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1 원 저 PCR-reverse Blot Hybridization Assay 을이용한피부사상균의동정 = Abstract = 연세대학교 1, 엠앤디 ( 주 ) 2, 한국의진균자원은행 3, 서울삼성병원 4, 전남대학교 5, 건국대학교 6, 건양대학교 7 김현정 1* 진현우 1* 김성현 1 왕혜영 2 최연임 1 방혜은 1 박제섭 3 이장호 4 원영호 5 안규중 6 김영권 7 이혜영 1 PCR-reverse Blot Hybridization Assay for Species Identification of Dermatophytes Hyunjung Kim 1*, Hyunwoo Jin 1*, Sunghyun Kim 1, Hye-young Wang 2, Yeonim Choi 1, Hyeeun Bang 1, Je-Seop Park 3, Jang-Ho Lee 4, Young Ho Won 5, Kyu-Joong Ahn 6, Young-Kwon Kim 7 and Hyeyoung Lee 1 Department of Biomedical Laboratory Science, College of Health Sciences, Yonsei University, Wonju, , M&D, Inc., Wonju Eco Environmental Technology Center, Wonju, , Korean Culture Collection of Medical Fungi (KCMF), College of Medical Science, Konyang University, Daejeon, , Department of Laboratory Medicine, Samsung Medical Center, Seoul, , Department of Dermatology, Medical School of Chonnam National University, Gwangju, , Department of Dermatology, Konkuk University School of Medicine, Seoul, , Department of Biomedical Laboratory Science, College of Medical Science, Konyang University, Daejeon, , Korea 7 Background: Dermatophytes (Trichophyton, Microsporum, and Epidermophyton) cause cutaneous mycoses called dermatophytosis. Forproper anti-dermatophytosis therapy, accurate and early diagnosis of dermatophytes is important. Laboratory diagnosis of dermatophytosis for dermatophytes still relies on microscopic and macroscopic examination of in vitro cultures and some physiological tests. These methods (conventional methods) are time-consuming (2~4 weeks) and yet, still have low sensitivity and specificity. Recently, in order to overcome such limitations of conventional methods, molecularbased methods have been developed to identify dermatophytes. The polymerase chain reaction-reverse blot hybridization assay (PCR-REBA) allows sensitive and specific identification of dermatophytes species. Objective: This study was aimed to develop a new PCR-REBA with higher sensitivity using less amount of probe concentration, so the assay can be more practical in clinical settings. 접수일 : 2011년 7월 21일, 수정일 : 2011년 9월 22일, 최종승인일 : 2011년 9월 22일 * These authors contributed equally to this work. Corresponding author: Hyeyoung Lee, Ph.D., Department of Biomedical Laboratory Science, College of Health Sciences, Yonsei University 1 Yonseidae-gil, Wonju-si, Kangwon-do , Korea. Tel: , Fax: , hyelee@yonsei.ac.kr Corresponding author: Young-Kwon Kim, Ph.D., Department of Biomedical Laboratory Science, College of Medical Science, Konyang University, Daejeon, , Korea. Tel: , Fax: , ykkim3245@konyang.ac.kr

