15_HM hwp

Transcription

1 Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 3, pp pissn DOI eissn Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea Article 생선내장으로부터분리된프로바이오틱유산균에의한히스타민생산균의제어 임은서 * 이남걸동명대학교식품영양학과 Control of histamine-forming bacteria by probiotic lactic acid bacteria isolated from fish intestine Eun-Seo Lim* and Nahm-Gull Lee Department of Food Science & Nutrition, Tongmyong University, Busan 48520, Republic of Korea (Received July 18, 2016; Revised September 12, 2016; Accepted September 13, 2016) ABSTRACT: In this study, we examined in vitro the potential probiotic properties of lactic acid bacteria (LAB) obtained from the fish intestine and their ability to degrade histamine through the production of diamine oxidase (DAO) enzymes and bacteriocin. Among 97 LAB strains isolated from the intestine of croaker, flatfish, pollack, and rockfish, CIL08, CIL16, FIL20, FIL31, PIL45, PIL49, PIL52, and RIL60 isolates exhibited excellent survival rates under simulated gastrointestinal tract conditions, high adhesion ability to HT-29 epithelial cells, and resistance to the antibiotics such as amoxicillin, ampicillin, erythromycin, penicillin G, streptomycin, tetracycline, or vancomycin. In addition, these strains did not produce histamine in decarboxylating broth containing histidine. In particular, 4 strains (CIL08, FIL20, PIL52, and RIL60) that may produce DAO were significantly able to degrade histamine. The bacteriocins produced by FIL20, FIL31, and PIL52 LAB inhibited the growth and histamine production of Enterococcus aerogenes CIH05, Serratia marcescens CIH09, Enterococcus faecalis FIH11, Pediococcus halophilus FIH15, Lactobacillus sakei PIH16, Enterococcus faecium PIH19, Leuconostoc mesenteroides RIH25, or Aeromonas hydrophilia RIH28. Histamine-producing strains isolated from fish intestine were found to reduce histamine accumulation during co-culture with CIL08, FIL20, PIL52, and RIL60 LAB showing histamine degradation or bacteriocin production ability. The probiotic strains preventing histamine formation were identified as Pediococcus pentosaceus CIL08, Lactobacillus plantarum FIL20, Lactobacillus paracasei FIL31, Lactobacillus sakei PIL52, and Leuconostoc mesenteroides RIL60 with high similarity based on 16S rrna gene sequencing. Key words: bacteriocin, histamine, lactic acid bacteria, probiotic 바이오제닉아민 (biogenic amine) 은알데히드나케톤의아미노화와아미노기전이화및아미노산의탈탄산반응에의해주로형성되는염기성질소화합물이다. 이는저분자의유기염기로서화학구조에따라지방족화합물 (putrescine, cadaverine, spermine, spermidine), 방향족화합물 (tyramine, phenylethylamine) 및헤테로고리화합물 (histamine, tryptamine) 등으로분류된다. 바이오제닉아민은어육이나식육가공품, 유제품, 와인, 맥주, 과일뿐만아니라땅콩이나초콜릿등다양한식품에서검출되는데이는식품내에함유된 Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Escherichia, Proteus, *For correspondence. limsm020@tu.ac.kr; Tel.: ; Fax: Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Photobacterium, Lactobacillus, Pediococcus 및 Streptococcus 등의미생물이나동식물의대사과정에의해주로합성된다 (Santos, 1996). 적당한양의히스타민, 트립타민, 베타-페닐에틸아민및티라민등은향정신성약물이나혈관수축효과등으로인체에중요한생리학적효과를나타내는활성아민으로작용하지만, 식품내에함유된과량의일부아민은고혈압, 두통, 설사, 발진, 염증등을비롯하여히스타민중독이나티라민독성과같은식이성질환의원인이되기도한다. 게다가유해아민은암을유발하는전구체로서알려져있다 (Shalaby, 1996). 바이오제닉아민중에서히스타민은가장대표적인활성아민으로서신선도가높은어류내에는히스타민의함량이낮

2 유산균에의한히스타민생성균의제어 353 으나, 보관하는동안세균의증식위험이높은온도에노출된경우세균이생산한히스티딘탈탄산효소에의해히스타민의농도는현저하게증가되고, 이는단순가열처리에의해제거되기어려워이로인한식중독발생위험이높아지게된다 (Visciano et al., 2012). 식품내히스타민의함량을감소시키기위해신선한원료의사용, 위생적인제조공정, 온도조절, 진공포장, 초고압, 방사선조사, 식품첨가물이용이외에발효시아민을생성하지않는스타터및아민산화효소 (amines oxidase, AO) 를생산하는미생물의활용등이보고되고있다 (Naila et al., 2010). 유해아민은 AO에의해산화적탈아미노화반응 (R-CH 2-NH-R + O 2 + H 2O R-CHO + H 2N-R + H 2O 2) 을통해분해되는데이러한분해효소는일부세균이생산한다 (Murooka et al., 1979). Micrococcus 속이나 Brevibacterium linens 등식품발효에관여하는미생물은히스타민과티라민등을분해할수있고, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei, Lactobacillus pentosus 및 Pediococcus acidilactici 등의유산균들도히스타민을분해하는것으로알려져있다 (Leuschner et al., 1998). Kongkiattikajorn (2015) 의보고에따르면, 발효어육소시지제조시유산균발효스타터를사용하지않은경우히스타민, 트립타민, 페닐에틸아민및티라민등유해아민의함량이매우높았으나, L. sakei KM5474와 L. plantarum KM1450 균주를이용하여발효시킨경우유해아민양이유의하게감소되었다고하였다. 발효식품으로부터분리된 Lactobacillus sp. 와 Pediococcus sp. 는 AO 활성으로인해유해아민의함량을감소시켰고 (Garcia-Ruiz et al., 2011), nisin Z와 lacticin 481을생산하는 Lactococcus lactis subsp. lactis VR84와 EG49는히스타민생성균의증식억제및그에따른아민축적량을감소시키는데효과적인것으로알려져있다 (Tabanelli et al., 2014). 유산균은발효과정동안당을분해하여유산을비롯하여과산화수소, 디아세틸, 단쇄지방산및박테리오신등다양한항균물질을생산하여유해균을제어함으로써향미개선및품질향상등의효과를발휘한다. 유산균의대사산물은인체에무해하고안전성이확보되어미 FDA로부터 generally recognized as safe (GRAS) 로서승인받았고, qualified presumption of safety (QPS) 의필수조건을충족하여가공식품의보존성향상을위한천연첨가물로서이용되고있다. 장기능개선을비롯하여다양한생리활성이밝혀짐에따라유산균은프로바이오틱균주로널리알려져있으며, 부패균이나식중독균제어에효과적이기때문에미생물의오염도가높고선도저하가빠른수산식품의저장기간연장을위한생물학적보존제로서활용가치가높다 (Ghanbari et al., 2013). 따라서본연구에서는생선내장으로부터분리된유산균중프로바이오틱균주로서적합하고히스타민분해능이있는균주를선발하여히스타민생성균에대한제어효과를확인하였다. 재료및방법 사용균주분리동정생선내장 (25 g) 을균질화한시료용액 1 ml를채취하여 Brain Heart Infusion (BHI) agar (Difco) 배지상에 37 C, 48시간평판배양하여얻은집락을순수분리배양한다음 BHI agar 사면배지에계대배양하였다. BHI broth 상에서준비된배양액은히스티딘이첨가된탈카르복시화배지상에서히스타민생성능을조사하여양성반응을나타낸균주를대상으로 BHI agar 사면배지에계대배양후그람염색, 세포형태, 포자형성능, 카탈라아제및옥시다아제생성능을확인하였다. 또한 UNI-L (5 -AGA- GTTTGATCATGGCTCAG-3 ) 와 UNI-R (Escherichia coli ; 5 -GTGTGACGGGC GGTGTGTAC-3 ) primer 를사용하여 16S rrna 염기서열을분석하여동정하였다. 즉, 분리균주는 BHI broth에접종하여 37 C에서 24시간배양한배양액은원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여세포를회수한다음 PBS (ph 7.0) 로 2회세척하고 20% sodium dodecyl sulfate (SDS) 로용해시켰다. 