Korean Journal of Microbiology (2014) Vol. 50, No. 4, pp. 319-326 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2014.4056 Copyright c 2014, The Microbiological Society of Korea 보문 전통장류에서분리한 Biogenic Amines 저감유산균 Pediococcus pentosaceus 의분리및특성 오현화 1 류명선 1 허준 1 전새봄 1 김용상 2 정도연 3 엄태붕 1 * 1 전북대학교자연과학대학생물학과, 2 식품의약품안전처, 3 발효미생물산업진흥원 Characterization of Biogenic Amine-reducing Pediococcus pentosaceus Isolated from Traditionally Fermented Soybean Products HyeonHwa Oh 1, MyeongSeon Ryu 1, Jun Heo 1, SaeBom Jeon 1, Young Sang Kim 2, DoYoun Jeong 3, and Tai-Boong Uhm 1 * 1 Department of Biological Sciences, Chonbuk National University, Jeonju 561-756, Republic of Korea 2 Ministry of Food and Drug Safety (MFDS), Osong 363-700, Republic of Korea 3 Microbial Institute for Fermentation Industry (MIFI), Sunchang 595-804, Republic of Korea (Received August 29, 2014 / Accepted September 24, 2014) Two bacterial strains, named as LE17 and LE22, were isolated from traditionally fermented soybean products in order to select lactic acid bacteria for the reduction of biogenic amines and harmful bacteria. Both strains were identified as Pediococcus pentosaceus by 16S rrna sequence analysis and additional biochemical tests. The strain LE17 reduced the amines by 13.7% for histamine and by 25.9% for tyramine, when it grew in minimal synthetic media containing 0.1% (w/v) histamine and 0.1% tyramine at 30 for 48 h, while the strain LE22 reduced the amines by 23.7% for histamine and by 15.7% for tyramine. Both strains also had broad inhibition spectra against pathogens. Considering their properties, they could be used as starters for industrial soybean fermentation. Keywords: Pediococcus, anti-bacterial agents, biogenic amines, lactic acid bacteria, soybean products Biogenic amines은인체에서생합성되는미량의필수생리물질로서합성분해의대사과정을통해일정한균형을이루고있다. 이들은미생물에의한발효과정중흔히생성되는데 amino acid decarboxylase 반응으로 histamine, tyramine류의 monoamine 과 putrescine, cadaverine류의 diamine을생성한다 (Karovičová and Kohajdová, 2005). 따라서식품을통해인체분해한도를넘는양을섭취할때는 histamine의경우혈압저하와알레르기, tyramine 은혈압상승과두통을유발하며, putrescine과 cadaverine은장내미생물대사를통해발암물질인 nitrosopiperidine, nitrosopyrrolidine 으로전환될수있다 (Warthesen et al., 1975). 한국인이섭취하는주식품을보면김치, 장류, 젓갈, 막걸리, 절임류등으로이들은모두미생물발효를통해만들어지기때문에 biogenic amines 과량섭취에따른인체안전성이문제가되었다. 