대한임상병리학회지 : 제 19 권제 6 호 1999 Korean J Clin Pathol 1999; 19: 662-6 임상미생물학 Helicobacter pylori 의배양에있어서 HCl-KCl buffer 의유용성 이종욱 황유경 * 배수환 * 김범수 ** 이경원 *** 정윤섭 *** 건양대학교임상병리과학교실, 인하대학교임상병리과학교실 *, 내과학교실 **, 연세대학교임상병리과학교실 *** Effect on Culture of Helicobacter pylori by the Use of HCl-KCl Buffer Jongwook Lee, M.D., Yu Kyoung Hwang, M.T.*, Su Hwan Pai, M.D.*, Pum Soo Kim, M.D.**, Kyungwon Lee, M.D.***, and Yunsop Chong, Ph.D.*** Department of Clinical Pathology, Konyang University of Medical College, Nonsan; Departments of Clinical Pathology*, Internal Medicine**, Inha University Medical College, Inchon; Department of Clinical Pathology***, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background : The selective media for culture of Helicobacter pylori (H. pylori) are Egg yolk emulsion medium, modified Thayer-Martin medium and Skirrow s medium. The non-selective media for culture of H. pylori are brucella agar, trypticase soy agar, and brain heart infusion agar. The selective media are more expensive and difficult to prepare than non-selective media, whereas nonselective media are difficult to isolate H. pylori due to contamination of upper respiratory tract bacteria. The objects of this study are to reduce upper respiratory contaminants by use of HCl-KCl buffer (H-K buffer) for primary isolation, and to compare with culture, CLO test, histologic examination and H. pylori IgG antibodies. Methods : Seventy one patients underwent upper gastrointestinal endoscopy with biopsy. For 32 patients, two biopsies were taken from antrum: One for direct inoculation into blood agar plate, the other for pretreatment of H-K buffer. For fifty six patients, we performed culture, CLO test, histology, and H. pylori IgG. Results : 1) Among the 32 patients, H. pylori were isolated in 25 patients (23 patients for H-K buffer non-pretreatment and 25 patients for H-K buffer pretreatment). Twelve cases among H-K buffer pretreatment group did not show contamination, whereas only two among non-pretreatment group showed no contamination. The average number of contaminating colony forming unit (CFU) for H-K buffer non-pretreatment and H-K buffer pretreatment were 77 and 9, respectively. 2) The positive rates of culture, CLO test, histology, and H. pylori IgG for H. pylori infection were 71.4%, 67.9%, 75.0%, and 57.1%, respectively. Conclusions : Pretreatment with H-K buffer showed marked decrease in number of contaminants and high isolation rates of H. pylori using non-selective media. (Korean J Clin Pathol 1999; 19: 662-6) Key words : Helicobacter pylori, HCl-KCl buffer, Culture 서 론 Helicobacter pylori 가 1984 년도 Marshall 등에의해위염환자 접수 : 1999 년 6 월 8 일접수번호 : KJCP1301 수정본접수 : 1999 년 8 월 19 일교신저자 : 이종욱우 302-241 대전광역시서구가수원동 685 건양대병원임상병리과전화 : 042-600-9274, Fax: 042-600-9090 의위점막에서처음보고된후 [1] 위염과위궤양의원인균 [2-9] 으로밝혀졌고, 최근에는위암과의연관성에 [10-13] 대해많은연구가진행중이다. H. pylori 감염의진단방법으로는세균배양을비롯하여, 신속요소반응검사, 병리조직검사및 urea breath test 등의여러가지가이용되고있다 [14]. 최근들어이세균의항균제내성증가로인한치료의실패, 재발등이 [7, 15-17] 보고되고있어이세균의항균제내성연구가절실히요구되고있다. 662