용균된세포현탁액은 85 C에서약 20분간가열한다음원심분리 (13,000 g, 5분, 4 C) 하여세포잔해물을제거하고상등액으로부터얻은 DNA는 70% 알코올을처리하여침전시켜중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 을위한 template DNA로사용하였다. PCR반응혼합물 [10 mm Tris-HCl; ph 8.3, 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 20 pmol primer, 0.2 mm deoxynulcleotide triphosphatese, 0.5 U Taq DNA polymerase] 과 template DNA (10 ng) 는 PCR Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratoreies Ltd.) 를이용하여 DNA를증폭 (94 C에서 4분간 initial denaturation, 94 C에서 30 초간 denaturation, 55 C에서 30초간 annealing, 72 C에서 1분간 extension, 72 C에서 7분간 final extension, 35 cycle) 시켰다. PCR 산물은전기영동 (1.5% agarose gel) 하여밴드를확인하고 QIA quick PCR purification kit (Qiagen) 로정제하였다. 정제산물은 DNA sequencer (ABI Prism 3730 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystem) 로분석하고난후 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, 의 Basic Local Align Search Tool (BLAST) 프로그램을활용하여염기서열의상동성을확 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

3 354 Lim and Lee 인하였다 (Chen et al., 2008). 한편, 유산균분리를위해균질화한시료용액 1 ml를채취하여 1% (w/v) CaCO 3 가첨가된 Lactobacilli MRS agar (BD Difco Co.) 평판배지에접종하여호기적인조건하에서 37 C, 48시간배양한후투명환을생성하는집락만을유산균으로간주하고이를순수분리배양하여 MRS agar 사면배지에계대배양하였다. 분리된유산균주를대상으로프로바이오틱균주로서의적합하고히스타민분해능및히스타민생성균에대한박테리오신의항균활성을나타내는균주를최종선발하여동정하였다. 즉, 형태학적및배양학적특성과 API 50 CHL system (biomérieux) 으로당분해능을조사하였고, DNA를추출정제하여 27F (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 와 1492R (E. coli numbering ; 5 -GGTTACCTTGTT ACGACTT-3 ) primer으로 DNA를증폭 (97 C에서 5분간 initial denaturation, 94 C에서 1분간 denaturation, 54 C에서 30초간 annealing, 72 C에서 1분간 extension, 72 C에서 4분간 final extension, 30 cycle) 시킨후 DNA sequencer (ABI Prism 3730 Avant Genetic Analyzer, Applied Biosystems) 로분석하여염기서열의상동성 (homology) 을확인하였다 (Tajabadi et al., 2013). 프로바이오틱균주적합성평가인공소화액하에서의생존율 : 실험균주의위액및담즙액에대한저항성은 Grimoud 등 (2010) 의방법을일부변형하여조사하였으며, MRS broth (100 ml) 에전배양액 (1%, v/v) 을접종하고호기적인조건하에서 37 C, 24시간배양한후배양액을원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여세포만을모으고, PBS (ph 7.0) 로 2회세척하고난다음 CFU/ml로세포수를조정하였다. PBS에 NaCl (125 mm), KCl (7 mm), NaHCO 3 (45 mm) 및 pepsin (1 mg/ml; Sigma-Aldrich) 을첨가한다음 ph 2.5로조정하여인공위액을제조한다음유산균을접종하고 37 C, 2시간배양하였다. 무균적으로배양액 (1 ml) 을채취하고 MRS agar 상에서표준한천평판배양법으로잔존하는생균수를측정하였다. 한편, PBS (ph 8.0) 에 oxgall (0.5%, Sigma-Aldrich) 를첨가하여인공담즙액을제조한다음유산균세포현탁액 ( CFU/ml) 을접종하고 37 C, 3시간배양한다음 MRS agar 평판배지상에서생균수를측정하였다. HT-29 세포에대한부착능 : 인체유래상피세포에대한실험균주의부착능은 Osmanagaoglu 등 (2010) 의방법을일부변형하여측정하였다. HT-29 는 Korean Cell Line Bank (KCLB) 로부터분양받은다음 56 C, 30분간가열처리한 10% (v/v) fetal bovine serum (FSB, Gibco), 2 mm L-glutamine, 1 mm sodium pyruvate, 100 U/ml penicillin 및 0.1 mg/ml streptomycin 을첨가한 Dulbecco s modified Eagle s minimal essential medium (DMEM, Sigma-Aldrich) 에접종하고 37 C, 5% CO 2 조건하에서배양하였다. FBS 와항생제를첨가하지않은 DMEM 배지는 6-well culture plate (Falcon, Beckton Dickinson) 에분주하고 monolayer를형성한 HT-29 세포는 PBS (ph 7.0) 로세척한다음동물세포주 ( cells/ml) 를 plate 내에접종하고 37 C, 5% CO 2 조건하에서 2시간동안전배양하였다. 한편, MRS broth에서 37 C, 24시간동안배양한유산균배양액을원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여세포를모은뒤 PBS (ph 7.0) 로세척한다음유산균수 ( CFU/ml) 를조정하고 HT-29 세포가있는 well에접종한후 37 C, 2시간동안배양하였다. 배양용배지와부착되지않은동물세포를제거하고난다음 well 안을 PBS (ph 7.0) 로 2회세척하고 2% formalin 으로 overnight 고정하고나서 2% eosin Y로염색한후에 1% acetic acid로 2회세척하였다. 그런다음 microplate reader (BioTek, Inc.) 를이용하여 570 nm에서흡광도를측정하여 HT-29 세포에대한유산균의부착능을측정하였다. 항생제에대한내성 : 실험균주는 MRS broth에접종한다음 37 C에서 24시간배양한후배양액을원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여세포를모으고 PBS (ph 7.0) 로 2회세척하여동일한 buffer에세균세포 ( CFU/ml) 를현탁시켰다. 50 C 정도로식힌 MRS agar [agar 1.0% (v/v), 10 ml] 에세균세포현탁액 (1%, v/v) 을접종하고혼합한후 MRS agar (10 ml) 평판배지위에중층하여응고시켰다. 응고된평판배지위에직경 8 mm인 well을만들고 stock solution (1 mg/ml) 으로부터 2배연속희석한항생제 (vancomycin, erythromycin, tetracycline, ampicillin, amoxicillin, streptomycin, penicillin G, Sigma- Aldrich) 용액을각 well에 50 μl씩 loading하였다. 37 C에서 24시간배양한후 well 주변에저해환을생성한최소농도를측정하여항생제에대한 minimum inhibitory concentration (MIC) 를구하였다 (Musikasang et al., 2012). 히스타민생성능 : 실험균주의히스타민생성능은히스티딘을첨가한탈카르복시화배지 (decarboxylating medium) 상에서측정하였다 (Bover-Cid and Holzapfel, 1999). 즉, 전구체아미노산 (L-histidine monohydrochloride monohydrate, Sigma- Aldrich, 1 g/l) 과 pyridoxal 5-phosphate (1 mg/l) 가첨가된탈카르복시화액체배지 (decarboxylating broth) 에실험균주를접종하고 35 C에서 48시간동안 5회전배양하였다. Microtiter plate의각 well에유산균전배양액, 음성대조군 (Pseudomonas 미생물학회지제 52 권제 3 호

4 유산균에의한히스타민생성균의제어 355 aeruginosa BK19) 혹은양성대조군 (Enterococcus faecalis ATCC 29212) 의배양액 (50 μl) 과히스티딘 (2%, w/v) 이첨가된탈카르복시화액체배지 (100 μl) 를분주하고난후 35 C, 72 시간동안혐기적인조건 (Anoxomat system, MART Co.) 하에서배양한다음자색으로변한경우양성으로판정하였다. 프로바이오틱유산균의히스타민분해능측정프로바이오틱유산균의히스타민분해능은 Lee 등 (2015) 의방법을일부변형하여측정하였다. 즉, 실험균주는 MRS broth에접종하여호기적인조건하에서 37 C, 24시간동안배양한후원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하였다. 그런다음세포만을모아 PBS (ph 7.0) 로 2회세척하고세포현탁액 (1 ml, CFU/ml) 은 histamine broth (glucose 0.1%, yeast extract 0.2%, NaCl 0.5%, histamine dihydrochloride 0.1%, K 2HPO %; ph 7.0) 10 ml에접종하고난다음 35 C, 5일간배양하여얻은배양액 (0.1 ml) 은 histamine agar (2%, w/v) 평판배지에도말접종하여 30 C, 5일간배양하였다. 평판배지위에자란독립된집락을선택하여 trypticase soy agar (TSA, Difco) 상에서순수분리하고히스타민분해능을조사하기위해 histamine dihydrochloride (h-tsb, 50 ppm) 이첨가된 trypticase soy broth (TSB) 에접종하고 35 C에서 24시간동안배양하였다. 배양액내에잔존하는히스타민의함량은 Eerola 등 (1993) 과 Mah 등 (2003) 의방법을일부변형하여 high pressure liquid chromatography (HPLC, Shimadzu) 로측정하였다. 