2 Methods: For this, PCR primers and species-specific oligonucleotide probes were designed within the internal transcribed sequences 1 region between 5.8S and 18S rrna. The species-specific probes designed in this study was to identify 6 species (T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum, and E. floccosum) comprised 99% of dermatophytes isolatedin Korea. Results: The detection efficiency of the PCR-REBA was compared with the microscopic method, and the results showed that the sensitivity of the PCR-REBA developed in this study is 100 times higher than previously developed one. Subsequently, the results of PCR-REBA were evaluated using clinical isolates. DNAs from a total of 68 clinical isolates were analyzed by PCR-REBA, and the inconsistent results between PCR-REBA and conventional microscopic identification results were confirmed by sequence analysis. Conclusion: In brief, the results showed that results of sequence analysis were identical with PCR- REBA implying newly developed PCR-REBA is very useful method for accurate and rapid identification of dermatophytes and would provide higher simplicity, specificity, sensitivity than conventional method. [Korean J Med Mycol 2011; 16(3): 86-98] Key Words: Dermatophytes, Dermatophytosis, Molecular based method, Reverse blot hybridization assay 서 론 피부진균증은전세계의인구의 1/4 이상이감염되어있으며 1 우리나라에서도전체피부질환의 1/5 이상을차지할만큼널리퍼져있는피부질환이다 2. 이러한피부진균증은최근노령인구또는면역억제치료를받는면역결핍인구의증가, 약물의오용, 목욕시설및스포츠활동의확대로인해그발생빈도가증가하고있다 3~5. 피부진균증은피부사상균에속하는각질친화성사상형진균이피부, 모발, 손톱, 발톱등피부표피층에감염하여발생되며, 그증상은약하게나타나지만, 각질화된조직내에감염이되면면역기작에의해쉽게완치되지않아난치성으로발전하기쉽다 5. 피부진균증을유발하는대표적인피부사상균에는백선균속 (Trichophyton), 소포자균속 (Microsporum), 표피균속 (Epidermophyton) 이있으며현재까지세계적으로는약 40여종의원인균이알려졌지만, 우리나라에서는 Epidermophyton floccosum, Microsporum ferrugineum, M. canis, M. gypseum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, T. schoenleinii, T. verrucosum, T. violaceum, T. tonsurans 등약 여종이피부진균증의원인이되는것으로확인된바있다 3. 현재임상에서는인체감염부위또는증상에따라피부진균증을분류및진단하여항진균제의처방이이루어지고있다 3. 따라서, 임상적으로유사한증상을가지는다른피부질환으로의오진이쉽게야기될수있으며, 이에따른적절한항진균제의처방이어렵기때문에항진균제의오용으로인한치료기간의연장과장기복용에따른인체의부작용을야기할수있으므로, 신속하고정확한피부사상균의동정과각원인균에따른적절한항진균제의선택은피부사상균에의한병변의빠른완치에도움을줄수있다 5,6~9. 현재널리사용되고있는피부사상균의진단법은피부병변으로부터직접균사체를확인하는수산화칼륨 (KOH) 검사법 10, 진균배양검사법 10, 피부조직검사법 11 등이있다. 수산화칼륨 (KOH) 검사법은쉽고간편하게균을동정할수있으나민감도가낮아진균배양검사법을병행해야하는단점이있고, 진균배양검사법은피부병변에서직접배양할경우배양성공률이낮으며, 진균이완전히자라기까지오랜시간 (2~4주이상 ) 이걸리며피부사상균의배양조건에따라전형적인분생자의특징을잃을수있기때문에신속하

3 고정확한균동정이어렵다는단점이있다 5,7,11~13. 최근보고들에의하면피부사상균의전통적인진단법들이가지는단점보완을위해신속하고정확한결과를제공할수있는분자생물학적인진단법들이개발되었다 14. 대표적인예로중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR) 을기초로한진단법들이개발되고있다 10,13,15~16. 소량의피부사상균 DNA를증폭시킨후, 제한효소를처리하여나타난 DNA 절편의절단양상을비교하는제한효소단편길이다형성분석법 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 7,17, 실시간으로피부사상균 DNA의증폭확인및정량이가능한실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR) 18, 염기서열을직접분석하는염기서열분석 13, 각균종의특이유전자부위에만반응할수있는올리고뉴클레오타이드프로브를이용해표적균에만반응하는중합효소연쇄반응-역교잡법 (poly merase chain reaction-reverse blot hybridization assay, PCR-REBA) 19,20 등이있다. RFLP는간편한실험과정으로균동정이가능하다는장점이있으나, 전기영동을통해 DNA 절편의절단양상을비교하는과정중의변수가많다는단점이있다 7,17,21~22. 그리고 real-time PCR은현재널리많이개발중인분자생물학적인진단법으로써, 민감도와특이도가높고피부사상균의감염에대한정량적인분석이가능하다는장점이있지만한번의검사로검출할수있는수가제한되어있으며 18, 또한염기서열분석법은분자생물학적인진단법의표준검사법으로사용되고있으나, 피부상재균의오염이나피부사상균의중복감염시결과를판독하기어렵다는단점이있다 13. PCR-REBA는한번의검사로여러원인균을검출할수있고, 얇은막 (membrane) 을재사용함으로써검사비용을아낄수있고자동화가가능하다는장점을가지고있다 19,20. 본연구에앞서이미 PCR-REBA을이용하여피부사상균을동정하는진단법을개발한연구가있었으나 19, 이들이개발한 PCR-REBA는고농도의올리고뉴클레오타이드프로브를바탕으로실 험의민감도를높여실제임상에적용하기에비용이많이드는어려움이있었고, 검출할수있는균주의종류가국내실정과는맞지않은단점이있다. 