J Korean Med Ophthalmol Otolaryngol Dermatol 2018;31(4):1-12 pissn 1738-6640 eissn 2234-4020 http://www.ood.or.kr http://dx.doi.org/10.6114/jkood.2018.31.4.001 Original Article / 원저창출금련탕 ( 蒼朮芩連湯 ) 추출물의항산화및 항염증활성에미치는영향 원혜련 1 박혜수 2 김이화 3 김용민 4 1 세명대학교한방화장품과학과 ( 대학원생 ) 2 세명대학교한의과대학안이비인후피부과학교실 ( 수련의 ) 3 세명대학교한의과대학경락경혈학교실 ( 교수 ) 4 세명대학교한방화장품과학과 ( 교수 ) The anti-oxidant and anti-inflammatory Activites of Changchulgeumryeontang Extract Hea-Ryeon Won 1 Hye-Su Park 2 Ee-Hwa Kim 3 Yong-Min Kim 4 1,4 Dept. of Oriental Cosmetic Sciences, Semyung University 2 Dept. of Oriental Ophthalmology, Otolaryngology & Dermatology, College of Korean Medicine, Semyung University 3 Dept. of Meridian and Acupoint, College of Korean Medicine, Semyung University Abstract Objectives : This study investigated the anti-oxidant and anti-inflammatory activities of Changchulgeumryeontang (CCGRT) extract. Methods : The macrophage cell line RAW 264.7 cells were used and MTT assay was performed to measure the cell viabilities at the various concentrations of CCGRT (25-200 μg / ml ). Nitric oxide (NO) and prostaglandin E 2 (PGE 2 ) were measured in LPS-induced RAW 264.7 cells. Expressions of inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β and IL-6 were also performed by real-time PCR. The anti-oxidant activities of CCGRT was measured by DPPH radical scavenging activity. Results : 1. there was no cytotoxicity in RAW264.7 cells treated with CCGRT compared to the control. 2. CCGRT treated group significantly inhibited NO and PGE 2 production compared to the LPS treated group. 3. CCGRT treated group significantly decreased mrna expressions of inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β and IL-6 compared to the LPS treated group. 4. CCGTR was found to have high DPPH free radical scavenging ability. c 2018 the Society of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology This is an Open Access journal distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/license/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 1