즉, 히스타민표준용액 (500 ppm) 및세포배양액 1 ml에 0.4 M perchloric acid (Merck) 9 ml를가하고진탕혼합한후원심분리 (3,000 g, 10분 ) 하여얻은상등액은 Whatman paper No. 1으로여과하였다. 시료용액 (1 ml) 에 2 N sodium hydroxide (200 μl) 와 sodium bicarbonate 포화용액 (300 μl) 을가하고 acetone에용해시킨 dansyl chloride (Sigma-Aldrich, 10 mg/ml) 2 ml을첨가하여 40 C에서 45분간배양하고난다음잔존하는 dansyl chloride는 25% ammonium hydroxide 100 μl를가하여제거하였다. 상온에서 30분방치한후추출물에 acetonitrile을가하여총량 5 ml로맞춘다음원심분리 (2,500 g, 5분 ) 하여얻은상등액을 0.22 μm membrane filter (Millipore Corp.) 로여과하여 dansyl 유도체를준비하였다. 히스타민함량분석을위해 Nova-Pak C 18 컬럼 ( mm, Waters, Milford) 을사용하였고, 이동상 ammonium acetate (0.1 M, solvent A) 와 acetonitrile (solvent B) 의유속은 1 ml/min, 시료는 20 μl로주입하였으며 254 nm에서흡광도를측정하였다. 히스타민생성균에대한박테리오신의항균활성측정 MRS broth로부터얻은유산균배양상등액내유산의영향을배제하기위해 6 N NaOH를이용하여 ph 6.5로조정하고, 과산화수소를제거하기위해 catalase (Sigma-Aldrich, 1 mg/ml) 를처리한다음황산암모늄 [60% (w/v)] 을첨가하여단백질침전을위해교반 (4 C, overnight) 하였다. 원심분리 (12,000 g, 30분, 4 C) 해서침전물만을모으고 20 mm PBS (ph 6.5) 에현탁시킨다음 molecular weight cut-off가 1,000 Da인투석막 (Spectrum Medical Industries, Inc.) 을이용하여 4 C, 24시간동안투석해서조박테리오신용액을조제하였다. 생선내장으로부터분리된히스타민생산균에대한박테리오신용액의항균활성은 microtiter plate method (Holo et al., 1991) 에따라측정하였다. 즉, 히스타민생성균주는 BHI broth에접종하여 37 C, 24시간배양한후원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하여세포를모으고 PBS (ph 7.0) 로 2회세척한다음세균세포수를 CFU/ml로조정하였다. Plate well에 BHI broth를분주하고이진희석법으로농도를맞춘박테리오신용액과히스타민생성균주의세포현탁액 1% (v/v) 를첨가한다음 37 C에서 24시간배양한후 microplate reader를이용하여흡광도 (600 nm) 를측정하였다. 박테리오신활성 (arbitrary units, AU) 은대조구 (PBS, ph 7.0 처리구 ) 의혼탁도에비해 50% 저해된최대희석배수의역수로표시하였다. 박테리오신에의한히스타민생성억제효과측정생선내장으로부터분리된히스타민생성균에대한프로바이오틱유산균이생산한박테리오신의영향은 Shakila 등 (1996) 의방법을일부변형하여측정하였다. 즉, % pyridoxal-hcl (Sigma-Aldrich) 와 0.5% L-histidine hydrochloride monohydrate 를혼합한 TSB (h-tsb) 에히스타민생성균을접종하고 35 C 에서 24시간배양하였다. 배양액 (1 ml, 10 8 CFU/ml) 을채취하여박테리오신용액 (200 AU/ml) 을첨가한 h-tsb (5 ml) 에접종하고 35 C에서 24시간배양하였다. 배양직후배양액을채취하여원심분리 (7,000 g, 10분, 4 C) 하고얻은상등액은 0.22 μm membrane filter로여과한후앞서언급한방법에따라 HPLC를사용하여히스타민함량을측정하였다. 유산균과의혼합배양에의한히스타민생성량변화측정히스타민생성억제능이있는유산균과생선내장으로부터분리된히스타민생성균을혼합배양한후히스타민함량변화를측정하였다. 즉, BHI broth와 MRS broth 배양액으로부터각각얻은히스타민생성균과프로바이오틱유산균의세포 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

5 356 Lim and Lee 현탁액 ( CFU/ml) 1% (v/v) 씩 BHI broth에접종한다음 37 C에서 24시간배양하여얻은배양액으로부터잔존하는히스타민함량을 HPLC로측정하였다. 통계처리항목별총 3회실험하여얻은측정값은평균 ± 표준편차로나타내었으며, SPSS 프로그램 (Ver. 12.0) 의 paired t-test를통해대조구와의유의적인차이 (P<0.05) 를검증하였다. 결과및고찰 프로바이오틱균주적합성평가조기, 가자미, 명태및우럭내장으로부터분리된유산균 97 균주중에서프로바이오틱균주로서적합하다고추정되는 8 균주를대상으로인공소화액에대한저항성, 인체상피세포에대한부착능, 항생제에대한감수성및히스타민생성능등에관한결과는 Table 1과같다. ph 2.5로조정한인공위액에서 2시간배양했을때 FIL31과 PIL52는초기균수 (10 8 CFU/ml) 로부터약 1 log cycle 이하만감소되었고, 그이외의균주도 10 6 CFU/ml 이상을유지하였다. 게다가 oxgall 0.5% 하에서 3 시간배양한후 CIL08, FIL20 및 FIL31은 10 8 CFU/ml을유지하였고, CIL16, PIL45, PIL49 및 RIL60은 10 7 CFU/ml 이상생존하였으나, PIL52는다른균주들에비해담즙액하에서저항성이다소낮았다. 분리된 10균주의 HT-29 세포에대한부착능은 % 로균주에따라다소차이가있었으나, 특히, CIL08, FIL20 및 PIL45는 20% 이상의부착능을나타내었다. 항생제에대한내성은균주에따라큰차이를보였는데, CIL08 균주는 amoxicillin, streptomycin 및 vancomycin, CIL16 균주는 ampicillin, penicillin G 및 streptomycin, FIL20 균주는 penicillin G, tetracycline, vancomycin, FIL31 균주는 ampicillin, erythromycin, penicillin G, streptomycin 및 vancomycin, PIL45 균주는 amoxicillin 및 etrythromycin, PIL49 균주는 erythromycin, tetracycline 및 vancomycin, PIL52 균주는 ampicillin, penicillin G, tetracycline 및 vancomycin, RIL60 균주는 amoxicillin, ampicillin 및 vancomycin 등에대한저항성이강한것으로나타났다. 한편, 선발된 8종의유산균은모두히스타민생성능이없는것으로확인되었다. 프로바이오틱균주선발기준으로는소화액에대한강한저항성이있어야하고장관상피세포에부착하여항균물질을생산함으로써장내유해미생물의증식을억제할수있어야만하는데본연구에서선발된 8종은이러한조건을 in vitro 상에서충족하였다. 훈제연어로부터분리된 Lactobacillus curvatus ET06, ET30 및 ET31, Lactobacillus fermentum ET35, Lactobacillus delbrueckii ET32, P. acidilactici ET34, Enterococcus faecium ET05, ET12 및 ET 88은인공소화기관내에서저항성이강하고 Listeria monocytogenes에대한박테리오신을생산하는것으로확인되었으며, Caco-2 세포에대한부착능도상당히높아프로바이오틱균주로적합하다고알려져있다 (Todorov et al., 2011). 생선젓갈에서분리한 L. plantarum DHK10은낮은 ph와 0.5% oxgall 하에서높은생존율을보이고, 항균물질을생산하여유해미생물제어능력이있다고보고된바있다 (Cho et al., 2006). 해산어로부터분리된 84종의유산균 (Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, L. plantarum, Lactobacillus pentosus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis 및 Carnobacterium piscicola) 들은 oxacillin, cefoxitin, ceftriaxone, streptomycin, tobramycin, neomycin, oleandomycin, oxolinic acid 등의항생제에대한저항성이강한반면, vancomycin, penicillin G 및 furans 등에는민감한것으로보고되었다 (Chahad et al., 2012). Table 1. Acid and bile tolerance, adhesion ability to HT-29 cell, antibiotic resistance, and histamine production of LAB strains obtained from fish intestine Strain Origin Viable cell counts (CFU/ml) Adhesion ability to Gastric juice Intestinal juice HT-29 cell (%) Antibiotic resistance (MIC, μg/ml) Amoxicillin Ampicillin Erythromycin Penicillin G Streptomycin Tetracycline Vancomycin CIL08 Croaker 5.3 ± ± ± < 2 < CIL16 Croaker 1.9 ± ± ± 4.6 < FIL20 Flatfish 8.4 ± ± ± < FIL31 Flatfish 7.1 ± ± ± 1.9 < PIL45 Pollack 8.5 ± ± ± < 2 < PIL49 Pollack 6.6 ± ± ± < PIL52 Pollack 5.1 ± ± ± RIL60 Rockfish 7.4 ± ± ± < 2 8 < Histamine production 미생물학회지제 52 권제 3 호

