임앙병리덤마고 I 악외 111 : 머 132 뀐머 13 호, 66-72, 2000. 진균예벼동정의새로운배지에관한연구 대구보건대학임상병리과 대구가톨릭피부과부설진균의학연구소 * 킨싸요. 바요주 *. ~ 으저 * I 그 C 그 C 그 ζ 그 O L!.. ζ 그 A Study on New Media for Presumptive Identifing of Fungi Kim, Ssang YOlmg., Bang, Young Jun*., α10, Eun Jung* Depalτment of αlm따1 pathology, Taegu health college, Taegu, koreα Institute of Medica1 η1)lcology 따tholic skin, Taegu, koreα* The authors have tried to make a potato commeal Tween 80 medium containing caffeic acid(pdcc) more convenient for routine mycological laboratory study than Sabouraud dextrose agar. Five species were culture on PDCC at 25 0 C and 37 oc. Gross and microscopic fmdings of their colonies were examined. The colonial morphology and microscopic appearance were compared with those of the same strains on caffeic acid agar(caa). Cηptococcus neoformans Which is a medically important and whose colony showed brown to purple brown on PDCC medium was distinguishable not only from buff colored C. laurentii after one week incubation but also 한 om Candida spp. Candida albicans also formed chlamydospores and pseudohyphae on PDCC. Trichophyton mentagrophytes showed yellow- brown pigmentation which were rapid and darker in the center with gradual fading to the periphery. π1e were better on PDCC. π1e macroconidia grape-like clusters of microconidia and spiral hyphae gross morphology of Microsporum canis, Epidermophyton floccosum were similar on PDCC, CAA but macroconidia were seen more typically on PDCC. Ked Words: PDCC, Cryptococcus ne o.φrmans, Brown, Candida albicans chl 따 nydospores * 본논문은 2 아 m 년도대구보건대학연구비지원으로이루어졌음. 1. 서를많이분리되는진균이며임상검체에서도분 리빈도가높아지고있다. 과거에는 Candida 피부사상균과효모균은진균감염에서가장 albicans, Cηptococcus neoformans등을인체감 66
염균으로생각했으나, 최근에장기이식과면역억제제의투여, 당뇨, 항암치료등에의한 c. tropical, C. parasilo 외 s, C. krusei, C. glabrata 등 이중증감염의원인균으로보고되고있다. 이러한효모균을선택적으로신속히동정 하기위하여상품화된것으로당동화의유무 에 따라동정하는 API 20C, ATB 32C(Fenn, 1994; 송등, 1997), VITEK Yeast Biochemical card 와최근외국에서상품화된 CHROM agar (Odds, 1994; 선등, 1997) 등이몇종의 Candida 균에착색을나타내어구별이가능하다. 또한 C. neoφ rmans 를선택적으로분리할수있는 caffeic acid agar 와 dopamin 배지는갈색의 을나타냄으로다른 candida 와구별된다. 