Conclusions : According to the above results, CCGRT may be a potentional choice for the treatment of inflammatory skin disease. Key words : Anti-inflammation; Anti-oxidant; nitric oxide (NO); Prostaglandin E 2 (PGE 2); Changchulgeumreontang (CCGRT) Ⅰ. 서론 최근산업화가심화되면서주거환경및식생활의 변화, 유전적영향, 환경오염등에의해발생되는화 학적, 생물학적유해인자들의노출로다양한연령층에 서면역조직이상으로유발된염증반응및아토피질 환과같은피부염증성질환의발생이크게증가하고 있다 1). 또한산업화에따른현대사회의급격한경제 성장으로인해현대인들의삶의질이상승되고건강 과미에대한욕구및노화에대한관심이점차늘어 나면서천연자원이나한약추출물을이용한항산화 및항염작용에관한연구가활발하게이루어지고있 는추세이다 2). 현대사회에서급증하고있는만성염증성질환및 생활습관병등은생체의대사과정중산화반응에서 발생한활성산소류 (reactive oxygen species, ROS) 에의한다고볼수있다 3). 활성산소는생체내의물질 과반응하여산화적스트레스를유발하고이러한산 화적스트레스는인체내다양한조직세포를손상시 켜노화와고혈압, 당뇨병, 동맥경화, 비만, 암, 아토 피성피부염등여러만성염증성질환을유발시키며 4), 이러한만성염증성질환들이임상에서차지하는 비율이증가함에따라체내에서활성산소소거능을 가진항산화물질에대한관심이높아지고있다. 활성산소의하나이면서고농도에서세포의기질적 손상을유발하는 nitric oxide(no) 는염증반응시 inducible NO synthase(inos) 에의해과생성되어 부종, 발열, 조직손상등의염증반응을촉발한다 5). Corresponding author : Yong-Min Kim, Dept. of Oriental Cosmetic Sciences, Semyung University, Jecheon, Chungbuk 27136, South Korea. (Tel : 043-653-6303, E-mail : dragonroom@hanmail.net) Received 2018/10/9 Revised 2018/11/5 Accepted 2018/11/12 염증반응은상처나감염등의외부의자극에의한생체조직의 1차적면역반응과정중의하나로서발열, 발진, 부종, 통증, 혈관투과성등을유발하는국소적반응으로 3,5), 이러한염증과정중에 inos에의해발생되는 NO와 cyclooxyfenase-2(cox-2) 에의해생성되는 prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 등의염증매개물질들은대사과정에서 NO 형성과정으로다시이어지게된다 5,6). 또한 tumor necrosis factor- α (TNF-α), interluekin-1α(il-1α), interluekin-1β (IL-1β), interluekin-6(il-6) 등의염증매개 cytokine 등은 nuclear transcription factor -kappa B(NF-κB) 라는전사인자에의해합성이조절되며, ROS의생성을촉진시킴에따라여러염증성질환들을악화시킬수있다 5,6). 창출금련탕 ( 蒼朮芩連湯, Changchulgeumryeontang, CCGRT) 은 張氏醫通 卷十五에수록되어창출, 황금, 황련, 목향, 지실, 반하, 시호, 승마, 천궁, 후박, 길경, 목통, 감초등으로구성되어있고 治瘴癘濕熱 하는효능으로염증성피부질환에사용가능한처방으로생각되나, 현재까지본처방에대한실험적연구는보고된바없었다. 이에본연구에서는 CCGRT 가항염증및항산화작용에어떠한효과가있는지조사하기위하여 RAW 264.7 대식세포를이용하여세포독성, NO, PGE 2 생성량, inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β 그리고 IL-6의발현을알아보고자하였다. Ⅱ. 재료및방법 1. 실험재료 CCGRT 을제조하기위한약재는 ( 주 )HMAX( 충청 2
원혜련외 3 인 : 창출금련탕 ( ) 추출물의항산화및항염증활성에미치는영향 북도제천시 ) 에서구입하였으며, 용량은다음과같다 (Table 1). Table 1. Contents of Changchulgeumryeontang Herbal Weight Pharmacognostic Name name (g) 蒼朮 Atractylodes lancea D.C 24g 黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi 16g 黃蓮 Coptis japonica Makino 16g 木香 Aucklandia lappa Decne 16g 枳實 Poncirus trifoliate Rafinesqul 16g 半夏 Pinellia ternate Breitenbach 16g 柴胡 Bupleurum falcatum 16g 升麻 Cimicifuga heracleifolia 16g 川芎 Cnidium officinale 16g 厚朴 Magnolia officinalis Rehder et Wilson 16g 桔梗 Playtcodon grandiflorum 16g 木通 Akebia quinata Decaisne 16g 甘草 Glycyrrhiza uralensis Fischer 16g Total 216g 2. 시료조제 상기의한약재들을 3 차증류수 2,000 ml와함께넣 은뒤 heating mantle 을이용하여 4 시간동안가열 하고 6 시간냉각시켜 CCGRT 를제조하였다. 추출물을 얻은후거즈로 1 차여과한후여과지로 2 차여과를진 행하였다. 