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大韓獸醫學會誌 (2014) 第 54 卷第 4 號 Korean J Vet Res(2014) 54(4) : 197~201 http://dx.doi.org/10.14405/kjvr.2014.54.4.197 < 원례보저 > 국내가축에서브루셀라병에대한혈청학적모니터링 성소라 김지연 * 허문 이기찬 강성일 이향근 조효림 이진주 정석찬농림축산검역본부세균질병과브루셀라병 OIE 표준실험실 ( 접수 : 2014년 7월 23일, 수정 : 2014년 9월 16일, 게재승인 : 2014년 10월 13일 ) Serological monitoring on brucellosis in livestock of Korea So-Ra Sung, Ji-Yeon Kim*, Moon Her, Kichan Lee, Sung-Il Kang, Hyang-Keun Lee, Hyo Rim Cho, Jin Ju Lee, Suk Chan Jung OIE Reference Laboratory for Brucellosis, Bacterial Disease Division, Animal and plant Quarantine Agency, Anyang 430-757, Korea (Received: July 23, 2014; Revised: September 16, 2014; Accepted: October 13, 2014) Abstract : In Korea, brucellosis has been reported periodically in cattle and rarely in dogs; however, it has not previously been screened in domestic animals such as elk, pigs and goats. To investigate the serological prevalence, serum samples were taken from the aforementioned animals annually during 2007-2013 and screened by the rose-bengal test () or modified, after which positive sera were evaluated by the standard tube agglutination test (). Finally, and -positive sera were confirmed by competitive-elisa. Brucella abortus biovar 1 was isolated from three elk that were shown to be positive serologically in 2008. There was no evidence of brucellosis in pigs. Based on serological monitoring and investigation of etiological agents, there is no evidence of outbreak of brucellosis in elk, pigs or goats of Korea since 2008. However, the possibility for brucellosis from cattle to affect these other livestock exists; therefore, extensive and continuous serological monitoring is required to maintain their brucellosis-free status. Keywords : brucellosis, competitive-elisa, rose-bengal test, serological test, standard tube agglutination test 서 브루셀라병은 Brucella(B.) 속균에의해소, 돼지, 산양, 면양, 개등에서발생하는법정제 2 종가축전염병으로 B. abortus( 소 ), B. canis( 개 ), B. ovis 및 B. melitensis( 양및염소 ), B. suis( 돼지 ), B. neotomae( 설치류 ), B. microti( 들쥐 ), B. inopinata( 사람 ), B. pinnipedialis 및 B. ceti( 해양포유류 ) 등총 10 종의속균이보고되었다 [2, 5, 16]. 브루셀라에감염되면잠복기가길게는약 6 개월에서 1 년간지속하기도하며, 가축에감염되면주로유산및불임, 유방염, 고환염, 전립선염등번식장애를일으키는질병이다. 