RESEARCH ARTICLE 야관문추출물을이용한 30~40 대남성의두피개선효과연구 김나연 1, 김주섭 2 * 1 건국대학교일반대학원생물공학과, 2 상지영서대학교피부미용과 A Study on Effects of Lespedeza cuneata Extract on the Improvement of Scalp Conditions in Adult Men in Their 30~40s NaYeon Kim 1, JuSub Kim 2 * 1 Department of Bioengineering, Graduate School of Konkuk University 2 Department of Cosmetology, Sangji Youngseo College Abstract This study conducted cytotoxicity and anti-inflammatory tests on Lespedeza cuneata extract. The study results found the followings: RAW 264.7 cells viability was 78%. The inhibition of production was as high as 84% at 25 μg /ml. It wasn t able to confirm decrease in cytokine in pro-inflammatory mediators such as inos, IL- 1β and IL-6. In a protein kinase inhibition test, however, p-jnk was slightly suppressed at high concentration while p-erk was inhibited at both low and high concentrations. Based on the results of this anti-inflammatory test, scalp tonic was produced with Lespedeza cuneata. Then, keratin, microbial biomass, erythema dose and image analyses were conducted against adult men (in their 30~40s) suffering from a scalp problem after dividing them into a control group (11 people), Lespedeza cuneata-added scalp tonic group ( T group, 11 people) and Lespedeza cuneata-added scalp tonic+scalp cleansing group ( TC group, 11 people) for four weeks. First, in terms of keratin, no significant change was found in a control group while it significantly declined in T group (by 50.3%) and TC group (58.5%). In microorganism as well, no significant difference was observed in a control group. It slightly decreased in T group (63.8%, p=.066) while a significant decrease was detected in TC group (74.5%). In changes in erythema, T and TC groups decreased by 36.6% and 38.9% respectively with statistical significance. In image analysis as well, no significant difference was found in a control group while improvement of erythema was detected in both T and TC groups. Compared to a control group, therefore, scalp improvement effects were observed in T and TC groups. The anti-inflammatory effects of Lespedeza cuneata were verified. According to the said results, it appears that Lespedeza cuneata extract is considerably valuable as the material of scalp cosmetics. Keywords: Anti-inflammation, Erythema Dose, Microorganism, Lespedeza Cuneata, Scalp 현대인들은평균수명이늘어나면서건강한삶을영위하기위한관심도가높아졌다. 