이에따라 2007년식품의약품안전처는주요발효식품을대상으로 biogenic amine 함량을조사하였고, 그결과한국인의 biogenic amines 섭취량대부분은전통장류, 김치, 젓갈로부터기인되며이들식품에서 *For correspondence. E-mail: tbuhm@chonbuk.ac.kr; Tel.: +82-63- 270-3439; Fax: +82-63-270-3362 높은함량은인체에해로운수준임을보고하였다 (Cho et al., 2006). 유럽의경우에도주발효식품인포도주, 치즈, 소시지등에서 biogenic amine 함량이높게나타나 2011년유럽연합은발효식품의 biogenic amine 저감화를위한 project를진행했으며 (BIAMFOOD #211441, 2008), 2013년 FAO/WHO 합동전문가회의에서는어류내 histamine 허용한도를 200 mg/kg 이내로권고하였다 (FAO/WHO, 2013). 발효식품내에 biogenic amines의함량은합성효소인 amino acid decarboxylase 활성과분해효소인 biogenic amine oxidase 활성에의해결정된다. Amino acid decarboxylase은 Bacillus, Lactobacillus, Proteus, Pediococcus, Streptococcus를포함하는대부분의발효관련미생물들에서발견되었고, tyrosine decarboxylase, histidine decarboxylase, ornithine decarboxylase, lysine decarboxylase 등의발현양은발효과정중의아미노산농도, 당농도, 온도, ph, 산소농도, 염농도에의해영향을받는것으로알려졌다 (Karovičová and Kohajdová, 2005). 유산균은식품의 ph를낮추면서동시에항균물질을생산해부패미생물을줄이는역할을하며, 대사과정을통해풍미를높이는주요발효균이다. 하지만소시지, 포도주, 치즈등의발효식품에서발견되는유산균인
320 Oh et al. Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus들은 biogenic amines 생산에주역할을하는것으로보고되었다 (Coton et al., 2010). Biogenic amine을분해하는유산균으로 L. plantarum (Capozzi et al., 2012; Callejón et al., 2014) 과 Pediococcus acidilactici (Callejón et al., 2014) 가분리되었다. 국내에서는전통장류에서분리한 B. licheniformis, B. subtilis, B. amyloliquefaciens들이 histamine, tyramine, putrescine, cadaverine을분해하는것으로알려졌지만 (Kim et al., 2012a, 2012b), 유산균에의한 biogenic amines 분해연구는아직보고된바없다. 다수의미생물이관여하는장류발효의경우미생물의대사제어는어려운일이기때문에우점미생물의역할은중요하다. 최근수행된메주 (Kim et al., 2011b) 와된장 (Jeong et al., 2014) 의세균군집구조를보면우점유산균으로메주에서 Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Weissella, Enterococcus가, 된장에서 Tetragenococcus가주로발견되었다 (Kim et al., 2011a, 2011b; Jeong et al., 2014). 이의해결방안은식품의약품안전처의 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주이면서도 biogenic amines 분해능력이크며유해균억제능력을지닌유산균주를분리하는일이다. Nagoya 의정서에따라균주사용료를지불해야하는현상황에서, 우리는국내토착미생물로서식품안전성이검증된유산균을선발함으로서한국전통장류의품질고급화를이루는데연구의목표를두었다. 재료및방법균주분리전통방식으로제조한 150종의된장, 간장, 고추장을구입한후, 각 0.1 g을취해 0.9 ml MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) broth (BD, USA) 로충분히혼합하였다. 각희석액 0.2 ml을취해 MRS agar (BD, USA) 표면에도말하여 28 에서 24시간배양하였고, 한 plate 내에서동일균주의선발을피하기위해집락형태가상이한균들을분리하였다. Biogenic amines 분해균주의 1차선발산업적용도를위하여 382종의균들중 biogenic amines을생성하지않는균주선발을위해변형된 Bover-Cid and Holzqpfel 방법 (1999) 을사용하였다. 