여과를마친후여과액을감압농축하여 100 ml농축액을얻었다. 농축액을 80 냉동고에얼린후 동결건조한뒤분말을얻어시료로사용하였다. 동결건 조추출물은 43g 을얻었고수율은약 20% 이다. 3. 세포배양 본연구에서 RAW 264.7 대식세포는 Amerian Type Culture Collection (ATCC) 에서분양받아 실험에사용하였다. 배양시배지는 10% fetal bovine serum (FBS; GenDEPOT, USA) 와 1% penicillin/streptomycin (GenDEPOT, USA) 이첨 가된 Dulbecco s modified eagle s medium (DMEM; GenDEPOT, USA) 을사용하였으며, 37, 5% CO 2 incubator (MCO-17AIC, SANYO, Japan) 에 서배양하였다. 4. 세포생존율측정 CCGRT 의세포독성을검사하기위해 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Bio basic, Canada) assay 를시행 하였다. RAW 264.7 대식세포를 96 well plate 에 5 10 4 cell/well 의세포수가되도록분주하고, 24 시 간동안 37, 5% CO 2 incubator 에서배양하였다. 그후 CCGRT 의농도가 25, 50, 100 및 200 μg / ml이 되도록처리하였다. 24 시간동안 37, 5% CO 2 incubator 에서배양후, MTT 용액 (4 mg / ml ) 을 20 μl 가한뒤 4 시간동안반응시켰다. 그후상층액을제거 하고 DMSO 100 μl를첨가하여용해시킨후 MTT 환 원에의해생성된 formazan 을 ELISA microplate reader (SoftMax Pro5; Molecular Devices, Sunnyvale, California, USA) 를이용하여 570 nm에 서흡광도를측정하였다. 세포생존율은다음의산출식 에따라 % 로나타내었다. 실험군의흡광도세포생존율 (%) = x 100 대조군의흡광도 5. RAW 264.7 대식세포에서의 NO 생성능측정 NO 의생성량은염증유도물질인 lipopolysaccharide (LPS, Sigma, USA) 와 CCGRT 를농도별로처리하여 RAW 264.7 대식세포배양액중에존재하는 NO 의 양을 Griess reagent (Sigma, USA) 을사용하여측 정하였다. RAW 264.7 대식세포를 96 well plate 에 5 10 4 cells/well 의세포수가되도록분주하고, 24 시간동안 37, 5% CO 2 incubator 에서배양하였 다. 그후 CCGRT 를 25, 50, 100 및 200 μg / ml와 LPS (1 μg / ml ) 을동시에처리하여 24 시간동안배양하 였다. 그다음세포의배양액을 100 μl를다른 96 well plate 에옮겨준후, Griess reagent 를 100 μl처리하였 다. 실온에서 10 분동안방치한후, ELISA microplate 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 3
6. PGE 2 측정 LPS로염증이유도된 RAW 264.7 macrophage cells를사용하여 PGE 2 의생성을 PGE 2 ELISA kit (abcam, UK) 을사용하여측정하였다. 6 well plate 에 RAW 264.7 대식세포를 5 x 10 5 cells/well 로분주한뒤 24시간동안 37, 5% CO 2 incubator 에안정화시켰다. 24시간뒤 CCGRT 농도 25, 50, 100 및 200μg / ml가되도록 LPS (1μg/ ml ) 와동시에처리하고배양하였다. 배양후상층액을 13,000rpm 에서 15분원심분리하여 PGE 2 정량에사용하였다. Goat anti-mouse IgG가코팅되어있는 96 well plate에상층액을농도별로각 well에첨가하였다. PGE 2 alkaline phosphate conjugate 를 50μl첨가한뒤 PGE 2 antibody 를 50μl첨가하여실온에서 2 시간동안반응시켰다. 반응후 1 x wash buffer를사용하여 2 3회세척한뒤 PnPP substrate 를 200 μl첨가하고실온에서 45분배양한후 450nm에서흡광도를측정하였다. 7. 염증성사이토카인의 mrna 발현측정 RAW 264.7 대식세포에서의 CCGRT가갖는 inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β 그리고 IL-6 발현억제효과를확인하기위해 realtime PCR 분석을진행하였다. 6 well plate에 5 x 10 5 cells/well 로분주한뒤 24시간동안 37, 5% CO 2 incubator 에서안정화시켰다. 24시간뒤 CCGRT 최종농도가 25, 50, 100 및 200μg / ml가되도록 LPS (1μg/ ml ) 와동시에처리하고배양하였다. 