Helicobacter pylori 의배양에있어서 HCl-KCl buffer 의유용성 663 H. pylori는미호기성조건에서느리게증식되는세균으로배양이매우까다롭다. 특히위내시경으로생검조직을채취할때상기도상재균의오염이많을경우, H. pylori의분리가어려울때가많다. H. pylori의배양에는혈액이나혈청이첨가된배지가쓰이는데 [18] 선택배지로는 [3, 18-20] 항균제가첨가된 egg yolk emulsion (EYE) 배지, modified Thayer-Martin (MTM) 배지및 Skirrow s 배지등이, 비선택배지로는 [3, 18] 항균제가첨가되지않은 brucella 배지, trypticase soy 배지및 brain heart infusion (BHI) 배지등이쓰이고있다. 그러나선택배지는제조하는데많은노력이들고, 비선택배지는상기도상재균의오염등으로 H. pylori의분리가쉽지않다. William 등은 [21] 위액에서 HCl-KCl buffer (H-K buffer) 와 maximum recovery diluent (MRD) buffer 등으로전처리한후 H. pylori를분리하였는데, 이때 H-K buffer 전처리가 MRD buffer 전처리에비하여상기도오염균이감소하였음을관찰하였다. 이에저자등은상기도상재균의오염을줄이기위하여위점막검체를 H-K buffer로처리후비선택배지에접종하여그유용성을보고자하였다. 대상및방법 1997년 8월부터 9월까지인하대부속병원소화기내과와건강검진센터에서위염이의심되어 H. pylori의배양이의뢰된 71 명을대상으로하였다. H-K buffer의전처리효과는 32명의검체를대상으로하였다. 한환자에서두개의위점막조직을채취하여한개는 500 L H-K buffer (0.001 N HCl:0.13 N KCl, 1:10, ph 2.2) 에 1시간넣어전처리하고, 다른한개는 H-K buffer로전처리없이혈액한천배지에접종하여 37 항온기에서미호기성 (10% CO2, 5% O2, 85% N2) 으로 3-5일간배양하였다. 증식된집락이도말염색에서만곡된그람음성간균이고, oxidase, catalase 및 urease 양성이면 H. pylori로동정하였고, 그외의오염균은집락을세었다. 56명의환자검체에서는 H-K buffer를이용한배양과병리조직검사, 신속요소반응검사, H. pylori IgG 항체검사간의결과를비교하였다. 신속요소반응검사는한개의위점막조직을상품화된 CLO 검사 (CLO test, Australia) 에넣고 37 항온기에넣었다가판독하였다. 혈청 H. pylori 항체는 H. pylori IgG (GAP test, UK) 를이용하여항체가를측정하였는데, 20 U/mL 이상을양성으로판독하였다. H. pylori의감염기준은조직에서 H. pylori가배양에서동정된경우는 H. pylori의감염으로판정하였으며, 배양에서동정되지않았을경우는조직검사, CLO 검사모두양성인경우로하였고, 한가지검사만양성인경우에는위양성으로판정하였다. Table 1. Effect of H-K buffer treatment on the isolation of H. pylori and prevention of contamination with 32 specimens Culture result H. pyloi 23 (71.9) 25 (78.1) Contaminant None 2 12 1-10 CFU 5 11 10-99 CFU 12 9 >100 CFU 13 0 결 32명의환자검체로 H-K buffer 전처리의오염방지효과를관찰한결과, H-K buffer로처리하지않은배지에서는 23 검체 (71.9%), H-K buffer로처리한경우는 25 검체 (78.1%) 에서 H. pylori가분리되었다. 두군모두에서 H. pylori 집락은대부분제 4구역까지집락이형성되었다. 오염균이증식되었던검체는 H-K buffer로처리하지않은경우는 30 검체였고, 평균집락수는 77 개였으나, H-K buffer로처리한경우는오염된것이 20 검체였고, 평균집락수는 9개였다. 오염균이전혀없었던경우는 buffer 처리안한경우는 2 검체이었고, 반면 buffer처리한경우에는 12 검체이었다 (Table 1). H. pylori의여러검사간비교에서배양, CLO 검사, 병리조직검사및H. pylori IgG 검사를동시에시행한환자는총 56 명이었다. 양성은조직검사가가장많았고 (42명), 배양 (40명), CLO 검사 (39명), H. pylori IgG (32명) 순이었다 (Table 2). 