집락 그러나, CHROM agar 는 C. neoformanse 를 구별할수없고 caffeic acid 는다른균사형진 균을억제해초대분리배지로적당하지못하 여이에저자들은 C. neoformanse 분리배지인 caffeic acid agar(caa) 와피부사상균분리배지 로널리사용되고있는 potato dextrose com meal Tween80 agar 에 caffeic acid 성분만단독 으로첨가한배지 (PDCC), PDC 에 caffeic acid 와 bromcresol green 을첨가한배지 (PDCCB) 를 사용하여실험한결과만족한성적을얻었기 에보고하는바이다. Potato dextrose com meal Tween80 agar caffeic acid (PDCC). (Potato dextrose agar 20g, com meal agar 20g, pepton 2g, caffeic acid 아ng, Tween80 6cc) Potato dextrose com meal Tween80 agar caffeic acid BCG (PDCCB). (Potato dextrose agar 20g, com meal agar 20g, pepton 2g, caffeic acid 1Omg, BCG 2아ng, Tween80 6cc) 위의배지에 chloramphenicol 5 00mg 과증류수 1L를첨가하여평판배지를만들어사용하였다. 실험에사용한균주는본연구소에보관하고있는 C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. laurentii, C. neoformans 각 2주와 Trichopyton entagrophytes 6주, Microsporum canis 6 주, Epidermophyton.flocossum 3주를사용하였고, 이균주를각각의배지에접종하여 25 0 C 와 3 TC 에서 2주간배양하여각균주의집락의성장, 착색유무를관찰하였다. 현미경관찰은슬라이드배양을하여 7 일과 14 일후에 lactophenol cotton blue로염색하여현미경관찰하였으며각균주의특징적소견즉, 소분생자및대분생자의형태, 후막포자의생성여부를관찰하였다. n. 재료및밤법 III. 결 과 실험에사용한배지는효모균과피부사상균의집락을육안적소견과현미경소견으로관찰하기위하여 3종류의평판배지를만들어사용하였다. Caffeic acid agar(caa). (glucose 5g, (NH4)zS04 5g, yeast extract 2g, K2HP04 O.8g, MgS04. 3H20 O.7g, caffeic acid O.18g, ferric citrate O.002g, agar 20g) 피부사상균의성장및착색유무시험 T. mentagrophytes 의성장속도는 PDCC 에서가장빨리자랐고, PDCCB 배지에서도비슷하였다. 표면에는황갈색과립상의균집락이넓게나타났고, 가장자리는흰색의솜털모양의균사가나타났다. 뒷면의착색은 CAA와 PDCC 에서연한황색을나타냈으나 PDCCB 에서는볼수없었다. 현미경소견은격벽이있 67
는균사에구형의소분생자가포도송이모양 의 착색이느리고, 20mg 첨가에서는다른진 으로나타났고, 표면에돌기가없는대분생자 및코일모양과후막포자를볼수있었는데 PDCC 에서는더욱잘나타났다 (Table 1). 균의성장이억제되었다. 그리고 BCG 를 5mg, 1 야 ng, 2Omg, 3 아 ng 및 50mg 을 caffeic acid 와 함께첨가했을때, BCG 2 아 ng 과 caffeic acid M. canis 는솜털모양의균사가방사상으로 1 아 ng 에서 C. neoformans 와 C. glabrata, C. 퍼지는모양으로자랐다. 뒷면의착색은 PDCC krusei 의착색이가장빨랐다. 에서만진한황색을나타내었고 c때, PDCCB 에서는나타내지않았다. 현미경소견은표면에돌기가있는방추형의대분생자가 PDCC 에서더욱특징적으로나타났다 (Table 2). E. floccosum 은황갈색의짧은균사내지는 효모균 5 종을 CAA, PDCC, PDCCB 배지에접종하여색소생성시험을실시한결과갈색의색소는 C. neoformans에서만생성되었다. C. neoformans 의배양기간별색소생성을보면배양 3 일째에는 PDCC 에서갈색의색소가 과립상의집락이 PDCC, PDCCB 에서유사하 선명하게나타난반면 CAA, PDCCB 에서 갈 게 보였고, 발육도빨랐다. 현미경소견에서 색의색소가나타나지않았다. 5 일째에는배 소분생자는볼수없는반면 PDCC 에서곤봉 모양의대분생자가많이보였다 (Table 3). 지전부에서갈색의착색이나타났고 7 일째에는진한갈색으로변화하였다. 그러나 c. laurentii 는배양 7 일이되어도착색이나타나 효모균의색소생성시험 지않아 C. neo 꺼 rmans 을쉽게구별할수있었 균집락의색깔변화를관찰하는데적합한 Candida 균속의색소생성을보면 C. albicans, 함량을알아보기위하여 PDC 배지에 caffeic C. tropicalis 는배지전부에서착색이나타나지 acid 를 5mg, l Omg, 20mg 을가해제조한배지않았지만, 균사형성시험에서 C. albicans 는 에균을접종하여 25 0 C 에서배양한결과 caffeic acid 5mg 을첨가한배지에서는 C. neoformans 다. 