따라서, 본연구에서는우리나라에서분리빈도가가장높은피부사상균 6종 T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum, E. floccosum를동시에신속하고정확하게동정할수있으며, 저농도의올리고뉴클레오타이드프로브를이용해최대의민감도를나타낼수있는 PCR-REBA을개발하였으며, 임상분리균주를이용해그성능을평가하였다. 재료및방법 1. Strain 및단일분리균주 2010년 5월부터 2011 년 6월까지국내종합병원으로부터분리하여한국의진균자원은행에기탁되어보관중인의진균목록중피부사상균을분양받아본연구에사용하였다. 피부상재균은연세대학교임상미생물학연구실에서제공받아사용하였다. 본연구에서사용한피부사상균의종류는표준균주 3종 (Trichophyton rubrum (ATCC 28188), Trichophyton mentagrophytes (IFM 48154), Epidermophyton floccosum (CBS ), 임상분리균 6종 (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Epidermophyton floccosum) 을대상으로실험을하였다. 그리고 PCR-REBA 의특이도를실험해보기위해서피부사상균이아닌진균 8종 (Malassezia furfur (KCMF 20409), Aspergillus oryzae (KACC 44847), Penicillium paneum (KACC 44823), Aureobasidium pullulans (KACC 41291), Aspergillus sydowii (41869), Bipolaris sorokiniana (KACC 44841), Cryptococcus neoformans (KCMF 20047), Candida albicans (KCMF 20403)), 피부상재균 2종 (Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Corynebacterium diphtheria (DML 460)) 을함께사용하였다

4 2. 피부사상균의배양 Sabouraud dextrose agar (SDA) 배지를이용해피부사상균배양에사용하였고, 배지는증류수 1,000 ml에 dextrose 분말 40 g, neopeptone 분말 10 g, Agar 분말 (Becton and Dickinson, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.) 15 g을넣고녹인후, 121 에서 15분간고압증기멸균한후, 60 까지식힌뒤, 배양접시에분주하고사용시까지냉장보관하였다. 피부사상균의표준균주와임상분리균주를 SDA 배지에접종한후, 집락의넓이가배지의 3분의 2 이상을덮을때까지 26 에서 2주에서 4주간배양하였다. 4주이상배양하더라도자라지않은검체는음성으로판정하고이번연구에서제외하였다. 3. 표준균주와임상분리균주에서의 genomic DNA 추출피부사상균으로부터 genomic DNA를추출하기위해 DNA Purification from Animal Tissue kit (SolGent, 대전, 한국 ) 를이용하였다. 상용화된핵산분리키트를사용하기이전단계로 5~10 mg 정도의균사체를 inoculation needle 로긁어 2 ml 시험관에옮기고, 액체질소를이용하여 1차동결시킨후, 동결건조기 ( 본듸로, ( 주 ) 일신바이오베이스, 양주, 한국 ) 를이용해 18시간동안동결건조하였다. 완전히건조된균사체를분쇄한후 DNA Purification from Animal Tissue kit (SolGent, 대전, 한국 ) 가권고하는실험법을균사체양과실험실환경조건에따라수정하여 DNA 추출하였다. 요약하면, 분쇄한균사체에 Cell lysis solution 500 μl 를넣고강하게교반한후 Proteinase K solution (20 mg/ml) 2 μl를넣고 55 에서 18시간동안반응하였다. 18시간동안반응이끝나면, 실온에꺼내어식힌후 Protein Precipitation Solution 200 μl 을넣고강하게교반하고 13,000 g에서 5분동안원심분리한후상층액을새로운 1.5 ml 시험관으로옮기고동량의 100% isopropanol을첨가하고 20회이상위, 아래로뒤집어섞고 -20 에서 30 분이상 DNA를침전하였다. 13,000 g에서 15분동안원심분리하여하얀색 DNA pellet을확인한뒤, 상층액을제거하고 80% 에탄올 1 ml을첨가한뒤, 5회이상위, 아래로뒤집어섞었다. 또다시상층액을제거하고 13,000 g에서 5분동안원심분리한뒤남아있는상층액은파이펫을이용하여완벽히제거한후시험관뚜껑을열고상온에서 10분동안건조시켰다. Kit 내구성물인 Hydration solution 50 μl을첨가하고 5초간위, 아래로섞어 DNA를녹이고 DNA가완벽하게녹을수있도록 4 에서 30분이상방치한후 RNase A (25 mg/ml) 를 2 μl 첨가하고 37 에서 30분동안반응시켰다. 마지막으로검체를 65 에서 60 분동안재수화시킨뒤, 사용시까지 4 에보관하였다. 4. 피부사상균의유전자수집및분석미국국립생물정보센터 (National center for biotechnology information, NCBI, ncbi.nlm.nih.gov) Genbank에서표적으로하는피부사상균들의 PCR 프라이머와올리고뉴클레오타이드프로브는피부사상균의정확한균동정을위해 18S ribosomal RNA (rrna) 와 5.8S rrna 의사이에존재하는 internal transcribed sequence 1 (ITS 1) 유전자를검색하여염기서열을수집하였다. 멀티얼라인 ( multalin) 을수행한후표적으로하는피부사상균들이공통으로가지는염기서열부위에서 2쌍의 primer를디자인하였고, 그중 reverse primer에는 PCR-REBA법을위해 biotin을 5' 말단에붙였다. 그리고 2쌍의 primer 내부에존재하는균특이부위에서각각의표적피부사상균을검출할수있는올리고뉴클레오타이드프로브를디자인하였고각올리고뉴클레오타이드프로브에는얇은막과펩타이드결합을할수있도록하기위해 5' 말단에 amine기를붙였다. 디자인한 primer와올리고뉴클레오타이드프로브는바이오니아 ( 대전, 한국 ) 에합성을의뢰하였다