24시간뒤 Trizol reagent (Ambion, USA) 를사용하여 RNA를추출하였다. 추출된 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC treated-water; Sigma, USA) 로용해하여사용하였고, cdna 합성 kit (Revetra ACE-α-; Toyobo, Japan) 를통해 total RNA (2μg) 으로 cdna를합성하여사용하였다. cdna 합성후유전자들의상대적인양은 Tagman master mix (Thermo fisher, USA) 10μl, 멸균수 4μl, primer 1μl, cdna 5μl를혼합하여 inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β, IL-6를실시간으로유전자별 mrna분석에사용하였다. 실험에사용된 probe들은 Table 2에나타냈다. 8. DPPH radical 소거능측정 DPPH radical 소거능을측정하기위해시료와 DPPH assay을실시하였다. 96 well plate에 CCGRT 를 25, 50, 100 및 200μg / ml의농도로 MeOH (Methanol) 에희석하여 100μl씩처리하고, DPPH (250μm ) 용액 100μl을처리하였다. 실온에서빛을차단하고 30분반응시킨후 microplate reader 을사용하여 520nm에서흡광도를측정하였다. Positive control 은 ascorbic acid (200μm ) 를사용하였다. 9. 통계처리실험결과는 SPSS 12.0 version (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) 프로그램을이용하였다. 모든데이터는평균 ± 표준편차로표시하였고, CCGRT의효과를판정하기위한통계학적분석은독립표본 t-test (independent t-test) 를통하여비교분석하 Table 2. Gene Name and Assay ID Number in Realtime PCR Analysis Symbol Gene name Assay ID GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Mm99999915_g1 inos Inducible nitic oxide synase Mm00440502_m1 IL-1α Interleukin 1 alpha Mm00439620_m1 IL-1β Interleukin 1 beta Mm004344228_m1 IL-6 Interleukin 6 Mm00446190_m1 NF-κB Nfkb1 Mm00476361_m1 4
원혜련외 3 인 : 창출금련탕 ( ) 추출물의항산화및항염증활성에미치는영향 였다. 시료의농도는각각 25, 50, 100 및 200 μg / ml 처리했을때를대조군과비교하였다. 다 (Fig. 2). Ⅲ. 결과 1. 세포생존률 CCGRT 를각각 25, 50, 100 및 200μg / ml의농도로배양한 RAW 264.7 대식세포의생존율을관찰한결과, control 군에비해서 96.86 ± 5.62%, 95.56 ± 3.42%, 99.15 ± 4.62% 및 104.4 ± 3.45% 로나타났다. 이러한결과, CCGRT 는 25, 50, 100 및 200μg / ml농도범위에서 RAW 264.7 대식세포에서통계학적으로유의하게독성이없음을확인하였다 (p>0.05)(fig. 1). Fig. 2. Effect of CCGRT the NO Production in RAW264.7 cells. control: untreated group; LPS: treated with LPS (1 μg / ml ); 25, 50, 100 and 200: treated with LPS and CCGRT ( μg / ml ). Values are relative to the control. *p < 0.05 indicate a significant different from the LPS. 3. PGE 2 생성저해효과 CCGRT 의 NO 생성저해능을확인하고또다른염증유발매개체인 PGE 2 의생성억제효능을평가하였다. LPS로염증이유도된 RAW 264.7 대식세포에서 PGE 2 의생합성이증가함을확인하였다. LPS 처리군에서 PGE 2 의농도는 602.22 ± 2.907pg/ ml로증가하였다. 또한 CCGRT (25, 50, 100 및 200μg / ml ) 처리군에서 PGE 2 농도는 594.5 ± 5.34, 592.78 ± Fig. 1. Effect of Changchulgeumryeontang (CCGRT) on the Toxicity of RAW 264.7 Cells. Control: untreated group; 25, 50, 100, 200: treated with various concentrations of CCGRT ( μg / ml ). values are represented to the mean ± SD. 2. NO 생성에미치는영향 RAW 264.7 대식세포에서의 NO 생성에대한 CCGRT 의저해효과를측정하였다. LPS 단독처리한군의 NO 생성율은 389.71 ± 9.35% 로증가하였다. 