6 유산균에의한히스타민생성균의제어 357 가물치내장으로부터분리된 L. mesenteroides sp. mesenteroides 는 ph 2.0에서 2시간배양후활성을잃었으나, ph 3.0 이상에서는활성을유지하였으며, bile salts 0.5% 하에서는 8시간동안에도생존하였다. 또한 streptomycin에대해선강한저항성을보였고, amoxicillin과 kanamycin에대해서도비교적저항할수있었으나, gentamycin, tetracycline, chloramphenicol 및 ampicillin에대해선감수성이높게나타났다 (Allameh et al., 2012). Balcázar 등 (2008) 은무지개송어의표피와내장으로부터분리한유산균 (L. lactis, L. plantarum, L. fermentum) 들은생선내장점막상피세포에약 % 의높은부착능을보였고, ph 2.5에서 1.5시간노출되었을때에도생존하였으며, 고농도의담즙하에서도강한저항성을나타내었다고하였다. 본연구에서분리된유산균은기존에보고된유산균들과배양조건과균종에따라활성의차이는있지만, 인공위액과담즙액에대한저항성과상피세포에대한부착능및항생제에대한내성이비교적높은것으로확인되었다. Straub 등 (1995) 은식품발효에관여하는유산균 523종의바이오제닉아민생성능을조사한결과, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus 및몇몇 Lactobacillus (L. pentosus, L. sakei) 등은바이오제닉아민을생성하지않았으나, Carnobacteria, Lactobacillus buchneri, L. curvatus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus alimentarius, L. brevis, Lactobacillus bavarius 및 L. delbrueckii ssp. lactis 등은바이오제닉아민을생성하는것으로보고하였다. 육류로부터분리된 L. brevis, L. buchnerii, L. curvatus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus divergens 및 Lactobacillus hilgardii 등도바이오제닉아민을생성하는유산균으로확인되었다 (Maijala et al., 1993). Priyadarshani와 Rakshit (2011) 의보고에의하면, 프로바이오틱유산균중에서 Lactobacillus casei TISTR389는많은양의히스타민 (1,820.9 ± 3.5 mg/l) 과티라민 (5, ± 47.6 mg/l) 을생성하였고, L. delbrueckii subsp. bulgaricus TISTR895은히스타민 (459.1 ± 0.63 mg/l) 을생산한반면, L. acidophilus, L. lactis subsp. lactis 및 L. plantarum 등은바이오제닉아민을생성하지않았다고하였다. 이와같이여러연구결과에서보듯이바이오제닉아민생성능은균종에의존하기보다는균주에따라차이가있는것으로판단된다. 이지않았으나, CIL08, FIL20, PIL52 및 RIL60 균주는대조구의히스타민함량을약 20 30% 정도감소시킨것으로나타났으며, 그중에서 RIL60의분해능이가장높게나타났다. 식품을통해섭취된바이오제닉아민은장내점막에있는 AO 및특정세균이생산하는 AO에의해분해되어무독화되며, AO는아미노기의수에따라 monoamine oxidases (MAO) 와 diamine oxidases (DAO) 로분류되고히스타민은 DAO에의해분해된다. 또한히스타민은 methyl 혹은 acetyltransferase 에의해무독화될수있는데, 만약이들효소들이유전적으로문제가발생하거나항우울제약물혹은알코올등의효소저해제의영향을받을경우바이오제닉아민이분해되지않아인체건강을위협하게된다 (Linares et al., 2011). 바이오제닉아민분해효소는중성내지는알칼리성범위에서최대활성을나타내고효소의활성을위해산소는필수적이며 DAO의활성은히스타민축적량에영향을준다 (Dapkevicius et al., 2000). Dapkevicius 등 (2000) 에따르면, 어묵으로부터분리된 77 종의유산균중에서 48균주는 MRS broth 내에서히스타민분해능이확인되었고, 이중에서도 L. sakei는히스타민의양을 40% 이상감소시켜히스타민생성균을제어하는데효과적인어류슬러지스타터라고보고하였는데본연구의분리균주들은이보다는분해능이다소낮았다. 와인으로부터분리된유산균중에서히스타민분해능은균주에따라다양하였으며, Pediococcus pentosaceus IFI-CA 30은약 10% 정도를분해한반면, L. casei IFI-CA 52는 54% 정도를감소시켰다 (Garcia-Ruiz et al., 2011). 태국전통발효어육소시지제조시 AO 생성균인 L. plantarum KM5474 및 L. sakei KM1450을이용하여발효시킨경우바이오제닉아민함량이유의하게감소되었다고하였다 (Kongkiattikajorn, 2015). Zaman 등 (2010) 은생선및어육가공품으로부터분리한 Bacillus amyloliquefaciens FS-05는다른균에비해히스타민 프로바이오틱유산균의히스타민분해능 인공소화액에대해저항성, 상피세포에대한부착능및항생제에대한내성이강하며, 히스타민생성능이없는 8균주를대상으로히스타민분해능을조사한결과는 Fig. 1과같다. CIL16, FIL31, PIL45 및 PIL49 균주는히스타민분해능을보 Fig. 1. Percentage of degradation of the histamine by LAB obtained from fish intestine. Data are means ± standard deviation (SD) from triplicate determinations. *Significantly differ (P < 0.05) from the control group by paired t-test. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

7 358 Lim and Lee 분해능이유의하게높아 24시간이내에초기함량의약 59.9% 의히스타민을분해했다고보고하였다. 한편, 생선으로부터분리된 Bacillus sp. LMG21002와 Bacillus megaterium KL-197 및 Bacillus coagulans 등은히스타민분해능이있는것으로확인되었고, Staphylococcus condiment FS-22와 Staphylococcus carnosus FS-19는히스타민을각각 27.4% 와 29.1% 분해하였다고보고된바있다 (Kim and Kim, 2006). 멸치젓갈내히스타민농도를감소시킬수있는균주검색결과, Staphylococcus xylosus No. 0538은다른균주들에비해월등히높은히스타민분해능을나타내어 0.5 mm 히스타민이함유된 buffer 내에서 24시간이내에히스타민농도를 38% 감소시켰다 (Mah and Hwang, 2009). 염장어육가공품으로부터히스타민분해능이있는균주를분리동정한결과, Rummeliibachillus stabekisii, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens 및 Bacillus subtilis 등으로확인되었고, 이중에서 B. polymyxa가가장높은히스타민분해활성을나타내었고, 분해능은배양온도, ph 및염농도에영향을받는다고하였다 (Lee et al., 2015). 따라서본결과와이미보고된결과에따르면세균의히스타민분해능은균종및배양조건에따라상이하며, 유산균의분해능은 DAO 생성에기인하는것으로추정된다. 히스타민생성균에대한박테리오신활성생선내장으로부터히스타민을생성하는균주를 16S rrna 염기서열분석을통해동정하고프로바이오틱으로적합하다고추정되는유산균박테리오신의항균활성을측정한결과는 Table 2와같다. 조기내장으로부터분리된히스타민생성균 인 CIH03, CIH05 및 CIH09의염기서열분석결과상동성 99% 이상의 Morganella morganii, Enterobacter aerogenes 및 Serratia marcescens으로각각동정되었다. 가자미로부터분리된 FIH11과 FIH15는각각 E. faecalis와 Pediococus halophilus 으로동정되었고, 명태내장으로부터분리된 PIH16, PHI19 및 PIH21은 L. sakei, E. faecium 및 Citrobacter freundii 등으로확인되었다. 그리고우럭으로부터히스타민생성능이높은 RIH25 및 RIH28 균주는상동성 99.7% 와 99.0% 의 L. mesenteroides 및 Aeromonas hydrophilia로동정되었다. 이와같이생선내장으로부터히스타민생성능이높은 10균주를대상으로프로바이오틱균주로추정되는유산균 8종의박테리오신활성을조사한결과, CIL08, CIL16, PIL45, PIL49 및 RIL60 유산균은히스타민생성균에대해항균활성을나타내는박테리오신을생산하지않았다. 하지만 FIL20, FIL31 및 PIL52 유산균은일부히스타민생성균에대해항균력을나타내었으며, 박테리오신활성은히스타민생성균주에따라다소차이가있었다. 특히, E. faecalis와 L. sakei 등에대한 FIL20의박테리오신활성은 128 AU/ml, S. marcescens에대한활성은 64 AU/ml이고 L. mesenteroides에대해선 32 AU/ml 의활성을나타내었다. FIL31 의박테리오신활성을측정한결과, E. aerogenes (256 AU/ml), A. hydrophila (128 AU/ml) 및 P. halophilus (32 AU/ml) 에대한항균활성을나타내었다. PIL52 의박테리오신은 E. faecium 에대해가장높은항균활성 (1,024 AU/ml) 을나타내었고, E. aerogenes에대해선 512 AU/ml의활성을나타내었다. Lakshmanan 등 (2002) 에따르면, 냉장저장한생선과새우로부터분리된아민생성우점종균으로는 Alcaligenes, Flavobacterium, Acinetobacter, Shewanella 및 Pseudomonas 속등의그람음성 Table 2. Bacteriocin activity of LAB against histamine-producing strains isolated from fish intestine No. Origin Identification of histamine-producing strain Accession No. related strain in NCBI Similarity (%) Bacteriocin activity of LAB (AU/ml) Identification CIL08 CIL16 FIL20 FIL31 PIL45 PIL49 PIL52 RIL60 CIH03 Croaker AB Morganella morganii ND ND ND ND ND ND ND ND CIH05 Croaker JN Enterobacter aerogenes ND ND ND 256 ND ND 512 ND CIH09 Croaker AY Serratia marcescens ND ND 64 ND ND ND ND ND FIH11 Flatfish EU Enterococcus faecalis ND ND 128 ND ND ND ND ND FIH15 Flatfish AB Pediococcus halophilus ND ND ND 32 ND ND ND ND PIH16 Pollack KM Lactobacillus sakei ND ND 128 ND ND ND ND ND PIH19 Pollack EU Enterococcus faecium ND ND ND ND ND ND 1,024 ND PIH21 Pollack DQ Citrobacter freundii ND ND ND ND ND ND ND ND RIH25 Rockfish HQ Leuconostoc mesenteroides ND ND 32 ND ND ND ND ND RIH28 Rockfish KU Aeromonas hydrophilia ND ND ND 128 ND ND ND ND ND, Not detected. 미생물학회지제 52 권제 3 호