5 5. 피부사상균으로부터추출한 genomic DNA로부터 ITS1 부위를표적으로한 one-tube nested PCR 추출한피부사상균의 genomic DNA를주형으로상용화된 Prime Taq Premix (2X) (GENET BIO, 논산, 대한민국 ) 를이용하여 PCR을수행하였다. Prime Taq Premix (2X) 의조성은 primer taq polymerase 1 unit/10 μl, 2X reaction buffer, 4 mm MgCl 2, enzyme stabilizer, sedment, loading dye, ph 9.0, 0.5 mm of each datp, dctp, dgtp, dttp이다. PCR을위한각조성은 Prime Taq Premix (2X) 10 μl, 2쌍의 10 pmole primer를각각 1 μl, ultrapure water 1 μl, 피부사상균 genomic DNA 5 μl, 총량을 20 μl 로하였다. 검사의민감도를높이기위해두쌍의프라이머를이용해 one-tube nested PCR을수행하였다. PCR 반응은초기변성과정을위해 95 5분, 일차증폭을위해 95 30초, 65 30초반응을 10번반복, 2차증폭을위해 95 30초, 60 30초반응을 40번반복후, 완전한신장반응을위해 72 10분간반응시켰다. PCR 반응이완료된 PCR 산물은 2% TBE (Trisborate-ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) agarose gel (W/V ratio) 에서 290 volt로 20분간전기영동하여 ethidium bromide에 10분간염색후자외선투과조명기로증폭여부를확인하였다. 6. ITS1 을기초로피부사상균동정을위한 REBA PCR 반응산물과 Denaturation solution (0.2 N NaOH, 0.2 mm EDTA) 을일대일로잘혼합한후 25 에서 5분간반응시켜이중가닥의 PCR 반응산물을단일가닥으로변성하였다. 반응하는동안균특이올리고뉴클레오타이드프로브가부착된얇은막에 2X SSPE/0.1% SDS (Hybridization solution) 100 ml을반응하였다. 변성된 PCR 반응산물을 Hybridization solution 130 μl와혼합한후, MN45 miniblotter system (immunetics, 보스턴, 매사추세츠주, 미국 ) 에 140 μl 점적하여, 25 에 서 30분간교잡하였다. MN45 miniblotter system (immunetics, 보스턴, 매사추세츠주, 미국 ) 로부터흡입기를이용하여 PCR 반응산물을완전히제거하고얇은막을미리데워둔 2X SSPE/0.5% SDS (Washing solution) 100 ml을이용하여 54 항온수조에서 90 rpm으로 2회세척하여비특이산물을제거하였다. 두번째세척이완료되기전에 Streptavidin-AP Conjugate (Roche, 독일 ) 를 Washing solution으로 1:2,000배희석하여미리준비한뒤 2회세척이끝난뒤 Washing solution을완전히제거하고 25 에서 30분동안얇은막전체에 AP solution이반응할수있도록 Rolling bottle (FHB15 Tube, Hyland Scientific, 시애틀, 워싱턴, 미국 ) 을이용하여얇은막과 AP solution을반응시켰다. 반응후 Washing solution을이용해 25 에서 5분씩 2회, 2X SSPE 용액으로 1분씩 2회세척하고 CDP-star (GE healthcare, 영국 ) 5 ml을 4분동안반응시켰다. 이후 Hyper TM film (GE healthcare, 영국 ) 에 10분간감광시킨후현상하여나온필름의결과를통해검출여부를판단하였다. 결과 1. 기존 Bergmans 등의 PCR-REBA 와의민감도비교 Bergmans 등의 PCR-REBA과본연구의 PCR- REBA의민감도비교를하기위하여, 계열희석한 T. rubrum의 DNA를가지고 PCR을수행한결과, Bergmans 등의 PCR은 1 pg 농도의 DNA 까지 449 bp의반응산물을확인하였고 19, 본연구에서디자인한 PCR은 100 fg 농도의 DNA까지 235 bp의 PCR 반응산물을확인하였다 (Fig. 1A, 1B). 이 PCR 반응산물들을가지고 Bergmans 등의 REBA와본연구의 REBA를실시하였다. 그결과, Bergmans 등의 REBA은 1 pg 농도의 DNA 까지증폭이가능하였고 19 본연구의 REBA로 10 fg 농도의 DNA까지증폭가능한민감도를가지는것을확인하였다 (Fig. 1C, 1D)

6 C D Fig. 1. Comparison of PCR-REBA sensitivity. (A) Using serially diluted T. rubrum DNAs for Bergmans' PCR. (B) Using serially diluted T. rubrum DNAs for PCR in this study. M, 100 bp DNA ladder (Bioneer, Daejeon), 1 ng (lane 1), 100 pg (lane 2), 10 pg (lane 3), 1 pg (lane 4), 100 fg (lane 5), 10 fg (lane 6), 1 fg (lane 7), and negative control (lane N); (C) and (D) REBA results. 2. PCR-REBA 에사용되는균특이올리고튜클레오타이드프로브의특이도검사표준균주를포함한피부사상균 (T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum, E. floccosum) 에대한올리고뉴클레오타이드프로브의특이도를확인하기위하여 PCR-REBA 를수행하였다. 실험에사용한모든피부사상균주들이본연구에서디자인한 Fungus-all 프로브와균특이적인올리고뉴클레오타이드프로브에양성반응을나타냈다. 또한 T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans가 Trichophyton-all 프로브에양성반응을나타냈고 M. canis와 M. gypseum가 Microsporum-all 프로브도양성반응을 나타냈다. 그리고각 T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum, E. floccosum 균특이적인올리고뉴클레오타이드프로브에피부사상균이특이적으로양성반응을나타냈다 (Fig. 2A). 각피부사상균검출용으로디자인한올리고뉴클레오타이드프로브가교차반응없이특이적인결합을하여피부사상균을정확하게동정하였다. PCR-REBA의특이도검사를위하여피부사상균이외에피부사상균이아닌진균과피부상재균으로알려진세균을대상으로 PCR-REBA를수행하였다. Malassezia furfur, Aspergillus oryzae, Penicillium paneum, Aureobasidium pullulans, Aspergillus sydowii, Bipolaris sorokiniana, Cryptococcus