균사와후막포자를형성하는데비해 C. laurentii 는균사를형성하지않아 Candida 균속과구별 Table 1. Characteristics of gross and microscopic fmgdings in T. mentagrophytes Incubation peri 여 s(14 days) CAA PDCC PDCCB Gross 원 ngdings Texture Gran버 ar Gran띠 ar Gr없mlar Reverse color Yellow Brown No pigmentation Diameter( cm) 5.0 7.3 6.8 Microscopic fingdings Microconidia Macroconidia Coile hyphae αùamydoconidia CAA : Caffeic acid agar PDCC Potato dextrose com meal Tween80 agar caffeic acid PDCCB Potato dextrose com meal Tween80 agar caffeic acid BCG 68
이가능하였다. C. krusei 와 C. glabrata 는 생성은균종동정에 매우중요한요소인데 PDCCB 에서만황녹색내지녹색으로착색되었다 (Table 4). 진균의분리배지에서균사및후막포자의 PDCC 와 PDCCB 에서 C. albicans는균사와후막포자를형성한반면그외 Candida균종은균사만을형성하였다 (Table 5). Table 2. Characteristics of gross and microscopic fmgdings in M. canis Incubation periods(14 days) CAA PDCC PDCCB Gross fmgdings Texture Cottony Cottony Reverse color No pigmentation Bri양1t yellow Diameter( cm) 5.8 7.8 Microscopic 센19dingS Microconidia Macroconidia Cottony No pigmentation 7.0 Table 3. Characteristics of gross and microscopic fmgdings in E. floccosum Incubation periods(14 days) Gross fmgdings Texture Reverse color CAA Downy No pigmentation Diameter( cm) 2.5 Microscopic fn 멍이 ngs Microconidia Macroconidia PDCC Downy to granular Dark brown 4.3 PDCCB Downy to granular No pigmentation 3.1 Table 4. Colonial color change of the media 3 days Incubation periods 5 days 7 days CAA PDCC PDCCB CAA PDCC PDCCB CAA PDCC PDCCB C. neoformans C. laurentii C. albicans /- C. krusei C'. glabrata YG G YG G YG : Yellow green G : Green 69
Table 5. αùamydospores production test of yeast Incubation periods(7days) C. neoformans C. laurentii CAA C. albicans C. krusei C. glabrata Hyphae PDCC Chlamydospore PDCCB CAA PDCC PDCCB N. 고 ;1:.. E 를 진균의동정은전통적으로육안적형태와현미경소견을기초로하고있는데그중육안 적소견은균의성장속도, 집락의착색등이 동정에중요한요소이다 (Rippon, 1988). 저자 들은 PDC 에 현재진균배양에널리사용되고있는 효모균중병원성진균으로많이분리 되고있는 C. albicans와 C. neoformans가간단하고신속하게동정되면서다른사상형진균 의집락에영향을주지않는배지를만들기위하여 PDC배지에 caffeic acid와 BCG를첨가 하여실험한결과다음과같은이점이있었 다. 피부사상균의 분류는 대분생자의 형태에 따라 Trichophyton속, Microsporium속, Epidermophyton속으로 구분한다 (Rippon, 1988; Elewski BE, 1989; Larone DH 1987). 이러한피부사상 균을동정하기위하여는집락의육안적형태 와현미경소견이기초가되는데, 육안적형 태로는배지의성장속도, 표면과뒷면의색상, 착색유무를관찰하고, 현미경소견으로는대분생자와소분생자의모양이균종을동정하는데중요한요소가된다 (Rippon, 1988; Elewski BE, 1989). 피부사상균의성장및착색을알아보기위하여 T. mentagrophytes, M. canis, E. floccosum 을 CAA, PDCC, PDCCB 배지에접종 하여배양하였다. T. mentagrophytes는 CAA 배지에서전형적인과립상의집락과연한갈색의뒷면을나타내었으나성장속도가 3 가지배지중에서가장느렸다. 그러나 PDCC배지는전형적인과립상의집락및뒷면의갈색착색과함께성장속도도가장빨랐으며소분생자도많이볼수있었다. M. canis는긴솜털모양의균사가방사상으로주위로퍼지는모양을볼수있었고, 뒷면의착색은 PDCC 에서빨랐다. 