또한, 사람도감염되는인수공통전염병으로공중보건상매우중요한질병이다 [6, 9, 13, 14]. 브루셀라병의진단은유산태아, 태반과양수등의시료와살처분시의림프조직등조직시료로부터직접원인균을분 론 리하는방법과브루셀라항원에대한특이세포매개성또는혈청학적반응을이용하여검사할수있다. 그러나브루셀라와형태학적으로유사한 Coxiella burnetii, Chlamydia나면역학적으로교차반응을일으키는 Yersinia enterocolitica와같은균들과의감별진단에대해유의해야할필요가있다. 현재세계동물보건기구 (OIE) 에서권장하는혈청학적진단방법에는 rose-bengal test(), modified-, standard tube agglutination test(), fluorescence polarization assay (FPA), indirect-enzyme linked immunosorbent assay(i-elisa), competitive-elisa() 등이있다 [1, 4, 10, 12, 13]. 우리나라는 결핵병및브루셀라병방역실시요령 에따라 1차스크린검사로 를사용하고, 에서양성진단을받은개체에대하여 2차확인검사인 및 를사용하고있다 [10]. 소브루셀라병에대한강력한방역정책및정기검진사업 *Corresponding author Tel: +82-31-467-1829, Fax: +82-31-467-1778 E-mail: kimjiyeon75@korea.kr 197

198 성소라 김지연 허문 이기찬 강성일 이향근 조효림 이진주 정석찬 을통해발병률은 2006 년이후로매년감소하여 2013 년에는기준우군양성률이 0.07% 로브루셀라청정국선언기준이하의낮은수준으로떨어졌지만, 소이외에사슴, 돼지, 염소등다른가축에대한브루셀라병발생률조사결과는많지않은실정이다. 따라서소를비롯한다른축종에서도브루셀라병청정국지위획득을위해서는지속적인모니터링과검색사업이필수적이다. 또한소를사육하는농가나인근농가에서다른축종도함께사육할경우상호간감염이전파될위험성이있다. 따라서, 본연구는지난 7 년간의혈청학적모니터링을통해소이외의국내다른축종에서의브루셀라병에대한현황을조사하여, 앞으로소뿐만아니라다른축종에서도브루셀라병청정국지위를획득하기위한기초자료로활용하고자수행하게되었다. 재료및방법 가검혈청혈청시료는 2007 년부터 2013 년까지강원도, 경기도, 충청도, 경상도, 전라도, 대구광역시, 울산광역시등지에서사슴 1,391 두, 돼지 8,509 두, 흑염소 2,946 두의혈액을채취하여 2,210 g 에서 30 분간원심분리를해서혈청을분리한후, 56 o C 항온수조에서 30 분간비동화하여 또는 modified-, 및 에이용하였다. 진단항원 와 modified- 는대성미생물연구소에서제조한 B. abortus 1119-3 배양균액이 8% 농도로첨가된로즈벵갈평판용브루셀라진단액을사용하였고, 는농림축산검역본부에서제조한 B. abortus 1119-3 배양균액이 4.5% 농도로첨가된브루셀라 tube 진단액을사용하였다. 는 Brucella-Ab kit(svanova, Sweden) 를사용하였다. 진단방법 는사슴과돼지의가검혈청 30 µl 와동량의로즈벵갈평판용브루셀라진단액을평판위에떨어뜨린후진단액과혈청을충분히혼합한다음실온에서 4 분간반응시킨후응집의유무및상태에따라결과를판독하였다. 염소의경우혈청은 75 µl, 진단액은 25 µl 를사용하는 modified- 방법을이용하여실험후결과를판정하였다. 는브루셀라 tube 진단액을 0.5% phenol saline 으로 1/100 농도로희석한후, 시험관에 2mL 씩분주하였다. 이후가검혈청을농도가각각 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 이되도록 80, 40, 20, 10, 5 µl 씩넣은후 37 o C 배양기에서 48~72 시간감작시킨후응집상태와상층액의탁도를대조군과비교하여결과를관찰하였다. 응집결과에따라 50 배미만에서응집이생기거나없는경우는음성, 50 배이상 100 배미만에서상층액이반투명하고응집이생기는경우는의양성, 100 배이상에서상층액이투명하고응집이생기는경우는양성으로판정하였다. 는 Brucella-Ab kit(svanova) 의실험방법에따라수행한후제조사의기준에따라결과를 PI (percent inhibition, %) 로판정하였다. PI(%) = 100 {(sample mean OD 100) / conjugate control mean OD} 로계산하였으며, PI 가 30% 이상이면양성, 30% 미만이면음성으로판정하였다. 브루셀라분리및동정브루셀라분리를위해서림프절등조직시료를잘라표면을알코올램프로순간화기멸균시킨후막자사발에넣어멸균 PBS 1 ml와혼합하여조직을분쇄하였다. 