15% 포함된세가지자외선차단제는광알러지나피부민감성을나타내지않는다 ( 참고문헌 27, 30, 32). 다음은사람에대한광독성자료를요약한것이다. 시험법시험물질피험자수 PT PT PT PT PA PA PA SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H) SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) U03127.03 (283285/1, 10% H) SPF-30 자외선차단제 (769-187, 10% H) SPF-45 자외선차단제 (769-190, 15% H) SPF-30 자외선차단제 (769-193, 10% H) Application Remark 결론 Ref. 20 명반폐쇄광독성유발없음 26 20 명반폐쇄광독성유발없음 29 20 명반폐쇄광독성유발없음 33 24 명폐쇄광독성유발없음 9, 18 29 명유발 28 명완료 29 명유발 28 명완료 29 명유발 28 명완료 반폐쇄 반폐쇄 반폐쇄 폐쇄 광알러지나피부민감성유발없음 광알러지나피부민감성유발없음 광알러지나피부민감성유발없음 27 30 32 PA U03127.03 (283285/1, 10% H) 29 명유발 28 명완료 피부자극이나누적피부자극반응없음. 1/27 만부수적으로기존의과잉자극감수성나타났음. 광알러지나피부민감성유발없음 8, 18 PT = phototoxicity test; PA = photoallergy test (SCCP COLIPA n S12, 2007) - 307 -

2.3.10.2. Neutral red uptake (NRU) 광독성시험 Guideline: OECD 432 (2004) Test system: Balb/c 3T3 fibroblasts (ATCC, Manassas, VA, USA) Test substance: Homosalate Batch: No information supplied Dose levels: Range-finding: 0.291 1000 μg/ml (8 dose levels, approx. 1/2 steps) Main assay: 1.63-100 μg/ml (8 dose levels, approx. 1/4 steps) Positive control: Chlorpromazine: Range-finding: 0.156-100 μg/ml (12 dose levels, approx. 1/2 steps) Main assay: 0.156 9.53 μg/ml (8 dose levels, approx. 1/2 steps) Solvent: first DMSO for stock solutions, afterwards with HBSS for dilution Irradiation: UV-A 1.7 mw/cm2 for 50 minutes resulting in UV-A dose of 5 J/cm2 GLP: in compliance 배양플라스크가 50-80% confluent 됐을때, Balb/c 3T3 세포들을 96-well microtiter plate에계대배양하였다. 처리전에배양배지 (DMEM) 을제거하고세포들을미리따뜻하게해준 Hank s Balanced Salt Solution (HBSS) 으로씻어냈다. 시험물질을 HBSS 용액을사용해 8개의농도로희석시키고세포들을첨가했다. 60분배양후, 세포들을모의태양광 (Dermalight SOL 3) 에 50분간노출시켰다 (UV-A 광도 : 1.7 mw/ cm2, UV-A 농도 : 5 J/ cm2 ). 노출후, 세포들을씻어내고 24시간후에 550 nm (OD550) 에서 plate reader 로 Neutral red 의흡수를측정하였다. 잠재적광독성예측은광저해요소 (PIF) 와평균광효과 (MPE) 를측정하여결정했다. 시험물질을처리하지않은대조배양과비교하여 NRU의 50% 감소를유발시키는시험물질의농도각각의 IC50 값들은나타냈다. 결과는다음표와같다. IC50 값요약 시험물질 IC 50 ( μg /ml) HBBS 의 ph ( 가장높은용량 ) Homosalate 예비실험광독성 (+UVA) 13.554 7.5-308 -

세포독성 (-UVA) 15.825 시험 2# 광독성 (+UVA) 13.077 세포독성 (-UVA) 16.742 7.0 시험 3# 광독성 (+UVA) 11.874 세포독성 (-UVA) 13.098 7.5 예비시험 광독성 (+UVA) 1.3948 세포독성 (-UVA) 22.983 7.5 Chlorpromazine 시험 2# 광독성 (+UVA) 1.6485 세포독성 (-UVA) 22.711 7.0 광독성 (+UVA) 1.4614 시험 3# 세포독성 (-UVA) 25.315 # 시험1은양성대조군의결과의유효성이없다고판단되어보고하지않았다. 7.5 평균광효과 (MPE) 와광저해효소 (PIF) 요약 시험물질 MPE 1 PIF 2 예비실험시험 2 시험 3 예비실험시험 2 시험 3 Homosalate 0.011 0.014 0.005 1.169 1.281 1.103 Chlorpromazine 0.539 0.529 0.464 16.483 13.782 17.336 평균광효과 : MPE < 0.1 광독성없음 0.1 MPE 0.150 광독성가능성있음 MPE 0.0150 광독성 광저해요소 : PIF < 2.0 광독성없음 2.0 PIF 5.0 광독성가능성있음 PIF 5.0 광독성 각시험결과에서 PIF 와 MPE 에대한호모살레이트값은광독성기준보다낮았다. 그러므로 호모살레이트는 Balb/c 3T3 섬유아세포에대하여인공태양광의존재하에서광독성이없다고 보여진다 ( 참고문헌 12). 2.3.10.3. 광감작성 in vivo. Guideline/method: Modified method according to the Harber et al. (1982, 1987) - 309 -