현미경소견은 CAA에서는대분생자와소분생자를볼수없었고, PDCCB에서는 BCG 의청색때문에피부사상균뒷면의착색을볼수없는단점이있었다. PDCC는대분생자와소분생자의생성이현저하게나타나며, 뒷면의착색도전형적으로나타나다른배지보다이점이있을것으로생각된다. C. neoformans 의집락에서나타나는갈색색소의생성원인은 Staib (1 962) 가적절한기질을첨가했을때갈색조를띤다고발표하였다. Shield and ajello (1 996) 는 Guizotia abyssinica씨앗에서추출한물질을첨가하여만든배지에서 C. neoφrmans만이갈색으로나타나선택배지로유용함을알았고, 그후에 diphenyl과 chloramphenicol 에 creatinin, Guizotia abyssinica 씨앗을첨가한배지에오염된가검물을배양하여 C. neoformans를선별적으로분리하는데 70
성공하였다. Korth와 Pulverer(1971 ) 는화학적으로제조된 caffeic acid를첨가하여 caffeic acid agar를고안하였고, Shaw와 Kapica(1972) 는 L-3, 4-dihydro- xyphenylalanine, chlorogenic acid, protocatechuic acid, catechol, norepinephrine 및 d뼈mine등이포함된배지에서 C. neoformans가갈색의색소를생산한다는사실을알았는데이색소는 mel뻐in색소이다. K won- chung( 1982, 1986) 은 C. neoformans melanin 색소생성능력을주요한발병인자로들고있는데이발병인자를보면 3TC 에서잘발육하여야하고, 협막을생성할수있어야하며 phenol oxidase를생성하여기질로이용해 melanin을합성할수있어야한다고하였다. 또한 C. neoformans가뇌로침투해병변을잘형성하는것은뇌에 dopamine 이많아 melanin합성이용이하기때문이라고추정하였다. C. neoformans 의착색유무를알아보기위하여 CAA, PDCC, PDCCB배지에균주를접종하여갈색의착색을관찰한결과 CAA에서는배양 5 일후에착색이나타나는데비해 PDCC, PDCCB 에서는배양 3 일후부터연한갈색의착색을나타내었다. PDCCB배지에는 C. krzμei 의집락이불규칙하며건조한연두색의착색을 C. glabarata는녹색의착색을나타내나다른효모균의집락은색깔의변화가없어쉽게구별할수있었다. 균사생성및후막포자의생성을보면 Cryptococcus균속은 3 가지배지모두에서분아포자만형성하였고C. albicans를제외한 Candidμ균속은 PDCC. 와 PDCCB 에서균사와분아포자를형성한반면 C. albicans는 PDCC, PDCCB 에서균사와분아포자및후막포자를관찰할수있었는데이는 PDCC, PDCCB 배지에 com meal agar성분이포함되어있기때문이라고생각된다. 이러한결과로볼때 PDCC는앞에서언급한대로 C. ne~φ rmans 의특징적인갈색의착 색과 C. albicans 에후막포자가생성되어동정 이 가능하므로진균의기초분리배지로사용 할때균사형및효모형진균의동정에도움이 될것으로생각된다. V. 렬론 PDC 배지에 caffeic acid 성분만단독으로첨 가한배지에서는피부사상균의전형적인집 락과착색을볼수있었고 C. neoformans 는집 락에갈색의착색이나타나쉽게동정할수 있었다. 또한 C. albicans 는후막포자가생성되 어진균의초대분리배지로의이용가치가높 을것으로생각된다. PDC 에 caffeic acid 와 BCG 를첨가한배지는 C. neoformans 가갈색, C. krusei 는연두색,c. glabrata 는하늘색, C. albicans 는후막포자를 형성하여효모균동정에는효과적이었으나 BCG 색소때문에피부사상균동정에가장중 요한뒷면의착색을볼수가없어피부사상균 의분리배지로는부적당하였다. 이상의실험결과로볼때진균의초대분리 배지로는 PDCC 가, 효모균의분리배양시에는 PDCCB 가기존에사용하고있는진균분리배지보다사용가치가있는것으로생각된다. 잠고문흰 1. Elewski BE, Hazen PG. The superficial mycoses and the dermatophytes. J Am Acad Dermatol 21:655-673, 1989 2. Fenn JP, Segal H, Barland B, Denton D, Whisenant J, Chun H, et al. Comparison of updated Vitek Yeast Biochemical Card and API 20C yeast idenification systems. J Clin Microbiol 32:1184-1187, 1994 3. Korth, H., and Pulverer, G. Pigment formation for differentiating Cryptococcus neoformans 71
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