분쇄한조직시료는멸균면봉을이용하여 modified Brucella selective medium(mbs) 과소혈청이 5% 첨가된 tryptic soy agar (Becton, Dickinson and Company, USA) 에도말하여 37 o C 배양기에서 CO 2 농도 5% 조건으로 3~4일간배양하였다. 추가적인균배양을위해서분쇄한조직시료를 tryptic soy broth(becton, Dickinson and Company, USA) 4 ml에도증균배양하였다 [5]. MBS 배지에서자란균집락을그람염색법에따라수행하여형태와염색상태를관찰하였고, oxidase, catalase 및 urease test를수행하여분리주를동정하였다 [3]. 브루셀라로동정된분리주는 CO 2 요구성, H 2 S 생산능력, 20 µg/ml 농도의 basic fushcin 및 thionin 첨가에따른성장능력과 A monospecific serum과 M monospecific serum(animal Health and Veterinary Laboratories Agency, UK) 의응집반응결과를바탕으로 biovar를규명하였다. 결 사슴에서의검색결과 2008 년부터 2013 년까지경기, 충남, 충북지역에위치한총 32 농가에서 1,391 두의사슴혈청을채취하여혈청학적검사를수행하였다. 2008 년 200 두중 에서 18 두 (9.0%) 가양성으로판정되었고, 그중 에서 2 두 (1.0%) 가의양성, 5 두 (2.5%) 에서양성결과를얻었으며그중 6 두 (3.0%) 가 C- ELISA 에서양성으로판정되었다. 이들로부터유방상림프절, 슬와림프절, 비장, 질분비물등의시료를채취하여브루셀라분리를시도한결과 3 마리에서소브루셀라 (B. abortus biovar 1) 를동정하여보고하였다 [5]. 2009 년에는 544 두중 에서 18 두 (3.3%) 가양성, 그중 에서 4 두 (0.7%) 가의양성으로판정되었지만최종 C- ELISA 에서는모두음성으로판정되었다. 2010 년에는 420 두전체가 에서음성으로판정되었고, 2011 년에는 35 두중 에서 2 두 (5.7%) 가양성으로판정되었지만, 에서는모두음성으로판정되었다. 2013 년에는 192 두전체가 에서음성으로판정되었다 (Table 1). 돼지에서의검색결과돼지는 2007 년부터 2013 년까지경기, 충남, 전남, 전북, 과

Serological survey on brucellosis of domestic animals 199 Table 1. Results on serological diagnosis of elks 2008 3 200 18 (9.00) 2 (1.00) 5 (2.50) 6 (3.00) 2009 5 544 18 (3.30) 4 (0.70) 0 0 2010 10 420 20 0 0 0 2011 2 35 22 (5.70) 0 0 0 2013 12 192 20 0 0 0 Total 32 1,391 38 (2.70) 6 (0.43) 5 (0.35) 6 (0.43) : rose-bengal test, : standard tube agglutination test, : competitive-elisa. Table 2. Results on serological diagnosis of pigs 2007 6 1,301 2,155 (11.90) 29 (2.20) 2 (0.15) 0 2008 118 1,610 29,30 (1.90) 10 (0.60) 0 0 2009 116 1,690 2,516 (30.50) 25 (0.30) 1 (0.05) 2 (0.10) 2010 76 970 2,292 (30.10) 23 (0.30) 0 0 2011 22 473 299,8 (1.70) 27 (1.50) 0 0 2012 54 1,156 2,108 (9.30) 29 (0.80) 0 0 2013 58 1,309 29,50 (3.80) 27 (0.50) 0 0 Total 450 8,509 1,159 (13.60) 70 (0.82) 3 (0.03) 2 (0.02) 경남, 경북, 강원지역에위치한 450 농가에서채취한총 8,509 두의혈청으로검사를수행하였다. 2007 년 1,301 두중 155 두 (11.9%) 가 에서양성, 그중 에서 29 두 (2.2%) 가의양성, 2 두 (0.3%) 가양성반응을보였지만, 에서는모두음성으로판정되었다. 2008 년 1,610 두중 에서 30 두 (1.9%) 가양성, 에서 10 두 (0.6%) 가의양성으로판정되었고, 에서는모두음성으로판정되었다. 