전기영동 ( SDS-PAGE )
개 요 전기영동과그목적 실험전준비 실험과정 실험결과및분석
전기영동과그목적 전기영동 단백질의순도나성질의분석및분리등에사용하는방법 -> 단백질의정성적인분석 SDS-PAGE ( Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis ) : SDS 와 Polyacrylamide 를사용한전기영동전기영동의목적 원하는단백질의유무확인 분자량을이미알고있는단백질과비교하여분자량산출
실험전준비실험에사용되는 Solution 만들기 Table 1. Solutions for Gel Casting. Solution A Solution B (ph 8.8) Solution C (ph 6.8) Acrylamide 146.0 g Tris(1.5M) 43.43g Tris(0.5M) 15 g Bisacrylamide 4.0 g Conc. HCl (ph 조절 ) 7.5 ml Conc. HCl (ph 조절 ) 10 ml D.W 500 ml SDS(0.4%) 1.0 g SDS(0.4%) 1.0 g D.W 500 ml D.W 500 ml
Table 2. 염색과탈색에사용되는시약. Staining solution [ CBA solution ] Destaining solution Isopropanol 250 ml Isopropanol(10%) 100 ml Acetic acid 100 ml Acetic acid(10%) 100 ml Coomassie blue R-250 500 ml D.W. 800 ml D.W 650 ml Total volume 1L Total volume 1 L
Buffer 만들기 Table 3. Sample buffer 와 running buffer. Running buffer Sample buffer [Laemmli Tray Buffer] [4X Laemmli Tray uffer] Tris(1.5M) Glycine(H 2 NCH 2 COOH) 3 g 14.4 g Tris Conc. HCl SDS 1.2 g 0.7 ml 0.8 g SDS 1 g Glycerol 8.0 ml 2-mercaptoethanol 4.0 ml D.W 1 L 1% Bromphenol Blue 2 ml D.W 5.3 ml * Running buffer : 실온보관 Total volume 20 ml
실험장치및준비 -비커3개, magnetic bar, 젤만들solutions, 에탄올, 증류수등 Fig.1. 실험장치.
실험과정 SDS-PAGE frame 제작 알루미늄판과유리판사이에 spacer 끼움 밑바닥으로부터 2mm 정도나오도록 setting함 Fig.2. Frame 에판끼우기.
Frame 나사를조임 Fig.3. Frame 나사조이기.
한쪽은고무, 한쪽은스펀지깔린틀에판끼움 Lever 로단단히고정 Fig.4. lever 로 castor 에고정.
잘 sealing이 되었는지 에탄올을 넣어 관찰 새지 않으면 에탄올 따라내고 기울여 방치 Fig.5. 에탄올로 sealing 확인.
Separating gel 제조 gel 만들용액을마이크로피펫으로비커에넣어 gel solution 제조.(TEMED-주입직전에넣음 ) Fig.6. gel solution 제조후주입준비.
판에 gel solution 을주입 (1-1.5cm 가량채우지않는다 ) Fig.7. Separating gel solution 주입.
gel solution 위에 Isopropyl alcohol을채움 Isopropyl alcohol의역할 - bubble 제거 -gel 표면건조방지 - 표면을고르게정리 실온에서 40-60분간방치 (* 중합이되었는지유리판기울여확인 )
loading sample 만들기 rack에 0.5ml 용량의 eppendorf tube를꽂아둠 1번 tube에분자량 marker를넣음 (* 실험에따라 marker는가변적 ) BSA(Bovine Serum Albumine) : 10 µl lysozyme : 10 µl Albumine : 10 µl 나머지 tube에 sample을 30µl 넣음
모든 tube 에 sample buffer 를 10µl 주입 Fig.8. Sample 주입 (L), Sample buffer 주입 (R).
Vortex mixer로 sample과 sample buffer 혼합 원심분리 Fig.9. Vortex mixer 로혼합.(L), Centrifuge(R).
미리끓여놓은물에넣고 5분간 sample들을끓임 (* 열처리후급냉 (quenching) 하는것이좋다 ) Fig.10. 열처리.
원심분리 (Centrifuge) (* tube를꽂을때대칭이되도록해야함.) Sample들을냉동보관
Stacking gel 제조 magnetic plate 위에서교반시키면서 gel solution 제조 frame의 Isopropyl alcohol을따라내고닦음 Fig.11. Isopropyl alcohol 제거.
TEMED 넣고 stacking gel 주입 Comb를 separating gel 바로위쪽까지끼움 5-10분가량중합되도록함 Fig.12. Comb 끼우기.
Sample loading gel 이굳으면유리판에있는 comb 제거 Fig.13. Comb 를제거 (L), 각 lane 의위치표시 (R).
Castor에서판만분리, 전기영동 kit에유리판을대고집게로고정 Running buffer를빈공간에채움 Fig.14. Running buffer 로빈공간채우기.
준비해둔 sample을 micro syringe로각 lane에주입 Fig.15. Micro syringe 로각 lane 에 sample 주입.
주입후, 전기를걸어줌 ( 검은색은 (-) 극, 빨간색은 (+) 극이며같은극끼리연결 ) Fig.16. Sample loading.
Sample이이동하는동안전류가일정하게유지되도록조정 ( 보통 20-40 ma) Sample이 gel의밑부분 5mm정도까지내려가면전기를차단, loading을마침
Staining 전기영동 kit에서판을분리 Gel 찢어지지않도록조심하면서 spacer와유리판제거 Spacer를이용하여알루미늄판에서 gel을떼냄
Fig.17. 알루미늄판에서젤떼어내기.
떼어낸 gel 을통에넣고 staining solution 을 gel 이잠길정도채움 Shaker 에올려놓고회전속도 50rpm 정도로회전하면서 1 시간정도염색 Fig.18. 염색하기.
Destaining 1시간후에 destaining solution으로바꿈 shaker에서 50rpm로회전하면서탈색 탈색용액을자주갈아주고 12시간정도후에마침 Fig.19. 탈색하기.
Coating & drying 셀로판지에물을묻혀사각아크릴판에잘펴고기포제거 그위에탈색을끝낸 gel을놓고, 다시물묻힌셀로판지를그위에잘펴서덮음 아크릴판덮개덮고집게로모서리를고정
Fig.20. 젤코팅하기.
그늘진곳에서하루이상건조후보관 Fig.21. 코팅한젤건조.
실험결과및분석 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 66.2 kda 45.0 kda ferritin 14.4 kda Fig.22. 전기영동실험결과.
Table 4. Separating gel 과 Stacking gel 의조성, Separating gel Stacking gel Solution A (ml) 5.0 0.67 Solution B (ml) 2.5 - Solution C (ml) - 1.0 D.W (ml) 2.5 2.3 10% Ammonium Persulfate (µl) 50 30 TEMED (µl) 30 20 * **