7 대한의진균학회지 제16권 제3호 2011 A B Fig. 2. The specificity of PCR-REBA for identifying dermatophytes. (A) Using dermatohytes' DNAs; Vertical lanes: genus-specific and species-specific oligonucleotide probes. Horizontal lanes: PCR products of T. rubrum (lane 1), T. mentagrophytes (lane 2), T. tonsurans (lane 3), M. canis (lane 4), M. gypseum (lane 5), and E. floccosum (lane 6). (B) Using dermatohytes, other fungus, and normal flora bacteria DNAs; Vertical lanes: genus-specific and species-specific oligonucleotide probes. Horizontal lanes: PCR products of T. rubrum (lane 1), T. mentagrophytes (lane 2), M. canis (lane 3), M. gypseum (lane 4), E. floccosum (lane 5), Malassezia furfur (lane 6), Aspergillus oryzae (lane 7), Penicillium paneum (lane 8), Aureobasidium pullulans (lane 9), Aspergillus sydowii (lane 10), Bipolaris sorokiniana (lane 11), Cryptococcus neoformans (lane 12), Staphylococcus epidemidis (lane 13), Corynebacterium diphtheria (lane 14), Candida albicans (lane 15), and negative control (lane 16). neoformans, Staphylococcus epidemidis, Corynebacterium diphtheria, Candida albicans는 all-fungus 프로브와 균특이적인 프로브에서는 검출되지 않 4. 임상분리균주를 이용한 PCR-REBA의 유용 성 평가 았다 (Fig. 2B). 따라서, 진균 및 피부상재균은 어 임상분리균주를 대상으로 PCR-REBA법을 실 떠한 올리고 뉴클레오타이드 프로브에도 음성반 시하였다. 전체 임상분리균주 68개 중 54개의 임 응을 나타냈고, 디자인한 균특이 올리고뉴클레오 상분리균주는 전통적인 검사법에 의해 동정이 균 타이드 프로브가 피부사상균에만 양성반응을 나 종 수준까지 완료된 균주였으며 나머지 14종 중 타내는 것을 확인하였다. 4종은 균속 수준까지 완료된 균주, 나머지 10균 3. PCR-REBA에 사용되는 균특이 올리고뉴클 레오타이드 프로브의 민감도 소견 주는 동정 결과가 없는 균주였다. 이들 균주를 대상으로 본 연구에서 개발된 PCR-REBA를 수행 하였다. 그 결과 전통적인 검사법에 의해 균종 수 다음은 피부사상균의 검출을 위한 PCR-REBA 준까지 동정된 54균주 중 PCR-REBA법과 일치 의 민감도를 검사하였다. 각 균종마다 1 ng에서 하는 균주의 비율은 98.1% (53균주)이었고, 일치 1 fg까지 10배 계열희석한 피부사상균의 DNA를 하지 않은 균주의 비율은 1.9% (1균주)이었다. 각 가지고 PCR-REBA를 수행한 결과, T. rubrum, T. 균주별로 살펴보면, 피부사상균인 T. rubrum, T. mentagrophytes와 M. gypseum은 10 fg까지 양성신 mentagrophytes, M. canis, M. gypseum, E. floccosum 호를 나타냈고, M. canis는 100 fg까지, E. floccosum 은 100% 모두 일치하였고, 하나의 균주는 전통 은 1 pg까지 양성신호를 나타냈다 (Fig. 3). 적인 동정법으로 T. verrucosum으로 동정되었으나, PCR-REBA 결과는 T. mentagrophytes로 동정되었 다. 그리고 전통적인 검사법으로 Trichophyton 속

8 A B C D E Fig. 3. The sensitivity of PCR-REBA for identifying dermatophytes. (A) Using serially diluted T. rubrum DNAs (B) Using serially diluted T. mentagrophytes DNAs (C) Using serially diluted M. canis DNAs (D) Using serially dilutedm. gypseum DNAs (E) Using serially diluted E. floccosum DNAs; 1 ng (lane 1), 100 pg (lane 2), 10 pg (lane 3), 1 pg (lane 4), 100 fg (lane 5), 10 fg (lane 6), 1 fg (lane 7), and negative control (lane N). 으로균속수준까지동정된 4균주는 PCR-REBA 에의해 T. rubrum 3균주와 T. mentagrophytes 1균주로각동정되었다. 전통적인검사법에의해동정된결과가없던 10균주의 PCR-REBA 결과, T. rubrum가 8균주, T. mentagrophytes가 1균주, E. floccosum가 1균주로동정이되었다 (Table 1). 총 68균종의임상분리균주중에서전통적인동정법으로동정된결과와 PCR-REBA 결과가일치하지않은 1균주와전통적인검사법으로 Trichophyton 속으로동정된 4균주와동정되지