Species/strain: Guinea pig/dunkin Hartley Group size: 5 20 animals/group Test substance: Homosalate (source: Humco Chemical, Memphis, TN, USA) Purity: > 95% (HPLC) Batch: No information available Route: Occlusive epicutaneous induction and challenge in Hill Top Chambers Carrier: Induction: Methanol Challenge: Acetone Dose level: Induction: 1% in methanol Challenge: 1% in acetone Light source: Bank of 6 fluorescent black light lamps (Sylvania F20T12/BL) Irradiation: 10 J/cm2 UV-A Positive control: Musk Ambrette; tetrachlorosalicylanilide) GLP: Not in compliance 암수 guinea pig 를사용하는 Harber et al. (1982, 1987) 의프로토콜에따라서시험물질의광 감작성을평가하였다. 본연구전에, UV-A 조사가있거나없는상태에서피부에자극이없는농도를결정하기위해초기자극연구를수행하였다. 4개의농도 (2/animal) 를허리부분의왼쪽과오른쪽부분에 Hill Top Chambers 패치를사용하여시험하였다. 패치들은 2시간동안 rubber dental dam으로밀폐하였다. 그후에, 패치들을제거하고 UV-A (10 J/ cm2 ) 노출을위하여오른쪽 dental dam에구멍을냈다. 패치부분들은자극후 24시간과 48시간에 0-3 범우로등급을매겼다. 본연구에서는목덜미부분의제모된피부에 2주동안일주일에 3번씩즉, 총 6번유발시켰다. 처음노출에서, Freund s complete adjuvant로 4번피내주사를하였다. 그후, 그부분을시험물질과사용한용매나아무런처리를하지않고 Hill Top Chambers 를적용하여셀로판테이프로 strip하였다. 패치들은 2시간동안밀폐시킨후제거하여시험물질, 시험한용매나아무것도처리하지않은부분에방사선 (10 J/ cm2 ) 을조사하였다. 6번의유발후, 10-14 일간휴지기를가졌다. 유발기에서, 모든동물들에목덜미부분의제모된피부에대하여방사선을조사하거나하지않고시험물질이나시험용매를처리하였다. 오른쪽과왼쪽의패치부분들을 24시간밀폐후제거하고 dental dam 부분에구멍을내서방사선 (10 J/ cm2 ) 을조사하였다. 24시간과 48시간후 - 310 -

에피부변화등급을매겼다. 결과는다음표에요약하였다. 기니피그에대한호모살레이트의감작성, 광자극성과광알러지성에대한결과 시험 반응 / 결과 가혹등급 d 유도 a 유발 b 발생 c 24h 48h H+UV-A H+UV-A 0/20 0.1 0.0 H+UV-A H 0/20 0.1 0.0 Sham H+UV-A 0/5 0.2 0.1 Sham H 0/5 0.0 0.0 Sham Acetone + UV-A 0/5 0.0 0.0 Sham Acetone 0/5 0.0 0.0. Methanol + UV-A Acetone + UV-A 0/10 0.0 0.0 Methanol + UV-A Acetone 0/10 0.0 0.0 H = Homosalate; UV-A = 노출당 10 J/ cm2 a = 1% 메탄올이나메탄올 ; b = 1% 아세톤이나아세톤 ; c = 24/48 시간에서전체시험당반응 ( 1) 수 ; d= 시험한전체동물로나눈피부등급합 호모살레이트와마찬가지로, 두가지다른자외선차단제 (p-aminobenzoic acid 와 4-isopropyldibenzoylmethane) 와인체에서광알러지, 광독성과접촉성감작을유발시킨다고알려진 2가지광알러지원 ( 인공사향 (MA) 와 tetrachlorosalicylanilide (TCSA)) 도시험하였다. 예상대로, TCSA와 MA에서광알러지반응이나타났다. 자외선차단제로수행한연구에서 p-aminobenzoic acid는광알러지가나타났지만호모살레이트와 4-isopropyldibenzoylmethane 는광알러지반응이나타나지않았다. 그러므로암수기니피그에대한 Harber et al. (1872, 1987) 연구에따른시험상태에서호모살레이트는광알러지, 접촉성알러지, 광독성이나자극이없다고보여진다 ( 참고문헌 19). 2.3.10.4. 마우스의귀부종광알러지시험. - 311 -