8 유산균에의한히스타민생성균의제어 359 균뿐만아니라 Micrococcus 속등의그람양성균이주를이룬다고보고하였다. 히스타민을생성하는히스티딘탈탄산효소는 Enterobacteriaceae, Clostridium 및 Lactobacillus 등으로부터확인되었고, 고등어중독 (scombroid poisoning) 과관련된히스타민생성세균으로는 M. morganii, E. aerogenes, Klebsiella pneumonia, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium histaminum 및 Hafnia alvei 등이알려져있다 (Morii et al., 1988). 게다가 Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Clostridium perfringens, E. aerogenes 및 Vibrio alginolyticus 등은어류로부터분리된히스타민생성균이다 (Shalaby, 1996). Middlebrooks 등 (1988) 은생선으로부터히스타민생성균을동정한결과, Acinetobacer lwoffi, Pseudomonas putrefaciens 및 A. hydrophilia 등으로확인되었다고하였다. 특히, 어류로부터분리된내염성균에서도 Staphylococcus, Vibrio 및 Pseudomonas 등이히스타민을생성하는것으로알려져있다 (Shalaby, 1996). Kim 등 (2009) 에따르면, 생선으로부터분리된 119균주중 56균주 (47.1%) 는히스타민 (0 4,073.3 mg/kg), 푸트레신 (2, ,759.5 mg/kg) 혹은카다베린 (0 1,735.9 mg/kg) 을생산하는것으로확인되었고, 이중에서 23균주는 3, ,073.3 mg/l의다량의히스타민을생산하였으며, 분리균을동정한결과주로 Enterobacter 속이라고보고하였다. 일부세균의바이오제닉아민생성조건으로는우선해당균주는유리아미노산의이용능을가지고있어야하고, 탈탄산효소에의해아민생성을위한적합한대사경로를거치고, 균의증식과아민생성효소의활성을위한최적의배양조건하에서최대의양을생성하게되는데 (Ten Brink et al., 1990), 여러연구결과에따르면균주및배양조건에따라히스타민생성량이다양하다. Gómez-Sala 등 (2015) 은생선및수산가공품으로부터총 1245종의유산균을분리하였고이중에서 197종은부패균및식이성병원균에대한항균활성을나타내는유산균임을확인하였으며, 64종유산균의항균력은박테리오신생산에기인한다고하였다. 또한박테리오신을생산하는유산균을동정한결과, E. faecium, E. faecalis, P. pentosaceus, Weissella cibaria, L. sakei subsp. carnosus, L. sakei subsp. sakei, L. curvatus subsp. curvatus 및 L. mesenteroides subsp. cremoris 등으로확인되었다. 게다가수산식품등에주로분포하는그람양성및음성의병원성균과부패균에대한해산어로부터분리된유산균 (E. faecium, Enterococcus sanguinicola, E. faecalis, Enterococcus gallinarum, Enterococcus cassseliflavus, Enterococcus mundtii, Enterococcus pseudoavium, L. lactis 및 Carnobacterium sp.) 의박테리오신생성능을조사한결과, L. monocytogenes, Staphylococcus aureus, A. hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio anguillarum 및 Carnobacterium 등에대해강한항균활성을나타내었고, B. cereus, Bacillus pumilus, B. subtilis, Brochotrix thermosphacta 및 S. aureus에대해서도항균효과가나타났다 (Chahad et al., 2012). Nugrahani 등 (2016) 은 L. casei가생산하는박테리오신은어류내에많은양의히스타민을생산하여히스타민중독위험가능성이높은 Pseudomonas sp., Proteus morganii 및 Micrococcus sp. 등의증식을억제하는효과를보고하였다. Nisin Z와 lacticin 481을생산하는 L. lactis subsp. lactis VR84와 EG46 균주는히스타민생산균인 Streptococcus thermophilus PRI60에대한살균효과를나타내지는않았지만, 증식억제및히스타민축적량을감소시키는효과는뛰어났으므로유산균박테리오신의히스타민제어능이확인된바있다 (Tabanelli et al., 2014). 한편, 박테리오신의활성은항균물질을생산하는균주와배양조건및히스타민생성균주에따라다양하다. 박테리오신에의한히스타민생성억제효과히스타민생성균에대한박테리오신활성을나타낸유산균을대상으로박테리오신 (200 AU/ml) 처리에의한히스타민함량변화를측정한결과는 Table 3과같다. 히스타민생성균이생성한히스타민함량은 ± 34.7 mg/l ± 50.4 mg/l로균주에따라상이한차이가나타났다. FIL20의박테리오신처리에의해서 S. marcescens CIH09, E. faecalis FIH11, L. sakei PIH16 및 L. mesenteroides RIH25의히스타민함량을 56 76% 정도감소시켰고, FIL31의박테리오신에의해서도 E. aerogenes CIH05 (29%), P. halophilus FIH15 (74%) 및 A. hydrophilia RIH28 (38%) 의히스타민생성을억제하는효과가나타났다. 또한 PIL52의박테리오신도 E. aerogenes CIH05 의히스타민생성량을 25% 감소시키고, E. faecium PIH19의생성량도약 20% 감소시켰다. Zaman 등 (2010) 에의하면, 생선내에함유된바이오제닉아민의함량은시료내호기성균및단백질분해활성이우수한세균수와상관이있으며, 히스타민함량은 ppm 으로측정되어미FDA에서권고하는히스타민함량 50 ppm을훨씬초과하였다고하였다. 또한수산가공품내바이오제닉아민축적량은유리아미노산에대한세균의탈탄산효소활성에기인하며, 단백질분해능이있는세균은단백질을분해함으로써아민생성균의탈탄산화에이용될기질인아미노산을제공하는중요한역할을한다고보고하였다. 히스타민분해능이있는 S. xylosus No. 0538은박테리오신을생성하는것으로확인되었고, 아민생성균인 B. licheniformis에대한강한항균활성을나타내었다 (Mah and Hwang, 2009). 화학합성첨 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

9 360 Lim and Lee 가물의독성에대한소비자들의우려로인해이를대체할수있는인체에무해한천연보존제를선호함에따라유산균이생산하는천연단백질성항균물질인박테리오신은식품의저장성향상과품질개선을위해많이이용되고있다. 박테리오신은세포내리보솜에의해합성되는항균성펩타이드물질로서인체내단백질분해효소에의해쉽게분해되어잔류성이없으며, 이를생산하는유산균과유사한종에서부터부패균및식중독균등다양한그람양성과음성균에대한광범위한항균스펙트럼을나타낸다 (Klaenhammer, 1993). 게다가박테리오신의항균활성을인해대상균주들이생산하는효소및유해물질의생성량감소에도효과적이므로바이오제닉아민분해능이있는균주를발효스타터로이용함으로써제품내에유해아민의축적량을감소시킬수있다 (Leuschner et al., 1998). Joosten과 Nuńez (1996) 에의하면, 히스타민생성균인 L. buchneri St2A를우유에 190 CFU/ml를첨가하여 4개월동안 치즈를숙성시킨후균수는 CFU/g에이르고히스타민생성량은 200 mg/kg에달한반면, 박테리오신생성균인 enterococci와 L. lactis를처리한결과, St2A의증식과히스타민생성이완전히저해되었다고보고하였다. Thiruneelakandan 등 (2013) 에따르면, L. planatrum의배양상등액이나대조구 ( 무처리구 ) 에비해부분정제된박테리오신을처리한경우참치시료내히스타민함량이유의하게감소되었다고하였는데, 본연구에서사용된유산균의박테리오신에의해서도히스타민생성량을감소시키는데효과적이었다. 유산균과의혼합배양에의한히스타민생성량변화생선내장으로부터분리된히스타민생성균과히스타민분해능및박테리오신생산능이있는유산균세포현탁액을 BHI broth에접종하여 37 C에서 24시간혼합배양한후배양액내에잔존하는히스타민함량을측정한결과는 Table 4와같다. Table 3. Effects the bacteriocin produced by LAB on histamine accumulation of histamine-producing strain Histamine content (mg/l) Histamine-producing strain Bacteriocin concentration (200 AU/ml) Control FIL20 FIL31 PIL52 Enterobacter aerogenes CIH ± 20.5 NT ± 30.1* ± 52.1* Serratia marcescens CIH ± ± 23.0* NT NT Enterococcus faecalis FIH ± ± 15.2* NT NT Pediococcus halophilus FIH ± 40.3 NT ± 11.7* NT Lactobacillus sakei PIH ± ± 31.4* NT NT Enterococcus faecium PIH ± 34.7 NT NT ± 27.3* Leuconostoc mesenteroides RIH ± ± 29.7* NT NT Aeromonas hydrophilia RIH ± 39.8 NT ± 40.5* NT Data are means ± SD from triplicate determinations. *Significantly differ (P < 0.05) from the control group by paired t-test. NT, Not tested. Table 4. Changes of histamine contents during co-culture with probiotic LAB showing histamine degradation and bacteriocin production ability Histamine-producing strain Control Histamine content (mg/l) CIL08 FIL20 FIL31 PIL52 RIL60 Enterobacter aerogenes CIH ± ± 16.4* ± 25.3* ± ± 41.5* ± 33.7* Serratia marcescens CIH ± ± 30.3* ± 26.1* ± ± 22.8* ± 18.7* Enterococcus faecalis FIH ± ± 19.4* ± 20.5* ± ± 20.7* ± 17.2* Pediococcus halophilus FIH ± ± 11.3* ± 13.1* ± ± 15.8* ± 17.5* Lactobacillus sakei PIH ± ± 30.0* ± 16.9* ± ± 31.0* ± 11.8* Enterococcus faecium PIH ± ± 13.4* ± 11.9* ± ± 12.4* ± 9.7* Leuconostoc mesenteroides RIH ± ± 20.3* ± 34.1* ± ± 17.5* ± 20.3* Aeromonas hydrophilia RIH ± ± 11.5* ± 27.1* ± ± 40.0* ± 19.3* Data are means ± SD from triplicate determinations. *Significantly differ (P < 0.05) from the control group by paired t-test. LAB 미생물학회지제 52 권제 3 호