즉, ph 5.3으로조절한배양배지 (0.4% yeast extract, 0.05% Tween-80, 0.02% MgSO 4, 0.005% MnSO 4, 0.004% FeSO 4, 0.01% CaCO 3, 2% agar, 0.006% bromocresol purple) 를멸균하고 0.1% 의 histidine과 tyrosine을각각무균적으로첨가하였다. 이한천배지에균을접종하여 30 에서 24시간배양하였으며이들중색의변화가없는집락을선발하였다. 선발균들중 histamine과 tyramine을질소원으로하는최소합성배지 (2% glucose, 0.1% histamine, 0.1% tyramine, 0.04% MgSO 4, 0.9% K 2HPO 4) 에접종하여 30, 48시간배양후집락을형성한 8종을선발하였다. Biogenic amines 분해력확인선발균주의 biogenic amines의분해능력을정량적으로분석 하기위해 HPLC를수행하였다. 선발균들을 0.1% histamine과 tyramine이함유된최소합성배지에서 30 에서 48시간동안배양후 16,000 x g에서 10분간원심분리를하였다. HPLC 분석을위한유도체화방법은일본위생시험법 (PSJ, 2005) 의일부를변형하여사용하였다. 즉, 상층액 100 µl에 100 µl 아세톤에용해된 1% dansyl chloride, 50 µl 포화 Na 2CO 3, 50 µl 내부표준물질 1,7-aminoheptane을섞어 45 암소에서 1시간유도체화시켰다. 이용액에 50 µl 10% proline 용액을넣어과잉의 dansyl chloride를제거한뒤, 0.5 ml diethyl ether를넣고잘섞어 3분후분리된상층액만을모아 diethyl ether 용매를증발시켰다. 이를 200 µl acetonitrile에녹여 HPLC 분석에사용하였다. HPLC 는역상컬럼으로 C18 Capcell pack (Shiseido, Japan; 4.6 mm x 150 mm, 5 µm), 이동상은 0.1% formic acid가용해된 H 2O (A) 와 0.1% formic acid가용해된 acetonitrile (B) 을사용하였고농도경사는 0 10분, A:B=45:55; 10 15분, A:B=35:65, 15 25분, A:B=20:80; 25 30분 A:B=10:90, 유속은분당 1 ml이었으며 10 µl 시료를주입하였다. 시료농도 (Cs) 계산은다음과같았다 (Smělá et al., 2003). Cis As Cs RFs Ais RFs ( 각 tyramine, histamine의 response factor) = (Aiss/Ass) (Css/Ciss) Aiss, 정량표준곡선에서내부표준물질의피크면적 ; Ciss, 정량표준곡선에서내부표준물질의농도 ; Ass, 정량표준곡선에서 tyramine 또는 histamine의피크면적 ; Css, 정량표준곡선에서 tyramine 또는 histamine 농도 ; Ais, 내부표준물질피크면적 ; As, 시료피크면적 ; Cis, 내부표준물질농도. Multicopper oxidase 유전자확인 Biogenic amines인 histamine, tyramine, putrescine을 aldehyde 와 ammonia로분해하는 amine oxidase 유전자를검출하기위해 MRS에서 24시간배양한균집락으로 colony PCR을수행하였다. 표준균주인 Pediococcus pentosaceus ATCC 25745의 copper amine oxidase 유전자 (GenBank accession no. NC_008525 region: 555105-556634) 를기준으로설계한 PCR primer는각각 5 -ATGGTTTGGCTGCCATGGTG-3 (forward primer), 5 -CGATCGCGACACTTTCGTCC-3 (reverse primer) 였고 PCR 은 95 5분열변성, 30 cycles (95 1분, 55 1분, 72 1분 ), 72 final extension 순으로수행하였다. PCR 산물의염기서열은 Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems Inc, USA) 를사용하여해독하였고, 표준균주의 copper amine oxidase 유전자염기서열과비교는 CLUSTAL OMEGA (Sievers et al., 2011) 를사용하였다. 유해균증식억제능유해균의증식억제능력을확인하기위해선발유산균을 MRS 배지에 30 에서 48시간배양하고 16,000 x g에서 10분간
