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희애 나
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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 43(2), 328~332(2014) 김치의저장성향상을위한항균활성우수유산균선발 연구노트 최학종 1 김유진 1 이나라 1 박해웅 1 장자영 1 박성희 1 강미란 1 김현주 1 이종희 1 이종훈 2 변유량 3 김태운 1 1 세계김치연구소미래기술연구단 2 경기대학교식품생물공학과 3 ( 주 ) 바이오벤 Selection of Lactic Acid Bacteria with Antibacterial Activity for Extension of Kimchi Shelflife HakJong Choi 1, Yu Jin Kim 1, Na Ra Lee 1, Hae Woong Park 1, Ja Young Jang 1, SungHee Park 1, Miran Kang 1, Hyun Ju Kim 1, JongHee Lee 1, JongHoon Lee 2, YuRyang Pyun 3, and TaeWoon Kim 1 1 Emerging Technology Research Group, World Institute of Kimchi, Gwangju , Korea 2 Dept. of Food Science and Biotechnology, Kyonggi University, Gyeonggi , Korea 3 R&D Div., Biovan Co., Gyeonggi , Korea ABSTRACT A survey was conducted on the isolation of lactic acid bacteria with antibacterial activity to extend kimchi shelflife. Antibacterial activity was tested against bacteria associated with acidification of kimchi, including Lactobacillus, Pediococcus, and Lactobacillus sakei, using agarwell diffusion assay. Two isolates from kimchi were identified as Lactococcus lactis subsp. lactis and Lactobacillus brevis by 16S rrna gene sequence analysis and API 50 CHL assay, and they showed antibacterial effects against indicator strains. The isolates displayed acid tolerance at ph 3.5, salt tolerance in 5% NaCl, and growth at 4 C. These result imply that the selected strains might be used to extend kimchi shelflife as a potential starter. Key words: kimchi, lactic acid bacteria, antibacterial activity, starter 서 김치는절인배추나무, 오이등의주원료에각종양념을혼합하여일정기간발효, 숙성시킨한국의중요한전통발효식품으로우리의식생활에서가장큰비중을차지하는부식이다. 김치는여러가지채소류를이용하여제조되는데이러한채소류에는토양, 공기, 물등으로부터유래된세균, 곰팡이, 효모등의여러미생물들이부착되어있다. 이들미생물들은절임, 세척등의공정을거치면서일부는제거되지만내염성유산균이다수잔존하여김치발효에주도적으로관여하게된다. 김치발효단계에따른유산균군집의변화는김치품질을결정하는중요한인자가된다. Leuconostoc mesenteroides 등과같은 hetero 발효형유산균의증식은김치의관능적특성을향상시켜주지만적숙기이후 homo 발효형유산균의증식은김치의품질을저하시키는것으로알려져 Received 25 July 2013; Accepted 6 January 2014 Corresponding author. korkimchiman@wikim.re.kr, Phone: 론 있다 (14). 최근들어상품김치의소비가점차늘어나고있으나김치의상품화에있어품질균일화나품질유지기한연장문제는여전히해결해야할문제로남아있다. 품질균일화를위해서는품종, 절임방법, 양념혼합, 숙성방법및미생물발효패턴조절등많은변수가조절되어야한다. 이중제조공정관리부분은현재까지축적된산업화노하우와연구데이터가있기에산업현장에서어느정도의품질관리가가능하지만, 미생물발효패턴조절기술은아직산업현장에서현실화된것이미비한실정이다. 또한김치는살균공정없이유통되기때문에유통과정에서도발효가진행되는특성을가지고있어김치의산도가계속증가하여김치의상품성이저하되는문제점을안고있다. 김치의저장성을연장하고자물리적 (5,6), 화학적처리 (7,8) 를이용한김치발효제어와함께종균 (starter) 을이용하여김치발효를제어하려는연구가다수진행되었다 (912). Bacteriocin을생성하는 Leuconostoc citreum GJ7을김치제조에적용한결과발효기간동안지속적인우점을차지함으로써우수한관능적특성과가식기간의연장효과가있었다고보고하였으나저장온도가상품김치의유통온도와다소상이하였다 (11). 또한