이에현대의학치료에주로사용되는인공합성화합물은부작용과중독성을동반하는경우가많아질병치료를현대의학에만의존하기보다는몸과마음을동 시에치료하고자하는자연치료법인대체의학과천연물연구에관심을가지고신약과화장품에대한개발이많아지고있다 (Hwang, 2012; Lee, 2014). 대표적인신약으로는소염작용, 관절염치료제, 항암제등이개발되었다 (Barbosa et al., 2006). 두피치료제도합성물질들이두피에알러지를유발하는등안전성에문제가보고되어지고있어대체물질을발견하기 *Corresponding author: JuSub Kim, Department of Cosmetology, Sangji Youngseo College, 102-704 Gyeongdong Apt., 86 Heungeop-ri, Heungeop-myeon, Wonju-si, Gangwon-do 220-042, Republic of Korea Tel.: +82 33 730 0811, Fax: +82 33 730 0814, E-mail : c-miro@hanmail.net Received September 11, 2015; Revised November 27, 2015; Accepted December 9, 2015; Published December 30, 2015 www.kosac.or.kr 735
위한연구수행이시급한실정이다 (Park, 2009). 그러므로지속적으로증가되는두피시장의소비자욕구에맞추어안전하고다양한천연물유래의두피관련제품에대한연구가필요하다 (Lee et al., 2015). 야관문 (Lspedeza cuneata G. Don) 은콩과 (Leguminosae) 싸리속 (Lespedeza) 에속하는여러해살이식물로비수리, 삼엽초 ( 三葉草 ), 음양초 ( 陰陽草 ), 천리광 ( 千里光 ), 대력왕 ( 大力王 ), 사퇴초 ( 蛇退草 ) 등여러가지이름으로도불리우며유정, 유뇨증등을치료하고, 해수, 천식, 유방염, 종기, 시력강화작용혈액순환을잘되게하여남성질병, 양기부족등에뛰어난효과가있다고알려져있다 (Hideyuki et al., 1990; Jeong & Sin, 1990). 천연물질인야관문의생리활성물질로는 pinitol, tannin, β-sistosterol, avicularin, juglanin, trifolin, quercetin, kaempferol, vitexin, orientin 등의성분이보고되어있으며선행연구로는 Kim (2008) 의연구에서혈당강화효과를나타냈으며, Jung & Im (2005) 의연구에서도음경해면체평활근이완효과를확인할수있었으며이외에도항균효과 (An, 1998), 미백효과 (Cho, 2011), 광노화개선효과 (Jung et al., 2014), 항염증효과 (Lee et al., 2013) 가있는것으로확인되었다. 따라서본연구는야관문의항염실험을바탕으로선정된 30 40대문제성두피를가진남성을대상으로두피개선효과를확인하고야관문추출물의두피화장품첨가성분으로유효성을검토하고자하였다. 1. 야관문추출물제조음건한야관문 500 g을 Blender (Model 51BL31, USA) 로분쇄하여 95% 에탄올 10배를첨가하여 3 d 동안실온에서추출하였으며, 추출액을분리하기위해 9,000 rpm에서 15 min 간원심분리 (Hanil science industrial co., Ltd, SUPRA25K, Korea) 후여과 (Whatman No. 2) 하였으며, 진공감압농축기 (EYELA, Model N-1000S-W, Japan) 를사용하고에탄올을제거한후 3일동안동결건조 (FDU-8606, Operaon Gimpo Korea) 하여분말형태로된야관문추출물을 4 이하로냉장보관하면서분말형태로추출하여세포배양액인 DMEM에녹여실험에사용하였다. 2. 세포주및세포배양실험에사용된세포는단핵세포모노사이트 (RAW 264.7), 인간진피섬유아세포 (Human Dermal Fibroblast; HDF) 를한국세포주은행에서분양받아사용하였다. 세포배양은 High glucose Dulbecco s modified Eagle s medium(dmem, Hyclone, USA) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma1%) 와 penicillin/streptomysin (100 IU/ 50 μg /ml) 을첨가하여 37 로유지되는 5% CO 2, 상대습도 100% 의습윤배양기에서배양하였고, 배양된세포는 1 scrapper로부유시킨후 0.4% trypan blue로염색하여 hemacytometer로세포수를계대하였다. 3. 항염증측정 1) Neutral Red (NR) assay 를이용한세포독성측정 실험에서사용된시료의독성농도범위를알아보기위하여 NR을이용하여측정하였다 (Borenfreund & Puemer, 1985). 96 well plate에 well당 3 10⁴ cells/well의농도로분주하고세포주는 RAW264.7 세포를사용하였으며, 24시간동안전배양하였다. 