한편 LPS와 CCGRT 를 25, 50, 100 및 200μg / ml의농도로처리한군에서는 364.27 ± 6.75%, 335.31 ± 13.2%, 326.6 ± 5.65% 및 294.69 ± 7% 로나타나 LPS 처리군에비하여농도의존적으로감소하였 Fig. 3. Effect of CCGRT the PGE2 Production in RAW 264.7 cells. Control: untreated group; LPS: treated with LPS (1 μg / ml ); 25, 50, 100 and 200: treated with LPS and CCGRT(25, 50, 100 and 200 μg / ml ). Values are relative to the control. *p < 0.05 indicate a significant different from the LPS. 5
2.12, 564.78 ± 0.39 및 498.78 ± 4.64pg/ ml으로나타나 CCGRT 는 LPS로유도된 PGE 2 의생성이농도의존적으로억제됨을볼수있었다 (Fig. 3). 4. inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β 그리고 IL-6 의 mrna 수준에서미치는영향 서갖는 inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β 그리고 IL-6 의 mrna발현효과를분석하였다. INOS, NF-κB, IL-1α, IL-1β and IL-6의발현은 LPS 처리군과비교하였을때농도의존적으로감소하는것을확인하였다. 따라서 CCGRT 는염증매개물질발현저해를통한항염증효능이있음을나타냈다 (Fig. 4). CCGRT 가 LPS 로유도된 RAW264.7 대식세포에 Fig. 4. Effect of CCGRT on LPS-induced inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β and IL-6 mrna Expressions in RAW 264.7 Macrophage Cells. LPS: treated with LPS (1 μg / ml ); 25, 50, 100 and 200 μg / ml : treated with various concentrations of CCGRT with LPS (1 μg / ml ). Values are relative to the control. *p < 0.05 indicate a significant different from the LPS. 6
원혜련외 3 인 : 창출금련탕 ( ) 추출물의항산화및항염증활성에미치는영향 5. DPPH radical 소거능 CCGRT 의의한 free radical 소거능을통하여항 산화효과를알아보기위하여 DPPH assay 를수행하 였다. 또한 CCGRT 를 25, 50, 100 및 200 μg / ml의 농도범위로처리한군에서는 DPPH free radical 소 거능이 8.156 ± 0.14%, 27.33 ± 1.01%, 46.853 ± 1.35% 및 72.532 ± 2.69% 로나타났다. 이러한 결과 CCGRT 의농도의존적인 free radical 소거능 을확인할수있었다 (Fig. 5). Fig. 5. DPPH Free Radical Scavenging Capability of Extract. Ascorbic: treated with ascorbic acid (200 μm ). 25, 50, 100 and 200 μg / ml : treated with various concentrations of CCGRT. Ⅳ. 고찰 피부염증반응은생체조직에물리작용이나화학물 질, 세균감염등어떠한기질적변화가가해질때, 이 에대해방어할수있도록다양한작용기전이빠르게 활성화되는숙주의방어작용이다. 이러한반응은대식 세포 (macrophage) 에서유도되는면역반응에서가 장중요한반응으로알려져있다 8). 염증반응에서중 요한역할을하는 nuclear transcription factor- kappa B(NF-κB) 는다양한사이토카인합성을조절 하는전사인자이다 9). NF-κB 는핵안으로들어가전 사인자로서작용하여 interleukin-6 (IL-6), interleukin- 1α (IL-1α), interleukin-1β (IL-1β) 등염증관련 cytokine 을합성하고 10,11), nitric oxide (NO), prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 와같은다양한염증성매개물질들이생성한다. 