2009 년 1,690 두중 에서 516 두 (30.5%) 가양성, 에서 5 두 (0.3%) 가의양성, 1 두 (0.05%) 가양성반응을보였고, 그중 에서 2 두 (0.1%) 가양성으로판정되어해당농장과농장에서도축장으로출하된돼지에서조직및혈액샘플을채취하여추가조사한결과모두음성으로판정되어돼지 2 마리에대한양성반응은비특이반응으로추정되었다 (data not shown). 2010 년에는총 970 두중 292 두 (30.1%) 가 에서양성, 그중 3 두 (0.3%) 가 에서의양성반응을보였고, 에서는모두음성이었다. 2011 년 473 두중 에서 8 두 (1.7%) 가양성, 에서 7 두 (1.5%) 가의양성이었고, 에서는모두음성으로판정되었다. 2012 년 1,156 두중 108 두 (9.3%) 가 에서양성, 그중 9 두 (0.8%) 가 에서의양성으로판정되었고, 에서는모두음성으로판정되었다. 2013 년 1,309 두중 에서 50 두 (3.8%) 가양성, 그중 7 두 (0.5%) 가 에서의양성반 응을보였지만, 에서는모두음성으로판정되었다 (Table 2). 염소에서의검색결과염소는 2007 년부터 2013 년까지경기, 충남, 충북지역의총 638 농가에서채취한 2,946 두의혈청으로실험하였다. 2007 년 360 두가모든진단법에서음성으로판정되었고, 2008 년 326 두중 45 두 (13.8%) 가 에서양성을보였고, 및 에서는모두음성반응을보였다. 2009 년 720 두중 82 두 (11.4%) 가 에서양성으로판정되었고, 그중 3 두 (0.4%) 가 에서의양성반응을보였지만최종 에서는모두음성으로판정되었다. 2010 년 160 두중 에서 1 두가양성반응을보였지만, 와 C- ELISA 에서모두음성으로판정되었다. 2011 년에는총 364 두중 에서 11 두 (3.0%) 가양성반응을보였지만, 에서는음성으로판정되었고 에서도역시음성으로판정되었다. 2012 년 500 두중 9 두 (1.8%) 가 에서양성으로판정되었지만 와 ELISA 에서는모두음성으로판정되었다. 2013 년 516 두중 9 두 (1.7%) 가 에서양성반응을보였지만 와 ELISA 에서는모두음성으로판정되었다 (Table 3).

200 성소라 김지연 허문 이기찬 강성일 이향근 조효림 이진주 정석찬 Table 3. Results on serological diagnosis of goats 2007 4 360 220 0 0 0 2008 69 326 245 (13.8) 0 0 0 2009 180 720 282 (11.4) 3 (0.4) 0 0 2010 40 160 221 (0.63) 0 0 0 2011 91 364 211 (3.0) 0 0 0 2012 125 500 229 (1.8) 0 0 0 2013 129 516 229 (1.7) 0 0 0 Total 638 2,946 157 (5.3) 3 (0.1) 0 0 Table 4. Comparison on serological diagnosis of elks, pigs and goats Livestock Number of farms Test sera Elk 232 1,391 29,38 (2.70) 26 (0.43) 5 (0.35) 6 (0.43) Pig 450 8,509 1,159 (13.60) 70 (0.82) 3 (0.03) 2 (0.02) Goat 638 2,946 2,157 (5.30) 23 (0.10) 0 0 사슴과돼지, 염소의검색결과비교그결과사슴총 1,391 두중 38 두 (2.7%) 가 에서양성반응을보였고, 그중 에서 6 두 (0.43%) 가의양성, 5 두 (0.35%) 가양성반응을보여 를진행한결과 6 두 (0.43%) 가양성으로판정되었다. 돼지는총 8,509 두중 1,159 두 (13.6%) 가 에서양성으로판정되었고, 그중 에서 70 두 (0.82%) 가의양성, 3 두 (0.03%) 가양성반응을보였고, 에서 2 두 (0.02%) 가양성을보였지만해당농가에대한정밀조사결과브루셀라병발생의징후는찾을수없었다. 염소는총 2,946 두중 에서 157 두 (5.3%) 가양성반응을보였고, 에서 3 두 (0.1%) 가양성반응을보여 를진행했지만모두음성으로판정되었다 (Table 4). 고 브루셀라병은감염될경우, 축산농가와국가에큰경제적피해를입힐뿐만아니라사람에게도전염되는인수공통전염병으로서공중보건학적으로도매우중요하며, 동물이나식용, 비식용동물성생산품의국제간교역에서중요한전염병이다 [13]. Brucella 속균은보통숙주선호성 (host-preference) 이있는것으로알려졌지만다른가축과동물에도교차감염이종종발생하기도한다 [7, 15]. 그러므로한농가에서여러축종을사육할경우사육장분리를통해축종간접촉을예방하고방역에각별한주의가필요하다. 