2 김치로부터항균활성유산균의선발 329 Lactobacillus 의생육억제를목적으로한기존연구와는달리발효후기에우점하는 Lactobacillus sakei 의생육을저해하는 Leuconostoc 및 Weissella 속균주의선발을시도한연구도있었다 (12). 그러나, sakei 두균주모두에대해생육억제능을나타낸보고는없었다. 본연구에서는기존종균관련연구결과들을고려하여김치의저장성을증가시키기위한일환으로김치발효과정중과도한산생성에관여하는균주를지시균 (indicator strain) 으로선정하고지시균의성장을억제할수있는항균활성을지닌균주를적숙기김치로부터선발한다음, 이들균주중김치환경의특수성을고려한 ph, 염도, 저온의조건에서잘생육할수있는균주를최종적으로선발하여김치종균으로이용하고자하였다. 재료및방법김치로부터배양액의 ph가낮은유산균의분리김치의 ph를과도하게저하시켜김치의품질을손상시키는균주를분리하고자 20 C와 4 C에서각각 4일, 3개월간발효시킨발효후기단계의김치및묵은지시료로부터유산균을분리하였다. 거즈를이용하여김치국물에있는고형분을제거하고순차적으로희석한뒤 MRS(Lactobacilli MRS agar, BD Difco, Sparks, MD, USA) 에 0.2% BPB(bromophenol blue) 지시약 1% 를넣어제조한 MRSBPB 배지에도말하여 30 C에서 48시간동안 BD GasPak EZ(BD Difco) 를사용하여혐기적조건으로배양한다음 colony를분리하였다. 분리된유산균은 MRS broth에순수배양한후 (30 C, 24시간 ) 이들의 ph를측정하여다른균들보다상대적으로배양액의 ph가낮았던균주를김치의과숙에관여하는균주로간주하여지시균으로실험에사용하였다. 그리고김치발효후기의우점종으로알려진 sakei CK0153과 sakei CK0154도경기대로부터분양받아지시균에포함시켜실험에사용하였다. 김치로부터배양액의 ph가높은유산균의분리김치종균으로사용했을때김치의적숙상태를오랫동안유지시키기위한일환으로배양액의 ph가높고항균활성이높은균주를선발하고자적숙기김치로부터유산균들을분리하였다. 김치유산균의분리방법은상기배양액의 ph가낮은유산균의분리방법과동일한방법으로수행하였다. 분리된유산균은 MRS broth에순수배양한후 (30 C, 24시간 ) 배양액의 ph가높은균주들을분리하고이들의항균활성특성을분석하였다. 항균활성시험항균활성시험은 agarwell diffusion assay 방법 (13) 을사용하여김치과숙관련지시균주에대해서분리균주들의생육저해활성을확인하였다. 실험에사용한균주들은 MRS broth에접종한후 30 C에서 18시간동안전배양한후, MRS 액체배지에전배양액 1% 를접종하여 30 C에서 18시간동안배양한후사용하였다. 분리균주의항균활성을측정하기위해 MRS 고체배지에지시균배양액 100 μl를 0.7% (v/v) soft agar에접종하여중층한후구멍을뚫어 well을준비하였다. 분리균주배양액은 0.45 μm membrane filter(sartorius, Frankfurt, Germany) 로제균한뒤 100 μl 를준비된 well에가하였다. 30 C에서 2일간배양하여생육저지환의생성을확인하였으며항균활성의정도는배양후생성된 clear zone의크기를측정하여나타내었다. Genomic DNA 추출, 16S rdna 염기서열분석및 API kit를이용한균주의동정항균활성이우수하여선발된균주는 MRS broth에배양시킨후 genomic DNA extraction kit(intron Biotechnology, Daejeon, Korea) 를사용하여 DNA를추출하였다. 추출된 DNA는 1% agarose gel을이용하여확인하였다. 16S rrna gene을증폭하기위하여추출된 genomic DNA를 template로하여 27F(5'AGAGTTTGATCCTG GCTCAG3', forward), 1492R(5'GGCTACCTTGTT ACGACTT3', reverse) primer를이용하여 PCR을진행하였다 (14). PCR 조건은 95 C에서 1분간 denaturation, 45 C에서 1분간 annealing, 72 C에서 1분 30초간 extension으로 30 cycle을수행하였다. 얻어진 PCR product 는 sequencing을위하여 purification kit(intron Biotechnology, Daejeon, Korea) 를이용하여정제하였다. DNA 염기서열은 ABI PRISM 3700 DNA analyzer(life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 를사용하여염기서열을결정하였으며, 이것을 National Center for Biotechnology Information(NCBI) 의 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) 를이용하여분리균주를동정하였다. 또한, 이들균주의생화학적특성을알아보고자 API 시스템 (API system, biomérieux, La BalmelesGrottes, France) 을이용하여분석하였다. 우선균체를 McFarland 표준용액 No.2(McFarland Standard Solution No.2) 의농도로균질화시킨후, API 50 CHL kit에상기배양액을넣고 30 C에서 48시간동안배양시켜 49종의탄수화물발효패턴을확인하였다. 내산성, 내염성, 저온생육가능성시험항균활성우수균주의김치환경내적응가능성을알아보고자내산성, 내염성, 저온생육가능성을측정하였다. 내산성시험은 ph를 3, 3.5, 4로조절한 MRS배지에전배양한균주를배양액의 1% 농도로접종하여 30 C에서 24시간배양한후생균수를측정하였다 (15). 내염성실험은 MRS 액체배지에 1%, 3%, 5% 의 NaCl을첨가한후전배양한균주배양액을 1% 접종하여 30 C에서 24시간배양한후 NaCl을첨가하지않은대조군의생균수와비교하여생존율을계산

3 330 최학종 김유진 이나라 박해웅 장자영 박성희 강미란 김현주 이종희 이종훈 변유량 김태운 하였다. 저온생육가능성은선발한균주를 MRS 액체배지에접종하여 4 C에서배양하며 1일간격으로 600 nm에서흡광도를측정하며저온생육성을살펴보았다. 결과및고찰김치로부터배양액의 ph가낮은유산균의선발발효후기단계의김치및묵은지에서분리한유산균들중에서배양액의 ph가낮은균주를분리하고자 MRSBPB 고체배지를이용하여 100여개의균주를분리한다음, 이들균주를 MRS broth에순수배양한후 ph를측정하여다른균들보다상대적으로배양액의 ph가낮았던 6균주 (ph 3.7~3.9) 를김치의과숙에관여하는균주로간주하여지시균 (indicator strain) 으로선발하였다. 이들균주들은 16S rdna 분석을통해서동정한결과 2010, A1, Pediococcus A2, A5, A6, B11로각각동정이되었다. 김치발효후기에검출되는 Lactobacillus 속중에서많은수가 으로동정되어 homo 발효형유산균인 은산패균으로인식되고있다 (11). 본연구에서분리 동정된 균들의경우배양액의 ph는 3.9~4.0 정도를나타내어 ph 을나타내었던 균주들보다는다소높았지만저온에서발효시킨김치적숙기의 ph가 4.2~4.5인점을감안하다면 homo 발효형유산균인이들 균들도김치를과도하게시어지게하는데어느정도기여를할것으로생각되었다. 지시균주에대한생육억제능을지닌균주선발및동정적숙기김치에서분리한유산균중에서배양액의 ph가상대적으로높았던 (ph 4.3 이상 ) 200여개의균주들중지시균 2010, A1, A2, A5, A6, B11, sakei CK0153, sakei CK0154에대해서항균활성을조사한결과두균주가지시균에대해서우수한항균활성을나타냄으로써최종적으로선발하여동정을수행하였다 (Fig. 1, Table 1). 지시균에대한생육억제능이우수했던두균주에대해 16S rdna 염기서열분석과 API kit를이용하여동정한결과 (Table 2), Lactococcus lactis subsp. lactis, brevis로동정이되어, brevis 로각각명명하였다. 김치발효관련미생물에대한연구가 16S rdna 염기서열을이용한계통발생학적분류가일반화되고분자생물학적방법론을적용한배양비의존적김치미생물군집연구가진행됨에따라 Leuconostoc 속뿐만아니라 Lactobacillus 속유산균이김치발효에중요한역할을하는것으로알려져있다 (16). 또한 Lactococcus lactis subsp. lactis가생성해내는 nisin은소규모의아미노산으로구성된단백질물질이며, 높은온도에서나낮은 ph에서세균을억제하는항균활성을보이고인체에도무해하기때문에식품보존제로서활용되고있다 (17,18). 이들선발균주들은, sakei, 균주에대해생육억제능을나타냄으로써기존에보고된김치종균들에비해우수한것으로판단되었다. A B A B A Fig. 1. Antibacterial activity of Lactococcus lactis subsp. lactis (A) and Lactobacillus brevis (B) against indicators by agarwell diffusion assay. Indicator strains: (1), A1; (2), A2; (3), sakei Table 1. Antimicrobial activity of isolates from kimchi Isolates A1 A2 A5 Indicator strains A6 B sakei 0153 sakei ) brevis Activity was expressed as the diameter of inhibition zone against each indicator strain. 1) Degree clarity of clear zone by growth inhibition:, strong inhibition;, weak inhibition.