세포부착확인후무혈청배지를이용하여야관문추출물을 3, 6, 12, 25, 50 μg/ml 농도로첨가한후 37, 5% CO 2 배양기에서 48 h 동안배양하였다. 배양한세포는 NR solution (Sigma, USA) 이 1% 포함된무혈청배지로교환하여 3시간동안배양한다음현미경하에서 neutral red의결정화유무를확인하였다. 세포고정액으로 formaldehyde 용액 10% 가첨가된 phosphate buffered saline (PBS) 을각 well에 100 µl로 20 min 처리하여고정하였다. NR desorb solution (1% glacial acetic acid, 49% ethanol, 50% distilled water) 을각 well 에 100 µl씩분주하여세포내의 neutral red를추출하고 microplate reader (Synergy-HT, BIO-TEK instruments, USA) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였고, 세포생존율은다음의식에따라계산하였다 (Kim, 2013). 세포생존율 (%) = 시료첨가군의 O.D. at 540 nm 시료무첨가군의 O.D. at 540 nm 100 2) Nitric oxide 생성억제능측정 Greenstork et al. (1993) 방법에따라 NO 생성저해능을측정하였다. RAW 264.7 세포를 96 well plate에 well당 5 10⁴ cells/well의농도로분주하고 24시간동안배양한다. 배양후배지를제거하고 lipopolysaccharide (LPS) 1 µg/ml 농도로처리된배지에야관문추출물을 3, 6, 12, 25 µg/ml를각농도별로가하여 48 h 동안배양하였다. New plate에배양된세포배양상층액 100 µl와 griess reagent 100 µl을가하여차광된상태에서 10 min간반응시키고 microplate reader를사용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 시료첨가군의 O.D. at 540 nm NO 생성억제능 (%) = 100 - 시료무첨가군의 O.D. at 540 nm 100 736 www.kosac.or.kr
야관문추출물의 30 40 대남성두피개선효과 3) Western blotting 60 mm 배양접시에세포를 1.5 10 5 개접종하여 24 h 배양후시료를 25, 50 µl/ml의농도로각각조건을처리하여 24 h 배양하였다. 배양된 HDF 세포를수확하여 PBS를세척한후 RIPA buffer로용해하였다. 용해된세포는 4 에서 12,000 g 로 30 min간원심분리하여상등액을회수하였다. 회수된상등액은 SDS sample buffer (60 mm Tris (ph 6.8), 14.4 mm 2-mercaptoethanol, 25% glycerol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue) 를첨가하고 100 에서 5 min간끓여단백질을 denatu-ration 시킨후단백질을 SDS-PAGE로분자량별로분리하였다. 분리된단백질은 100 V의조건에서 1 h 동안 nitrocellulose membrane (Whatman, UK) 으로 transfer한후 membraned은 0.1 용액에서 blocking 처리한후세척하였다. 1차항체로는 HDF 세포에서 p-erk, p-jnk를사용하였으며 Supersignal West pico solution (Pierce, USA) 을이용하여발광시키고필름 (Konica, Japan) 을덮고자동현상기 (QX- 103Ⅱ, Konica) 를이용하여측정하였다. 단백질 band의변화는 densitometer program인 Image J (NIH, USA) 를사용하여 band intensity 차이를비교하였다. 4) RT-PCR 야관문추출물이염증유전자 inos, IL-1β, IL-6 의발현을확인하기위하여 RT-PCR을시행하였다. RAW 264.7 세포에 LPS 를처리하여시료를 25, 50 µg/ml 의농도별로처리한후 Trizol reagent (Invitrogen, USA) 를이용하여 RAN를추출하였다. RAW 264.7세포가들어있는 tube에 1 ml Trizol reagent 를넣고상온에서 5 min간방치하여세포를용해하였으며, 0.2 ml chloroform을첨가하여 3 min간상온에방치한후 12,000 g, 4 의조건에서 20 min간원심분리하여 phenol층과수용성층으로분리하였다. 수용성층만회수하여 0.5 ml isopropanol 을첨가하고상온에서 10 min간방치후 15 min간원심분리하여 RNA를침전시킨후건조하였다. 