10 유산균에의한히스타민생성균의제어 361 CIL08 및 RIL60 균주들의히스타민분해능에의해배양액내에잔존하는히스타민함량이대조구에비해유의하게감소되었다. FIL20 및 PIL52 균주들은히스타민분해능뿐만아니라박테리오신생산능이확인되었으나, BHI broth 상에서 FIL20 의박테리오신활성은 MRS broth에서생산된활성의 50% 수준이었고, PIL52 균주의박테리오신활성은 BHI broth에서나타나지않았다. 따라서 FIL20과 PIL52 균주들의히스타민생성능에대한감소효과는 BHI broth 상에서다소낮게나타났으며, FIL31 균주도 BHI broth 내에서는박테리오신활성이나타나지않아히스타민축적량이대조구와차이가없었다. Özogul (2011) 에따르면, 식품에서유래한병원균에의한바이오제닉아민생성에대한유산균의영향을살펴본결과, L. lactis subsp. lactis 및 L. plantarum과병원균을혼합했을때배양액내에암모니아함량이유의하게감소되었으나, 아민형성에대한유산균의저해효과는크게나타나지않았다고하였다. Tabanelli 등 (2014) 은박테리오신을생산하는 L. lactis subsp. lactis VR84 및 EG46과티라민생성능이있는 E. faecalis EF37 을혼합배양한결과, EF37의균수는유의하게감소되었으며, 초기접종량에따라증식속도와최대균수에차이가있었으므로바이오제닉생성균의초기접종량이적을수록티라민축적량은감소되었다고하였다. 생선을발효하는동안바이오제닉 아민축적감소를위한발효스타터의영향을살펴본결과, AO 활성이있는 S. carnosus FS19 (27.7%) 와 B. amyloliquefaciens FS05 (15.4%) 는대조구에비해유의하게히스타민농도를감소시켰다 (Zaman et al., 2011). Mah와 Hwang (2009) 은히스타민분해능이있는 S. xylosus를멸치젓갈숙성을위한스타터로이용한경우, 대조구에비해히스타민함량을약 16.0% 감소시켜젓갈제조시제품의안전성을강화시키는데도움이되었다고보고한바있다. L. plantarum-15, S. xylosus-12, P. pentosaceus-atcc33316 및 L. casei subsp. casei 등의유산균을혼합하여제조한어육소시지내에생성된히스타민을비롯한각종바이오제닉아민의함량이유의하게낮아졌다고보고된바있다 (Yongjin et al., 2007). 히스타민생성균에대한항균활성이있는프로바이오틱유산균동정 생선내장으로부터분리된유산균중프로바이오틱균주로서적합하고히스타민분해능이있으며박테리오신생산에의한히스타민생성균의항균활성을나타낸균주를최종선발하여형태학적및배양학적특성, API 50 CHL kit에의한당발효능및 16S rrna 염기서열분석을통해동정한결과는 Table 5와같다. CIL08과 RIL60 균주는구균인반면, FIL20, FIL31 Table 5. Identification of the probiotic LAB showing histamine degradation and bacteriocin production ability according to phenotypic characteristics, carbohydrate fermentation, and 16S rrna gene sequencing Phenotypic characteristics API50 CHL system 16S rrna sequencing Identification Contents LAB CIL08 FIL20 FIL31 PIL52 RIL60 Cell shape Coccus Rod Rod Rod Coccus Gram staining Motility Gas from glucose Lactic acid L D D L L Catalase Types of available carbohydrate Related strain in NCBI L-Arabinose, Ribose, D-Xylose, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, N-Acetylglucosamine, Amygdaline, Esculine, Salicin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Saccharose, D-Raffinose, β-gentiobiose Pediococcus pentosaceus L-Arabinose, D-Ribose, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Mannitol, Sorbitol, α-methyl-d-mannoside, Cellobiose, Maltose, Lactose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, Melezitose, D-Turanose Lactobacillus plantarum L-Arabinose, Ribose, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Mannitol, Sorbitol, N-Acetylglucosamine, Amygdaline, Esculine, Salicin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Saccharose, Trehalose, Melezitose, β-gentiobiose, D-Tagatose Lactobacillus paracasei L-Arabinose, D-Ribose, D-Xylose, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, L-Rhamnose, Mannitol, Sorbitol, N-Acetylglucosamine, Amygdaline, Salicin, Cellobiose, Maltose, Lactose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, β-gentiobiose, D-Turanose Lactobacillus sakei L-Arabinose, Ribose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Esculine, Cellobiose, Maltose, Melibiose, Saccharose, Trehalose, D-Raffinose Leuconostoc mesenteroides Accession No. KF EU KP KM JN Similarity (%) Pediococcus pentosaceus CIL08 Lactobacillus plantarum FIL20 Lactobacillus paracasei FIL31 Lactobacillus sakei PIL52 Leuconostoc mesenteroides RIL60 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

11 362 Lim and Lee 및 PIL52 균주는간균이었고 5균주모두운동성이없는그람양성균이었다. FIL31과 PIL52 균주는포도당을분해하여가스를생성하였으나, CIL08, FIL20 및 RIL60 균주는가스를생성하지않았다. CIL08, PIL52 및 RIL60 균주는 L형의유산을생성하였고, CIL08, FIL20 및 RIL60은 catalase를생성하였다. 한편, 당발효능과염기서열분석을통해 P. pentosaceus CIL08, L. plantarum FIL20, L. paracasei FIL31, L. sakei PIL52 및 L.mesenteroides RIL60으로동정되었다. Ghanbari 등 (2009) 은생선내장으로부터분리된유산균을동정한결과, L. sakei, L. plantarum, Lactobacillus coryneformis, Lactobacillus alimentarius, L. brevis, L. casei 및 Lactobacillus oris 등으로확인되었다고하였다. 한편, 민물고기내장으로부터항균활성을가진유산균으로 L. sakei 111이보고된바있으며 (Bajpai et al., 2016), Nirunya 등 (2008) 은생선, 새우및패류의내장으로부터분리된 160종의유산균중 P. pentosaceus LM2, P. pentosaceus SL4 및 E. faecium SF가프로바이오틱균주로적합하다고보고한바있다. Migaw 등 (2014) 도생선내장으로부터분리된 9종의유산균중에서박테리오신의생성능을조사한결과, Enterococcus durans, L. lactis 및 E. faecium 등이 Listeria innocua 및기타유산균에대한항균활성을나타내었으며, 이들은프로바이오틱스로서식품의생물학적보존제로서유용하다고하였다. 생선은단백질함량이높아서부패발생가능성이높고특히히스티딘은표피나내장에분포하는아미노산탈탄산효소생산균에의해과량의히스타민으로분해되어이를섭취한경우알레르기식중독을유발하게되므로본연구에서는프로바이오틱유산균이생산한항균물질과히스타민분해능에의한유해아민축적량감소효과를살펴보았다. 프로바이오틱유산균은강산이나담즙산등의소화액에대한저항성으로인체소화기관을통과하는동안생존하여장에도달한후장점막상피세포에부착하고항생제에대한내성으로인해장관내에서증식하는동안항균물질을생산하여장내에유입된유해균의증식을억제시킨다. 