구체적으로살펴보면, NO는체내방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장등의다양한생리기능을가지고있으며, 3종류 NOS인 neuronal nitric oxide synthase (nnos), endothelial nitric oxide synthase (enos), inducible nitric oxide synthase (inos) 에의해합성되고, 이들 NOS 중 inos에의한 NO 생성이절대적으로많으며이는병리적으로중요한작용을한다 12). INOS는외부자극을받으면대식세포등다양한세포에서발현되어다량의 NO을생산한다고보고되고있다 13). PGE 2 는혈관의확장과혈관벽의투과성을높이고염증부위로면역세포들이모이게할뿐만아니라 IL-6와같은염증성사이토카인의분비를촉진시킨다 14). 생화학적산화반응은생체내에서필요한에너지공급을위해끊임없이일어나며이과정에서항상발생하는활성산소를생성하는데 15), 활성산소는정상적인대사과정에서도소량씩생성되며세포기능유지에필요한물질이지만환경오염이나화학물질에대한노출, 스트레스, 비만등에의하여생성량이증가하거나제거시스템의기능이약화되는경우활성산소가세포구성성분과강하게반응하여세포와조직에손상을가한다 16). 또한활성산소에의한세포외조직의지속적인손상은 DNA 변성 17), 단백질분해 18), 이온수송계손상 19), 암 20), 노화 21) 등을초래하게되며, 활성산소는 NF-κB를활성화시켜여러조직에서 inos, IL-1 그리고 IL-6 등의염증촉진물질들을증가하게한다 22,23). 이러한과정에의해다양한만성염증성질환이유발되는데, 현대사회의서구화로인해아토피성피부염, 암, 당뇨병, 비만등다양한만성염증성질환이증가하고있고급격한경제성장으로인한삶의질향상및미에대한욕구와웰빙 (well-being) 문화가확산되고있는추세에따라노화방지와활성산소소거 7
능이있는항산화물질및항염작용을갖는생리활성물질등을천연물이나한약재에서찾는연구가활발하게이루어지고있다 2-6). 본연구에서사용된창출금련탕 ( 蒼朮芩連湯 ) 은한의학고서인 張氏醫通 에수록되어있는처방중에하나로약재는창출 ( 蒼朮 ), 황금 ( 黃芩 ), 황련 ( 黃蓮 ), 목향 ( 木香 ), 지실 ( 枳實 ), 반하 ( 半夏 ), 시호 ( 柴胡 ), 승마 ( 升麻 ), 후박 ( 厚朴 ), 길경 ( 桔梗 ), 목통 ( 木通 ), 감초 ( 甘草 ), 천궁 ( 川芎 ) 으로구성되어있으며, 治瘴癘濕熱 이라하여체내에濕熱과같은山嵐瘴氣및外邪등이피부사이에침투함으로인해염증질환발생시정기를보존하고邪氣를몰아내어소염시키는작용을가진다 7). 구성약재중에서군약으로사용되는창출은박등 24) 에의해소염및항산화활성작용을갖는것으로연구되었으며, 황금은윤등 25) 이 LPS로유도된대식세포의 cytokine 과염증인자생성을유의하게억제함을보고하였고, 황련은이등 26) 이항염효과를, 김등 27) 이항산화활성효과를보고한바있다. 또한목향은항염, 항균작용및 inos 생성억제등으로항산화효능이있음이보고되었으며 28), 길경은김등 29) 의연구에의해부종억제를통한급성염증에항염효과가있음이밝혀졌고, 감초또한박등 30) 의연구에서 NO생성에영향을미쳐항염증효과가있다고보고된바있다. 이외에도지실은항균및항산화효과 31,32), 반하는 cytokine 을억제하는항염효과 33), 시호는염증성대장염에대한치료효과등 34) 이보고되었고, 승마는항알레르기효과 35), 후박은항산화및항암효과 36), 목통은항산화및항균활성효과 37), 천궁은항산화및항당뇨활성효과등 38) 을가지는것으로연구된바있다. 이를통해창출금련탕은군약인창출을비롯해항염, 항균, 항산화작용등을가진여러약재들로구성되어있다고볼수있으나, 현재이러한항산화활성및항염증효과가있다고보고되어온약재로구성된창출금련탕에대한항염증및항산화작용과관련된연구는전무한실정이다. 이에저자는 CCGRT 의항염증및항산화효과를알아보기위해서세포생존률에미치는영향, 항산화활성에미치는영향, NO생성에미치는영향, PGE 2 생성, realtime PCR을통한 inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β 및 IL-6 mrna 발현량등에대해실험하였다. 실험에앞서 CCGRT 의세포독성평가를위해 RAW 264.7 대식세포의생존율을측정하였다. RAW 264.7 대식세포의생존율측정에서 CCGRT 25, 50, 100 및 200μg / ml농도별로처리한결과모두대조군과비교하여세포생존율에유의한차이가없었다 (Fig. 1). 따라서 CCGRT 는 200μg / ml의농도까지 RAW 264.7 대식세포에서통계학적으로유의한독성이없음을확인하였다 (p<0.05). CCGRT 의항염증효과를입증하기위하여 NO 생성, PGE 2 생성에미치는효과를조사하였다. NO 생성실험결과 LPS를처리한군은대조군에비해서유의하게증가하였고 (p<0.05), CCGRT 200μg / ml는 LPS처리군과비교하였을때약 35% 감소하였다 (Fig. 2). PGE 2 의생성또한 CCGRT 는 LPS 처리군에비해서약 19% 감소하였다 (Fig. 3). 