건조된 RNA는 diethy1- pyrocarbonate (DEPC) water로녹여실험에사용하였으며, 추출된 RNA는 Nanodrop (Nanodrop, USA) 을이용하여 260/280 nm의 ratio를확인한후 ratio 1.8 이상인순도의 RNA만을실험에사용하였다. cdna는 M-MLV reverse transcriptase를첨가하여 37 에서 1 h 반응시켜 cdna를합성하였다. 확보한 cdna는 Taq polymerase (Bioneer, Korea) 와 primer를혼합하여실행하였으며, PCR products은 ethidium bromide (EtBr) 이포함된 1.5% agarose gel 에서전기영동을시행후 ultraviolet transilluminator (Htech, Korea) 로확인하였다. 4. 인체적용시험본연구는야관문추출물의두피개선효과를확인하기위하 여병적요인이없는 30 40대문제성두피를가진남성을대상으로 2015년 7월부터 2015년 8월까지 4주간실시하였으며실험전본실험의목적을설명하였고실험기간동안두피관련치료나관리염색, 펌시술을제한하기로하였으며연구대상자의임상참여동의서를자발적으로받아실험을진행하였다. 야관문추출물의두피토닉의효과를확인하기위해야관문추출물두피토닉을제조하여 4주동안대조군 11명, 두피토닉을사용한 T군 11명, 아침, 저녁으로두피토닉과주 1회두피클렌징을시술받은 TC군 11명을나누어두피변화를측정하였으나실험기간내적절한두피토닉사용이이루어지지않은대조군 1명과 T군 1명이중도탈락되어대조군10명, T군 10명, TC 군 11명으로임상실험을진행하였다 (Figure 1). 5. 야관문추출물미스트제형화장품제조 본연구에서야관문추출물이함유된화장품 T 군, TC 군에는 야관문추출물이 5% 포함되어있으며, 대조군에는두피토닉에사용된야관문추출물과동일양의정제수를함유시켰다. 6. 두피측정방법 (n=33) (n=10) T(n=10) TC(n=11) 2/, 2 ml/(30) (,,, ) ( 5%) 2/, 2 ml/(30) 4 (,,, ) Figure 1. Procedure of scalp treatment. (15) (10) ( 5%) 2/, 2 ml/(30) 야관문추출물두피토닉이 30 40 대남성의문제성두피의 개선효과를확인하고자연구대상자들의두피측정은샴푸 3 h 이후부터측정하였으며측정오차범위를최소화하기위해서동일조건에서동일인이안면두피모발경계선의 center point로 www.kosac.or.kr 737
Control LPS LCE LCE 1μg/mL 25μg/mL 50μg/mL LPS - + + + inos ll-1 β Figure 2. Effect of treated with Lspedeza cuneata extract (LCE) on cell viability in Raw 264.7 cells. IL-6 β-actin Figure 3. Inhibitory effect of treated with Lspedeza cuneata extract (LCE) NO production by RAW 264.7 cell. 부터 10 cm 뒤의지점을 5회씩측정하여평균값을내어사용하였으며실험전 후모두동일인이측정하였다. 두피의각질량은 Skin visiometer (SV-600, Germany) 를이용하여측정하였고, 미생물변화량은 Lummitester TM PD-20 (KIKOMAN, Japan) 을이용하여측정하였고, 홍반색소량은 Mexameter (MX18,Courage-Khazaka Electronic Co, Germany) 측정하였다. 두피홍반의화상분석은디지털마이크로스코프 (digital microscope, AM3013T, Dino-lite, Taiwan) 200배율촬영을실시하여실험물질사용전과실험 4주후측정하였다. 7. 연구윤리위원회승인본연구는건국대학교기관생명윤리위원회 (IRB) 에서과제번호 7001355-201506-HR-063번으로승인을얻어연구대상자의동의하에실시하였다. 8. 자료분석본연구의수집된자료는 SPSS Win 20.0을이용하여분석하였고, 연구대상자두피의동질성검증을위해 ANOVA를시행하였으며, 대조군과실험군의전, 후변화를파악하기위해 paired t-test를시행하였다. Figure 4. Effect of Lspedeza cuneata extract on the expression of proinflammatory molecules in RAW 264.7 cells. 1. 야관문추출물의항염증측정결과 1) RAW 264.7 세포에대한세포독성야관문추출물의세포독성은 NR assay를실시하여세포의증식과생존율을확인하였고, RAW 264.7 세포에대한 3, 6, 12, 25, 50 µg/ml 농도별로세포독성을나타낸결과 Figure 2와같이야관문추출물의세포생존율이 78% 이상을유지하였으며농도 50 µg/ml에서세포독성이확인되었으나 Lee (2013) 등의연구에서는농도 100 µg/ml 까지세포독성이발견되지않아본연구와상이한결과가나타났으며이러한결과는실험방법과추출방법에따라연구결과차이가있는것으로사료된다. 2) RAW 264.7 세포에대한 Nitric Oxide 생성능억제야관문추출물의 RAW세포의항염증실험에서는 LPS에의 738 www.kosac.or.kr