Biogenic amines 저감기능과유해균저해능력을동시에지닌유산균 321 원심분리하여상층액을취했다. 유해균배양을위해 Bacillus cereus 배양액 200 µl는 chromogenic polymixin B-methoprim agar (CPMA) (oxoid, UK) plate에, Micrococcus와 Pseudomonas 각배양액 200 µl는 Nutrient agar plate에, Staphylococcus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenesis 각배양액 200 µl는 Luria-Bertani (LB) agar plate에도말하였다. 6 mm 직경의멸균 paper disc (Toyo Roshi, Japan) 를도말한표면에올린뒤선발유산균배양상층액 20 µl를각각분주하여 37 에서 18시간배양후, paper disc 주위의투명환의크기를측정하였다. 유해균억제물질이단백질구조를가지는지확인하기위해 10 0 에서 10분간열처리한뒤냉각후짧게원심분리한시료와 1,000 units의 proteinase K를 1 ml의시료에첨가후 50 에서 30분간처리한시료를각각사용하여 paper disc diffusion assay 를수행하였다. 균주동정생화학적특성에따른동정은 API 50 CHL kit (biomérieux, France) 를사용하여제품 manual에따라분석했고, 얻어진결과들은 on-line bacteria database인 apiwebsoftware (biomérieux) 를사용하여분류균의생화학적특성을비교계산한뒤동정하였다. 16S rrna 유전자의염기서열에의한동정을위해 universal primer로 27F (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3 ) 와 1492R (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ) 을사용하여 16S rrna 유전자를증폭하고, 이 PCR산물을정제한후염기서열을해독하였다. 이염기서열을이용하여 BLASTN search (Zhang et al., 2000) 와 Ribosomal Database Project (version 11) 의 SeqMatch program에서서열일치도가높은표준균주의 16S rrna 유전자염기서열을얻었고, 염기서열간의상호비교를위해 CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) 를사용했다. 계통도분석은균주들의 16S rrna 유전자염기서열들을정렬하고 chromatogram의비교와수작업으로 gap이최소화되게보정한후 Tamura-Nei model에기초한 Maximum Likelihood 방법 (Tamura and Nei, 1993) 을사용하여작성하였다. 산출한각각의계통수에서각분지에대한통계적신뢰도를산출하기위해 bootstrap 분석을 1,000회실행하였으며, 계통분석과 bootstrap 분석은 MEGA program (Tamura et al., 2011) 을사용하였다. 결과및고찰선발균주의동정최종선발한 LE17과 LE22 균주의집락은 MRS 한천배지에서모두백색의윤택있는원형으로자랐고집락크기는직경약 1 2 mm였다. RDP (Ribosomal Database Project) 의 SeqMatch 프로그램을통해두균의 16S rrna 유전자염기서열과가장가까운표준균주들을선정한뒤 MEGA program에서계통도를분석하였다. LE17과 LE22 균주는 P. pentosaceus DSM 20336 과가장가까운근연관계 (Fig. 1) 로 16S rrna 유전자의염기서열상동성은각각 99.5% (1,408 bp/1,415 bp) 와 99.6% (1,414 bp/1,420 bp) 였다. LE17과 LE22 균주의 16S rrna 유전자내 1,420 bp의염기서열을상호비교한결과 3곳에서차이가있었고, 그중 2곳에서염기소실 (LE22) 과 1곳에서염기치환 (A C) 이발견되었다. API 50 CHL kit에의한 50 종류의생화학적검 Fig. 1. Phylogenetic tree constructed from comparative analysis of 16S rrna gene sequences showing the relationships of LE17 and LE22 with other type strains. Bootstrap values (percentage from 1,000 replicates) are indicated at the nodes. The scale bar indicates the nucleotide change per site.