브루셀라병은소를비 찰 롯하여다른축종에도전염될수있으므로철저한방역관리체계등대책을확립해농가의재산피해및국가의보상금지급으로인한직접적인경제적손실과환경오염, 연관산업의판매및수요감소등의간접적인피해도예방해야한다. 본연구에서는 2008 년부터 2013 년까지 1,391 두의사슴혈청과 2007 년부터 2013 년까지총 8,509 두의돼지혈청그리고총 2,946 두의염소혈청을대상으로 또는 modified-, 와 를수행하여국내다른축종에서의브루셀라병에대한발병률과발생현황을조사하였다. 결과를보면전체두수중사슴은 2.7%, 염소는 5.3% 의양성율을보인반면에돼지는그보다 2.5~5 배높은 13.6% 의양성율을보였다 (Table 4). 그이유는 Yersinia enterocolitica O:9 등과같은세균과혈청학적교차반응에의한것으로추정되며, 또한편으로는축종의특성상지방함유량이높은돼지혈청과진단액을혼합했을때실제양성반응과유사한형태의응집이관찰되는데, 이런가양성반응을양성으로오인하여판정하였기때문에양성율이높아진것으로판단된다. 따라서돼지와같은축종특성을가진혈청에대한실험결과를판정할때는경험이풍부한실험자의조언을얻어실험결과의오차를줄일수있도록해야한다. 2008 년에사슴 3 두에서 B. abortus biovar 1 이분리되었으며, 국내소에서분리되는균대부분과동일한생물형인 biovar 1 인것으로보아브루셀라병에감염된소와사슴의직접또는간접적인접촉으로인해전파된것으로추정할수있다 [5]. 이는소에서다른가축으로의전염가능성을보여

Serological survey on brucellosis of domestic animals 201 주는동시에서로다른축종간에도전염될가능성을보여주는것이기때문에축종간분리사육의필요성을다시한번시사해준다. 이러한축종간전염의예방을위해서는분리사육뿐만아니라양성발병농가에서유산시배출되는태반이나유산태아를취급한농장주나관련종사자의장화, 장갑등에의해서도브루셀라가전파될수있으므로양성농가를다녀왔을경우에는관련기구의소독또는교체후다른축종의축사에출입하여야한다. 그리고축산관련기구등은가급적타농가와공동사용을금지하고, 축사를정기적으로소독하고세척하여야한다. 또한브루셀라병뿐만아니라다른전염병의전파방지를위해서라도기본적인방역수칙을준수해야한다 [7, 8, 11, 15]. 이번연구결과에서는사슴, 염소나돼지에서숙주선호성을보이는 B. melitensis 및 B. suis 는검출되지않았으며, 2008 년이후국내에서사육되고있는사슴, 돼지, 염소에서브루셀라가분리되지않았고혈청학적으로도세계동물보건기구 (OIE) 에서제시하고있는축군 (herd) 의 99.8% 이상, 개체별 99.9% 이상음성으로국제기준 (Terrestrial Animal Health Code) 에부합되어이들가축에대해서는브루셀라병청정국선언이가능할것으로생각된다. 하지만브루셀라병이발생하고있는소에서이들축종으로전염될가능성이있으므로한농가에서여러축종을사육할경우철저한분리사육을통해가축간의접촉을차단하고, 브루셀라병을전파할수있는개, 고양이, 야생동물이축사내로접근하지않도록관리하여야한다. 또한농장주와관련종사자들에게충분한교육기회를제공하여방역수칙에대해정확히인지시키고농장을관리할수있도록하여야한다. 우리나라에서소이외에다른축종에서도브루셀라병근절선언을위해서는미국의경우와같이발생빈도에따라권역을구분하여차등방역을하고, 발생빈도가높은지역은가축의이동을제한하고정기검진을시행하여브루셀라병근절에한발더다가서게끔유도해야한다. 또한브루셀라병이인수공통전염병인것을고려해개나고양이와같이사람과함께생활하여직접접촉의빈도가높은동물에대해서는정기검진을의무적으로받도록제도의개선이필요할것으로여겨진다. 감사의글 본연구는농림축산식품부농림축산검역본부농림축산검역검사기술개발시험연구예산 (N-AD13-2014-18) 으로수행되었습니다. References World Health Organization, Geneva, 1975. 2. Banai M, Corbel M. Taxonomy of Brucella. Open Vet Sci J 2010, 4, 85-101. 3. Ewalt DR, Bricker BJ. Validation of the abbreviated Brucella AMOS PCR as a rapid screening method for differentiation of Brucella abortus field strain isolates and the vaccine strains, 19 and RB51. J Clin Microbiol 2000, 38, 3085-3086. 4. Godfroid J, Saegerman C, Wellemans V, Walravens K, Letesson JJ, Tibor A, Mc Millan A, Spencer S, Sanna M, Bakker D, Pouillot R, Garin-Bastuji B. How to substantiate eradication of bovine brucellosis when aspecific serological reactions occur in the course of brucellosis testing. Vet Microbiol 2002, 90, 461-477. 5. Her M, Cho DH, Kang SI, Lim JS, Kim HJ, Cho YS, Hwang IY, Lee T, Jung SC, Yoo HS. Outbreak of brucellosis in domestic elk in Korea. Zoonoses Public Health 2010, 57, 155-161. 6. Hur J, Kakoman I, Jeong JM, Lee HJ, Baek BK. Comparison of a new ELISA with other serodiagnostic tests for bovine brucellosis. Korean J Vet Serv 2007, 30, 385-391. 7. Jung SC, Her M, Kim JW, Kim JY, Hwang IY, Ku BK, Park YH, Yoo HS. Bovine brucellosis in Korea. J Zoonoses 2010, 1, 1-15. 8. Kim JY, Kang SS, Her M, Lee K, Sung SR, Gu JH, Kang SI, Lee HK, Kim YJ, Kim DG, Jung SC. Investigation of occurrence factors on brucellosis-outbreak farm in Korea. Korean J Vet Serv 2012, 35, 263-268. 9. Kim KH, An SH, Park YH, Kim DS. Comaprison of six serological methods for the diagnosis of bovine brucellosis. Korean J Vet Res 1982, 22, 149-153. 10. Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries (KR). Control and prevention measures standard operation protocol of brucellosis and tuberculosis. Notice 2009-147 (Aug. 25, 2009). 11. Nicoletti P. The epidemiology of bovine brucellosis. Adv Vet Sci Comp Med 1980, 24, 69-98. 12. Nielsen K. Diagnosis of brucellosis by serology. Vet Microbiol 2002, 90, 447-459. 13. OIE Biological Standards Commission. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). 6th ed. Vol. 2. pp. 624-659. World Organisation for Animal Health, Paris, 2008. 14. Quinn PJ, Carter ME, Markey B, Carter GR. Clinical Veterinary Microbiology. pp. 261-267. Wolfe, London. 1994. 15. Ryu JY, Bun JH, Lee HY, Lee YC, Lee JJ, Song YG, Nam HM. Isolation of Brucella spp from sero-positive native bulls and calves below twelve months old. Korean J Vet Serv 2007, 30, 375-384. 16. Truong LQ, Kim JT, Yoon BI, Her M, Jung SC, Hahn TW. Epidemiological survey for Brucella in wildlife and stray dogs, a cat and rodents captured on farms. J Vet Med Sci 2011, 73, 1597-1601. 1. Alton GG, Jones LM, Pietz DE. Laboratory Techniques in Brucellosis. Issue 55 of Monograph Series. 2nd ed. pp. 70-80.