야관문추출물의 30 40 대남성두피개선효과 해유도하여 NO생성을억제시키는실험을실시하였다. 그결과야관문추출물 3, 6, 12, 25 µg/ml 농도에서 9.9%, 9.3%, 12%, 47%, 84% 로농도의존적으로 NO생성이억제됨을확인할수있었다 (Figure 3). Nitric Oxide Synthase (NOS) 에의해 L-arginine으로합성되는 NO는새로운유형의염증매개물질로주목받고있으며, NOS 및 NO활성을억제함으로써염증성질환의진행을억제할수있는것으로알려져있다 (Farias et al., 1994). 이러한연구결과는야관문추출물이두피의염증매개물질을억제할수있는두피제품적용이가능할것으로판단된다. UVB P-ERK P-JNK Control UVB LCE LCE 25μg/mL 50μg/mL - + + + 3) RAW 264.7 세포에대한 inos, IL-1β, IL-6 발현억제능측정야관문추출물이염증반응인자인 inos, IL-1β, IL-6 등의 cytokine이농도의존적으로억제됨을 RT-PCR 실시하여확인하였다. 그결과 inos, IL-1β, IL-6은 LPS 에의해발현이증가되었고, inos, IL-1β, IL-6 염증사이토카인유전자는발현감소가크지않았다 (Figure 4). 그러나야관문의항염증효과의선행논문 (Lee et al., 2014) 에서는 LPS에의해활성화된 Raw 264.7 세포에서분비되는 IL-1β, IL-6을유의하게억제한것으로나타나본결과와차이를보였다. β-actin 4) 단백질인산화효소억제능측정본연구에서는 Western blotting을이용하여 UVB에의한 MMP-1 유전자발현에관련이있다고알려진 p-erk 와 p-jnk의인산화정도를확인하였다. 야관문추출물을 25, 50 µg/ml 농도로처리한후 UVB를조사하여각각의인산화가증가되었음을확인하였으며, p-jnk 의 50 µg/ml 농도에서약하게인산화가억제되었고, p-erk 에서저농도와고농도모두인산화억제가되는것을확인하였다. 특히 50 µg/ml 농도에서대조군과비교하여효과적으로인산화억제효과가확인되었다 (Figure 5). 이러한결과는야관문추출물이염증발현물질에유의미한영향을미칠것으로사료된다. 2. 인체적용시험 1) 연구대상자들의두피상태동질성검증본연구대상자의실험전두피의각질, 미생물, 홍반상태는 Figure 5. Inhibitory effect of sprout extract on the p-erk and p-jnk in expression HDF cells. 다음에제시한 Table 1과같고, 모든항목에서집단간유의한차이를나타내지않았으므로, 동질성이확보되었다 (p>.05). 2) 두피의각질변화본연구대상자의그룹에따라전 후각질변화를분석한결과는다음에제시된 Figure 6과같다. T군, TC군의각질변화는실험후 50.3%, 58.5% 로유의하게감소하였다 (p<.01). 따라서대조군을제외한실험군모두에서유의한각질의감소를나타냈으며, 선행연구에서도콩과인야관문과연계성이있는콩단백질인이소플라본을이용한 Lee(2011) 의연구에서도이소플라본두피개선제를사용후각질이감소되어유사한결과를보였다. Table 1. Similarity of measurement point for the scalp Variable Cont (n=10) T (n=10) TC (n=11) MSD MSD MSD F p Keratin 42.9021.15 49.9028.94 55.3626.12 0.620 0.545 Erythema Index 138.6022.45 153.6024.21 167.9046.51 2.003 0.154 microorganism 8179.103729.60 4555.804615.67 8604.275530.84 2.274 0.122 Abbreviations: Cont, control group; T, Lespedeza cuneata-added scalp tonic group; TC, Lespedeza cuneata-added scalp tonic + scalp cleansing group. www.kosac.or.kr 739
Figure 6. Comparison of scalp keratin. Figure 8. Comparison of scalp erythema. 와일치하였다. 이는야관문추출물이두피의홍반을완화하는데긍정적인도움을주는것으로생각된다. Figure 7. Comparison of scalp microorganism. 3) 두피의미생물변화두피의피지선이활성화되면피지선량이증가하게되고이로인해피지막이알칼리화되어미생물번식이증가한다 (han et al., 2005). 두피의개선상태를확인하기위해야관문추출물을이용한두피토닉사용전 후미생물변화를분석한결과는다음에제시된 Figure 7과같다. T군의미생물변화는실험후 63.8% 감소 (p=.066), TC군실험후 74.5% 로두군모두유의하게감소했다 (p<.01). 4) 두피의홍반변화두피의염증반응인홍반의상태를확인하기위해야관문추출물두피토닉사용전 후홍반변화를분석한결과, Figure 8 과같이 T군 36.6%, TC군은 38.9% 로실험후홍반변화는유의하게감소하였다 (p<.001). Lee et al. (2013) 의연구에서야관문추출물이염증매개물질을억제한다는세포실험결과를바탕으로흰쥐의발부종실험을측정한결과야관문추출물투여군에서유의한발부종의억제를나타내었다. 또한야관문추출물의 UVB에의한피부노화억제활성을살펴보고자피부홍반도를확인한결과야관문추출물 3% 도포군이대조군에비해 9.3% 홍반감소효과 (Kim et al., 2013) 가나타나본연구결과 5) 화상분석홍반변화두피의화상분석을실시한결과대조군에서는육안으로식별가능한변화는없었으나두피토닉을사용한군에서는실험전 T2에서농포성여드름이실험 4주후에 T2-1이호전되어있는것을확인할수있었으며, 두피토닉과두피클렌징을사용한군에서는실험전모세혈관에확장된 TC3은두피의홍반정도가심각하였으나실험후에 TC-3의홍반정도가많이개선되었음을확인할수있었다 (Figure 9). Im (2011) 등의연구에서도야관문추출물처리군에서신생혈관과상피층의회복조짐도관찰하였으며반흔형성도현저히감소함을관찰할수있었다. 이러한연구결과는야관문추출물이홍반을개선시키는데유의미한영향을미친다고사료된다. 야관문추출물을이용한항염증측정을위해 nitric oxide assay, Western blotting, RT-PCR 실험을실시하였다. 그결과 RAW 264.7 세포에대한세포독성이 78% 유지하였으며염증유발물질인 NO생성량결과, 25 µg/ml에서 84% 높은 NO생성억제율을나타내었다. 염증반응인자인 inos, IL-1β, IL-6 등의 cytokine이유의미한발현의감소를확인할수없었으나단백질인산화효소억제능실험에서는 p-jnk가농도 50 µg/ml에서약하게인산화가억제되었고 p-erk에서저농도와고농도모두인산화억제가되는것을확인하였다. 이러한세포실험의결과를바탕으로문제성두피를지닌 30-40대남성을대상으로하여 4주동안 T군과 TC군나누어 740 www.kosac.or.kr
야관문추출물의 30 40 대남성두피개선효과 Cont T TC Before After Before After Before After Cont 1 Cont 1-1 T 1 T 1-1 TC 1 TC 1-1 Cont 2 Cont 2-1 T 2 T 2-1 TC 2 TC 2-1 Cont 1 Cont 1-1 T 1 T 1-1 TC 1 TC 1-1 Figure 9. The scalp Erythema before and after. 두피의각질변화량, 미생물변화량, 홍반변화량, 화상분석을측정하였다. 각질변화량은대조군에서는유의한변화는보이지않았고 T군은실험후 50.3%, TC군실험후 58.5% 유의하게감소했다. 미생물변화량도대조군은후유의한변화가없었고 T군의실험후 63.8% 감소했지만유의한변화는없었고 (p=.066) TC 군은실험후 74.5% 유의하게감소했다. 홍반변화는대조군을제외한실험군 T군, TC군에서실험후각각 36.6%, 38.9% 로유의하게감소했다. 화상분석결과에서도대조군은유의한변화가없었으나 T군에서농포성여드름개선과 TC군에서홍반의개선상태를확인할수있었다. 따라서두피의각질변화량, 미생물변화량, 홍반변화량, 화상분석을실시한결과대조군에비해 T군과 TC군의경우두피개선효과가있었고야관문추출물의항염효과를검증할수있었고두피화장품제제로써의가능성을시사하며, 두피화장품의소재로써충분한가치가있는것으로판단된다. An DG. South Korea Prime primaries book. Seoul Kyohaksa., p111, 1998. Ahn DK. Illustrated Book of Korean Medicinal Herbs. Kyohaksa Publishing Co. Ltd., Seoul., 1988. Barbosa-Filho JM, Piuvezam MR,Moura MD,Silva Ms, Lima KVB, da-cunha EVL, Fechine IM,Takemura OS. Anti-Inflammatory Acivity of Alkaloids A Twrnty-Century Review. Revista Brasileira De Farmacognosia., 12: 109-139, 2006. Borenfreund E, Puemer JA. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicol. Lett., 24: 119-124, 1985. Cho EJ, Ju HM, Jeong CH, Eom SH, Heo HJ, Kim DO. Effect of Phenolic Extract of Dry Leaves of Lespedeza www.kosac.or.kr 741
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