생선내장으로부터분리된유산균중에서 L. plantarum FIL20 균주는인공소화액및항생제에대한저항성이높고장관상피세포에대한부착능이높으므로프로바이오틱균주로서적합한것으로나타났다. 또한히스타민분해능및박테리오신생산능을모두가지고있어일부히스타민생성균에대한항균활성및히스타민생성량을감소시키므로유해아민저감화에효과적일것으로사료된다. 게다가프로바이오틱유산균은소화액에대한저항성이높아체내에유입된아미노산탈탄산효소생산균의제어에도유용하며, 히스타민분해능이있는유산균을발효스타터로이용할 경우발효식품의저장성향상과품질개선효과를얻을수있을것으로판단된다. 적 요 본연구에서는생선내장으로부터분리된유산균의프로바이오틱특성과아민산화효소 (diamine oxidase, DAO) 및박테리오신생산을통한히스타민분해능을조사하였다. 조기, 가자미, 명태및우럭내장으로부터분리된총 97종의유산균중에서 CIL08, CIL16, FIL20, FIL31, PIL45, PIL49, PIL52 및 RIL60 균주는인공소화액에대한저항성이강하고, HT-29 상피세포에대해서도높은부착력을보였으며, 항생제 (amoxicillin, ampicillin, erythromycin, penicillin G, streptomycin, tetracycline 및 vancomycin) 에대한내성도강한것으로나타났다. 게다가이들균주들은히스티딘이함유된탈카르복시화액체배지내에서히스타민을생산하지않았다. 특히 DAO를생산하는것으로추정되는 CIL08, FIL20, PIL52 및 RIL60 등의 4균주는히스타민분해능이유의하게높았다. FIL20, FIL31 및 PIL52 유산균이생산한박테리오신에의해선 Enterococcus aerogenes CIH05, Serratia marcescens CIH09, Enterococcus faecalis FIH11, Pediococcus halophilus FIH15, Lactobacillus sakei PIH16, Enterococcus faecium PIH19, Leuconostoc mesenteroides RIH25 혹은 Aeromonas hydrophilia RIH28의증식과히스타민생성량이유의하게감소되었다. 또한생선내장에서분리된히스타민생성균과히스타민분해능혹은박테리오신생산능을가진 CIL08, FIL20, PIL52 및 RIL60 유산균과혼합배양에의해히스타민축적량이감소되었다. 히스타민생성을억제하는프로바이오틱유산균의배양학적특성과 16S rrna 염기서열분석을통해 Pediococcus pentosaceus CIL08, Lactobacillus plantarum FIL20, Lactobacillus paracasei FIL31, Lactobacillus sakei PIL52 및 Leuconostoc mesenteroides RIL60으로동정되었다. References Allameh, S.K., Daud, H., Yusoff, F.M., Saad, C.R., and Ideris, A Isolation, identification and characterization of Leuconostoc mesenteroides as a new probiotic from intestine of snakehead fish (Channa Striatus). Afr. J. Biotechnol. 11, Bajpai, V.K., Han, J.H., Nam, G.J., Majumder, R., Park, C.S., Lim, J.H., Paek, W.K., Rather, I.A., and Park, Y.H Characterization and pharmacological potential of Lactobacillus sakei 111 isolated 미생물학회지제 52 권제 3 호

12 유산균에의한히스타민생성균의제어 363 from fresh water fish Zacco koreanus. DARU J. Pharm. Sci. 24, Balcázar, J.L., Vendrell, D., De Blas, I., and Ruiz-Zarzuela, I Characterization of probiotic properties of lactic acid bacteria from intestinal microbiota of fish. Aquacuture 278, Bover-Cid, S. and Holzapfel, W.H Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. Int. J. Food Microbiol. 52, Chahad, O.B., Bour, M.E., Calo-Mata, P., Boudabous, A., and Barros- Velàzquez, J Discovery of novel biopreservation agents with inhibitory effects on growth of food-borne pathogens and their application to seafood products. Res. Microbiol. 163, Chen, H.C., Kung, H.F., Chen, W.C., Lin W.F., Hwang, D.F., Lee Y.C., and Tsai, Y.H Determination of histamine and histamine-forming bacteria in tuna dumpling implicated in a food-borne poisoning. Food Chem. 106, Cho, G.S., Do, H.K., Bae, C.Y., Cho, G.S., Whang, C.W., and Shin, H.K Candidate of probiotic bacteria isolated from several jeotgals: Korean traditional fermented seafoods. J. Food Sci. Nutr. 11, Dapkevicius, M.L.N.E., Nout, M.J.R., Rombouts, F.M., Houben, J.H., and Wymenga, W Biogenic amine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 57, Eerola, S., Hinkkanen, R., Lindfors, E., and Hirvi, T Liquid chromatographic determination of biogenic amines in dry sausages. J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int. 75, Garcia-Ruiz, A., González-Rompinelli, E.M., Bartolomé, B., and Moreno-Arribas, M.V Potential of wine-associated lactic acid bacteria to degrade biogenic amines. Int. J. Food Microbiol. 148, Ghanbari, M., Jami, M., Domig, K.J., and Kneifel, W Seafood biopreservation by lactic acid bacteria- A review. LWT-Food Sci. Technol. 54, Ghanbari, M., Rezaei, M., Jami, M., and Nazari, R.M Isolation and characterization of Lactobacillus species from intestinal contents of beluga (Huso huso) and Persian sturgeon (Acipenser persicus). Iran. J. Vet. Res. 10, Grimoud, J., Durand, H., Courtin, C., Monsan, P., Ouarne, F., Theodorou, V., and Roques, C In vitro screening of probiotic lactic acid bacteria and prebiotic glucooligosaccharides to select effective synbiotics. Anaerobe 16, Gómez-Sala, B., Muńoz-Atienza, E., Sánchez, J., Basanta, A., Herranz, C., Hernández, P.E., and Cintas, L.M Bacteriocin production by lactic acid bacteria isolated from fish, seafood and fish products. Eur. Food Res. Technol. 241, Holo, H., Nilssen, O., and Nes, I.F Lactococcin A, a new bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. cremoris: isolation and characterization of the protein and its gene. J. Bacteriol. 173, Joosten, H.M. and Nuńez, M Prevention of histamine formation in cheese by bacteriocin-producing lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 62, Kim, M.W. and Kim, Y.M Isolation and identification of histamine degrading bacteria from Kwamegi. Kor. J. Life Sci. 16, Kim, M.K., Mah, J.H., and Hwang, H.J Biogenic amine formation and bacteria contribution in fish, squid and shellfish. Food Chem. 116, Klaenhammer, T.R Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 12, Kongkiattikajorn, J Potential of starter culture to reduce biogenic amines accumulation in som-fug, a Thai traditional fermented fish sausage. J. Ethn. Foods 2, Lakshamanan, R., Shakila, R.J., and Jeyasekaran, G Survival of amine-forming bacteria during the ice storage of fish and shrimp. Food Microbiol. 