322 Oh et al. Table 1. The carbohydrate fermentation patterns of the isolated strains, LE17 and LE22, using API 50 CHL strips Substrate LE17 LE22 Control - - Glycerol - - Erythritol - - D-Arabinose - - L-Arabinose + + Ribose + + D-Xylose - - L-Xylose - - Adonitol - - β-methyl-d-xyloside - - Galactose + + Glucose + + Fructose + + Manose + + Sorbose - - Rhamnose - - Dulcitol - - Inositol - - Mannitol - - Sorbitol - - α-methyl-d-mannoside - - α-methyl-d-glucoside - - N-Acetyl glucosamine + + Amygdalin + + Arbutin + + Esculin + + Salicin + + Cellobiose + + Maltose + + Lactose - - Melibiose + + Sucrose + + Trehalose + + Inulin - - Melezitose - - Raffinose + + Starch - - Glycogen - - Xylitol - - Gentiobiose + + D-Turanose - - D-Lyxose - - D-Tagatose + + D-Fucose - - L-Fucose - - D-Arabitol - - L-Arabitol - - Gluconate - - 2-Keto-gluconate - - 5-Keto-gluconate - - 사결과는 Table 1에요약되었으며각 99.9% 와 99.9% 의확률로 P. pentosaceus로동정되었다. Homofermentative 발효특성을 Table 2. Degradation of histamine and tyramine by the biogenic amine-degrading strains after 48 h of culture in minimal synthetic medium supplemented with histamine (0.1%) and tyramine (0.1%) Strains Degradation (%) Histamine Tyramine Control 0 0 LE 5 10.43 ± 0.05 15.71 ± 0.01 LE 10-0.86 ± 0.14 15.05 ± 0.23 LE 11 19.03 ± 0.15 17.84 ± 0.12 LE 13 10.74 ± 0.06 16.51 ± 0.08 LE 15 13.76 ± 0.09 8.73 ± 0.20 LE 17 13.71 ± 0.05 25.89 ± 0.08 LE 20-4.80 ± 0.20 8.81 ± 0.11 LE 22 23.66 ± 0.02 15.64 ± 0.13 Data represent mean±sd of three separate experiments 가진 P. pentosaceus는기질로서 pentose인 L-arabinose, D-ribose, D-xylose를이용할수있는특징을가졌다 (Dobrogosz and DeMoss, 1963). 따라서생화학분석과계통학적분류를고려하여두균주를 P. pentosaceus LE17 (GenBank accession no. KM288714) 와 P. pentosauceus LE22 (KM288715) 로각각명명하였다. Biogenic amines 저감화균주의선발 Amines 저감화를위한접종균으로사용하려면 amine 분해능력이생성능력보다크면서 GRAS에포함된유산균을선발하는것이요구된다. 이를위해집락의증식동안염기성 amines 생성에의한 ph 변화를 indicator 발색을통해확인한뒤, biogenic amines 함유최소배지에서집락형성유무를확인하는방식으로 8종의균주를분리하였다. 이선발방법은정량적이지않았지만다수의장류시료에서 amines의생산과감소능력을신속하게확인하는데유용하였다. Monoamine인 histamine과 tyramine에대한저감능력을확인하기위해 8종의균주를대상으로 HPLC 로정량적인감소율을조사하였다. 유일한질소원으로 0.1% (w/v) histamine과 0.1% tyramine이첨가된최소합성배지에서배양후분석한결과, 각균주에따라 histamine과 tyramine의감소율에차이를보였다 (Table 2). 이들중 LE22 균주의경우 histamine 은평균 23.7%, tyramine은 15.7% 가감소한반면, LE17의경우 histamine은 13.7%, tyramine은 25.9% 가감소하였다. 선발균들에의한전체적인감소율은 histamine에서 10 24%, tyramine에서 8 26% 범위였다. 비교를위해동일량의 histamine과 tyramine 을첨가했지만균주만접종하지않았던동일배양배지에서는이들의감소가전혀관찰되지않아 (Table 2), biogenic amines의분해가이들균주들에의해서만일어난다는것을확인하였다. 최근포도주에서분리한 Lactobacillus plantarum ENOLAB Lb132 균주는 0.004% (w/v) histamine 또는 tyramine이첨가된포도주에서각각 28.4%, 14.7% 의감소율을보였고, L. plantarum ENOLAB Lb98 균주에서는각각 25%, 27.8% 감소되었다 (Callejón et al., 2014). 사용한배양액과 amine의농도가서로달라균들간 amine 분해능력을직접비교할수없었지만, LE17 및 22 균주또한 Lactobacillus와같은 amine oxidase 활성이있을것으로예상되었다. 포도주에서분리했던 L. plantarum J16과