9 않은 10균주는염기서열분석법의뢰하였다. 그결과전통적인검사법과 PCR-REBA의결과가일치하지않은균주의염기서열분석결과는 T. mentagrophytes로동정되어 PCR-REBA 결과와일치하였으며, 전통적인동정법을이용하여 Trichophyton 속으로동정된 4개의균주는염기서열분석결과가 T. rubrum 3균주, T. mentagrophytes 1균주로분석되어 PCR-REBA의결과와일치하였다. 한편, 전통적인검사법으로동정결과가없었던 10균주의염기서열분석결과, T. rubrum 가 8균주, T. mentagrophytes가 1균주, E. floccosum가 1 Table 1. Comparison of isolates identification by microscopic method and PCR-REBA Microscopic PCR-REBA T. rubrum 35 T. rubrum 35 T. mentagrophytes 8 T. mentagrophytes 8 M. canis 5 M. canis 5 M. gypseum 3 M. gypseum 3 E. floccosum 1 E. floccosum 1 T. tonsurans 1 T. tonsurans 1 T. verrucosum 1 T. mentagrophytes 1 Trichophyton spp. 4 Unidentified samples 10 T. rubrum 3 T. mentagrophytes 1 T. rubrum 8 T. mentagrophytes 1 E. floccosum 1 Total 균주로동정이되었다 (Table 2). 따라서염기서열분석결과와 PCR-REBA의결과가일치하였다. 고찰피부사상균증은피부사상균의감염으로인해발생하는피부질환으로 1, 정확한균동정없이치료를시작하게되면치료실패확률이증가되며치료기간이연장되어환자에게신체적또는경제적인부담을안겨주게되므로피부진균증의원인균동정은중요하다 5. 현재우리나라에서피부진균증을일으키는원인균으로분리된피부사상균의 99.8% 는 T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum, E. floccosum이다. 그중에서 T. rubrum 이 92.0% 를차지하고있으며, T. tonsurans가증가하고있다 3. 현재임상에서피부사상균을동정하는방법으로는 KOH 검사와분리배양검사가있으나 10, 이러한전통적인검사법은양성율이낮고특히진균을배양하여균을동정하기까지오랜시간이걸리며, 오염균이나피부상재균에의한오염으로인해정확하게균을동정하는데어려움을겪고있다 1. 최근에는분자생물학적인검사법을이용하여피부사상균의 DNA를직접검출하는방법이널리사용되고있다 10,13~16. 본연구에서사용된 PCR-REBA법은 PCR을이용하여소량의 DNA 를증폭하고얇은막 (membrane) 에있는특이올리고뉴클레오타이드프로브와반응시켜검출하기때문에적은양의검체로도검출할수있고, Table 2. Comparison of the PCR-REBA with microscopic identification using dermatophytes clinical isolates Microscopic method PCR-REBA Sequence analysis T. verrucosum 1 T. mentagrophytes 1 T. mentagrophytes 1 Trichophyton spp. 4 T. rubrum 3 T. rubrum 3 T. mentagrophytes 1 T. mentagrophytes 1 T. rubrum 8 T. rubrum 8 Unidentified samples 10 T. mentagrophytes 1 T. mentagrophytes 1 E. floccosum 1 E. floccosum

10 김현정등 : Table 3. Comparison of the PCR-REBA with Bergmans's PCR-REBA and new developed PCR-REBA Oligonucleotide (Species) New developed PCR-REBA Sequence 5'-3' Target A mount of probe per lane (pmole/lane) Primer Primer Oligonucleotide (Species) Bergmans' PCR-REBA Sequence 5'-3' MF1 GCCDYACSGCCCCATTCTTGT ITS1 DERMF1 GGAAACGACCGCCCAGG CR1 Biotin-TCGCTGCGTTCTTCATCGATG 5.8S rrna gene MF2 CDYACSGCCCCATTCTTGTCTAC ITS1 CR2 Biotin-TGCGTTCTTCATCGATGCCGGA 5.8S rrna gene Probe Probe All-fungus Amine-CTTTCAACAACGGATCTCTTG 5.8S rrna gene DERMR2 Biotin-CGGAATTCTGCAATTCACATTACT 100 All-fungus Amine-AAG TAA AAG TCG TAA CAA GGT Target 18S rrna gene 5.8S rrna gene 18S rrna gene A mount of probe per lane (pmole/lane) Trichophyton Amine-AGCTGTCAGTCTGAGCG ITS1 100 Trich4 Amine-AGC TGT CAG TCT GAG CG ITS1 400 Microsporum Amine-ACACTCTTGAAAGAACATACC ITS1 100 Micro1 Amine-CAC TCT TGA AAG AAC ATA CC ITS1 800 T. rubrum Amine-ACAAGAA AAA ATTCTCTGAAGAG ITS1 100 Truso1 Amine-CAA GAA AAA ATT CTC TGA AGA G ITS1 800 T. mentagrophytes Amine-AGCCTCTCTTTAGTGGCTA AACG ITS1 500 Tment2 Amine-AGT GGC TCA ACG CTG G ITS T. tonsurans Amine-AGCCTCTCTTTATAGCGGCTCAAC ITS1 250 Ttons1 Amine-CTT TAT AGC GGC TCA ACG ITS1 400 M. canis Amine-A GGGGACTCTTGTTTCCTAG ITS1 100 Mcafe1 Amine-GGG GAC TCT TGT TTC CT ITS M. gypseum Amine-GAG TGA TTA AAA TCC ATG AAT ACT GTT ITS1 100 E. floccosum Amine-TACGAA ATCTCCATAGGTG ITS1 100 Efloc2 Amine-TAC GAA ATC TCC ATA GGT G ITS1 800 Tinte1 Amine-TAG TGG CTA AAC GCT GG ITS1 400 Tviol1 Amine-AGG AAA ATT CTC TGA AGG G ITS1 800 Tverr3 Amine-GAT CAG CGT TCC ATC AG ITS Maudo1 Amine-GGG GGA CTT TTG TTT CC ITS