위의사실을기초로하여 NO의생성저해기전을알아보기위한 realtime PCR을수행하였다. INOS, NF-κB, IL-1α, IL-1β 및 IL-6 mrna발현을분석한결과 inos 발현억제는 NO의생성억제와유사한경향을보였으며, NO의생성억제는 inos의발현저해에기인하여나타난것임을알수있었다. NF-κB, IL-1α, IL-1β 그리고 IL-6의발현은또한농도의존적으로감소하는것을확인하였다 (Fig. 4). CCGRT 의항산화효과를입증하기위하여, DPPH 소거활성을조사하였다. 본실험에서는 DPPH시약을사용하여 CCGRT 를 25, 50, 100 및 200μg / ml농도별로항산화효과를측정한결과, CCGRT 의농도의존적으로높은활성을보여항산화효과가뛰어난것을확인하였다 (Fig. 5). 이상의결과는 CCGRT 가 LPS 유도성염증모델에있어서항염증효과가있었고, 또한 DPPH 소거활성 8
원혜련외 3 인 : 창출금련탕 ( ) 추출물의항산화및항염증활성에미치는영향 을통해항산화효과가있음을확인하였다. 따라서 CCGRT 를향후급성또는만성염증성피부질환에활용할수있을것으로판단되나, 본연구에서는 CCGRT 가어떠한기전으로항염증및항산화효과를발휘하였는지에대해서는밝히지못하였기에차후추가적인연구가필요할것으로사료된다. Ⅴ. 결론 LPS로유도된 RAW 264.7 대식세포에서의염증반응에대한 CCGRT 의항염증및항산화작용을규명하기위해 CCGRT 의 NO, PGE 2 생성조절및 DPPH free radical 소거능, realtime PCR에대한영향을실험한결과다음과같은결론을얻었다. 1. CCGRT 는 RAW264.7 대식세포에서 MTT에의한세포독성을관찰한결과 25-200μg / ml에서세포독성이없었다. 2. NO, PGE 2 생성을측정한결과 CCGRT 는 LPS에의해유도된 RAW 264.7 대식세포에서 NO생성과 PGE 2 생성을농도의존적으로감소시켰다. 3. LPS에의해유도된 inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β 그리고 IL-6 mrna 발현또한유의하게감소시켰다 (p< 0.05). 4. DPPH free radical 소거능을관찰한결과 CCGRT 의농도가높아질수록높은항산화효과가나타났다. 이상의실험결과 LPS로유도된 RAW264.7 대식세포에서 NO, PGE 2 inos, NF-κB, IL-1α, IL-1β 그리고 IL-6를억제시킴으로써항염증효과를나타내는것으로확인되었으며, 또한 DPPH free radical 을감소시킴으로써항산화효과를내었다. * 이논문은세명대학교석사학위졸업논문임. ORCID Hea Ryeon Won (https://orcid.org/0000-0001-7407-8140) Hye Su Park (https://orcid.org/0000-0003-2430-532x) Ee Hwa Kim (https://orcid.org/0000-0003-0400-9056) Yong Min Kim (https://orcid.org/0000-0002-3064-9412) References 1. Lee JY, Yoo DH, Joo DH, Kim SR, Jo HS, Joo SH, et al. Anti-inflammatory effects of amelanchier asiatica fruits ethanol extract. J Soc Cosmet Sci Korea. 2017;43(1):19-26. 2. Yoon JM, Kim DI, Lee JH, Han SJ, Kim HE, Kim HJ, et al. Study on Anti-oxidant and Anti-inflammatory Activity of Eggplantcheongyeolsodokum. J Soc Cosmet Sci Korea. 2017;43(2):125-35. 3. Jeong SI, Kim HS, Jeon IH, Kang HJ, Mok JY, Cheon CJ, et al. Antioxidant and Anti-inflammatory Effects of Ethanol Extracts from Perilla frutescens. KOREAN J FOOD SCI TECHNOL Korea. 2014;46(1): 87-93. 4. Oh HK. Antioxidant and Anti-inflammatory Activities of Extracts from Eugenia caryophyllata Thunb. J Korean Soc Food Cult Korea. 2016;31(5):481-8. 5. Yi MR, Kang CH, Bu HJ. Antioxidant and anti-inflammatory Activity of extracts from kohlrabi(brassica Oleracea var. Gonglodes). J of Korean Oil Chemists Soc Korea. 2017; 9
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