Biogenic amines 저감기능과유해균저해능력을동시에지닌유산균 323 Pediococcus acidilactici CECT 5930의 biogenic amines 분해작용은해당유전자의발현결과 laccase의일종인 multicopper oxidase (MCO) 인것으로판명되었고, 이들은 histamine, tyramine, putrescine을분해할수있었다 (Callejón et al., 2014). 선발균주 들중 histamine과 tyramine에대해감소율이높았던 LE17과 LE22 균주를대상으로 multicopper oxidase 유전자의존재유무를 PCR로조사하였다. 두균주모두 Pediococcus pentosaceus 로동정되었으므로, 표준균주인 P. pentosaceus ATCC 25745 의 putative multicopper oxidase 유전자를기준으로 primers를설계하고 PCR을수행하였다. P. pentosaceus ATCC 25745의 putative muicopper oxidase 보존영역을 CD-Search program (Marchler-Bauer and Bryant, 2004) 으로분석했을때 3개의 cupredoxin domain을포함하는산화효소임을보였다. 전기영동결과두균주모두예상 PCR 산물크기인 591 bp 위치에서밴드 (Fig. 2) 가나타났고, 이들 PCR 산물의염기서열은 P. pentosaceus ATCC 25745 multicopper oxidase 유전자내 548 bp 염기서열영역과 94.3% 상동성 ( 각 517 bp/548 bp) 을나타내이들유전자의발현으로 biogenic amine이분해될것으로예상되었다 (Fig. 3). 그러나두균주가생산하는 biogenic amine 분해효소가실제로이유전자로부터발현되는지는앞으로기질에대한활성특성과반응속도의확인을통해검증할필요가있다. Fig. 2. PCR amplication of the putative multicopper oxidase gene of strains LE17 and LE22. M is a DNA ladder. 유해균주억제능력선발 8종유산균들중 histamine과 tyramine의분해비율이상대적으로높았던 LE17 및 LE22 균주를대상으로병원성유해 Fig. 3. Partial sequence comparison of putative multicopper oxidase gene in strains LE17 and LE22 with that of Pediococcus pentosaceus ATCC 25745 (GenBank accession no. NC 008525: 555105-556634).
324 Oh et al. Table 3. Inhibitory spectra of two isolates, LE17 and LE22, exhibiting antibacterial activity Pathogenic strains Inhibitor zone (mm) LE17 LE22 Bacillus cereus KACC 13066 11.52±0.87 10.73±1.03 Pseudomonas aeruginosa KACC 10259 8.37±0.48 8.19±0.13 Micrococcus luteus KACC 11306 10.44±0.23 9.83±0.20 Staphylococcus aureus KACC 10778 14.82±2.65 15.41±1.69 Escherichia coli KACC 13821 7.23±0.66 7.04±0.39 Enterococcus faecalis KACC 11304 10.92±0.55 10.40±0.35 Listeria monocytogenes KACC 10764 10.37±1.02 9.80±0.56 Data represent mean±sd of three replications 균에대한항균효과를조사했고그결과는 Table 3에요약되어있다. 두유산균은유해균주모두에대해항균작용을가졌고특히 Staphylococcus aureus KACC 10778에대한증식저해능력이컸다. 유산균의항균능력은주로유산에의한 ph 감소와 bacteriocins 작용때문이다. 낮은 ph 범위 (ph 2 4) 에서도증식 할수있는 E. faecalis 의내산특성 (Nakajo et al., 2006) 을고려할 때, 두균주는 bacteriocins을생산하여 E. faecalis에대한항균활성을나타내는것으로판단되었다. 항균물질이 bacteriocins 일가능성을확인하기위해배양상층액을처리한후저해를많이받은 Staphylococcus aureus와 Listeria monocytogenes를대상으로 paper disc diffusion assay를수행하였다 (Fig. 4). 