11 중복감염시에도검출할수있다는장점이있다. Bergmans 등의연구팀에서이미 PCR-REBA를개발하였으나, 고농도의올리고뉴클레오타이드를사용하여비용이많이들고검출대상균주가국내에서분리되는균주와는차이가있었다 19. 본연구에서는국내실정에맞게검출대상균주를정하고, 단점을개선하였다. Bergmans 등이사용하는 PCR 조건에서의민감도보다높은민감도를나타내기위하여 PCR 반응산물의크기를 235 bp로작게증폭하도록프라이머를디자인하였고, PCR 반응온도와조건을조정하여민감도를극대화하였다. 그리하여 PCR에서민감도가 10배상승하였다. REBA에사용되는올리고뉴클레오타이드프로브도보다높은민감도를나타내는염기서열로수정및신규디자인하여 REBA 결과에서도 100배의민감도가상승하였다 (Fig. 1). 한편, 사용하는올리고뉴클레오타이드프로브의양이 Bergmans 등에서는최소농도 400 pmol/lane에서최대농도 3,200 pmol/lane 으로평균 1,077 pmol/lane 농도로사용하였으나 19, 본연구에서는최소농도 100 pmol/lane에서최대농도 500 pmol/lane으로평균 161 pmol/lane 농도를사용하였다 (Table 3). 이러한결과를볼때, Bergmans 등의 REBA 보다적은양의올리고뉴클레오타이드프로브를사용하면서높은민감도를나타냈기때문에경제적인측면에서볼때보다유용하다는것을확인하였다. 본연구에서개발한피부사상균검출 PCR-REBA의민감도가균종에따라차이가있지만 M. canis의경우는기존논문에서보다 100배, T. rubrum, T. mentagrophytes 와 M. gypseum은 10배뛰어난민감도를나타냈고, E. floccosum은동일한민감도를나타냈다. 그리고새로개발된 PCR-REBA의특이도검사를위해피부사상균이아닌진균과피부상재균을함께 PCR-REBA 수행해본결과, 피부사상균에만양성반응을나타냈다 (Fig. 2). 따라서본연구에서개발한 PCR-REBA법은피부사상균을검출하기위하여높은민감도와특이도를나타냈다. 전통적인동정법은배양환경, 슬라이드제작방법, 실험자의경험에따라검사결과의차이를나타낼수있기때문에, 피부사상균의정확한종동정이어렵다. 하지만임상분리균주를대상으로 PCR-REBA를수행해본결과, 전통적인동정법으로동정할수없었던균주들까지정확하게동정할수있었다. 새로개발된 PCR-REBA를평가하기위해염기서열분석법을실시하였고그결과, PCR-REBA와염기서열분석법의결과가일치하였다 (Table 2). 본연구는이미임상검체로부터분리배양된임상분리균주를대상으로 PCR- REBA를수행하였지만, 피부병변으로부터직접피부사상균의 genomic DNA를추출하여 PCR- REBA를수행한다면, 피부사상균을동정하는과정에있어정확함을높이는것뿐만아니라배양시간을줄여신속하게피부사상균의동정이가능할것이다. 결론본연구에서는전통적인피부사상균동정법이가지는단점을극복하고원인균을빠르고정확하게동정하고자임상분리균주를대상으로분자생물학적인방법인 PCR-REBA를수행하였다. 본연구에서사용한 PCR-REBA의경우에는 DNA를대상으로분석하기때문에 DNA만추출할수있으면정확한동정이가능하다는장점을이용하여전통적인피부사상균동정법보다신속하고정확하게피부사상균의동정결과를얻을수있었다. 본연구에서는피부사상균의종수준까지구분이가능하다고알려진 5.8S와 18S rrna사이에존재하는 ITS1 부위를표적으로하여 PCR-REBA를실시해본결과, 그민감도는기존에다른연구팀에서발표한결과보다약 100배정도높은민감도를보였고, 총 68개의임상분리균을이용하여유용성을검사한결과배양을기초로한방법으로정확하게동정할수없는검체들까지정확하게동정할수있었다. 따라서, 본연구에서개발한 PCR-REBA법은우리나라실정에맞는피부진균증을유발하는피부사상균을동정할때에

12 전통적인검사법을대신하여유용할것으로생각되며, 보다나은평가를위해서는보다많은수의임상분리배양균과직접검체에의한유용성평가가필요할것이다. REFERENCES 1. Havlickova B, Czaika VA, Friedrich M. Epidemiological trends in skin mycoses worldwide. Mycoses 2008;51: Jang SJ, Ahn KJ. Superficial dermatomycosis and the causative agents in Korea. Korean J Med Mycol 2004;9: Kim KH. Changing patterns of dermatophytosis and its causative agents according to social and economic developments in Korea. Korean J Med Mycol 2006; 11: Blanco JL, Garcia ME. Immune response to fungal infections. Vet Immunol Immunopathol 2008;15: 125: Garg J, Tilak R, Garg A, Prakash P, Gulati AK, Nath G. Rapid detection of dermatophytes from skin and hair. BMC Res Note 2009;18: Jessup CJ, Warner J, Isham N, Hasan I, Ghannoum MA. Antifungal susceptibility testing of dermatophytes: establishing a medium for inducing conidial growth and evaluation of