19, Lee, Y.C., Lin, C.S., Liu, F.L., Huang, T.C., and Tsai, Y.H Degradation of histamine by Bacillus polymyxa isolated from salted fish products. J. Food Drug Anal. 23, Leuschner, R.G., Heidel, M., and Hammes, W.P Histamine and tyramine degradation by food fermenting microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 39, Linares, D.M., Martin, M.C., Ladero, V., Alvarez, M.A., and Fernández, M Biogenic amines in dairy products. Crit. Rev. Food Sci. 51, Mah, J.H., Ahn, J.B., Park, J.H., Sung, H.C., and Hwang, H.J Characterization of biogenic amine-producing microorganisms isolated from Myeolchi-Jeot, Korean salted and fermented anchovy. J. Microbiol. Biotechnol. 13, Mah, J.H. and Hwang, H.J Inhibition of biogenic amine formation in a salted and fermented anchovy by Staphylococcus xylosus as a protective culture. Food Control 114, Maijala, R.L., Erola, S.H., Aho, M.A., and Hirn, J.A The effect of GDL-induced ph decrease on the formation of biogenic amines in meat. J. Food Prot. 50, Middlebrooks, B.L., Toom, P.M., Douglas, W.L., Harrison, R.E., and Mcdowell, S Effects of storage time and temperature on the microflora and amine development in Spanish mackerel (Scoberomorus maculatus). J. Food Sci. 53, Migaw, S., Ghrairi, T., Belguesmia, Y., Choiset, Y., Berjeaud, J.M., Chobert, J.M., Hani, K., and Haertle, T Diverstiy of bacteriocinogenic lactic acid bacteria isolated from Mediterranean fish viscera. World J. Microbiol. Biotechnol. 30, Morii, H., Cann, D.C., and Taylor, L.Y Histamine formation by luminous bacteria in mackerel stored at low temperatures. B. Jpn. Soc. Sci. Fish. 54, Murooka, Y., Doi, N., and Harada, T Distribution of membrane bound monoamine oxidase in bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 38, Musikasang, H., Sohsomboon, N., Tani, A., and Maneerat, S Bacteriocin-producing lactic acid bacteria as a probiotic potential from Thai indigenous chickens. Czech J. Anim. Sci. 57, Naila, A., Flint, S., Fletcher, G., Bremer, P., and Meerdink, G Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 3

13 364 Lim and Lee Control of biogenic amines in food-existing and emerging approaches. J. Food Sci. 75, R139 R150. Nirunya, B., Suphitchaya, C., and Tipparat, H Screening of lactic acid bacteria from gastrointestinal tracts of marine fish for their potential use as probiotics. Songklanakarin J. Sci. Technol. 30, Nugrahani, A., Anik, H., and Hariati, M Characterization of bacteriocin Lactobacillus casei on histamine-forming bacteria. J. Life Sci. Biomed. 6, Osmanagaoglu, O., Kiran, F., and Ataoglu, H Evaluation of in vitro probiotic potential of Pediococcus pentosaceus OZF isolated from human breast milk. Probiotics Antimicrob. Proteins 2, Özogul, F Effects of specific lactic acid bacteria species on biogenic amine production by foodborne pathogen. Int. J. Food Sci. Technol. 46, Priyadarshani, W.M.D. and Rakshit, S.K Screening selected strains of probiotic lactic acid bacteria for their ability to produce biogenic amines (histamine and tyramine). Int. J. Food Sci. Technol. 46, Santos, M.H.S Biogenic amines: their importance in foods. Int. J. Food Microbiol. 29, Shakila, R.J., Vasundhara, T.S., and Rao, D.V Inhibitory effect of spices on in vitro histamine production and histidine decarboxylase activity of Morganella morganii and on the biogenic amine formation in mackerel stored at 30 degrees C. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 203, Shalaby, A.R Significance of biogenic amines to food safety and human health. Food Res. Int. 29, Straub, B.W., Kicherer, M., Schilcher, S.M., and Hammes, W.P The formation of biogenic amines by fermentation organisms. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 201, Tabanelli, G., Montanari, C., Bargossi, E., Lanciotti, R., Gatto, V., Felis, G., Torriani, S., and Gardini, F Control of tyramine and histamine accumulation by lactic acid bacteria using bacteriocin forming lactococci. Int. J. Food Microbiol. 190, Tajabadi, N., Mardan, M., Saari, N., Mustafa, S., Bahreini, R., and Manap, M.Y.A Identification of Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus and Lactobacillus fermentum from honey stomach of honeybee. Braz. J. Microbiol. 44, Ten Brink, B., Damink, C., Joosten, H.M.L., and Veld, J.H.J Occurrence and formation of biologically active amines in foods. Int. J. Food Microbiol. 11, Thiruneelakandan, G., Sesuraj, V.J., Babu, V., Senthikumar, V., Kathiresan, K., Sivakami, R., and Anthoni, S.A Efficacy of preserving sea foods using marine Lactobacillus. Sci. Technol. Arts Res. J. 2, Todorov, S.D., Furtado, D.N., Saad, S.M.I., Tome, E., and Franco, B.D.G.M Potential beneficial properties of bacteriocinproducing lactic acid bacteria isolated from smoked salmon. J. Appl. Microbiol. 110, Visciano, P., Schirone, M., Tofalo, R., and Suzzi, G Biogenic amines in raw and processed seafood. Front. Microbiol. 3, Yongjin, H., Wenshui, X., and Xiaoyong, L Changes in biogenic amines in fermented silver carp sausages inoculated with mixed starter cultures. Food Chem. 104, Zaman, M.Z., Bakar, F.A., Selamat, J., and Bakar, J Occurrence of biogenic amines and amines degrading bacteria in fish sauce. Czech. J. Food Sci. 28, Zaman, M.Z., Bakar, F.A., Jinap, S., and Bakar, J Novel starter cultures to inhibit biogenic amines accumulation during fish sauce fermentation. Int. J. Food Microbiol. 145, 미생물학회지제 52 권제 3 호