Guideline/method: Optimized method according to Brown et al. (1986), Granstein et al. (1983), Maguire and Kaidbey (1982) and Takigawa and Miyachi (1982) Species/strain: Mouse/BALB/c Group size: 6-8 animals/group Test substance: Homosalate (source: Witco Corp., Humco Chemical Division, Memphis, TN, USA, purity:> 95%) Batch: No information available Route: Epicutaneous induction on the back and epicutaneous challenge on right/left ear Carrier: Acetone or acetone/corn oil (4:1) but not specified for Homosalate Dose level: Induction: 10% Challenge: 5% Light source: UV-A: Bank of 8 fluorescent black light lamps (Sylvania F40/350BL) UV-B: Bank of 8 fluorescent light lamps (PhilipsF40UVB) Irradiation: UV-A: 10 J/cm2 UV-B: 30 J/cm2 Ear thickness measmt: Hand-held dial micrometer (Oditest gauge, model D-10000 The Dyer Co. LancasterPA,USA) GLP: Not in compliance 암컷 BALB/c mice를이용한방법들 (Brown et al. (1986), Granstein et al. (1983), Maguire & Kaidbey (1982) 와 Takigawa & Miyachi (1982)) 로호모살레이트의광알러지뿐만아니라접촉성감작성과광독성에대하여시험하였다. 유도기 : 군당 6-8마리동물들에 cyclophosphamide (200 mg/kg bw) 을복강주사하였다. 광알러지와접촉성알러지대조군과사용된용매 / 방사선조사대조군의피부에시험물질이나용매 50 μl을 0, 1 2일에유도시험으로적용하였다. 광독성그룹의쥐에는유도기동안시험하지않았다. 그후, 마우스들을방사선상자에넣었다. 적용하고 30-60 분후, 적용한부위를깨끗이닦아냈다. 접촉성알러지마우스들다시케이지로옮겼다. 광알러지군과사용된용매 / 방사선조사대조군에먼저 UV-A (10 J/ cm2 ) 방사선을조사하고뒤이어 UV-B (30 J/ cm2 ) 를조사하였다. 유발기 : 귀두께측정의기준치는처음유도후 7일에각마우스에대해서수행하였다. 유발기 - 312 -

동안, 용매에녹은시험물질이나용매 8 μl을양쪽귀에적용하였다. 30-60 분후에, 귀를닦아 내고 UV-A (10 J/ cm2 ) 와 UV-B (30 J/ cm2 ) 를조사시켰다. 귀두께측정은유발기후 24 시간에 hand-held dial micrometer 로측정하고기준치에따른변화를확인했다. 결과 10 % 물질로유도하고 5% 물질로유발시킨암컷 BALB/c 마우스에대한호모살레이트의감작성, 광자극성과광알러지성연구는유발후 24시간에기준치 (mmx10-2 ) 변화로귀부종을나타냈다. 접촉성광알러지군 : -0.1 ± 0.6 mm x 10-2 접촉성알러지군 : -0.3 ± 0.4 mm x 10-2 용매방사선군 : -0.1 ± 0.4 mm x 10-2 광독성군 : -0.2 ± 0.5 mm x 10-2 시험결과, 호모살레이트는광알러지, 접촉성알러지나광독성이나타나지않았다 ( 참고문헌 20). 2.3.11 에스트로젠잠재적영향시험 1) in vitro Guideline/method: Mechanistic study on oestrogen receptor binding properties according to a modified protocol of Bosel and Shain (1974) Test system: Human recombinant oestrogen receptor (ER), -subtype (PanVera, Madison, WI; USA) Replicates: Two separate experiments with triplicate concentration levels Test substance: Homosalate Batch: 50446454 Purity: 99.6% Concentrations: 100, 1000, 10000, 100000 nm Solvent: DMSO - 313 -

Positive Controls: Genistein: 0.03 100 nm Estradiol: 10-10000 nm GLP: Not in compliance 에스트로겐수용체 (ER) 와호모살레이트의상호작용은수용체인 α-subtype 과리간드인방사선동위원소가있는에스트라디올의인체재조합에스트로겐수용체로수용체결합분석으로연구하였다. ER 친화력강한에스트라디올 (0.03 100 mm) 과 ER 친화력이약한제니스테인 (10 1000 nm) 을양성대조군물질로사용했다. Boesel 과 Shain (1974) 의연구에따라수정한방법으로시험하였다. BSA와 2% DMSO (± 시험화합물 ) 이들어있는분석완충액 100 μl와 4.8 mm의방사선동위원소가있는에스트라디올 50 μl을 microtiter plate well에서섞었다. 4 에서밤새진탕배양한후, 분석완충액에활성탄현탁액을첨가했다. 혼합후활성탄을원심분리기로침전시키고상층액의 50 μl을액체섬광계수기 ( 3 H활성도 ) 로분석했다. ER-리간드혼합물이포함된 50 μl과섬광칵테일 200 μl을혼합하고샘플이평형을이루면 10분동안분석기로방사능을측정하였다. 수용체결합은불특정결합으로수정했다. 시험물질의존재하에방사선동위원소가있는에스트라디올의결합은비존재결합과관련이있었다. IC 50 값은측정할수있는경우에측정했다. 결과 100000 nm의적용가능한최고농도에서에스트로겐수용체에대한호모살레이트의친화도는관찰되지않았다. 시험물질이있을때방사선동위원소가있는리간드에스트라디올결합양은대조군과비슷했다. 그러므로호모살레이트는기술적으로가능한 100000 nm의최고농도까지사람의제조합된에스트로겐수용체에대해서친화도가없다고보여진다 ( 참고문헌 3). 2) in vivo Guideline/method: Uterotrophic assay in immature rats according to OECD Validation Work and OECD Protocol (Draft, 2000) Species/strain: Rat/Wistar ((HsdCpb:WU) Group size: 6 animals/sex/group Test substance: Homosalate Batch: 507 57115-314 -

Purity: 89.64% Dose levels: 0, 200, 1000 mg/kg bw Vehicle: Corn oil Positive control: Ethinylestradiol (EE); 0.3 and 1.0 μg/kg bw Route: Subcutaneous (sc.) Exposure period: 3 consecutive days GLP: in compliance 미성숙랫드에대한자궁비대반응시험으로호모살레이트의에스트로젠잠재적영향을연구했다. 6마리의미성숙암컷 Wistar 랫드각각에게 200 mg/kg bw와 1000 mg/kg bw 농도로콘오일에녹인시험물질을연이어 3일동안하루에한번씩피하주사하였다. 실험은미성숙랫드가 19가 19일지났을때 3일순화후시작하였다. 대조군으로, 각각 6마리의랫드들을약물처리를하지않았고추가군으로 6마리의랫드에게콘오일을주었다. Ethinylestradiol 을양성대조군물질로선택하고 6마리의랫드에게같은일정으로 0.3 과 1.0 μg /kg bw의용량으로피하주사하였다. 임상적증상, 사망률, 체중과음식섭취량같은임상적실험을수행하였다. 실험이종료되었을때, 모든동물들을희생시켜서육안검사를하고자궁무게를측정하였다. 결과사망과일반적인건강상태에대한영향도없었다. 체중과음식섭취는대조군과비슷했다. 200 과 1000 mg/kg bw 용량의호모살레이트피하주사후자궁무게에대한영향도없었다. 그러므로미성숙암컷 Wistar 랫드에대해서 1000 mg/kg bw 용량까지호모살레이트의 3일연속반복피하주사투여는자궁비대반응시험에서에스트로젠잠재적영향이보이지않는다 ( 참고문헌 1). 2.3.12. 안드로겐잠재적영향시험 Guideline/method: Mechanistic study on androgen receptor binding properties according to a modified protocol of Bosel and Shain (1974) Test system: Rat recombinant fusion protein to thioredoxin containing the hinge region and ligand binding domain of the androgen receptor (AR, PanVera, Madison, WI; USA) - 315 -

Replicates: Two separate experiments with triplicate concentration levels Test substance: Homosalate Batch: 50446454 Purity: 99.6% Concentrations: 100, 1000, 10000, 100000 nm Solvent: DMSO Positive Controls. Dihydrotestosterone: 0.1-300 nm Androstendione: 30 100000 nm GLP: not in compliance Published: No 수용체원인안드로겐수용체와방사성동위원소가있는 methyltrienolone (R 1881) 리간드의경첩영역과리간드결합액이있는랫드의재조합융합단백질을이용한수용체결합분석으로호모살레이트와안드로겐수용체 (AR) 의상호작용에대해시험하였다. AR과친화력이강한 dihydrotestosterone (0.1 300 nm) 과 AR과친화력이약한 androstendione (30 100000 nm) 을양성대조군물질로사용했다. 분석완충액에 γ-globulin 과 2% DMSO (± 시험물질 ) 가포함된분석완충액 100 μl과 8 nm 방사선동위원소가있는 R1881 용액 50 μl을 microtiter plate well에혼합했다. 4 에서밤새진탕배양한후, 활성탄현탁액을첨가하여섞은후원심분리하여활성탄을침전시키고상등액 50 μl을액체섬광계수기 ( 3 H활성도 ) 로분석했다. AR- 리간드혼합물이포함된상등액 50 μl과 200 μl섬광칵테일을섞은후샴플이평행이되면 10분간분석기로방사능을측정했다. 시험물질이있을때방사선동위원소가있는 R1881 의결합은없는상태에서의결합과관계가있었다. IC 50 은측정할수있는경우에측정했다. 결과호모살레이트는표준안드로겐과비교하여안드로겐수용체 (AR) 과약한친화도를보이고기술적으로얻을수있는가장높은농도인 100000 nm의농도에서용량반응관계가없었으므로, 안드로겐수용체의결합역과의특정상호작용에대한증상이없다고보여진다 ( 참고문헌2). - 316 -

제 3 장. 참고문헌 1. Bayer (2002a) Neo Heliopan HMS, Uterotrophic assay in immature rats, Pharmaceutical Business Group, Report No. PH 31927, Bayer, Wuppertal, Germany, unpublished data, 08 April 2002. 2. Bayer (2002b) Neo Heliopan HMS, In vitro studies on its androgen receptor binding properties, Research Toxicology, Report No. PH 32215, Bayer, Wuppertal, Germany, unpublished data, 23 July 2002. 3. Bayer (2002c) Neo Heliopan HMS, In vitro studies on its estrogen receptor binding properties, Research Toxicology, Report No. PH 32216, Bayer, Wuppertal, Germany, unpublished data, 23 July 2002 4. Bonin A. M., Arlauskas A. P., Angus D. S., Baker R. S. U., Gallagher C. R., Greenoak G., Lane Brown M. M., Meher-Homji K. M. and Reeve V. (1982) UV-absorbing and other sunprotecting substances: genotoxicity of 2-ethylhexyl P-methoxycinnamate, Mutation Res., 105, 303-308 5. Chatelain E., Gabard B and Surber C. (2003) Skin penetration and sun protection factor of five UV filters: Effect of the vehicle, Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 16, 28-35 6. Clinical Research Laboratories (CRL, 2003) Repeated insult patch test, MT#2101420 (10% Homosalate), Clinical Study No. CRL67703-8, Clinical Research Laboratories Inc., Piscataway, NJ, USA, unpublished data, 29 July 2003 7. Concordia Research Laboratories (2001) Human repeated insult patch test, Five formulations (Lotion 3 = 12% Homosalate sunscreen), 200 Subjects, Study No. PLO-041 A, Concordia Research Laboratories Inc., Cedar Knolls, NJ, USA unpublished data, 04 May 2001-317 -

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[ 별첨 3] 국제워크숍을통한선진위해평가기술습득및정보교류 - 324 -

[ 별첨 4] Lillian J. Gill, MS, DPA Dr. Gill is the Deputy Director of the Cosmetic Ingredient Review (CIR). The CIR thoroughly reviews and assesses the safety of ingredients used in cosmetics in an open, unbiased, and expert manner. Results of CIR safety assessments are published in the open, peer-reviewed scientific literature. Prior to joining CIR in October, 2011, Dr. Gill served as the Senior Associate Director of FDA s Center for Devices and Radiological Health (CDRH). She was a member of the Senior Executive Service and the leader responsible for the development and management of regulatory programs at CDRH. She established the first FDA-wide performance scorecard and project management plan accountability system which linked measurable outcomes to budget. She has significant international experience as the previous Head of Delegation (FDA) for the Memorandum of Agreement with the State FDA of China, and the Head of Delegation (US) for the Global Harmonization Task Force Steering Committee. She was trained as a clinical chemist/chemist and worked at Johns Hopkins University and in FDA s Baltimore district laboratory. In 1993, Dr. Gill directed the FDA Device Center s science and engineering laboratories, and assumed the position as Director of the Center s Office of Compliance from 1994 to 1999, after which she served for 12 years as Senior Associate Director in the Office of the Center Director. Dr. Gill has served 8 years on each of the Board of Directors of the American Association of Medical Instrumentation and the Clinical and Laboratory Standards Institute. - 325 -

[ 별첨 5] - 326 -