단계별희석한상층액에의해생성된투명환을비교한결과정량적이지는않았지만그크기가감소되었고, Staphylococcus의경우희석시료의투명환안에작은집락들이관찰되었다. 원심분리만한상층액과이를 0.20 µm filter (Toyo Roshi, Japan) 에서한번더여과한상층액의투명환직경에차이가없는점으로보아, 상층액중의미생물에의한투명환생성가능성은배제되었다. 또한배양상층액을 100 에서열처리한시료와 proteinase K를처리한시료모두항균활성에영향을주지않아항균물질이단백질이아닐가능성을시사했다. Pediococcus 속이내는 bacteriocins의경우 Class IIa에속하는저분자성 peptide로서 pediocin PD-1, AcH/PA-1, SM-1, SA-1 등의구조가존재하며, 특히식품병원성미생물로서 Gram(+) 세균인 B. cereus, C. perfringens, Listeria species, S. aureus에대해항균능력을지닌다 (Papagianni and Anastasiadou, 2009). 또한열저항 peptide로서 121 의가열시 Fig. 4. Antibacterial effect of differently treated culture filtrate of the strain LE17 (upper) and LE22 (lower). (A) Culture supernatant without treatment; (B) filtrate of supernatant with 0.20 μm filters; (C) culture supernatant diluted 2-fold with MRS medium; (D) culture supernatant diluted 4-fold with MRS medium; (E) culture supernatant heated at 100 for 10 min; (F) culture supernatant treated with proteinase K (20 U in 20 µl) at 5 0 for 30 min. Amount of soaked sample on the paper disc was 20 µl.
Biogenic amines 저감기능과유해균저해능력을동시에지닌유산균 325 에도항균활성을거의그대로유지할수있기때문에식품의보존제로서잠재적가능성을가지고있다. Kingcha 등 (2012) 은 P. pentosaceus의한균주가 L. monocytogenes를효율적으로감소시켰으며이균주가생산하는항균물질은 pediocin AcH/PA-1 과같음을보고하였다. Cytotoxin K, non-hemolytic enterotoxin, hemolysin, cereulide 등의설사및구토독소를생산하는 B. cereus는자연계에흔할뿐아니라포자형성으로열에잘견디기때문에, 식품의약품안전처는식품안전성확보를위해 2007년부터모든장류제품에서 B. cereus 균의허용한도를 1 x 10 4 CFU/g 이하로고시하였다. 그러나, 위해요소중점관리제도 (HACCP) 가정착되지않은소규모전통장류제조업체입장에서는식품의약품안전처가정한 B. cereus 균수상한선을맞추기가어려운실정이다. Gram(+) 유해균들에대해항균 spectrum 이넓은이유산균들을발효 starter로사용한다면, 장류의위생안전성을향상하는데도움을줄수있을것이다. 적요장류식품에서 biogenic amines 저감기능과유해균저해능력을동시에지닌유산균을선발하기위해, 전통방식으로제조한장류시료로부터 2종의균주를분리하였다. 생화학적동정및 16S rrna 유전자염기서열을분석결과이들균은유산균인 Pediococcus pentosaceus로동정되었다. 질소원으로 0.1% (w/v) histamine과 0.1% tyramine이첨가된최소합성배지에서 30, 48시간배양후잔류 amine을분석한결과, LE22 균주의경우 histamine은 23.7%, tyramine은 15.7% 가감소한반면, LE17의경우 histamine은 13.7%, tyramine은 25.9% 가감소하였다. 장류에서발견되는주요유해균에대한항균효과를조사한결과, 두균주모두유해균들애대해항균작용을보였다. 두균주의발효특성을고려했을때이들은유산균종균으로써산업적장류생산에적용할수있을것으로보인다. 장류발효균주로서평가전통장류의숙성동안발효과정은다수의미생물들이관여하지만우점을형성하는균주들이장류의풍미와식품안전성유지에큰영향을준다. 장류발효에주요한미생물군집은 amylase와 protease의공급원인 Bacillus 속이지만, 풍미와부패방지에함께역할을하는것은효모와유산균이다. 오랫동안소시지, 포도주, 피클, 치즈등유럽의발효식품에유산균으로사용되어온 Pediococcus 속은균주안전성이확립되어있을뿐아니라 probiotic 으로서잠재된능력을평가받고있다 (Shukla and Goyal, 2014). Biogenic amines을감소시키고동시에병원균에대해증식억제능을가진 P. pentosaceus를같은특성을지닌 Bacillus 속과함께숙성을진행한다면식품안전성을높이는데효과적일것이다. 또한장류환경인 10 12% 염농도와 ph 4.2 8.2의범위에서잘증식하는 P. pentosaceus의일반적배양특성 (Tanasupawat et al., 1993) 을고려할때, 장류종균 (starter) 으로써이균주들은적합하게사용될수있다. 현재식품의약품안전처가제정한식품첨가물규격 (http://fse.foodnara.go.kr/origin/ search_data_list.jsp) 에따르면 Pediococcus 속들중 P. pentosaceus, P. acidilactici, P. halophilus 만이 GRAS 균주로인정받고있다. 전통장류의 biogenic amines 저감화는위생적인면에서중요한과제이다. 장류발효과정은 Bacillus, Aspergillus, 효모, 유산균들간의상호길항적증식관계를유지하며그에따른미생물의대사과정이서로복합적으로얽혀있다. 따라서 biogenic amines의저감화는유산균뿐아니라장류발효의주요미생물인 Bacillus, Aspergillus, 효모들도함께고려해야한다. 이를위해우리는장류주요세균으로서 biogenic amines이저감화된 B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens 균주들을선발해왔다 (Kim et al., 2012a, 2012b). 앞으로 amine 생성이저감화된 Aspergillus와효모균주들을선발한뒤이들균주들을이용하여복합발효를하는경우, biogenic amine이감소된전통장류를얻을수있을것으로예상한다. 현재이유산균들을산업용 Bacillus 균주들과혼합배양하여발효적절성을검증할예정이다. 감사의말 본연구는 2014년농림수산식품부고부가가치식품개발사업 ( 과제번호 311036-3) 에의해수행되었습니다. References BIAMFOOD. 2008. Controlling biogenic amines in traditional food fermentations in regional Europe (Project Reference no. 211441), EU s 7 th Framework Program for Research, EU. Bover-Cid, S. and Holzapfel, W.H. 1999. Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 53, 33 41. Callejón, S., Sendra, R., Ferrer, S., and Pardo, I. 2014. Identification of a novel enzymatic activity from lactic acid bacteria able to degrade biogenic amines in wine. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 185 198. Capozzi, V., Russo, P., Ladero, V., Fernández, M., Fiocco, D., Alvarez, M.A., Grieco, F., and Spano, G. 2012. Biogenic amines degradation by Lactobacillus plantarum: toward a potential application in wine. Front. Microbiol. 3, 122. Cho, T.Y., Han, G.H., Bahn, K.N., Son, Y.W., Jang, M.R., Lee, C.H., Kim, S.H., Kim, D.B., and Kim, S.B. 2006. Evaluation of biogenic amines in Korean commercial fermented foods. Korean J. Food Sci. Technol. 38, 730 737. Coton, M., Romano, A., Spano, G., Ziegler, K., Vetrana, C., Desmarais, C., Lonvaud-Funel, A., Lucas, P., and Coton, E. 2010. Occurrence of biogenic amine-forming lactic acid bacteria in wine and cider. Food Microbiol. 27, 1078 1085. Dobrogosz, W.J. and DeMoss, R.D. 1963. Pentose utilization by Pediococcus pentosaceus. J. Bacteriol. 85, 1356 1364. FAO/WHO (Food and Agriculture Organization of the United Nations/ World Health Organization). 2013. Public health risks of histamine and other biogenic amines from fish and fishery products. Meeting Report. Rome, Italy. Jeong, D.W., Kim, H.R., Jung, G., Han, S., Kim, C.T., and Lee, J.H. 2014. Bacterial community migration in the ripening of doenjang, a traditional Korean fermented soybean food. J. Microbiol. Biotechnol. 24, 648 660.
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