4 김치로부터항균활성유산균의선발 331 Table 2. Characteristics of carbohydrates fermentation patterns of isolates Carbohydrate Lc. lactis (KCTC 3769) brevis brevis (KCCM 40399) Carbohydrate Lc. lactis (KCTC 3769) brevis brevis (KCCM 40399) Control Glycerol Erythritol DArabinose LArabinose Ribose DXylose LXylose Adonitol Methylβxyloside DGalactose DGlucose DFructose DMannose LSorbose Rhamnose Dulcitol Inositol Mannitol Sorbitol EthylαDmannoside MethylαDglucoside NAcetylglucosamine Amygdaline Arbutine Esculine Salicine Cellobiose Maltose Lactose Melibiose Saccharose Trehalose Inulin Melezitose DRaffinose Amidon Glycogene Xylitol βgentiobiose DTuranose DLyxose DTagatose DFucose LFucose DArabitol LArabitol Gluconate 2Ketogluconate 5Ketogluconate : positive reaction, : negative reaction. 항균활성우수균주의내산성, 내염성, 저온생육가능특성분석본연구에서선발된항균활성이우수한균주가김치종균으로사용되기위해서는김치발효환경에잘적응해야함으로이들균주의내산성, 내염성, 저온생육가능성을분석해보았다. 식품공전에따르면냉장보관제품의보존온도는 0~10 C로되어있으며, 보통상품김치의유통온도는 10 C 부근으로알려져있다. 또한이온도에서발효가완료된김치의경우 ph가 4.0 부근에도달하였으며, 염도는일반적으로 2.5~3% 를나타내었다 (19). 분리균주의특성을살펴본결과, 내산성의경우 ph 3.5에서 는 70.8%, brevis는 91.5% 의생존율을나타내었다. 내염성의경우 3% NaCl에서 는 108.5%, brevis는 103.1% 의생존율을나타내었다. 한편저온생육성의경우 균주가 brevis에비해다소느린증식율을나타내었지만두균주모두증식능이있는것으로판단되었다. 최종선발된, brevis 두균주모두 ph 3.5에서의내산성, 3% NaCl에서의내염성, 4 C에서의생육가능성을나타내었다. Lee와 Lee(12) 는김치종균이갖추어야할조건으로김치발효초기및적숙기의우점종이어야하며, 산생성량이적고청량감을부여하는 hetero 발효형유산균, 내산성보유, 김치발효후기에우점하는 homo 발효형 Lactobacillus 속유산균에대해생육억제능을지닌균주가적합 하다고하였는데, 본연구에서선발된항균활성보유균주들이위의요건들을일부갖추고있는것으로나타났다. 향후본연구에서선발된균주에대하여생육저해활성물질및작용기작구명, 타균주와혼합배양시길항작용여부, 안전성시험등을거쳐김치적용실험을진행할예정이다. 요약김치는살균공정없이유통되기때문에유통과정에서도발효가진행되는특성을가지고있어김치의산도가계속증가하여김치의상품성이저하되는문제점을안고있다. 본연구에서는김치발효과정중과도한산생성에관여하는균주선발과더불어이들균주의성장을억제할수있는항균활성을지닌균주를김치로부터선발하고자하였다. 우선김치과숙관련균주를선발한결과 2010, A1, A2, A5, A6, B11로동정이되었다. 이들균주를억제할수있는항균활성을지닌균주를적숙기김치로부터선발한결과, brevis 두균주가항균활성이우수한것으로나타났다. 이들균주의김치종균으로서의적용가능성을살펴본결과모든균주가 ph 3.5에서의내산성, 3% NaCl에서의내염성, 4 C에서의생육가능성을나타내었다.

5 332 최학종 김유진 이나라 박해웅 장자영 박성희 강미란 김현주 이종희 이종훈 변유량 김태운 감사의글 본연구는농림축산식품부고부가식품기술개발사업연구비지원에의해이루어진것입니다 (# ). REFERENCES 1. Lee CW, Ko CY, Ha DM Microbial changes of the lactic acid bacteria during Kimchi fermentation and identification of the isolates. Korean J Appl Microbiol Biotechnol 20: Lim CR, Park HK, Han HU Reevaluation of isolation and identification of grampositive bacteria in Kimchi. Korean J Microbiol 27: Mheen TI, Kwon TW Effect of temperature and salt concentration on Kimchi fermentation. Korean J Food Sci Technol 16: So MH, Kim YB Identification of psychrotrophic lactic acid bacteria isolated from Kimchi. Korean J Food Sci Technol 27: Park JG, Kim JH, Park JN, Kim YD, Kim WG, Lee JW, Hwang HJ, Byun MW The effect of irradiation temperature on the quality improvement of Kimchi, Korean fermented vegetables, for its shelf stability. Radiat Phys Chem 77: Shon KH, Lee HJ Effect of high pressure treatment on the quality and storage of kimchi. Int J Food Sci Technol 33: Han JS, Kang J Retardation of Kimchi fermentation by addition of gluconoδlacton. J Korean Soc Food Sci Nutr 33: Kim DH, Hahn YS Effect of addition of ethanol and organic acids on the quality of Mulkimchi. J East Asian Soc Dietary Life 13: Kim YH, Kim HZ, Kim JY, Choi TB, Kang SM Strain improvement of Leuconostoc mesenteroides as a acid resistant mutant and effect on Kimchi fermentation as a starter. Korean J Appl Microbiol 33: Moon GS, Kang CH, Pyun YR, Kim WJ Isolation, identification, and characterization of a bacteriocinproducing Enterococcus sp. from Kimchi and its application to Kimchi fermentation. J Microbiol Biotechnol 14: Chang JY, Chang HC Improvement in the quality and shelf life of Kimchi by fermentation with the induced bacteriocinproducing strain, Leuconostoc citreum GJ7 as a starter. J Food Sci 75: M103M Lee KH, Lee JH Isolation of Leuconostoc and Weissella species inhibiting the growth of Lactobacillus sakei from Kimchi. Korean J Microbiol Biotechnol 39: Holder IA, Boyce ST Agar well diffusion assay testing of bacterial susceptibility to various antimicrobials in concentrations nontoxic for human cells in culture. Burns 20: Lane DJ S23S rrna sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. Stackebrandt E, Goodfellow M, eds. Wiley, New York, NY, USA. p Park SH, Yang S, Lee JH, Kang M Selection of phytatedegrading lactic acid bacteria from Kimchi and reaction properties in brown rice. J Korean Soc Food Sci Nutr 42: Cho YR, Chang JY, Chang HC Production of γaminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from Kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells. J Microbiol Biotechnol 17: Taylor TM, Davidson PM, Zhong Q Extraction of nisin from a 2.5% commercial nisin product using methanol and ethanol solutions. J Food Prot 70: Park H, Khang Y Simple and rapid extraction of a bacteriocin produced by Streptococcus parauberis Z49 from fermented cultures. Korean J Microbiology 46: Chang JY, Choi YR, Chang HC Change in the microbial profiles of commercial Kimchi during fermentation. Korean J Food Preserv 18:

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386-390.hwp 386 HANYANG MEDICAL REVIEWS Vol. 29 No. 4, 2009 우리나라 미숙아의 통계와 의료비용 Statistics and Medical Cost of Preterm in Korea 윤혜선 을지대학교 노원을지병원 소아청소년과학교실 Hye Sun Yoon, M.D., Ph.D., Department of Pediatrics, Nowon