고 No. (%) of specimen Not treated Treated *Mean CFU of contaminants were 77 for not treated specimens, and 9 for treated specimens. Table 2. Comparison between culture, CLO test, histologic examination, and serum H. pylori IgG for detection of H. pylori infection with 56 cases TP FP TN FN Sensitivity Specificity Culture 40 0 12 4 90.9 100.0 CLOtest 38 1 11 6 86.4 91.7 Histology 42 0 12 2 95.5 100.0 H. pylori IgG 32 1 11 12 72.7 91.7 Abbreviation: TP, true positive; FN, false positive; TN, true negative; FN, false negative. H. pylori는미호기성그람음성간균으로혈액이첨가된배지에서 3일에서 5일배양후에무색집락이증식되고, 계대배양했을경우약 2일정도에집락이증식되는것으로알려져있다 [22]. 과 찰 H. pylori 의배양에사용되는배지는항균제의첨가여부에따
664 이종욱 황유경 배수환외 3 인 라비선택배지와선택배지로나뉜다. 비선택배지에는항균제가첨가되지않은혈액한천배지, brucella 배지, trypticase soy 배지및 BHI 배지등의 [3, 22] 사용되고있는데, 배양이잘되는것이보통이지만상기도상재균의오염이심한경우에는 H. pylori의분리가어렵다고알려져있다. 항균제가첨가된선택배지로는 [3, 18-20] EYE 배지, MTM 배지및 Skirrow s 배지등이쓰이는데, 그중 EYE 배지에는풍부한영양물질 (egg yolk emulsion 과 1% vitox) 과 triphenyltetrazolium chloride가첨가되어있어서 H. pylori가빨강색집락으로증식되므로분리율이가장높은것으로보고되고있다. 그러나선택배지는여러가지첨가물과항균제를넣어서만들기때문에시간과노력이들고제조가까다롭다. H. pylori의배양에는선택배지와비선택배지등 2가지배지를함께쓰는것이권장되고있다 [3, 22]. Piccolomini 등은 [3] 선택배지로 EYE 배지, 비선택배지로는 modified chocolate 배지를같이사용하였을때분리율이가장높았다고보고하였다. 그러나국내병원에서직접선택배지를만들수있는여건을갖고있는병원은많지않고, 2개배지를사용할경우경제적인부담이가중될수있다. 본원에서는처음에는상품화된 brucella 배지와 Campy pouch (BBL, Microbiology Systems, Cockeysville, Md., USA) 를이용하여 H. pylori를배양하였는데, 혈액한천배지에비해성장속도가빠르고, 집락의크기가컸지만, brucella 배지와 Campy pouch의값이비싸고, 또한 brucella 배지에는항균제가들어있지않아서오염균이증식되어분리하는데불편하였다. 본연구에서는위점막검체를 H-K buffer로처리한후비교적값이저렴한혈액한천배지에접종하였고, GasPak Jar (BBL, Microbiology Systems, Cockeysville, Md., USA) 에넣고, 혐기성단지 (anaerobic chamber) 에서혼합가스를 (10% CO2, 5% O2, 85% N2) 주입한후 37 로배양하였다. 그결과, 오염균이하나도없었던경우가 12 검체 (37.5%) 였고, 오염균의집락수도 H-K buffer를처리하지않은경우에비하여매우감소되어 (Table 1) 쉽게 H. pylori를분리할수있었다. 위점막검체는될수있는한신속하게검사실로운반되어야하며, 수송배지를사용하면 4시간이내에접종할수있다. H. pylori가위점막에판상으로 (patchy distribution) 분포하기때문에배지에접종하기전에조직을잘게가는것이 (grinding) 칼로잘게써는것보다 (mincing) H. pylori의배양이잘된다 [23]. 그러나이러한전처리과정중에오염이될수있고, 시간이많이소요된다. 본원에서는조직을 H-K buffer에 30분내지한시간넣어두었다가조직을갈거나썰지않고, 혈액한천배지에접종을하였는데, CLO검사에서양성이었던대부분의검체에서 H. pylori 집락을관찰할수있었다. H. pylori 배양시에증식되는오염균은주로 Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus spp. 및 Candida spp. 로 [3] 이들세균들을억제하기위해선택배지에는항균제를첨가한다. 본연구에서증식된오염균은대부분 Neisseria spp., Candida spp., -hemolytic Streptococcus이었고, Proteus spp. 는관찰되지않았다. H-K buffer 전처리를안한배지에서관찰된상기오염균들이 H-K buffer 전처리한검체가접종된배지에서는대부분증식이억제되었다 (Table 1). H. pylori의요소는 Proteus mirabilis의약두배, 요검체에서분리되는다른세균의약 10-100배정도의활성을갖는다 [24]. 신속요소분해검사 [25, 26] 는 H. pylori의강력한요소분해효소 (urease) 활성을이용한것으로신속하고, 간편하며, 검사자간의차이가없는것이장점이다. 그러나위조직내에 H. pylori의분포가균일하지않기때문에위음성이나올수있고, urea를분해하는다른세균에의해서위양성이나올수있다. 보고자들마다차이는있지만선택배지와비선택배지등두가지배지를사용한경우배양이 CLO검사보다양성률이다소높다 [26, 27]. 본원에서사용하는 CLO검사의민감도와특이도는각각 98.3% 와 92.6% 로알려져있다 [27]. 본연구에서는 CLO검사와배양이높은일치율을보였고, 양성률은배양이다소높았다 (Table 1, 2). CLO검사에서양성이었고배양에서음성이었던검체는두개였는데, 오염이너무심하여서분리를못한경우였다. H-K buffer 전처리의시간을조절해주면분리율을좀더높일수있을것으로사료된다. CLO검사에서음성이었고, 배양에서양성이었던검체는 4 검체였는데, 이는 CLO검사에사용된위생검조직에 H. pylori가없었거나또는위생검조직의표면에있는 H. pylori의집락수등이검사에영향을미친것으로사료된다. 혈청 H. pylori 항체를검사하는방법은 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 방법이가장널리쓰이고있는데, 주로역학적조사나대중선별검사에쓰이고있다 [28, 29]. 현재는혈청학적검사가 H. pylori 진단의보조적도구이므로감염상태의유무나단기간내의치료효과를알려는목적으로는사용하지는말것을권고하고있다 [26]. 본연구에서이용한 ELISA 검사는다른검사와의일치율이매우낮아서면역혈청학적검사로 H. pylori의감염을정확히진단하기에는어려울것으로사료된다 (Table 2). H. pylori의진단에서배양이 Gold standard 임에도불구하고, 분리율이낮기때문에많은검사실에서이용하지못했었다. 외국의 H. pylori의배양분리율은조직검사에비교하여약 75-95% 정도로 [3] 보고되고있는데, 이는선택배지와비선택배지를함께사용한경우였다. H. pylori의분리율이연구자들에따라매우많은차이가있는데이는내시경검사때이세균에영향을주는약제의복용, 실온에서오래방치된조직으로배양, 오래된배지로배양, 상기도오염균의증식등으로설명되고있다 [7]. 본연구에서는비선택배지로분리한결과가조직검사와비교하여 95.2%(40/42) 로김등 [25](40.2%) 및김등 [31](86.1%) 보다높았다. 따라서국내여건에서는 H-K buffer로전처리한후비선택배지에접종하는방법이 H. pylori 배양에유용할것으로사료된다. 이상의결과로 H-K buffer로위내시경검체를처리하여접종
Helicobacter pylori 의배양에있어서 HCl-KCl buffer 의유용성 665 한경우, 상기도세균오염을현저히감소시켰고, H. pylori의분리율이높아져서, H. pylori 배양에있어서저렴하게제조할수있는 H-K buffer를사용하는것이바람직하다고사료되었다. 요약배경 : 1997년 8월부터 9월까지인하대부속병원내과와건강검진센터에서 H. pylori의배양이의뢰된 71명의위생검조직검체로 H. pylori의배양에서 HCl-KCl buffer (H-K buffer) 의유용성을보고자하였고, 또한배양, 신속요소반응검사, 병리조직검사및혈청H. pylori IgG 검사간의양성률과일치도를알아보고자하였다. 방법 : H-K buffer 전처리효과는 32명의환자의검체를대상으로하였다. 두개의위점막조직검체중한개는 H-K buffer 로전처리하고, 다른한개는 H-K buffer로전처리없이혈액한천에접종한후미호기성상태로 3-5일간배양후 H. pylori와오염균의증식여부를비교하였다. 56명의환자검체에서는 H-K buffer를이용한배양과 CLO검사, 조직학검사, H. pylori IgG 항체시험간의검사결과를비교하였다. 결과 : H-K buffer 전처리효과시험에서는 32명의환자중, H-K buffer로전처리하지않은검체에서는 23검체 (71.9 %), H-K buffer로처리한경우에는 25검체 (78.1%) 에서 H. pylori가분리되었다. 오염균이전혀없었던경우는 buffer처리안한경우는두검체이었고, 반면 buffer처리한경우에는 12 검체이었다. 총 56명의검체로실시한검사간비교에서양성은병리조직검사가가장많았고 (42명), 배양 (40명), CLO 검사 (39명), H. pylori IgG (32명) 순이었다. 결론 : H-K buffer로위내시경검체를처리하여접종한경우, 상기도세균오염을현저히감소시켰고, H. pylori의분리율이증가되어, H. pylori 배양에있어서저렴하게제조할수있는 H-K buffer를사용하는것이바람직하다고사료되었다. 참고문헌 1. Marshall BJ and Warren JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1984; 1: 1311-5. 2. Greenberg RE and Bank S. The prevalence of Helicobacter pylori in nonulcer dyspepsia: Importance of stratification according to age. Arch Intern Med 1990; 150: 2053-5. 3. Piccolomini R, Bonaventura GD, Festi D, Catamo G, Laterza F, Neri M. Optimal combination of media for primary isolation of Helicobacter pylori from gastric biopsy specimens. J Clin Microbiol 1997; 35: 1541-4. 4. Anderson L, Holck S, Povlsen L, Elsborg L, Justesen T. Campylobacter pyloridis in peptic ulcer disease. Scan J Gastroenterol 1987; 22: 219-24. 5. Alper J. Ulcer as an infectious disease. Science 1993; 260: 159-60. 6. 장명구, 김학양, 조병동, 장웅기, 김동준, 김용범등. 한국인의위궤양및십이지장궤양환자에서 Helicobacter pylori 감염빈도. 대한내과학회지 1997; 52: 457-64. 7. 이경원, 김태승, 권상옥, 이미경, 윤갑준, 정윤섭. 위염과소화성궤양환자에서위점막내의 Campylobacter pyloridis 검사에관한연구. 대한의학협회지 1987; 30: 553-60. 8. 채현석, 김태규, 한훈, 김성수, 최규용, 정인식등. Helicobacter pylori 에감염된십이지장궤양과비궤양성소화불량에서 ABO 혈액형과 HLA의연관. 대한소화기학회지 1996; 28: 623-31. 9. 류복덕, 이우곤, 조명제, 전영석, 이광호. Helicobacter pylori의전체유전자를순서대로결집시킨중복클론과 Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Library의제작. 대한미생물학회지 1996; 31: 533-55. 10. International Agency for Research on Cancer, World Health Organization: Schistomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum 1994; 61: 218-20. 11. Barreto-Zuniga R, Maruyama M, Kato Y, Aizu K, Ohta H, Takekoshi T, et al. Significance of Helicobacter pylori infection as a risk factor in gastric cancer: serological and histological studies. J Gastroenterol 1997; 32: 289-94. 12. Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orenteichet N. Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med 1991; 325: 1127-31. 13. The Urogast Study Group: An international association between Helicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet 1993; 341: 1359. 14. Andersen LP, Kiilerick S, Pedersen G, Thoreson AC, Jorgensen F, Rath J, et al. An analysis of seven different methods to diagnose Helicobacter pylori infections. Scand J Gastroenterol 1998; 33: 24-30. 15. van der Hulst RW, Weel JF, van der Ende A, ten Kate FJ, Dankert J, Tytgat GN. Therapeutic options after failed Helicobacter pylori eradication therapy. Am J Gastroenterol 1996; 91: 2333-7. 16. Loo VG, Fallone CA, De Souza E, Lavallee J, Barkun AN. In-vitro susceptibility of Helicobacter pylori to ampicillin, clarithromycin, metronidazole and omeprazole. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 881-3. 17. Weel JF, van der Hulst RW, Gerrits Y, Tytgat GN, van der Ende A, Dankert J. Heterogeneity in susceptibility to metronidazole among Helicobacter pylori isolates from patients with gastritis or peptic ulcer disease. J Clin Microbiol 1996; 34: 2158-62. 18. Hachem CY, Clarridge JE, Evan DG, Graham DY. Comparison of agar based media for primary isolation of Helicobacter pylori. J Clin Pathol 1995; 48: 714-6. 19. Tee W, Fairley S, Smallwood R, Dwyer B. Comparative evaluation of three selective media and a nonselective medium for the culture of Helicobacter pylori from gastric biopses. J Clin Microbiol 1991; 29: 2587-9. 20. Westblom TU, Madan E, Midkiff BR. Egg yolk emulsion agar, a new medium for the cultivation of Helicobacter pylori. J Clin Microbiol 1991;
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