susceptibility of clinical isolates. J Clin Microbiol 2000;38: Shin YM, Shin DH, Cho JS, Kim KH, Kim GJ. A comparative study of KOH preparation, fungal culture, histopathologic examination and polymerase chain reaction for diagnosis in onychomycosis. Korean J Med Mycol 2007;12: Gupta AK, Cooper EA. Update in antifungaltherapy of dermatophytosis. Mycopathologia 2008;166: Nweze EI, Mukherjee PK, Ghannoum MA. Agarbased disk diffusion assay for susceptibility testing of dermatophytes. J Clin Microbiol 2010;48: Robert R, Pihet M. Conventional methods for the diagnosis of dermatophytosis. Mycopathologia 2008; 166: Kwon OC, Baek SC, Cho BK. Significance of polymerase chain reaction for the detection of causative fungi of onychomycosis: comparison with fungus culture and KONCPA (KOH + nail clipping + PAS (periodic acid-schiff) stain). Korean J Dermatol 1999; 37: Dobrowolska A, Staczek P, Kaszuba A, Kozłowska M. PCR-RFLP analysis of the dermatophytes isolated from patients in central poland. J Dermatol Sci 2006; 42: Wengenack NL, Binnicker MJ. Fungal molecular diagnostics. Clin Chest Med 2009;30: Hay RJ, Jones RM. New molecular tools in the diagnosis of superficial fungal infections. Clinics in Dermatology 2010;28: Turin L, Riva F, Galbiati G, Cainelli T. Fast, simple and highly sensitive double-rounded polymerase chain reaction assay to detect medically relevant fungi in dermatological specimens. Eur J Clin Invest 2000; 30: Uchida T, Makimura K, Ishihara K, Goto H, Tajiri Y, Okuma M, et al. Comparative study of direct polymerase chain reaction, microscopic examination and culture-based morphological methods for detection and identification of dermatophytes in nail and skin samples. J of Dermatology 2009;36: Baek SC, Chae HJ, Houh D, Byun DG, Cho BK. Detection and differentiation of causative fungi of onychomycosis using PCR amplification and restriction enzyme analysis. Int J Dermatol 1998;37: Bergmans AM, van der Ent M, Klaassen A, Böhm N, Andriesse GI, Wintermans RG. Evaluation of a single-tube real-time PCR for detection and identification of 11 dermatophyte species in clinical material. Clin Microbiol Infec 2010;16: Bergmans AM, Schouls LM, van der Ent M, Klaassen A, Böhm N, Wintermans RG. Validation of PCR

13 reverse line blot, a method for rapid detection and identification of nine dermatophyte species in nail, skin and hair samples. Clin Microbiol Infect 2008; 14: Martin C, Roberts D, van Der Weide M, Rossau R, Jannes G, Smith T, et al. Development of a PCRbasedlineprobeassay for identification of fungal pathogens. J Clin Microbiol 2000;38: Bagyalakshmi R, Senthilvelan B, Therese KL, Murugusundram S, Madhavan HN. Application of polymerase chain reaction (PCR) and PCR based restriction fragment length polymorphism for detection and identification of dermatophytes from dermatological specimens. Indian J Dermatol 2008; 53: De Baere T, Summerbell R, Theelen B, Boekhout T, Vaneechoutte M. Evaluation of internal transcribed spacer2-rflp analysis for the identification of dermatophytes. J Med Microbiol 2010;59: