최 종 연구보고서 기능성이강화된인삼제품의개발 Development of Ginseng Products with Functional Improvement 부산대학교 농림수산식품부
제출문 농림수산식품부장관귀하 본보고서를 기능성이강화된인삼제품의개발에관한연구 과제의최종보 고서로제출합니다. 2008 년 4 월 24 일 주관연구기관명: 부산대학교 총괄연구책임자: 안순철 세부연구책임자: 안순철 연구원: 강주형 연구원: 김보혜 연구원: 이선이 연구원: 유선녕 연구원: 김광연 협동연구기관명: 경희대학교 협동연구책임자: 박천석 협동연구기관명: 경희대학교 협동연구책임자: 백무열 참여기업명: ( 주) 고려원인삼 참여기업대표자: 최성욱 - 1 -
요약문 Ⅰ. 제 목 기능성이강화된인삼제품의개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 본과제의최종목표는유효활성물질의효율적인추출과인삼특유의효능이증 대된유효기능성성분을규명하고기능성식품및식품의약소재로개발하여인삼의 고부가가치를창출한다. 생균제로사용되고있는미생물로인삼을발효하여인삼내의구성성분을새로 운항산화물질이나생리활성이증가한물질로전환하고, 유효성분인 saponin 성분과 새로이생성된활성물질의변화를분석한다. 배당체분해효소및당전이효소를이용하여인삼내의성분을유용성분으로 전환하고전환된유용성분을분석하고새로운생리활성을검토한다. 생물전환인삼소재의기능성식품으로서의적용가능성을검토하기위하여, 기능성식품제조시식품가공기술에필수적으로동반되는가열, 건조, 살균및 ph 변화에대한유효성분의의안정성을검토함으로써분말, 캡슐또는음료등적합한 형태의기능성식품으로서의적용가능성을제시한다. Ⅲ. (1) 연구개발내용및범위 인삼의발효조건확립 최적조성, 최적온도, 최적 ph, 최적접종량및최적배양기간을조사하고발효 산물의유기산분석및생리활성분석한다. (2) 배당체분해및당전이효소의선발 초고온성미생물유래유전체로부터 β-glucosidase를선별하고 PCR cloning을 수행하여유전자를확보하며효소로는 CGTase, maltogenic amylase, maltosyltransferase 와같은다양한효소를이용한다. 확보된유전자를대량발현할 수있는 vector (phis119, prest) 에삽입하여대량발현시킨다. - 3 -
(3) 재조합효소의반응특성 각효소에의한여러배당체의기질특이성관찰하고각효소와기질에대한효 율적전환관계를확인하고배당체의분해및당전이산물을효율적으로생산할수 있는효소반응조건을확립. 효소, 기질의농도, ph, 온도, 유기용매에대한반응 수율등을실험하여최적조건확립한다. (4) 활성물질의분리, 정제및구조동정 Column chromatography 를통해활성물질의분리, 정제하고 Rf 값, 발색반응, UV, 1 H-NMR, 13 C-NMR, mass spectroscopy 등의기기분석을통한구조동정한 다. (5) 인삼의가공적성검사 농축전, 후생물전환인삼유효성분의열, ph 안정성및초고압처리분석한다. 또한열, ph 안정성의분석을통한유효성분의온도의존성분석및가공방법검토 한다. 초고압처리를통해유효성분의열및 ph 안정성및관능평가를통한기능성 식품소재로서의가능성검토한다. (6) 인삼발효산물의생리활성 전환된물질의 nitric oxide 저해활성, free radical scavenging 활성, 항균활성, 세포독성측정등을측정한다. Ⅳ. (1) 연구개발결과및활용에대한건의 인삼의효능증대 생균제를이용하여인삼을발효, 가수분해하고발효산물과분해물을건조분말화 하여특정성분의함량을증가하거나추출능을증가시키고장내효과개선및소화 흡수율을증대시킬수있다. 그리고식물체내에존재하는비활성형태의물질로부터 glucoside 결합을분해하는 pectinase, hemicellulase, lactase 및 cellulase 등의효소 를사용하여배당체화합물을 aglycone 형태로전환하여활성형태의유효물질양을 증가시키거나유효활성물질을효율적으로추출, 정제하여효소와미생물을이용한 인삼가공식품을개발을통해체내소화를촉진할뿐만아니라인삼속에함유되어있는생리활성성분이나미생물발효및효소반응에의해생성되는생리활성물질을생산해낼수있다. 따라서유용미생물과효소전처리에의한인삼의발효를통 - 4 -
하여활성성분추출을증대및인삼가공산물의보존성을증가시킬수있다. (2) 대사산물의전환에의한유효물질생합성 β-glucosidase 활성을갖는효소들을대상으로식물체의 aglycone 형태활성물 질을보다효율적으로추출하는방법을개발한다. 이런기술들은참깨로부터 sesaminol, 상백피와포도로부터 resveratrol, 백강잠, 상백피, 닭의장풀로부터 1-deoxy nojirimycin, 귤, 오렌지로부터 naringenin 및 hesperetin, 은행잎, 메밀, 양파 로부터 quercetin, 황금으로부터 baicalin 등의전환에활용할수있다. 또한생균제의 생합성효소에의해천연물내의구성성분의전환으로새로운생리활성물질을개발하 거나당의결합에의한감미료와같은새로운기능성식품소재를개발하여사료첨가 제, 식품가공의첨가제, 기능성식품, 건강보조식품에사용할수있다 (3) 활성이강화된제품개발 활성이강화된인삼제품은인삼에함유되어있는특정단일성분을분리 정제 하여약리효능을입증한인삼의성분의강화제품과차별화된제품을개발할수있고 밝혀져있지않은유효성분물질에대한화학적연구와작용기전에대한연구를통 해우수성을과학적으로입증하여인삼의고부가가치및활용성을확대해나갈수 있다. 최근축산분야에서는광우병, 구제역의발생등이세계적인현안으로부각되고 있으며축산사료에항생제의사용이규제되면서친환경적이미지를가지는미생물 제제나천연물질의이용에대한관심이높아지고있다. 따라서인삼을생물전환하여 기능성과소화성을향상시킴으로써가축의소화촉진, 항병력증진, 건강증진및장 내세균의균형조절효과를가지는기능성사료첨가제개발이가능하다. - 5 -
SUMMARY Ginseng, Panax ginseng C.A. Meyer, is cultivated mainly in the Korea Peninsula and the northeast areas of China. Its root, also called ginseng, has been used as a representative medicinal herb, having tonic effect for 1000 years or longer in the far-east Asia. Ginsenosides are triterpenes saponins considered to be the main bioactive materials of ginseng. More than 30 types of ginsenosides have been found in the roots and in other parts of P. ginseng. The transformed natural ginsenosides are more effective in human health than their original form, like ginsenoside Rh2 and 20-(S)-Rg3 in red ginseng which is created by thermal processing like steaming process of fresh ginseng. Additionally, thermal and enzymatic transformation of ginseng has been reported. The objectives of this research were to improve the effective functional compounds of ginseng by converting the effective functional compounds of ginseng using physical and biochemical transformation, and to create the value-added ginseng products using developed physical and biochemical transformation technology. Because ginseng saponins of sugar structures (glycones) are the main bioactive components in P. ginseng, we used commercially available hydrolyzing enzymes to determine their metabolites. We combined a 5% crude ginseng saponin preparation with each of the following: 5% AMG, 5% Pectinex, and 5% Viscozyme. The metabolites generated by the action of Pectinex, which contains pectinase and arabanase, were detected at several bands on TLC and one of these productswas supposed to be compound K through same R f value on TLC. However, the metabolites transformed significantly by AMG and Viscozyme were not detectable, which contains amyloglucosidase and cellulase, respectively. A greater amount of compound K was found in the mixtures containing 5% ginseng extract than in those of other ginseng products. The extent of biotransformation ginseng in the presence of Pectinex depends on the ph and temperature of the reaction mixture. The amount of compound K produced, as determined by HPLC, was produced optimally at ph 3 to ph 5 and at 50 0 C-55 0 C on the first day after Pectinex exposure. The optimal conditions for the production of compound K from rootlet ginseng were found to be 10% to 15% rootlet ginseng, ph 5, 50 0 C, and 2 to 3 days of incubation. For physical transformation, ultra high pressure processing was applied. Approximately 150g of ginseng powder slurry (70%, 80%, 90% moisture content) was put into a - 7 -
retortable pouch then hermetically sealed using heat sealer, and subjected to ultrahigh pressure treatment at selected pressures in the range of 150 600 MPa for different durations (5-15min). UHP ginseng showed relatively higher extraction yield (312.2-387.1 mg/g ginseng) and amounts of crude saponin (19.3-32.6 mg/g ginseng) than control ginseng (189.9 ± 1.8 mg/g ginseng and 17.5 ± 1.1 mg/g ginseng, respectively). Extraction yield gradually increased with increasing pressure level and pressing time. However, crude saponin content was not affected by pressure level and pressing time. Therefore, correlation coefficient between extraction yield and crude saponin content was relatively low (r 2 =0.2908, data not shown) suggesting that these two parameters are not always highly correlated. When ginseng slurry was treated with UHP, the cellular structure altered and/or damaged. Therefore, not only crude saponin content but also large amounts of cellular contents were extracted during UHP processing resulting in relatively higher extraction yield. This may be one reason for relatively low correlation between extraction yield and crude saponin content. The highest extraction yield and crude saponin content were obtained in 90 % moisture content sample pressurized at 600 MPa for 15 min. Overall, amounts of measured six ginsenosides (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, and Rg1) increased with UHP processing but Rg3 did not appear in both control and UHP treated ginsengs. On the other hand, pressure level and pressing time did not influence the amount of ginsenosidessuggesting that relatively lower pressure level and short pressing time would be enough to increase the amount of ginsenosides compared to control. It is interesting to note that the sharp contrast between control ginseng and UHP treated ginseng is enhanced by intensity of latter peak area. The peaks at retention time about 81 min and about 82 min are considered as Rh2 and compound K, respectively. It has been reported that these two ginsenosides showed very similar retention time in HPLC analysis. Thus it is very difficult to identify these two peaks with only HPLC analysis and further investigation is needed to clear interpretation of these two materials. UHP processing of ginseng greatly influence the extraction yield and ginsenoside contents at relatively low pressure level and pressing time and UHP induced non-thermal transformation of some ginsenosides needs to be further investigated. This work elucidates the potential of non-thermal UHP extraction of ginseng. In this work, we developed both physical and biochemical transformation of ginsenoside, which can be used to produce value-added ginseng products. - 8 -
CONTENTS Chapter 1. Outlines of the Research 13 1. Goal of the Research 13 2. Need of the Research 17 3. Scope of the Research 21 Chapter 2. Status of the Research 23 1. Domestic Status of the Research 23 2. Oversea Status of the Research 24 Chapter 3. Research Contents and Results 25 1. Materials and Methods 25 2. Results 33 Chapter 4. Object Achievement and Contribution to Related Fields 87 1. Object of Research 87 2. Object Achievement 88 3. Contribution to Related Fields 90 Chapter 5. Their Applications of Research Results 91 Chapter 6. State of the Art Report 95 Chapter 7. References 97-9 -
목 차 제 1 장연구개발과제의개요 13 제 제 1 절연구개발의목적 13 2 절연구개발의배경 14 1. 인삼의효능 14 2. 인삼의유효성분 15 3. 인삼의체내대사 15 4. 인삼의생물전환 16 제 3 절연구개발의필요성 14 1. 기술적측면 17 2. 경제 산업적측면 19 3. 사회 문화적측면 20 제 4 절연구의내용및범위 21 1. 생물전환조건확립 21 2. 전환물질의분석및분리ㆍ정제 21 3. 전환물질의가공적성분석 22 4. 발효물의생리활성분석 22 제 2 장국내외기술개발현황 23 제 제 1 절국내연구동향 23 2 절국외연구동향 24 제 3 장연구개발수행내용및결과 25 제 1 절연구내용 25 1. 사용균주및효소 25 2. 사용시약및기기 25 3. 인삼의발효및분석 28 4. 배당체분해및당전이효소의개발 29 5. 당분해효소를이용한인삼의전환 30 6. 인삼유효성분의가공적성연구 31-11 -
7. 생리활성분석 31 제 2 절연구결과 33 1. 생균제를이용한인삼의발효 33 2. 당분해효소에의한인삼의전환 43 3. 배당체분해및당전이효소를이용한인삼의전환 53 4. 인삼유효성분의가공적성연구 64 5. 시제품개발 81 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 87 제 1 절연구개발목표와내용 87 1. 세부연구기관 87 2. 제1 협동연구기관 87 2. 제2 협동연구기관 87 제 2 절연차별연구개발목표와내용 88 1. 1 차년도 88 2. 2 차년도 88 3. 3 차년도 88 제 3 절연구평가의착안점 90 제 5 장연구개발결과의활용계획 91 제 1 절기대효과 91 1. 인삼의효능증대 91 2. 활성이강화된제품개발 91 3. 친환경소재개발 92 제 2 절활용방안 92 1. 다양한형태별인삼제품의개발 92 2. 대사산물의전환에의한유효물질생합성 93 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 95 제 7 장참고문헌 97-12 -
제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 천연물을구성하고있는성분들은탄수화물, 질소화합물, 지용성화합물및기타 미네랄등으로미생물이발효하는데필요한모든성분을함유하고있다. 인삼의경 우, saponin (protopanaxadiol, protopanaxatriol, oleanolic acids) 은 3-6%, 질소화합물 ( 단백질, amino acids, peptides, 핵산, alkaloids) 은 12-16%, 지용성화합물 ( 지질, 지 방산, essential oils, terpenoids, polyacetylenes, phenolic compounds) 은 1-2%, vitamin (thiamine, riboflavin, ascorbic acid, niacin, biotin, folic acid) 은 0.05%, 탄수 화물 ( 다당류, lignins) 은 60-70%, 무기화합물 (N, P, K, Ca, Mg 등의미량원소) 은 4-6% 를함유하고있다. 따라서인삼은천연의재비성분으로적합하며, 특정미생물 의발효를위해일부성분만을보충해줌으로써미생물을이용하여발효혹은생물 전환이용이하다. 본연구에서는다양한종류의분해효소를생산하는미생물생균제를이용하여 인삼의배당체형태를무배당체형태로전환시켜특정성분의함량증가, 장내효 과개선및소화흡수율증대와생리활성이증가되거나새롭게생합성된대사산물 을기대하였다. 인삼을장내미생물이나상업적으로사용되는생균제나효소를이용 하여발효함으로써유효성분의추출증가와체내에서의흡수증대로장내미생물의 유무나가수분해능력의차이로인한흡수와효능의차이를제거할수있다. 미생물 에의한인삼의전환뿐만아니라당분해효소인 Pectinex를이용한인삼의전환으 로생리활성을보이는물질을분리함으로써기존에알려진효능뿐만아니라새로 운효과를기대하고응용방안을검토하게되었다. 최종적으로는기존의방법에비교 하여인삼의 ginsenoside의강력한성분으로알려진 compound K의수율을더높일 수있는방법과이성분을분리및정제하는방법을고안하였고생균제의발효와효 소의처리를통해새로운전환물질에대한연구도진행하게되었다. Compound K 는면역증강작용, 종양혈관신생억제작용및세포침윤억제작용이 있는것으로알려져있는장내대사산물의최종생리활성물질이다. Ccompound K를 제조하기위한종래의방법으로, 토양균이나사람분변유래의장내세균을이용할경 우상당시간의배양기간을필요로할뿐만아니라 compound K외에도다른중간 - 13 -
체들이제조되며, β-galactosidase, nariginase 및 lactase 등의효소를반응시키는경 우에는 compound K와진세노사이드 F1이소량생성되고 ginsenoside Rh1과 Rh2가 주로생성되는문제점이있다. Compound K의제조방법으로서다이올계사포닌을 쥐에경구투여한후대장에서 compound K를분리한경우가있으나수율이매우낮 고여러가지 2차대사산물이생성되어 compound K를고순도로정제하는데어려 움이있다. 따라서본연구에서는인삼으로부터여러공정을통해조사포닌혹은정 제진세노사이드를제조하지않고미삼, 수삼자체를분쇄한현탁액에다당류분해 효소인 Pectinex 또는 Viscozyme을반응시켜인삼의배당체형태를무배당체형태 로전환함으로써인삼의진세노사이드중가장강력한성분으로알려진화합물 같은특정성분으로간단하게전환하여수율을향상할수있는방법을개발하고자 하였다. K와 제 2 절연구개발의배경 1. 인삼의효능 인삼은생약의형태로한국, 중국, 일본등의아시아국가에서정신의학적, 신경 계의질병및당뇨병등의여러가지질병에대해사용되어왔다(1). 인삼의주요생 리활성성분으로는 saponin 을비롯하여정유성분, 폴리아세틸렌(polyacetylene), 페놀 성분, 배당체및산성펩티드등이있으며그밖에도비타민, 당류, 무기질과같은다 양한영양성분들이함유되어있다. 그중가장대표적인생리활성성분인 saponin의 경우, 1960년의일본의 Shibata와 Tanaka 그룹에의해그화학적연구가시작되었으 며, 이후최근까지도새로운 saponin 성분및 saponin 성분의생리활성에관한많은 연구가진행되고있다(2). 인삼의화학성분과약리효능은현대과학적인연구를통해 saponin 이주요유효성분으로밝혀졌고, 그약리작용으로는항암작용, 면역기능강 화작용, 혈당강하작용, 간기능강화작용, 혈압조절및동맥경화예방작용, 조혈및 빈혈회복효과, 노화방지효과, 뇌기능강화작용, 갱년기장애개선작용, 항스트레스 와항피로작용, 항산화작용, 기초대사촉진, 중추신경작용, 강장효과, 알코올해독작 용, AIDS 면역기능증진, 성기능부전에관한효능, 위장장애개선, 불감증, 항위 - 14 -
궤양작용, histamine 및 serotonin 유리작용등이있다(3,4,5). 2. 인삼의유효성분 Saponin은인삼의약리효능을나타내는주요물질중의하나로지금까지 30 종 의 saponin이인삼으로부터분리되어 ginsenoside 로명명되어있다. 그중에서 ginsenoside Rh2는홍삼에만함유되어있는 saponin으로함량이낮아약리효능연구 에필요한시료의공급이제한되어있어연구결과가아주적다(6). 이러한 saponin 은당부분(glycone) 와비당부분(aglycone) 로구성된배당체로서식물계에널리분포 하고있는데, ginsenoside은비당부가 dammarane계 triterpene인점이특징적이고 protopanaxadiol (PD) 및 protopanaxatriol (PT) 계로나누어지며현재까지 30 여종 이상의화학구조가밝혀져있다(7). 인삼에서발견되는주요한 3 가지형태의 ginsenoside는 protopanaxadiol 계, protopanaxatriol 계, oleanolic acid 이다. 20 번, 3번 탄소에 glucose가붙어있는데이것이가수분해되어 H 로치환되면, OH기가두개 가붙게되어 diol 이되고, 20 번, 6번탄소에 glucose 가붙어있는데, 이것이가수분 해되어 H로치환되면 OH기가 20 번, 6 번, 3번탄소에붙게되어 triol 이된다(8,9,10). 그러나이러한 ginsenoside는고분자구성성분과연결되어있어서섭취후사람의 장내에서식하는특유의미생물에의해분해되지않고서는체내흡수가되지않아 약효가없으므로반드시장내에서식하는미생물에의해분해가되어야저분자의형 태로흡수된다(11,12,13). 즉여러가지당이떨어져나간, 분자량이작은 ginsenoside 만인체에잘흡수된다고볼수있다. 사람의배설물을표본추출하여장내미생물의 ginsenoside Rb1의가수분해능력을실험한결과표본중 21% 는분해능력이없는 것으로나타났다. 즉, ginsenoside를분해하는미생물을보유하지않은것으로나타 났으며, 분해미생물을보유한것으로나타난 79% 도 ginsenoside를분해하는능력에 있어서저마다차이가있음을확인하였다 (14,15). 3. 인삼의체내대사 인삼의치료효과를높이기위한관심의고조로인해인삼의약효발현을위한 주요성분으로생각되는 ginsenoside의경구투여후관찰되는활성성분에초점이맞 추어졌다. 약물동태학적연구에서경구로투여된 ginsenoside 중혈중에서검출되는 - 15 -
활성성분이 ginsenoside 자체가아니라 ginsenoside의장내대사산물이라는것이제 시되었다. 또한약물학적활성에대한각각의활성을 in vitro에서검토한연구에서 도대사산물이 ginsenoside 보다활성이더높다는것이보고되고있다. 즉생체막에 대한친화성이 ginsenoside 보다대사산물에서더높고, ginsenoside의대사산물이 종양세포에서글루코오스의유입을차단하는등의작용으로종양세포의성장을억제 시키고종양과세균에대한여러약물내성을반전시키는효과를나타낸다는것이다. 현재까지의연구에의하면경구투여한사포닌중 ginsenoside는장내미생물에 의해대사되어활성을보이는대사체로변환되며특히 Prevotella oris 가이에관여 한다고밝혀졌다. 이런 ginsenoside의장내미생물에의한대사체중항암효과가가 장큰물질이 20-O-β -D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol (IH-901, compound K) 이다. Ginsenoside 중 protopanaxadiol type의 saponin 즉, ginsenoside Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, F2 등의장내미생물에의한최종적으로 20-β -O-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol 또는 20(S)-protopanaxadiol 로전환되고 대사산물로서우수한암세포전이억제효과가보고되었다(1). 전환된 compound K는 tumor invasion를방해하거나염색체변이와 tumorigenesis를예방함으로써항전이 나항암활성을유도한다(16,17). 그러나이러한대사적경로는장내미생물에따라서 다르다. 4. 인삼의생물전환 Bifidobacterium K-103은 ginsenoside Rc를 ginsenoside Rd를거쳐 compound K 로전환된다. 반면에 Bifidobacterium K-506은 ginsenoside Mb를거쳐 compound K 로전환된다(16). 게다가이러한 ginsenoside Rb1, Rb2와 Rc는위산과같은약산의 처리에의해 ginsenoside Rg3 로전환되어진다. Bae 등은 ginsenoside Rg3가사람장 내미생물에의해 ginsenoside Rh2 로전환됨을보고했다(18). 전환된 ginsenoside Rh2는 ginsenoside Rg3나 Rc 보다더높은세포독성활성을보여준다. 또한 tumor cell line 에대해인삼추출액과발효된인삼추출액의항암활성을측정하였을때, 인 삼추출액은 tumor cell line 에대해항암활성은나타나지않았다. 하지만, 발효된인 삼추출액은 tumor cell line 에대해항암활성을나타내었다. 이러한결과로보아인 삼추출액을경구투여하였을때, ginsenoside Rb1, Rb2 그리고 Rc는사람의장에서 - 16 -
compound K 로전환됨을알수있다. 그리고전환된 compound K는 tumor cell line 에대한항암활성과같은약물학적인활성을나타낸다. 이러한결과로 natural glycosides인 ginsenoside Rb1, Rb2 그리고 Rc는 prodrugs로써장내미생물에의해 활성화된성분으로전환될수있다 (19). 제 3 절연구개발의필요성 1. 기술적측면 가. 천연물의소화ㆍ흡수 천연물에는유익한생리활성성분들이다량함유되어있으며, 많은종류들이생 리활성물질과당이결합된배당체로존재하며배당체를구성하는당으로는 glucose, arabinose, galactose, rhamnose, xylose 등이있다. 대부분활성물질과 β-glycoside 결합으로존재하므로당결합을끊을수있는 β-glucosidase, pectinase, hemicellulase, lactase 및 cellulase 등의효소나미생물을사용하여천연물내의배 당체화합물을무배당체형태로전환하여활성형태의유효물질양을증가시키거나 효율적으로추출, 정제하여사용하는것이바람직하다. 다양한종류의분해효소를 생산하는미생물을이용하여인삼의배당체형태를무배당체형태로전환시켜특정 성분의함량증가, 추출능의증가, 장내효과개선및소화흡수율증대와생리활성 이증가되거나새롭게생합성된대사산물을기대할수있다 (20). 배당체들은소장이나대장에서식하는미생물들이분비하는다양한효소에의해 분해되어체내로흡수되지만, 분해되지않은성분은흡수되지못하고체외로배출된 다. 배당체의 β-glycoside 결합은소장에서미생물에의해분해되어야대장에서흡 수되어생리활성을나타낸다(21). 배당체의종류, 결합위치에따라소장에서의흡수 율이달라지며, 무배당체가배당체에비해혈액내로의흡수나생리활성이더효과 적이다. 소장에존재하는 β-glucosidase 활성에의한 deglycosylation 과정이식이 ginsenoside 배당체의흡수및대사과정에중요하다고알려져있다. 인체로부터 glucocerebrosidase, lactase phlorizin hydrolase와 broad-specific enzyme 등의 β - 17 -
-glucosidases가동정되었으며 broad-specific enzyme 은간, 신장, 소장에존재하며 배당체의흡수, 대사, 배출, 생리활성에관여하는것으로알려졌다. 나. 인삼의항산화활성 인삼의효능은 free radical 공격에대한방어기전과밀접한관련이있으므로, 인 삼추출물은 hydroxyl, DPPH, superoxide radical의제거및과도한운동에의해유 도되는산화적스트레스에대한간의방어작용에기여한다고알려져있다(22). 활성 산소및과산화물이각종질병및노화등에직접적인원인으로밝혀지면서, 미국의 대학및연구소를중심으로노화억제및질병치료제로서의천연항산화제의개발및 생물학적기능연구가활성화되고있는추세이다(23). 인삼의여러가지유효성분 에서다양한항산화활성이보고되어있어, 생물전환을통하여항산화활성이증가 되거나항산화활성을가지는새로운대사산물을개발함으로써지질의산화억제, free radical 소거활성및 glutamate 독성보호작용을기대할수있다. 인삼을발효하는동안 saponin을비롯한유효성분이분해됨으로써분자량이작아 져경구섭취할경우체내흡수력이증진되고, 으로여러가지유익한작용을기대할수있다. 피부를통한흡수도용이해져국소적 또한각종식물또는버섯에함유되 어있는산성다당질들의항암작용, 면역활성증강작용과같이인삼의산성다당질 에서도유사한효과가보고되어있다 (24). 다. 체내에서인삼의소화ㆍ흡수 수삼의유효성분인 ginsenoside 등은고분자구성성분과연결되어있어서섭취 후사람의장내에서식하는특유의미생물에의해분해되지않고서는체내흡수가 되지않아약효가없으므로반드시장내에서식하는미생물에의해분해가되어야 저분자의형태로흡수된다(11). 자연건조된백삼은열수추출법에의해유효성분이 추출되어도체내에서의분해는불완전하여효과가낮다. 가열건조한홍삼도유효성 분의추출은가능하나체내에서분해가불완전하여더좋은효과를보기위해서열 수추출을한뒤섭취하고있으며, 홍삼추출물의경우에 methanol로유효성분을추 출하지만체내에서의분해는불완전하여효과가낮다. - 18 -
2. 경제 산업적측면 인체의생리기능을활성화시키는기능성식품으로서의인삼( Ginseng) 의유용성 이과학적으로입증되면서, 세계건강보조식품시장에서은행 (Gingko), 마늘 (Garlic) 과함께소위 3-G Boom-up" 을주도할정도로시장규모가증가되고있다. 인삼제 품의주요소비국은중국, 홍콩, 한국, 일본, 대만및기타동남아국가들이며, 주요 수출국으로는우리나라, 중국, 일본, 미국, 캐나다등이있다. 우리나라의인삼수출은 1990년 1억 6,490 만달러를정점으로지속적으로감소하여, 2002년에는 5,500만달러 로 1990년의 30% 수준으로축소되고있는추세이므로인삼의신기능성을창출함으 로써새로운시장의개척이필수적인시점이다. 인삼은우리나라의전통산업으로품질에있어서세계최고의수준이나, 최근중국, 미국, 캐나다등새로운경쟁자의출현으로세계시장및우리나라에서의시장경쟁력 이크게약화되고있다. 현재세계백삼시장은캐나다와미국산백삼이시장을주도 하고있으며, 우리나라의백삼은이미세계시장에서경쟁력을상실하여국내시장에 서만소비되고있다. 이상과같이우리나라인삼관련제품의총수출량이감소하고 있을때, 스위스의 Pharmaton 제약회사가제조한 GINSANA라는인삼캡슐제품은 2001년도에만약 1 억불정도가전세계에판매되고있으며(25), 최근중국, 미국, 캐 나다등새로운경쟁자의출현으로세계시장및우리나라에서의시장경쟁력이크게 약화되고있다. 인삼종주국이라는명성과지위를유지하고있는 6 년근홍삼역시 1996년의전 매제폐지에따른품질저하, 국내업체간수출시장에서의과다경쟁, 외국시장에서의 가짜홍삼범람, 국내묘종의해외생산에따른품질격차의감소, 재배지역의감소, 인건비의상승등생산원가의증가, 불합리한유통구조에의한물류비용의증가등 의복합적인문제로인하여해외시장에서의점유율이지속적으로하락하고있음. 따 라서고부가가치를목적으로하는새로운시장의창출이필요하다(26). 더욱이 2인삼 관련시장의개방은우리나라인삼관련산업의존립에영향을미칠수있는심각한 위기적상황을야기하고있다. 따라서인삼가공제품의기능성을증진시키고인삼 성분의생물전환관련기술을확보하여농가소득수준의향상과관련제조업의확대 를유도함으로써인삼종주국으로서의명예를지키고인삼관련제품의세계시장 - 19 -
확대에따른준비가필요하다. 3. 사회 문화적측면 가. 생균제를이용한인삼의발효 생균제 (probiotics) 는 Parker (1974) 에의해 " 장내미생물균형에도움을주는미 생물혹은첨가물" 로제안되면서, Fuller (1989) 에의해 장내미생물의균형을개선 함으로써숙주에유익하게작용하는살아있는미생물첨가물" 로정의된다. 상업적으 로사용되는생균제로는젖산균간균 (Lactobacillus acidophilus, Lb. salivarius, Lb. plantarum, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. casei), 젖산균 구균 (Enterococcus faecium, Ec. faecalis, Streptococcus thermophilus), 비피더스균 (Bifidobacterium thermophilum, Bif. Bifidum, Bif. pseudolongum), (Saccharomyces cerevisiae), 고초균 (Bacillus subtilis, B. coagulans), 효모 국균 (Aspergillus oryzae), 낙산균 (Clostridium butyricum) 등이있다(27). 나. 인삼의발효물의친환경소재로의개발 최근축산분야에서는광우병, 구제역의발생등이세계적인현안으로부각되고 있다. 축산사료에항생제의사용이규제되면서친환경적이미지를가지는미생물 제제나천연물질의이용에대한관심이높아지고있다. 따라서인삼을생물전환하여 기능성과소화성을향상시킴으로써가축의소화촉진, 항병력증진, 건강증진및장 내세균의균형조절효과를가지는기능성사료첨가제개발이가능하다. 다. 인삼가공식품에대한선행연구의필요성 기능성식품의약리활성은체내에서효과가느리고대상동물의상태, 성장단계, 투여방법, 투여량및주위환경등에따라그효과가영향을받기때문에정확한생 리적기능을설명하기곤란하므로인삼성분의정확한작용기전, 생리적효능, 장내 미생물과의상호관계및여러조건에서의안정성에대한기초연구가필요하다. - 20 -
제 4 절연구의내용및범위 1. 생물전환조건확립 가. 미생물발효조건 발효미생물의특성분석 ph, 온도, 배지, 발효산물, 접종량등검토 나. 유전자확보및발현 효소의수집 배당체분해및변환효소유전자확보 배당체분해및변환효소대량발현조건확립 다. 효소작용연구 재조합효소에의한인삼유효성분의변환특성관찰 배당체의분해및당전이산물에생합성확인 각효소에의한기질특이성확립 성분변환관련최적효소선발및최적화 효소반응최적화를통한기능성인삼유효성분의생산 2. 전환물질의분석및분리ㆍ정제 가. 유용전환물질의분석 TLC 분석조건확립 PDA-HPLC 분석조건확립 나. 전환물질의분리ㆍ정제 산, 알카리안정성, 수지흡착성, 용매이행성 Diaion HP-20, silica gel, Sephadex LH-20, HPLC 이용 인삼유효성분전환산물의분리정제및구조분석 UV, 1 H-NMR, 13 C-NMR, MS 등의기기분석 - 21 -
3. 전환물질의가공적성분석 가. 초고압처리 생물전환전ㆍ후의인삼유효성분에대한초고압특성분석 초고압처리인삼의관능적평가를통한식품소재로의가능성검토 초고압처리를통한인삼유효성분의변화분석 나. ph 안정성분석 농축방법및열처리에따른인삼유효성분의 ph 안정성분석 생물전환인삼유효성분의 ph 안정성분석 ph 다. 의존성분석을통한가공적성검토 열안정성분석 농축방법및열처리에따른인삼유효성분의열안정성분석 생물전환인삼유효성분의열안정성분석 온도의존성분석을통한가공적성검토 4. 발효물의생리활성분석 free radical scavenging 활성 NO 저해활성측정 항균활성측정 세포독성측정 - 22 -
제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국내연구동향 우리나라는인삼에대한재배기술과가공기술에관한노하우가오랫동안축적되 어있어기본기술력에인삼의효능을극대화시킬수있는신기술을접목할경우고 부가가치가기대되고있다. 최근들어신기술을이용하여고부가가치의기능성식품 을개발함으로써국내인삼산업을활성화시키고고려인삼을세계적인상품으로발 전시키려는연구들이진행되고있다. 그예로서, 한국생명공학연구원김영국박사팀 은인삼에서비만을억제하는 polyacetylene 계열의신물질 panaxynone A를분리하 였다(28). 이물질은장내콜레스테롤의흡수를억제하여체내로유입되는콜레스테 롤의양을감소시키는것으로알려져있으며, 생명공학기술전문개발기업 ( 주) 싸이제 닉에특허실시권을양도하여상업화하였다. 그리고원광대학교약학대학김재백교 수팀에의해서도국내에서처음으로 4 년근인삼을적정온도, ph, 수분에서 1개월 발효시킨약리성분이대폭향상된효삼을개발하였다. 뿐만아니라일화중앙연구소 와경희대학교약학대학김동현교수팀에의해세계최초로유산균발효인삼이개 발되어 ginsenoside의대사물질인 IH-901의암전이억제능력과건강증진작용을 확인하였다(29). 그래서인삼농축액을유산균으로발효하여 saponin 함량과흡수력 을높인인삼제품락토진생을출시하여, 인삼과유산균의효과를함께내어장내의 부패균번식을억제하고유익균의번식을도와장을건강하게하고, 인삼의항암및 건강증진작용의효과를보고하였다. 그리고서울대학교와 ( 주) 제일제당의연구팀 은인삼을특수가공하여일부기능이산삼보다 8배이상월등한선삼을개발하였는 데, 일반인삼에는없고홍삼에만미량이들어있는특유의약효성분인 ginsenoside Rg3, Rg5 등을다량함유하여암세포의 apoptosis를유도해암을예방하고억제함을 보고하였다 (30). 일부벤처기업에서는 β-glucosidase 등의미생물효소를이용하여 saponin의분 자구조를전환시키는방법으로 ginsenoside Rb2, Rc로부터 Rd 및다른특이성분 을생산하고, 신장기능개선및혈관확장등에효험이있는기능성식 의약품을 개발하였으며기존의 saponin을산가수분해하여고부가가치의 saponin으로전환하 - 23 -
는기술도개발하였다. 또한사람의분변을이용하여 puerarin을 daidzein 으로, poncirin을 ponciretin 으로, glycyrrhizin을 18β-glycyrrhetic acid 로, ginsenoside Rb1 을 compound K 로, ginsenoside Rb2를 compound K 등의유효생리활성물질로전환 하려는연구도진행중이다(31). 또한 β-glucosidase 효소를이용하여 300종이상의 천연물함유 saponin의분자구조를전환하여 ginsenoside Rb2, ginsenoside Rc로부 터 ginsenoside Rd 및다른특이성분의생산을시도하고있다. 제 2 절국외연구동향 Akao와 Hasegawa 등은경구투여한인삼의진세노사이드는체내에서대사되어 유익한효능을보이는데이때장내미생물의일종인 Prevotella oris 가관여하는것 으로보고하였다(14). 또한녹차를섭취한뒤, 오줌, 담즙혈장에서녹차의 catechin 대사산물을분석하거나대사산물의 transport와신진대사과정에대한연구가진행되 고있다. 한편, 특정물질을투여한후 urine 또는혈액내에서의 metabolite profiling을분석하고이들자료를 probabilistic neural network 기법을이용하여조 직독성을규명하는 metabonomics 연구수행되고있으며 Mayo clinic의 Biomedical Mass Spectrometry and Functional Proteomics Facility에서는 in vitro 와 in vivo 에 서치료제의 metabolites를분석하기위해 line chromatography with tandem MS 사 용하여약물의체내대사에대한연구를수행하였다. - 24 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절연구내용 1. 사용균주및효소 가. 사용균주 실험에사용한균주중생균제로이용된 Bacillus subtillis KCTC1666, Aspergillus oryzae KCTC6292, Saccharomyces cerevisiae KCTC7919, Lactobacillus plantarum KCTC3108, Lactobacillus acidophilus KCTC3155(27) 와 test organism으로이용된 Bacillus subtillis KCTC1021, Pseudomonas aeruginosa KCTC1750, Escherichia coli KCTC1924, Salmonella typhimurium KCTC1926, Staphylococcus aureus KCTC1927, Candida albicans KCTC7965, Malassezia furfur KCTC7743 는한국생명공학연구원(KRIBB) 으로부터분양받아사용하였다. Lactobacillus와 Bifidobacterium의고체및액체배지는 MRS (Difco), Bacillus는 nutrient broth (Difco) 를, Saccharomyces는 YM broth (Difco), Aspergillus는 potato dextrose (Difco) 를사용하였다. 나. 사용효소 수삼을분해하여유효성분으로의전환에사용한효소들은상업적으로판매되어 사용되고있는 AMG 300L (Novo Nordisk Co., Denmark), Pectinex 100L (Novo Nordisk Co., Denmark) 및 Viscozyme (Novo Nordisk Co., Denmark) 을부산소재 바이오시스로부터구입하여사용하였다. 2. 사용시약및기기 가. 인삼재료 실험재료인미삼, 수삼 6 년근은부산광역시부전시장인삼상가에서구입하여 - 25 -
원료로사용하였고, 원료를믹서로 2 분가량분쇄하여시료로사용하였다. 인삼엑기 스와홍삼엑기스는 ( 주) 고제로부터얻었고, 홍삼분말은 ( 주) 고려원인삼으로부터, saponin 분말은대전소재 KT&G 로부터얻었다. 실험의대조군으로사용된 compound K (IH901), Rh2, Rb1, Rg3 는경희대학교약학대학김동현교수님으로부 터얻어서실험에사용하였다. 나. 사용시약 배양에사용된배지인 Nutrient broth (NB), Luria broth (LB), yeast extract-malt extract (YM) broth, Lactobacilli MRS (MRS) broth, potato dextrose (PD) broth는 Difco (Maryland, USA) 제품을사용하였다. 활성물질분리및확인에 사용된 silica gel (Kiesegel 60, particle size : 0.045~0.063 nm) 은 Merck사 (Darmstadt, Germany) 로부터, ODS RP-18 column (ODS-A, 120A, S-5 μm) 은 YMC-GEL 사(Tokyo, Japan) 로부터구입하여사용하였다. Thin layer chromatography (TLC) 에이용된 precoated silica plate 60F 254 (0.25 mm in thickness) 와 ODS R18 F 254s (25DC-Platten 5x10 cm) 는 Merck 사(Darmstadt, Germany) 로부터구입하였다. 각분리단계에서사용된유기용매는 SKY SOLTECH 제품을이용하였고, HPLC 용매는 J.T.Baker (Ashland, USA) 의고순도제품을사용 하였다. DPPH assay에사용한 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrozyl와 MTT assay에사 용한 triazolyl blue tetrazolium bromide는 Sigma (St. Louis, USA) 에서구입하였다. 세포주실험에사용된 Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) 는 HyClone (Logan, Utah, USA) 사의제품을구입하였다. 다. 사용기기 시료의활성검색을위한흡광도측정은 ELISA reader (VERSA, USA) 를이용 하여측정하였다. 효소및인삼배양을위한진탕배양기는 Labtech( 한국) 사의것을 사용하였고, 인삼대량배양을위한발효조는 Biotron( 한국) 사의 Pilot 50L Fermentor 를사용하였다. 추출을위한초음파분쇄기는 Hwashin( 한국) 사의 Power Sonic420을 사용하였다. 물질분석을위해 HPLC와 MS 를사용하였다. 본실험에사용된 HPLC 는 SCL-10A controller, SPD-M10A UV spectrophotometric detector, LC-10AT - 26 -
liquid chromatograph, FCV-10AL, DGU-14A (Shimadzu Scientific Co., Japan) 로 구성되었다. LR-MS는부경대학교공동실습관이보유하고있는 QP 5050A (Shimadzu Scientific Co., Japan) 을사용하였고, inlet은 DIP로하고초기온도는 30 로하여분당 40 씩올려최대온도 340 까지고정하였으며, 스캔범위는 50~750m/z 로하였다. 세포배양에는 CO 2 incubator (NUAIRE, USA) 를사용하였다. 라. Thin Layer Chromatography (TLC) 전환된배양물질을확인하기위하여시료를 silica gel TLC plate (Silica gel 60F 254, Merck, Darmstadt, Germany) 의하단으로부터 5 mm 되는위치에점적하였 고, 점적시각점적의직경이최소가되도록주의하였으며시료간의거리는전개 후옆시료에의해생성된 spot에시료가방해받지않도록 0.5 cm 이상차이가나 도록하였다. 시료의전개용매는 chloroform/methanol/water (4/2/1, v/v/v) 의아래층 을사용하여전개하였다. 전개후 anisaldehyde sulfuric acid로분무하고 110 에서 약 10 분간가온하여발색시켰다. 마. High performance liquid chromatography (HPLC) 생균제로의인삼발효액의분리된활성분획의농도를 1 mg/ml로맞추어 5 μl씩 주입하였으며, 이동상은 90% MeOH, 유속 0.5 ml/min, 고정상으로는 YMC C18 column 을사용하였다. 효소반응하여전환시킨활성분획의농도는 5 mg/ml로맞추 어 10 μl씩주입하였으며, 이동상은물(A) 와 acetonitrile(c) 을사용하여 30% C(0-5 min); 30-80% C(5-40 min); 80% C(40-50 min) 로농도구배를주면서 0.5 ml/min의 유속으로흘렸다. 고정상으로는 YMC C18 column (6.0x150 mm) 을사용하였다. 바. 전환산물의분리및동정 인삼발효산물이나효소전환산물로부터유용물질로전환되었거나신규가능성이 있는전환물질을분리하기위하여먼저발효산물과전환산물을 MeOH로추출하고 상등액만을농축하여 BuOH 추출을하였다. BuOH 추출물의산, 알카리안정성, 수 지에대한흡착성, 용매이행성을조사하여정제하기위하여 Diaion HP-20 흡착 chromatography, silica gel TLC와 column chromatography, Sephadex LH-20-27 -
column chromatography, reverse phase (RP-18) column chromatography 그리고 HPLC 를통해활성물질을분리및정제하였다. 그리고 Rf 값, 발색반응, UV, mass spectroscopy 등의기기분석을통하여구조동정을하였다. 전환된산물이분리가능 한정도일경우, recycling HPLC 또는 paper chromatography를이용하여당전이및 배당체를분리정제하였으며정제된전환산물은 하여구조를분석하였다. MALDI-TOF MS, NMR등을이용 3. 인삼의발효및분석 가. 인삼의발효조건확립 배양조건은 Saccharomyces와 Aspergillus인경우, 30 에서 120 rpm의속도로 진탕하면서 5~ 7 일간배양하고 Bacillus는 37 에서 2~3일간 120 rpm으로진탕 배양하며, Lactobacillus 와 Bifidobacterium 는동일한조건에서혐기적정치배양하였 다. 인삼을믹서기로완전분쇄하여첨가한인삼발효용배지에여러가지생균제를 접종하여 30 혹은 37 에서적당한기간동안배양하였다. 인삼분쇄물을적당한 배지에첨가하고배양한후, 최적조성, 최적온도, 최적 ph, 최적접종량및최적 배양기간을조사하고발효산물의유기산분석및생리활성분석하였다. 나. 발효인삼시료의제조 인삼발효액을대상으로주요생리활성성분인 성된대사산물을분석하기위하여동량의메탄올을넣어 saponin의함량과발효에의해생 2시간동안초음파로추출 한뒤, 진공건조기로건조하였다. MeOH 추출물을증류수에현탁한후 chloroform (CHCl3), butanol (BuOH) 로순차적으로추출하여각분획물을완전히건조시킨후, MeOH을이용하여 5 mg/ ml, 1 mg/ ml의용액을만들고일정량을취하여 high performance liquid chromatography (HPLC) 하여 saponin과대사산물의변화를측정 하였다. 다. Aspergillus oryzae 를이용한대량배양 A. oryzae를이용하여대량배양하기위해먼저, 인삼 3 kg을믹서로분쇄하여 - 28 -
30 L potato dextrose (PD, Difco) 액체배지와함께멸균한후, 종배양한접종균 A. oryzae를 10% 접종하여 50 L 발효조(Biotron, KOREA) 30 에서 120 rpm으로 5 일 간배양하였다. 배양기간동안 0.5 g 의소포제(LS-303, Dow-corning, KOREA) 를 2 회첨가하여 saponin 에의해생성되는배양액의기포를제거하였다. 라. 배양액의추출및용매분획 A. oryzae로 5 일배양한수삼을원심분리하여배양상등액은 Diaion HP-20 (Mitsubishi, Tokyo, Japan) 에흡착하여 MeOH로용출하고인삼침전물은 MeOH로 추출하여각각을모아농축하였다. 농축액을 chloroform, ethylacetate, buthanol로추 출하여용매별분획물을얻었다. 추출물과각분획물은진공농축기로용매를제거 하여메탄올에용해시킨후정량하여성분의변화와활성실험에사용하였다. 4. 배당체분해및당전이효소의개발 가. 배당체분해효소의선발 배당체로구성되어있는인삼성분의비배당체로의전환을효율적으로수행할수 있는효소를선발하였다. 주로 β-glycosidic 결합을분해할수있는 β-glucosidase를 주 target 으로하였다. 기질의수용성이낮으므로유기용매에서반응조건에서도활 성을갖는초고온성미생물 (Sulfolobus, Pyrococcus 등) 유래효소에관심을갖고 연구를수행하였다. 기존에알려진여러미생물유래유전체로부터 β-glucosidase를 선별하고 PCR cloning을수행하여유전자를확보하였으며확보된유전자를대량발 현할수있는 vector (phis119, prest) 에삽입하여대량발현시켰다. 이때효율적 인정제를위하여 histidine이나 GST와같은 tagging 을연결하였다. 나. 당전이효소의선발 인삼성분의전환에있어서배당체에당전이를시킴으로써새로운형태의배당체 를만들고자여러종류의당전이효소를선발하고자하였다. 당전이효소로는 CGTase, maltogenic amylase, maltosyltransferase 와같은다양한효소를이용하고 자하였다. 이들효소의 source로는현재본연구실에서보유하고있는 Bacillus, - 29 -
Thermus 유래효소또는초고온성미생물 (Sulfolobus, Pyrococcus 등) 을사용하고자 하였다. 위에언급된효소들을여러미생물유래유전체로부터선발하고대량발현 시킬수있는 vector 에삽입재조합효소를만들고자하였다. 다. 재조합효소의반응특성 재조합효소에의한인삼 saponin 의변환특성을관찰함. 배당체분해효소에의 하여인삼에존재하는여러배당체가분해되는정도를 TLC를통하여간단하게확인 함. 다. 또한당전이효소가여러배당체에당을효과적으로붙일수있는지를관찰하였 각효소에의한여러배당체의기질특이성관찰하고각효소와기질에대한효 율적전환관계를확인하였다. 라. 효소반응최적화 배당체의분해및당전이산물에생합성에가장효과적인효소를선발하고생합 성산물에대한전환률을확인하였다. 배당체의분해및당전이산물을효율적으로 생산할수있는효소반응조건을확립하기위하여효소, 기질의농도, ph, 온도, 유 기용매에대한반응수율등을실험하여최적조건확립하였다. 5. 당분해효소를이용한인삼의전환 가. 처리조건 효소의선정을위하여 5% saponin에식품첨가물효소인 AMG, Pectinex, Viscozyme을각각 10% 씩첨가하여 37 에서 150 rpm으로 5 일간처리하였다. 또한 인삼시료의선정을위하여 5% 의수삼엑기스, 홍삼엑기스, 홍삼분말, 사포닌과 10% 의수삼과미삼에분해활성이우수한 Pectinex를 10% (v/v) 처리하여위와같 은조건으로반응하였다. 온도별, 날짜별및효소농도별최적조건을선정하기위하 여온도는 37 와 50 의두조건에서실험하였으며최적효소농도를측정하기위 하여 10% 수삼과미삼, 그리고 5% 홍삼분말에 Pectinex를각각 0.1%, 1%, 3%, 10% 를첨가하여처리하였다. - 30 -
나. 배양액의추출및용매분획 10% Pectinex로 5 일간처리한수삼과미삼을원심분리하여침전물에상등액과 동량의 MeOH을첨가하여 1 시간동안초음파분쇄기로분쇄하였다. 진공농축기로 MeOH을제거한후물에현탁하고 BuOH 로용매추출한뒤, 정량하여성분의변화와 활성실험에사용하였다. 6. 인삼유효성분의가공적성연구 가. 열안정성분석 농축전, 후및농축방법에따른인삼유효성분의열안정성분석하였으며생물 전환한인삼의유효성분에대한열안정성을분석하였다. 열안정성의분석을통해 유효성분의온도의존성분석및가공방법을검토하였다. 나. ph 안정성분석 농축전, 후및농축방법에따른인삼유효성분의 ph 안정성분석하였으며생물 전환한인삼의유효성분에대한 ph 안정성을분석하였다. ph 안정성의분석을통해 유효성분의온도의존성분석및가공방법을검토하였다. 다. 초고압처리 인삼소재의초고압처리를통한인삼유효성분의변화를분석하였다. 또한생물 전환한인삼소재의초고압처리를하여인삼유효성분의변화를분석하였다. 초고 압처리후유효성분의열및 의가능성을검토하였다. ph 안정성및관능평가를통한기능성식품소재로서 7. 생리활성분석 가. 항균활성측정 Paper disc를이용한 agar diffusion method를이용하여배양된물질의항균스펙 트럼을조사하였다. 각검정균은다음표의각균주용배지를시험관에 3 ml씩넣어 - 31 -
전배양하였다. B. subtillis KCTC1021, P. aeruginosa KCTC1750, E. coli KCTC1924, S. typhimurium KCTC1926, S. aureus KCTC1927은 37 에서 12~18 시 간진탕배양하였고, C. albicans KCTC7965, M. furfur KCTC7743은 30 에서 24 시간진탕배양하였다. LB 한천배지를멸균하여식힌후각검정균의전배양액을 1% 접종하고 90 mm Petri dish에 20 ml씩분주하여검정 plate 로사용하였다. 물질 의항균활성을검정하기위해 10 mg/ml의농도로 MeOH에녹인측정시료 50 μl를 8 mm paper disc 에흡수시켜건조시킨후, 고체배지에얹어놓고 24 시간동안배 양한후 disc 주위에나타나는생육저지환(inhibitory zone) 의직경을측정하였다. 나. DPPH radical 소거활성측정 DPPH 분자내질소는쉽게전자를받아들임으로써본래의짙은자색을잃어버리 는성질을갖는다. 이러한전자공여작용은지질과산화의연쇄반응에관여하는산 화성활성 free radical 전자를공여하여산화를억제시키는척도가된다. 이러한활 성 free radical은인체내에서각종질병과노화를일으키기때문에이들과반응하 여그활성을소거시키는능력을지닌항산화제로작용할수있는새로운물질을탐 색할필요성이있다(22). EtOAc로추출한시료를 silica gel TLC를실시하고건조시 킨후 DPPH 용액(1.5x10-4 M in EtOH) 을 plate에분사하여보라색에서노란색으로 변화하는 radical 소거활성을나타내는부분을확인하였다. 96-well plate상에서 90 μl DPPH 용액에 10 mg/ml의농도로 MeOH에녹인측정시료 10 μl를넣어 30 분 간방치한다음 490 nm 에서의흡수도의감소정도를조사하였다. 다. 세포독성저해활성측정 MTT assay는살아있는세포의 mitochondria에있는탈수소효소에의해생성된 blue formazan 결정을 DMSO (dimethyl sulfoxide) 로녹여서 540 nm에서흡광도로 측정하였다. 세포주로는 MCF-7 cell (5x10 4 cells/500 μl/24 well) 과 PC-3 cell (1x10 4 cells/250 μl/48 well) 을 5% CO2가포함된 37 배양기에서 12 시간배양한 후, 측정시료를처리하고다시 48 시간동안배양하였다. MTT 용액을 0.5 mg/ml 이되게배양세포에첨가한후, 37 에서 4 시간동안반응하고 DMSO를처리하여 20 분간 shaking 한뒤, ELISA reader 를사용하여흡광도를측정하였다. - 32 -
라. Nitric oxide (NO) 저해활성측정 복강대식세포를세포배양판에 5 10 5 / ml의세포가되도록재부유하여 LPS (1 μg/ ml) 의자극하에 48 시간배양하고배양상등액내의 nitrite 화합물 (NO) 를 Griess 반응에의해측정하였다(32). 제 2 절연구결과 1. 생균제를이용한인삼의발효 가. 배양산물의추출및분석 전환된배양물질을확인하기위하여수삼배양액을 MeOH 로추출, 건조하고물 에현탁한뒤, BuOH로재추출및건조하여 MeOH에녹여 10 mg/ml 농도의시료 로만들어대사산물의변화를 TLC 로확인하였다. 시료를 silica gel TLC plate (60F 254, Merck, Germany) 의하단으로부터 5 mm 되는위치에점적하였고, 시료의 전개용매는 chloroform/methanol/water (4/2/1, v/v/v) 의아래층을사용하여전개하 였다. 전개후 anisaldehyde sulfuric acid 로분무하고가온하여발색시켰다. 수삼발효액의분획농도를 1 mg/ml로맞추어 5 μl씩주입하였으며, 이동상은 0-5분 30% CH 3 CN, 5-40분 30-80% CH 3 CN, 40-50분 80% CH 3 CN으로하여유속 0.5 ml/min, 고정상으로는 YMC-Pack C18 column ( 6.0x150 mm, YMC Co., Japan) 을사용하였다. 표준물질로서 compound K, Rh2, Rb1, Rg3 를사용하였으며. Fig. 1A와같이수삼의 protopanaxatriol ginsenoside인 Rb1은 24 분대, Rb1에서포 도당이 1개분해되어제거된 Rg3는 33 분대와 36 분대, Rb1에서포도당이 2개분해 되어제거되거나 Rg3에서포도당이 1개분해되어제거된 Rh2 의경우, 43.5 분에확 인할수있었다. 한편 protopanaxadiol ginsenoside로서 Rh2와같이포도당이 2개분 해되어제거된 compound K 의경우, Rh2와유사하게 43.0 분에서확인할수있었 다. Compound K의함량을비교하기위하여농도의존적으로 compound K에해당 하는 peak 의면적이증가하는것을볼수있었다(Fig. 1B). - 33 -
(A) (B) Fig. 1. Quantitative analysis of compound K. (A) Representative HPLC chromatogram of authentic ginsenosides as standards. YMC-Pack C18, 6.0x150 mm; A, H 2O; B, CH 3CN; 0-5 min, 30% C; 5-40 min, 30-80% C; 40-50 min, 80% C; 0.5 ml/min. (B) Standard curve of compound K by HPLC. 나. 수삼발효를위한생균제의선정 Compound K와새로운전환물질을탐색하기위하여생균제로서이용되고있는 5 개의균주를선별하여수삼과함께배양하였다. 수삼 6 년근은부산광역시부전시장 인삼상가에서구입하여원료로사용하였고, 원료를믹서로 2분간분쇄하여시료로 사용하였다. 생균제로는 B. subtillis KCTC1666, A. oryzae KCTC6292, S. cerevisiae KCTC7919, L. plantarum KCTC3108, L. acidophilus KCTC3155가이용 되었으며, 배지와함께멸균된수삼에 10% 씩각각접종하여 37 에서 150 rpm으로 5 일간배양하였다. 생균제에의한수삼의배양조건은 Table 1 과같았다. 새로운전환물질을확인하기위하여수삼발효물의 BuOH 추출물을순상 silica TLC plate에점적하고 C/M/W (65/35/10, lower phase) 를전개한후 anisaldehyde sulfuric acid 로분무하여발색시킨결과, Fig. 2에서와같이 A. oryzae KCTC6292로 배양한분획물의 Rf치 0.9 부근에서새로이생성된것으로예상되는성분변화를확 인할수있었으나, B. subtillis KCTC1666, L. acidophilus KCTC3155, L. plantarum KCTC3108 및 S. cerevisiae KCTC7919를첨가하여배양한수삼에서는전환물질을 확인할수없었다. 90% MeOH을전개용매로한 RP-18 TLC 결과에서도순상 TLC 에서확인된물질로추정되는 spot 을확인할수있었다(Fig. 3). 한편수삼을첨가하 지않고 A. oryzae KCTC6292의종배양액만으로배양한분획물에서는이러한전환 물질을확인할수없었기때문에전환물질은 A. oryzae KCTC6292 배양액자체의 - 34 -
것이아니라 A. oryzae KCTC6292에의해전환된수삼에서유래된것으로추정되었다. Table 1. Fermentation condition of Undried Ginseng by Probiotics. Probiotics Medium Cultural Conditions Bacillus subtilis KCTC1666 (BS) Nutrient broth (Difco) Aspergillus oryzae Potato dextrose KCTC6292 (AO) broth(difco) Saccharomyces cerevisiae YM broth(difco) KCTC7919 (SC) Lactobacillus plantarum KCTC3108 (LP) MRS(Difco) Lactobacillus acidophilus KCTC3155 (LA) MRS(Difco) Inoculation size : 10% 37, 120 rpm, 5 days Inoculation size : 10% 30, 120 rpm, 5 days Inoculation size : 10% 30, 120 rpm, 5 days Inoculation size : 10% 37, standing, 5 days Inoculation size : 10% 37, standing, 5 days Final ph 8.0 7.0 5.0 3.5 4.5 Fig. 2. TLC analysis of fermented Ginseng by probiotics. Silica gel 60F 254 TLC plate; chloroform/meoh/h 2O(65/35/10, lower phase); BS, Bacillus subtillis only; BS1, 1st fermented ginseng; BS2, 2nd fermented ginseng; AO, A. oryzae only; AO1, 1st fermented ginseng; AO2, 2nd fermented ginseng; G1, autoclaved ginseng; G2, unautoclaved ginseng; SC1, 1st fermented ginseng; SC2, 2nd fermented ginseng; LA, fermented ginseng; LP, fermented ginseng - 35 -
BS1 BS2 AO1 AO2 G1 G2 SC1 SC2 Fig. 3. Reverse phase TLC analysis of Undried Ginsengs Fermented by Probiotics. RP-18; 90% MeOH; BS1, 1st fermented ginseng; BS2, 2nd fermented ginseng; AO1, 1st fermented ginseng; AO2, 2nd fermented ginseng; G1, autoclaved ginseng; G2, unautoclaved ginseng; SC1, 1st fermented ginseng; SC2, 2nd fermented ginseng. 다. A. oryzae KCTC6292를이용한수삼의 대량배양 Fig. 2에나타난 Rf치 0.9의대사산물의생성양상을검토하기위하여수삼의양 과배양날짜를달리하여실험하였다. 종배양액은 10% A. oryzae KCTC6292로고 정하고수삼의양을각각 5%, 10%, 20% 로하였으며, 배양날짜는 0 일을기준으로 하여 3 일째, 5 일째, 8 일째, 10 일째배양액을회수하였다. Fig. 4A는 5% 수삼, Fig. 4B는 10% 수삼, Fig. 4C는 20% 수삼에서의 A. oryzae KCTC6292에의한날짜 별변화를보여주고있다. 10 일까지진탕배양한결과, 전환물질이 3 일째부터생성 되기시작하여배양후 5 일에서 8 일째 10% 수삼이최대로전환됨을 TLC를통해 알수있었다. 전환물질의확인을위하여인삼혹은인삼전환물질의주요성분인 ginsenoside Rb1, Rg3, Rh2, compound K와 HPLC 를통하여비교한결과, 전환된 물질이 compound K와동일한 retention time (RT) 인 43 분과일치하며 A. oryzae KCTC6292에의해수삼의전환된물질에는 compound K가포함되어있음을확인할 수있었다. 전환된물질을대량생산하기위하여, 수삼 3 kg을믹서로분쇄하고 30 L potato dextrose broth 배지와함께멸균한후, 종배양한 A. oryzae를 10% 접종하여 50 L 발효조(Biotron, 한국) 에서 30, 120 rpm으로 5 일간배양하였다. 사용된발효조는 Biotron사의 Pilot 50L fermentor이며초기배양액의 ph는 4.91이었으나배양 2 일째 ph 6.6, 배양 4 일째는 ph 6.96, 배양이끝나는 5 일째 ph는 7.67 로상승하였다(Fig. - 36 -
5A). 배양기간동안공기는 30 vvm 으로고정하였고, saponin에의한거품생성을 방지하기위하여소포제(LS-303, Dow-corning, 한국) 를 1 일과 4 일째에 2 회첨가 하였다. 2 일, 4 일 5 일의발효물을회수하여 MeOH 추출하고회수한시료를 HPLC하여날짜별로배양액내의전환된 compound K 양을비교한결과, 배양 2 일 부터검출되기시작하여 5 일째최대로생성되는것을확인하였다(Fig. 5B). Fig. 4. Culture Profiles of Fermented Ginseng by Aspergillus oryzae KCTC6292. Silica gel 60F 254 TLC plate; chloroform/meoh/h 2O(4/2/1, lower phase). (A) 5% ginseng, (B) 10% ginseng, (C) 20% ginseng (A) (B) ph Amount of Compound K (µg/ml) 8 7 6 5 4 250 200 150 100 50 0 0 2 4 5 Culture time (days) * Fig. 5. Cultural Profile of Undried Ginseng by Aspergillus oryzae. (A) Profiles of Compound K and ph during Fermentation of Undried Ginseng. (B) HPLC of Undried Ginsengs Fermented by Aspergillus oryzae. YMC C8 6.0X150-37 -
mm, 0-5min, 30% CH 3CN; 5-40min, 30-80% CH 3CN; 40-50min, 80% CH 3CN, 0.5 ml/min. 라. 전환물질 WG2-2-1과 WG2-2-2의분리및정제 A. oryzae KCTC6292 로발효하여대량으로얻은배양액으로부터 compound K 및새로운전환물질을분리하기위하여배양액을원심분리하여상등액와침전물로 나누고침전물은 30 L의 MeOH로 2 일간추출하였다. 물로현탁된수삼의 MeOH 추출물을 ethylacetate (EtOAc) 로 3 회추출하여농축시킨활성분획을 chloroform으 로충진된 silica gel column에서 chloroform과 methanol의비율을단계적으로증가 시키는 step-wise 용출법(chloroform : methanol = 50 : 1 10 : 1, v/v) 으로전개 하여 WG1, WG2, WG3 를분리하였다(Fig. 6). 이중활성이높은 WG2를선택하여 2 차 silica gel column chromatography 하였고, 이때전개용매는 chloroform/meoh/water (65/35/10, lower phase) 을사용하여 WG2-1과 WG2-2의 분획을분리하였으며활성이높은 WG2-2는 80% MeOH로충진된 RP-18 column chromatography 로용출하였다. Reverse phase column chromatography로용출된활 성분획을 Fig. 7과같이 HPLC (3 ml/min, 70% acetonitrile ; 고정상, YMC C18 column, 20.0x150 mm ; detector, PDA) 를이용하여 WG2-2-1 분획을분리하였다. Fermented ginseng for 5 days in potato dextrose broth centrifuged Supernatant Precipitate extracted with MeOH Ethylacetate extraction 1 st Silica gel column chromatography eluted with chloroform/meoh (10/1) Crude WG1 Crude WG2 Crude WG3 2 nd Silica gel column chromatography eluted with chloroform/meoh/water (65/35/10) WG2-1 WG2-2 Reverse phase column chromatography eluted with 80% MeOH WG2-2-1 WG2-2-2 (Compound K) Fig. 6. Purification Scheme of WG2-2-1 and WG2-2-2 from Fermented Undried Ginseng. - 38 -
(A) (B) WG2-2-1 WG2-2-2 (compound K) WG2-2-1 1 2 3 4 Fig. 7. Purification of WG2-2-1 from Fermented Undried Ginseng. (A) TLC analysis of WG2-2. silica gel 60F 254 TLC plate; chloroform/meoh/h 2 O (4/2/1, lower phase); 1, autoclaved ginseng; 2, fermented ginseng by AO; 3, partially purified compound WG2-2. 4, Compound K. (B) HPLC purification of WG2-2-1. YMC C18, 20.0x150 mm, 70% MeOH, 3.0 ml/min 마. 전환물질 WG2-2-2의동정 A. oryzae KCTC6292에의해전환된 WG2-2-2가 compound K임을확인하기 위하여 compound K의표준물질을구하여분리한 WG2-2-2와 LR-MS를수행하여 비교하였다. 스캔범위는 50~750 m/z로두었고분당 40 씩최대 340 까지올려 분석한결과, Fig. 8에서보면기존에알려진 compound K의분자량은 621 로서(33, 34) 135, 207, 341, 425 등에서분절된 molecular ion peak를확인할수있었으며 compound K와 WG2-2-2의분절양상이동일하여전환된물질 WG2-2-2가 compound K 임을확인하였다. * * Compound K * * * * * * Fig. 8. LR-MS Spectrum of WG2-2-2. - 39 -
바. 생리활성측정 배양한발효산물과분리, 정제한물질의생리활성을측정하기위하여항균활성, DPPH free radical 소거활성, PC-3와 MCF-7 세포에대한세포독성을조사하였다. 1) 항균활성측정 항균활성을측정하기위하여전배양된균종 B. subtillis KCTC1021, P. aeruginosa KCTC1750, E. coli KCTC1924, S. typhimurium KCTC1926, S. aureus KCTC1927, C. albicans KCTC7965, M. furfur KCTC7743 1% 를 LB 한천배지에접 종하여검정 plate 로사용하였다. Paper disc에각시료의농도를 10 mg/ml로맞추 어 50 μl씩 loading 하였으며, disc 당올려진시료의양은 500 μg이다. Table 3에서 와같이실험에사용된농도에서는 B. subtillis KCTC1666, S. cerevisiae KCTC7919, L. plantarum KCTC3108, L. acidophilus KCTC3155에의한인삼발효 물의항균활성이나타나지않았다. 그리고 A. oryzae KCTC6292에의해대량배양 된수삼의발효산물에서도위의 test organism에대한항균활성은전혀나타나지않 았으며보고된바에의하면항균활성에대한보고는아직까지없다. Table 2. Antibacterial Activity of Ginseng Fermented by Probiotics. Probiotics Test Organisms 1) BE SL BS 209 R209 C Bacillus subtilis KCTC1666-2) - - - - - Aspergillus oryzae KCTC6292 - - - - - - Saccharomyces cerevisiae KCTC7919 Lactobacillus plantarum KCTC3108 Lactobacillus acidophilus KCTC3155 - - - - - - - - - - - - - - - - - - Unfermented ginseng - - - - - - Fermented ginseng 3) - - - - - - 1) Staphylococcus aureus(209), Staphylococcus aureus(r209), Escherichia coli(be), Bacillus subtilis(bs), Salmonella typhimurium(sl), Candida albicans(c) 2) 500 μg of MeOH extract from fermented ginseng 3) Fermented ginseng by A. oryzae. - 40 -
2) DPPH free radical 소거활성측정 DPPH radical 소거활성측정을위하여각분획의농도를 10 mg/ml로맞추어실 험에이용하였다. 96-well plate에 1.5x10-4 M의 DPPH를 90 μl를넣고희석된시료 를 10 μl섞어실온에서 30 분간방치한다음 ELISA를이용하여흡광도 490 nm에 서측정하였다. 시료의농도는 1 mg/ ml, 300 μg/ ml, 100 μg/ ml, 30 μg/ ml가되게하였 다. 그결과농도의차이는있었으나, 분획별차이는크게보이지않음을알수있었 고, 농도의존적으로활성이나타남을볼수있었다. 그리고분리한 WG2에서의 DPPH radical 소거활성이 1 mg/ ml과 300 μg/ ml에서강한활성을확인할수있었다 (Fig. 9). 0.4 control 1 m g/m l 300 ug/ml 100 ug/ml 30 ug/ml 0.3 O.D (490nm) 0.2 0.1 0.0 control W G1 W G2 W G3 Fig. 9. DPPH radical Scavenging Activity of WG1, WG2, and WG3. 3) 세포독성측정 PC-3와 MCF-7 세포에대한세포독성을알아보기위하여 48-well plate에 1x10 4 cells/250 μl의 cell을분주하여 12 시간뒤에 WG1, WG2, WG3를최종농도가 30 μg/ ml, 10 μg/ ml, 3 μg/ ml이되게처리하였다. 그리고 48 시간동안 37, CO2 세포배 양기에서배양한다음, 상등액을제거하고 Triazolyl Blue Tetrazolium Bromide를 0.5 mg/ml 이되게넣은후, 37 에서 4 시간동안방치하였다. DMSO를넣어 Fomazan 결정을완전히녹이고, 다시 96-well에 100 μl씩분주하여흡광도 540 nm 의 ELISA reader 로측정하였다. WG1, WG2는농도의존적으로 PC-3 세포와 - 41 -
MCF-7 세포에대해저해하는것을확인할수있었고, WG3는 PC-3 세포에대하여 30 μg/ ml농도에서약간저해하는것을볼수있었으나대체적으로세포독성을보이 지않았다 (Fig. 10, 11). 따라서분리된 WG2-2의분획의 PC-3 세포에대한세포독 성을측정하였고, HPLC (YMC C18 column, 20.0x150 mm, 70% MeOH, 3 ml/min) 를통하여분리된분획(WG2-2-1) 에서세포독성이나타남을확인할수있었 다. WG2-2-2는 WG2-2-1 에비해세포독성활성이더강했으며, 이런결과를통해 WG2-2-1은 WG2-2-2 의중간단계의대사산물임을추정할수있었다(Fig. 12). 1.2 1.0 O.D (540nm) 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Control WG1 WG2 WG3 Fig. 10. Cytotoxicity of WG1, WG2, and WG3 on PC-3 cells. 1.2 1.0 control 30 ug/ml 10 ug/ml 3 ug/ml O.D (540nm) 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 control WG1 WG2 WG3 Fig. 11. Cytotoxicity of WG1, WG2, and WG3 on MCF-7 cells. - 42 -
1.4 control 100 ug/ml 50 ug/ml 1.2 25 ug/ml 12.5 ug/ml 1.0 O.D (540nm) 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 control WG2-2 WG2-2-1 WG2-2-2 Fig. 12. Cytotoxicity of WG2-2, WG2-2-1, and WG2-2-2 on PC-3 cells. 2. 당분해효소에의한인삼의전환 가. 전환물의추출및분석 당분해효소를처리한사포닌과인삼의메탄올추출물을박층크로마토그래피와 고속액체크로마토그래피를이용하여진세노사이드를분석하였다. 박층크로마토그래 피조건은키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피판(Merck, Germany) 를사용하였으며 클로로포름-메탄올-물의비율을 4:2:1로하여아래유기용매층을전개용매로사용하 였다. 전개후, anisaldehyde sulfuric acid로분무하고 110 에서약 10 분간가온하 여발색시켰다. 고속액체크로마토그래피조건은시료의농도를 1 mg/ml로맞추어 5 μl씩주입하였으며, 이동상으로물과아세토나이트릴을부피비 30% 로하여 5분간 흘려주고, 40분까지는 80% 아세토나이트릴, 40분에서 50분까지는 80% 아세토나이트 릴로농도구배를주며유속은 0.5 ml/min로하였으며고정상으로는 YMC-Pack C18 column ( 6.0 150 mm, YMC Co., Japan) 을사용하였다. 나. 효소의선정 Saponin의전환에이용된당분해효소인 AMG, Pectinex, Viscozyme은 - 43 -
NOVOZYME 사의제품을이용하였다. AMG와 Pectinex는 Aspergillus niger로부터 생산된효소이며최적 ph는 4.5이고최적온도는 60 이다. 그리고 Pectinex의최적 ph와온도는 ph 3.5와 50 이다. 또한 Viscozyme은 Aspergillus aculeatus 유래의 효소이며최적 ph는 ph 5 이고, 최적온도로는 55 이다. 효소의선정을위하여시료로사용된 saponin을 5% 로고정하고식품첨가물효소 로이용되고있는 AMG, Pectinex, Viscozyme을각각 10% 가되게첨가하여 37 에 서 150 rpm 으로진탕배양한결과, Pectinex를처리한 saponin에서인삼 ginsenoside의강력한성분으로알려진 compound K가생성되는것을 TLC를통해 확인할수있었고(Fig. 13), HPLC를한결과 29 분, 34 분, 40 분대에도새로운물질 이생성됨을확인할수있었다. AMG를처리한 saponin에서는새로운전환물질및 compound K 는생성되지않았고, Viscozyme을처리한 saponin에서는 compound K 가미량생성됨을확인할수있었다(Fig. 14). 위의결과로 AMG와 Viscozyme을처 리하였을때, 전환량이없거나극미량이므로새로운전환물질과 compound K가상 대적으로많이전환된 Pectinex 를선택하여다른시료에적용하였다. 1 2 3 4 5 Fig. 13. Ginseng Saponin Biotransformed by AMG, Pectinex, and Viscozyme. Silica gel 60F 254 TLC plate; chloroform/meoh/h 2O(4/2/1, lower phase); 1, biotransformed saponin by AMG; 2, biotransformed saponin by Pectinex; 3, saponin; 4, compound K; 5, biotransformed saponin by Viscozyme - 44 -
(A) (B) (C) ** ** * (D) ** * Fig. 14. HPLC Chromatograms of Biotransformed Saponin by Enzymes. YMC C 18 6.0x150 mm; A, H2O; B, acetonitrile; 0.01-5 min, 30% C; 5-40 min, 30-80% C; 40-50 min, 80% C; 0.5 ml/min. * Compound K, ** Biotranformed saponin by Pectinex, (A) 5% saponin, (B) Biotransformed saponin by AMG, (C) Biotransformed saponin by Pectinex, (D) Biotransformed saponin by Viscozyme 다. Pectinex 를이용한인삼진세노사이드의전환 인삼내진세노사이드를화합물 K로전환하기위하여 5% 인삼엑기스, 5% 홍삼 엑기스, 5% 홍삼분말, 10% 수삼, 5% 미삼에 5% Pectinex를처리하여 50 에서 150 rpm으로 3 일간효소를반응시킨후, 75% 메탄올로추출하고부탄올로추출하 여화합물 K 로의전환량을고속액체크로마토그래피로비교분석하였다(Fig. 15). 0 일, 1 일, 2 일, 3 일의시료를회수하여분석한결과, 0 일째모든시료에서의화합 물 K 는측정되지않았으나, 인삼시료모두에서 1일부터화합물 K가최대로생성되 어 3 일까지유지되었다. 다른인삼에비해 5% 인삼엑기스에의화합물 K로의전환 율이가장높았으며, 5% 미삼, 5% 홍삼엑기스에서도비슷한전환율을보였다. 그러 나 10% 미삼, 5% 홍삼분말의경우, 화합물 K 로의전환율이낮았다. - 45 -
Fig. 15. Amount of compound K produced from ginseng products by Pectinex. RLG: rootlet ginseng; RG: raw ginseng; RGP: red ginseng powder; GE: ginseng extract; RGE: red ginseng extract. 라. Pectinex 의최적반응조건선정 미삼에대한 Pectinex 처리 ph 에대한영향을조사하기위하여, 5% 미삼에 5% Pectinex를처리하고 ph 3, 5, 7, 9의조건에서 50 에서 150 rpm으로각각 3 일간 배양하고화합물 K 로의전환율을알아보았다(Fig. 16). ph 3과 ph 5에서는 1일째부 터화합물 K가최대로생성되기시작하여 3 일째까지비슷하게유지되었으며, ph 7 과 9에는 1일째생성되기시작하여 3 일째에최대로전환되었다. 또한반응온도에 대한영향을조사하기위하여 5% 미삼에 5% Pectinex를처리하고 ph 5의조건에서 25, 37, 50, 55 에서 150 rpm으로각각 3 일간배양하고화합물 K로의전환율을알 아보았다(Fig. 17). 그결과, 배양온도 50-55 에서최대로전환되었다. 그러나 25, 3 7 에서는전환율이낮았다. 따라서미삼에 Pectinex를처리하여화합물 K로의전환 을위해서는 50 이상으로열을가하는과정이필요하다. 한편효소처리시미삼의 함량에대한영향을조사하기위하여 0.2, 1.0, 5.0, 10.0, 15.0% 미삼에 5% Pectinex 를처리하고산도 5, 50 에서 150 rpm으로각각 3 일간배양하고화합물 K로의전 환율을알아보았다 (Fig. 18). 그결과, 1일째에는 5.0-15.0% 에서비슷한전환율을보 - 46 -
였으나 2-3일째는 10.0-15.0% 에서최대로화합물 K 로전환되었다. 따라서미삼으로 부터화합물 K로최대전환하기위해서는 10.0-15.0% 미삼, 5% Pectinex, ph 5, 50-55 에서 150 rpm으로각각 2-3 일간반응시키는것이최적이었다. Fig. 16. Optimal ph on the production of compound K from rootlet ginseng by Pectinex. Fig. 17. Optimal temperature on the production of compound K from rootlet ginseng by Pectinex. - 47 -
Fig. 18. Optimal concentration of rootlet ginseng on the production of compound K by Pectinex. 마. Pectinex 처리한미삼으로부터화합물 K의분리 위의결과를토대로다량의화합물 K의양을분리하기위하여 Pectinex로 2일간 처리한미삼 300 g 을회수하였다. 상등액과침전물로나누고침전물에상등액과동 량의메탄올을처리하여초음파분쇄기로 1 시간동안침전물을분쇄하여상등액만을 농축한후, 부탄올추출을하여 30 g 의추출물을얻었다. 실리카겔컬럼크로마토그래 피를위하여추출물을실리카겔에흡착을시킨후, 클로로포름으로충진된실리카겔 에클로로포름 (200 ml) 과에틸아세테이트 (500 ml) 를용출시키고클로로포름-메탄 올-물의비율을부피비 4:2:1 으로하여아래층만을전개용매로사용하였다. 박층크 로마토그래피한결과, 클로로포름-메탄올- 물 (4:2:1, 아래층) 의용매에서 Pectinex에 의해전환된화합물 K가포함된분획 18 g 을얻을수있었다. 이를 60% 메탄올로 충진된역상 RP-18 컬럼크로마토그래피를통하여진세노사이드 F1 (PG-1) 을 1.4 g, 70% 메탄올에서는 PG-2( 미동정진세노사이드) 를 310 mg 분리하고 70-80% 메탄올 에서는화합물 Y (PG-3) 와화합물 K (PG-4) 를얻었다. PG-3와 PG-4 혼합물은 2 차실리카겔컬럼크로마토그래피를통해전개용매클로로포름- 메탄올(20:1-10:1, 부 피비) 의조건에서백색분말의화합물 Y ( PG-3, 250 mg) 과화합물 K (PG-4, 4.2 g) 을얻었다 (Fig. 19). - 48 -
Fig. 19. Purification Procedure of PG-1, PG-2, PG-3 & PG-4. 바. Pectinex 처리를통해전환된화합물 여러가지정제과정을통해얻은분리물질 K의동정 PGF-1, PG-2, PG-3, PG-4를박층 크로마토그래피, 고속액체크로마토그래피, 핵자기공명법등으로기기분석하여구조 를동정하였다. 분리물질 PG-1( 진세노사이드 F1) 의물리화학적성상은백색의무정형분말로서 키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피를이용하여클로로포름-메탄올- 물(4:2:1, 아래 층) 로전개하였을때 Rf값이 0.65이고 RP-18 박층크로마토그래피를이용하여메탄올 - 물(8:2) 로전개하였을때 Rf값이 0.60 이다. 또한탄소핵자기공명스펙트럼( δ) 은 16.5, 17.4, 17.5, 17.6, 17.8, 22.3, 23.2, 25.8, 26.7, 28.2, 30.8, 31.0, 32.0, 36.2, 39.4, 39.4, 40.4, 41.2, 47.5, 49.2, 49.9, 51.4, 51.6, 61.8, 63.0, 67.6, 70.2, 71.7, 75.1, 78.3, 78.5, 79.2, 83.3, 98.3, 126, 131 ppm에서 signal을보여 PG-1은 20-O-β -D-glucopyranosyl-20(S )- protopanaxatriol ( 진세노사이드 F1) 으로동정되었다(Fig. 20). 분리물질 PG-3( 화합물 Y) 의물리화학적성상은백색의무정형분말로서키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피를이용하여클로로포름-메탄올- 물(4:2:1, 아래층) 로전 - 49 -
개하였을때 Rf값이 0.50이고 RP-18 박층크로마토그래피를이용하여메탄올- 물(8:2) 로전개하였을때 Rf값이 0.35 이다. 또한탄소핵자기공명스펙트럼( δ) 은 16.1, 16.3, 16.3, 17.4, 17.9, 18.8, 22.3, 23.2, 25.8, 26.6, 28.3, 28.7, 30.7, 30.8, 35.1, 36.2, 37.4, 39.4, 39.6, 40.1, 49.5, 50.3, 51.4, 51.7, 56.4, 65.6, 68.6, 69.2, 70.2, 71.8, 72.1, 74.1, 74.9, 76.7, 78.1, 79.3, 83.5, 98.1, 104.78, 126.0, 131.1 ppm에서 signal 을보여 PG-3는 20-O-[ α -L-arabinopyranosyl-(1 6)-β-D-glucopyranosyl]-20( S)-protopanaxadiol ( 화합물 Y) 으로동정되었다(Fig. 21). 분리물질 PG-4( 화합물 K) 의물리화학적성상은백색의무정형분말로서키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피를이용하여클로로포름-메탄올- 물(4:2:1, 아래층) 로전 개하였을때 Rf값이 0.70이고 RP-18 박층크로마토그래피를이용하여메탄올- 물(8:2) 로전개하였을때 Rf값이 0.30 이다. 또한탄소핵자기공명스펙트럼( δ) 은 115.9, 16.2, 16.3, 17.3, 17.6, 18.7, 22.2, 23.1, 25.6, 26.5, 28.2, 28.6, 30.7, 30.9, 35.1, 36.1, 37.2, 39.3, 39.5, 40.0, 49.4, 50.2, 51.3, 51.5, 56.2, 62.8, 70.0, 71.6, 75.1, 77.9, 78.2, 79.2, 83.1, 98.1, 125.9, 130.8 ppm에서 signal을보여 PG-4는 20-O-β -D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol ( 화합물 K) 으로동정되었다(Fig. 22). Fig. 20. 13 C Assignment and Chemical Structure of PG1. - 50 -
Fig. 21. 13 C Assignment and Chemical Structure of PG1. Fig. 22. 13 C Assignment and Chemical Structure of PG1. - 51 -
사. 전환물질의생리활성분석 인삼의대사산물은항암활성을포함한여러가지생리활성이보고되었으며주요 생리활성성분으로는사포닌이알려져있다. Pectinex 에의해전환된미삼, 분리정 제한전환물질진세노사이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2의 전립선암세포인 PC-3 세포(Fig. 23) 와유방암세포인 MCF-7 세포(Fig. 24) 에서의 항암활성을분석한결과, 전환된미삼추출물, 진세노사이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2 등이 PC-3 세포와 MCF-7 세포에대하여세포독 성을보였다. 따라서전환된미삼에서항암활성을나타내는인삼성분으로진세노사 이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2인것으로밝혀졌으며그 중, 화합물 K로동정된 PG-4의경우농도의존적으로가장높은항암활성을보였 다. Fig. 23. Cytotoxic activity of ginsenosides metabolites on the prostate cancer PC-3 cells. - 52 -
Fig. 24. Cytotoxic activity of ginsenosides metabolites on the breast cancer MCF-7 cells. 3. 배당체분해및당전이효소를이용한인삼의전환 가. 내열성 Thermus 속균주로부터 α-glucanotransferase 유전자확보 1) Thermus α-glucanotransferase 유전자의 cloning 배당체를분해또는변환할가능성이있는효소중기존에유전자를확보하고있 는 maltogenic amylase 와 β-glucosidase 외에 α-glucanotransferase (amylomaltase) 유전자를 cloning 하고자하였다. 내열성을갖는효소를확보하기위 하여내열성균주인 Thermus 속균주로부터 α-glucanotransferase를 search 한결과, T. aquaticus, T. scotoductus, T. thermophilus로부터유전자가알려져있었다. 따라 서이들이외의균주인 Thermus brockianus 를이용하여 α-glucanotransferase 유전 자의확보를시도하였다. T. aquaticus, T. scotoductus, T. thermophilus 로부터알려 진유전자서열을비교하여가능성이있는 PCR primer 를다음과같이제조하였다. 5` 3` primer : ATG GAG CTT CCN C/AGC/G GCT/C TT/AC/T GG 3` 5` primer : TAC CGG/C CTC CGG TGC CCG/C ACC G/CAN ATC - 53 -
위 primer를이용하여아래와같은조건으로 PCR 을수행하였다. 이때 template는 Thermus brockianus의 genomic DNA 를사용하였다(PCR 조건 : 94 1min, 55 1min, 72 2min 35 cycles). PCR 결과, Fig. 25와같은 PCR fragment를얻었으 며 pgem T-easy vector에 cloning 하여염기서열을확인한결과(Fig. 26), α -glucanotransferase 와상당히높은유사성을보임을확인하고계속하여발현벡터 를만들고자하였다. 염기서열분석결과를다른 Thermus 속 α-glucanotransferase 들과 sequence 유사성비교한결과는 Fig 27 과같았다. 즉, cloning 된유전자는확실하 게 α-glucanotransferase롸확인이되었으며유전자의유사성은다른 래 α-glucanotransferase와 84-87% 정도의상당히높은유사성을보였다. Thermus 속유 Fig. 25. PCR products from Thermus brockianus. ㆍ DNA sequence ATGGAGCTTCCTTGCGCTTATGGTCTGCTCCTCCACCCCACGAGCCTTCCGG GCCCTTGGGGTGTGGGGGTGCTGGGGGAGGAAGCCCGGGGCTTTCTCCGCTT CCTGAAGGAAGCGGGAGCCCGTTACTGGCAGGTTCTACCCCTGGGCCCCACG GGCTATgGCGACTCCCCCTACCAGTCCTTTAGCGCCTTCGCCGGGAACCCTTA CCTGATAGACCTAAGGCCCCTGGTGGACCGGGGCTTCGTTCGGCTGGAAGAC CCCGGGTTCCCGGAGGGCAGGGTGGACTACGGGCTCCTTTATGCCTGGAAGT GGCCCGCCCTGCGGGCAGCTTTCCAAGGCTTCCGCCAAAAGGCTTCTCCTGA GGAGAAGGAGGACTTCGCCCGCTTCCAGGAGGAGGAGGCCTGGTGGCTTCGG GACTATGCCCTTTTCATGACCCTGAAGTCCCACCACGGCGGTCTTCCCTGGA ACGCCTGGCCCTTGGCCCTGAGGACGCGGGAGGAGAGGGCGCTAAAAGAGGC GGAGGCTTCCTTGGCGGAGGAAATCGCTTTCCACGCCTTTACCCAGTGGCTC TTTTTCCGCCAGTGGGGCGCCCTCAAGGAGGAGGCCGAGGCCTTGGGCATCG CCTTCATCGGGGACATGCCCATCTTCGTGGCCGAGGACTCCGCCGAGGTCTG GGCCCACCCCGAGTGGTTCCACCTGGACGAGGAGGGGAGGCCCACGGTGGTG GCGGGGGTGCCCCCGGATTACTTCTCGGAAACCGGGCAACGCTGGGGCAACC CCCTTTACCGCTGGGAGGTTTTGGAGGAGGAGGGCTTCTCCTTTTGGATCGC CCGCTTGCGGAAGGCATTGGAACTCTTCCACTTGGTACGCATTGACCACTTC CGGGGTTTTGAGGCCTACTGGGAAATCCCCGCCTCTTGCCCCACGGCGGtGGA GGGGCGCTGGGTCAAGGCCCCGGGGGAAAAGCTTTTCGCCCGCATCCAGGAG GCCTTCGGCCGGATTCCCATCCTGGCGGAGGACCTAGGGGTCATCACCCCCGA GGTGGAGGCCTTGCGGGACCGCTTCGGTCTGCCCGGGATGAAGGTCCTGCAG - 54 -
TTCGCCTTTGACAACGGGATGGAAAACCCCTTCCTCCCCCACAATTACCCCG AGCACGGGCGGGTGGTGGTCTACACCGGCACCCACGACAACGACACCACCCT GGGCTGGTACCGCACCGCCACGCCCCACGAGCGGGATTTCCTGAAGCGGTAT CTGGCGGACTGGGGGATCACCTTTAGGGAGGAAGCCGAGGTGCCCTGGGCCC TCATGCGCCTGGGGATGGCGTCCCGGGCCCGGCTTGCCGTCTACCCGGTCCAG GACGTGCTGGCCCTGGGCTCGGAAGCGCGGATGAACTACCCGGGAAGGCCCA GCGGCAACTGGGCCTGGCGGCTTCGGCCGGGGGAGATAAAGGAGGAACACGG GGAAAGGCTTCTCTCCCTGGCGGAGGCCACGGGCAGGGTTTAA ㆍ Amino acid sequence (total 501 a.a) MELPCAYGLLLHPTSLPGPWGVGVLGEEARGFLRFLKEAGARYWQVLPLGPTGY GDSPYQSFSAFAGNPYLIDLRPLVDRGFVRLEDPGFPEGRVDYGLLYAWKWPAL RAAFQGFRQKASPEEKEDFARFQEEEAWWLRDYALFMTLKSHHGGLPWNAWP LALRTREERALKEAEASLAEEIAFHAFTQWLFFRQWGALKEEAEALGIAFIGDM PIFVAEDSAEVWAHPEWFHLDEEGRPTVVAGVPPDYFSETGQRWGNPLYRWEV LEEEGFSFWIARLRKALELFHLVRIDHFRGFEAYWEIPASCPTAVEGRWVKAPGE KLFARIQEAFGRIPILAEDLGVITPEVEALRDRFGLPGMKVLQFAFDNGMENPFLP HNYPEHGRVVVYTGTHDNDTTLGWYRTATPHERDFLKRYLADWGITFREEAE VPWALMRLGMASRARLAVYPVQDVLALGSEARMNYPGRPSGNWAWRLRPGEI KEEHGERLLSLAEATGRV. Fig. 26. Sequencing of PCR products ㆍPhylogenetic tree of T. brockianus α-glucanotransferase ㆍPair distance of T. brockianus α-glucanotransferase Fig. 27. Phylogenetic tree and Pair distance of Thermus brockianus α -glucanotransferase. - 55 -
2) T. brockianus α-glucanotransferase 유전자의발현 T. brockianus α-glucanotransferase를대장균에서발현하기위하여기존에많이 사용이된 p6xhis119를이용하여발현을시도하였으나성공적인발현이되지않았 다. 따라서다른 vector인 prset vector를사용하여발현을시도하였다이 prset vector는 T7 promoter와 histidine tag을포함하고있는 vector 이다. Cloning된 T. brockianus α-glucanotransferase 유전자를 prset vector에삽입하여단백질의생 산과효소활성을측정한결과, 성공적으로 T. brockianus α-glucanotransferase의 유전자가발현되는것을확인하였다. 이때사용한발현방법은다음과같았다. 재조합 T. brockianus α -glucanotransferase 유전자를포함하는전배양한대장균을 LB 배지에접종하고 3 7 에서 3 시간동안배양한다. 이후 IPTG 를 10 mm 의농도가되게첨가한후 3 시간가량추가배양하고 cell lysis 한후에 glucose oxidase method를이용하여활 성을측정하였다. 성공적으로발현된재조합 T. brockianus α-glucanotransferase를 Ni-NTA column을이용하여 one step 으로분리정제하였다. 이때효소는 65 에서 20 분간열처리를하여내열성을갖고있지않은효소들을제거한후분리, 정제를 시도하였으며분리된단백질의 SDS-PAGE 사진은 Fig. 28 과같았다. Fig. 28. SDS-PAGE of purified T. brockianus α-glucanotransferase. 1. Standard, 2. BL 21, 3. Pellet, 4. Heat treated sample, 5. purified enzyme 나. 당전이효소및배당체분해효소유전자의확보 1) 당전이효소및배당체분해효소의발현및정제 당전이활성이있는효소와배당체를분해할수있는효소인 Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA), Bifidobacterium sucrose - 56 -
phosphorylase, Sulfolobus shibatase β-glucosidase, Thermus brockianus α -glucanotransferase (amylomaltase) 유전자를 cloning 하였다. 각각의재조합유전자 는대장균 expression vector인 p6xhis119 에삽입하였고분리, 정제를간편하게하 기위하여 histidine tag 을붙였다. 발현된단백질은 Ni-NTA column을이용하여 one step 으로분리정제하였고. 정제된재조합단백질의 SDS-PAGE 결과는 Fig. 29 와같았다. 각효소의활성을측정하여성공적인효소활성을확인하였다. Fig. 29 Purification of various enzymes having transglycosylation and carbohydrate-hydrolyzing activity. 1: marker, 2: whole cell extract, 3: purified α -glucanotransferase, 4: Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) whole cell extract, 5: purified BSMA, 6: sucrose phosphorylase whole cell extract,, 7: purified sucrose phosphorylase, 8: β-glucosidase whole cell extract, 9: purified β-glucosidase. 2) 당전이효소및배당체분해효소를이용한인삼의생물전환 정제된효소를이용하여인삼의생물전환을시도하였다. 각 enzyme에인삼농축 액의농도를 10% 되도록하여 total volume 10ml scale 로반응시켰다. 반응시간은 0 hr에서 control을잡고각각 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72 hr 으로반응시켰다. 당전이활 성이있는효소의경우, 인삼농축액에존재하는 ginsenoside의다양성으로인하여특 별한당전이산물이생성되는것으로보이지않았다. 그러나배당체를분해할수있 는효소인 Sulfolobus shibatase β-glucosidase의경우 ginsenoside의변화를확인할 수있었다(Fig. 30). Ginsenoside 분석조건에의하여 TLC 를수행한결과, 특히 Ginsenoside Rb 1 (G-Rb 1 ) 과 β-glycosidase가반응하여 compound K로변하는결과 - 57 -
를확인할수있었다. G-Rb 1 이 compound K로변하는지알아보기위해순수한 G-Rb 1 과 β-glycosidase 를반응시킨결과, G-Rb1의 spot이사라지고 compound K의 spot 이생기는결과를얻을수있었다. TLC 로정성적분석을마친후, 인삼농축액을 기질로반응시킨 sample을 HPLC 로정량분석을시도하였다. 결과적으로 60 시간이 후에반응이 steady-state로도달하고 compound K 가최대로생성됨을보였다(Fig. 31). HPLC 분석결과 Rb 1, Rc, Rb 2 가분해된것으로보이며세가지물질이분해되 어생긴다고보고되어있는 Rd가 1-12 hr 까지는증가하고 12 hr 이후부터는감소 하는경향을보였다(Table 1). Rd에서당이하나떨어져나가면서생기는 compound K 역시 24 hr 이후의시간대에서는증가하는경향을보였다. 그리고계속일정한 peak를보이던 Unknown Product는 72hr 대에서급격한증가의추이를보였다. β-glycosidase 활성을갖는다른효소도같은활성을보이는확인하기위하여 β -glycosidase Themotoga neapolitana 유래 β-glucosidase을 cloning하고정제한후 같은실험을하였으나 T. neapolitana 유래 β-glucosidase는 ginsenoside에별다른 영향을미치지못하였다. 이런결과를통해효소의종류에따라 substrate specificity 가다르다는것으로결론을맺을수있었다. Fig. 30. Ginsenoside Rb 1 reacted by β-glycosidase from S. shibatae. - 58 -
Fig. 31. HPLC results by β-glucosidase from S. shibatae. Table. 3. Relative yield of various ginsenosides reacted with S. shibatae β -glucosidase Rb 1(%) Rd(%) F 2(%) C-K(%) 0hr 100 100 100 100 12hr 0 246.6 103.8 145.7 24hr 0 88.9 111 218.5 36hr 0 70.8 98.4 222.4 48hr 0 56.3 103.4 247.7 60hr 0 40.2 108.5 285.5 다. 효율적인인삼유효성분의생물전환 당전이효소를이용하여인삼의유효사포닌에대한전환을시도한결과, 반응 결과물의난해함과효율적인당전이반응의측정이어렵다는결론을얻었다. 따라서,, 다양한배당체분해효소를이용한효율적인인삼유효성분의생물전환을목표로 하여실험을진행하였다. 1) 곰팡이로부터 β-glucosidase 효소의탐색 - 59 -
1차적으로전통식품으로부터분리된곰팡이균들로부터 β-glucosidase의활성을 확인하였다. 곰팡이균은국내전통식품제조에사용되는메주로부터순수분리된 20 균주의곰팡이균을사용하였다. API-zym Kit를이용한효소의정성적활성을분석 한결과, Table 4에서보는바와같이몇종류의 Aspergillus oryzae (#4, 6, 10, 11, 18, 19, 23) 와 A. fumigatus (# 3, 12, 17, 24) 에서높은 β-glucosidase 의활성을나타 내었다. 그러나 A. fumigatus의경우비록식품재료로부터유래되었으나미생물학 적으로식품에적용가능성이낮으므로 Aspergillus oryzae 에집중하여다음실험을 진행하였다. 7 균주의 Aspergillus oryzae을배양하여배양액에서의 β-glucosidase의 활성을정량적으로측정하였다. 각균주의 crude extract로서의 β-glucosidase 효소 활성은각각다음과같다 (Table 5). 2) 곰팡이 β-glucosidase를이용한인삼의생물전환 각곰팡이균주의배양액을이용하여 crude cell extract를제조하고 crude extract의효소활성을일정하게맞춘후에 ginsenoside Rb1과반응한후다른 ginsenoside로의전환을 HPLC 로확인하였다. 시간을 12 시간, 24 시간, 48시간동안 반응후분석한결과는 Table 6 과같았다. 결론적으로 A. oryzae 6, 11, 19가효과적 으로 ginsenoside Rb1을 biotransform 할수있는능력을가지고있음을확인하였다. 그러나 48시간반응한후의결과를보면 A. oryzae 6, 19의경우는거의모든 ginsenoside Rb1을 compound K로전환하였으나 A. oryzae 11의경우 ginsenoside Rb1을전부변화하기는하였으나모두 compound K로전환되는것은아니고약 50% 정도만전환하고나머지는 ginsenoside Rd와 F2 로남아있었다. Ginsenoside의생전환효율을 S. shibatae β-glucosidase 효소와비교하기위하여 같은효소활성조건에서의 A. oryzae 6, 19의 ginsenoside Rb1의전환효율을살펴 보았다. Table 7에서보듯이전환효율은곰팡이유래효소의경우 S. shibatae β -glucosidase 와비슷한정도로관찰되었으나전환속도에있어서많은차이를보여 주었다. S. shibatae β-glucosidase의경우반응 24시간내에거의모든 ginsenoside 가 compound K로전환되었으나곰팡이유래 β-glucosidase이경우는 48시간이지 난후에야전환이다이루어졌음을확인할수있었다. 이는반응온도가곰팡이효 소의경우 30 에서이루어졌고 S. shibatae β-glucosidase의경우는이보다높은 7 0 에서반응을진행하였다. 결론적으로 ginsenoside의생물전환은 S. shibatae β -glucosidase 를사용하여최적화하였다. - 60 -
Table 4. Enzymatic activity of various fungal strains isolated Korean traditional food. strains 1 * 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 unknown - - - - - - - - - - + + + - - - + - - - 2 unknown - ++ + + - + - - - - - - - + - - - + + - 3 A. fumigatus - ++ + + - +++ +++ - - - + + - - - + +++ +++ - - 4 A. oryzae - ++ - - - + - - - - + + - - - + +++ +++ - - 6 A. oryzae - - + - - - - - - - ++ - - +++ - + +++ + - - 7 Arthrinium.sp - - - - - - - - - - + + + - - - + - - - 8 A. fumigatus - +++ - - - - - - - - +++ + - - - - + + - - 9 A. fumigatus - + - - - - - - - - +++ - - - - - - + - - 10 A. oryzae - - + + - - - - - - + + - - - - +++ ++ - - 11 A. oryzae - - + + - ++ - - - - - - - +++ - + +++ +++ - - 12 A. fumigatus - +++ - + - +++ - - - - +++ +++ - - + - +++ +++ +++ - 13 A. oryzae - ++ + - - + - - - - +++ ++ - - - - - +++ +++ - 16 A. oryzae - ++ + + - + - - - - - - - + - - - + + - 17 A. fumigatus - +++ + +++ - + - - - - +++ + - - - - +++ +++ - - 18 A. oryzae - +++ + + - + - - - - ++ ++ + + - + +++ +++ + - 19 A. oryzae - - - - - + - - - - ++ ++ - - - - +++ +++ - - 21 A. oryzae - - + + + - + - - - + - - ++ - - ++ +++ - - 22 A. oryzae - - + + + - +++ +++ - - - - - - - ++ ++ - - - 23 A. oryzae - - + + - + - - - - ++ ++ - - - - +++ +++ - - 24 A. fumigatus - ++ - - - + - - - - + - - - - - +++ ++ - - * Each enzyme is as follows. 1. control; 2. alkaline phophatase; 3. esterase; 4. esterase lipase; 5. lipase; 6. leucine arylamidase; 7. valine arylamidase; 8. crystine arylamidase; 9. trypsin; 10. alpha-chymotrypsin; 11. acid phospatase; 12. Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase; 13. alpha-galcatosidase; 14. beta-glucuronidase; 15. beta-glucosidase; 16. alpha-glucosidase; 17, beta-glucosidase; 18. N-acetyl-beta-glucosaminidase; 19. alpha-mannosidase; 20. alpha-fucosidase - 61 -
Table 5. β-glucosidase Activity of Aspergillus oryzae strains. No of strains Units/ml A. oryzae 4 6.8 A. oryzae 6 18.22 A. oryzae 10 2.64 A. oryzae 11 13.46 A. oryzae 18 10.7 A. oryzae 19 19.18 A. oryzae 23 7.48 Table 6. Biotransformation of ginsenosides with fungal β-glucosidases Microbes Transformed ginsenoside ( μm), after 12 h Rb1 Rd F2 CK Rh2 A. oryzae 4 810 16 18 - - A. oryzae 6 492 196 185 - - A. oryzae 10 799 18 21 - - A. oryzae 11 516 182 - - - A. oryzae 18 762 41 38 - - A. oryzae 19 507 190 - - - A. oryzae 23 753 53 46 - - Microbes Transformed ginsenoside ( μm), after 24 h Rb1 Rd F2 CK Rh2 A. oryzae 4 836-10 - - A. oryzae 6 24 628 196 114 - A. oryzae 10 848 - - - - A. oryzae 11-696 159 67 - A. oryzae 18 802 33 - - - A. oryzae 19-578 166 138 - A. oryzae 23 821-21 - - Microbes Transformed ginsenoside ( μm), after 48 h Rb1 Rd F2 CK Rh2 A. oryzae 4 825 5 12 - - A. oryzae 6-14 23 824 - A. oryzae 10 829-7 - - A. oryzae 11-345 164 438 - A. oryzae 18 799 26 - - - A. oryzae 19-18 10 836 - A. oryzae 23 809 - - - - - 62 -
Table 7. Biotransformation of ginsenosides with selected fungal β -glucosidases Enzymes Transformed ginsenoside ( μm) Rb1 Rd F2 CK Rh2 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h A. oryzae 6 24-628 14 196 23 114 824 - - A. oryzae 19 - - 578 18 166 10 138 836 - - S. shibatae β-glucosidase - - 20 11 32 28 852 842 - - 3) S. shibatae β-glucosidase를 이용한최적생물전환조건확립 S. shibatae β -glucosidase의경우최적온도와 ph는각각 95 와 ph 5.0으로알 려져있다. 따라서생물전환효율을온도및 ph 에따라서관찰하였다. 반응온도에 따른생전환효율: 반응온도를 30, 50, 70, 90 로나누어서 ginsenoside Rb1 의전환효율을살펴보았다. 반응 24시간후의 ginsenoside Rb1과 compound K의 양은 Table 8 과같았다. Table 9에서살펴보듯이비록효소의최적온도가 95 이지 만 70 이상의반응에서는거의같은전환속도로 ginsenoside Rb1을 compound K 로전환할수있음을확인하였고따라서굳이높은온도인 아니라 90도에서반응하는것이 70 에서반응하여도같은결과를도출할수있었다. 반응 ph에따른생전환 효율: 반응 ph를 ph 4-9까지변환후에 ginsenoside Rb1의전환효율을살펴보았 다. 이때반응온도는 70 일정하게유지하였다. 반응 24시간후의 ginsenoside Rb1 과 compound K의양은 Table 9 와같았다. ph의경우 ph 5, 6 에서만높은전환효 율을나타내었다. ph7에서그나마낮은전환효율을나타내었으나그외 ph 즉 ph 4, 5, 9 에서는거의반응이일어나지않았다. 이는 S. shibatae β-glucosidase의최적 ph와많은관련이있는것으로 S. shibatae β-glucosidase는매우좁은범위에서의 optimum ph 를보여준다. 즉 ph 5-6에서만높은활성을보여주지만그외의조건에 서는매우낮은활성이관찰되기때문이다. 결론적으로인삼의유효성분이 ginsenoside 그중에서도 ginsenoside Rb1을 compound K로전환하기위하여서는 ph의 control 이매우중요할것으로사료된다. 또한여러곰팡이균주가 ginsenoside Rb1의 compound K로의전환에관여하고높 은효율로전환할수있음을관찰하였다. 하지만본연구의결과는미생물유래효 - 63 -
소가생물전환에좀더효율적임을확인하였다. Table 8. Effect of Temperature on biotransformation of ginsenosides with S. shibatae β-glucosidase Temperature ( ) Transformed ginsenoside ( μm) Rb1 Rd F2 CK Rh2 24h 24h 24h 24h 24h 30 369 123 93 307-50 - 56 78 637-70 - 20 32 852-90 - 18 26 849 - Table 9. Effect of ph on biotransformation of ginsenosides with S. shibatae β-glucosidase ph Transformed ginsenoside ( μm) Rb1 Rd F2 CK Rh2 24h 24h 24h 24h 24h 4 768 62 54 - - 5-20 32 852-6 - 17 29 844-7 452 88 102 195-8 779 45 53 - - 9 782 43 38-4. 인삼유효성분의가공적성연구 가. 1) 인삼전분의특성분석 인삼전분입자의형태 인삼전분을주사전자현미경으로관찰한결과는 Fig. 32 와같았다. 인삼전분입 - 64 -
자의형태는거의구형및다각형이며일부손상받은모양의입자도관찰되었는 데, 이는전분제조시물리적으로파손되거나시료처리과정중, 금으로증착시기 계적인파손또는현미경관찰중전자선조사에의해손상된것으로생각되며, 전 분입자중에서표면이함몰된입자가관찰되었는데이는전분입자간혹은조직과 전분입자가밀착되었다가떨어진부분으로생각된다. 인삼전분의입자의크기는 1, 2, 3 등급간에차이를보이지않았다. (a) (b) (c) Fig. 32. Scanning electron micrographs of ginseng starches. (a : 1 st, b : 2 nd, c : 3 rd grade) 2) 인삼전분의팽윤력및용해도 인삼전분의팽윤력과용해도는 Fig. 33 및 34 와같았다. 팽윤력은전분입자를충 분한양의수분과함께가열할때팽윤된입자의무게를측정함으로서수분을얼마 나보유할수있는가를측정하는것으로, 40 이후부터가열온도가증가할수록급 격히증가하는경향을보이다 70 이후에는다소완만하게증가하였다. 팽윤력은 가열온도 50 에서는 1, 2, 3등급의순서로높은팽윤력을나타내다 60 에서는등 급간에차이를보이지않았으며 70 이후부터등급간의차이가나타나기시작하여 80 와 90 에서는 1등급이 2, 3등급에비해낮은팽윤력를나타냈으며 2등급과 3등 급간에는큰차이를나타내지않았다. 용해도는전분입자의팽윤시전분입자바깥으로빠져나와물에녹게되는수용 성전분을측정한것으로 40 이상에서는가열온도가증가할수록급격히증가하다 60 이후로는완만하게증가하였으며등급간에유의적으로차이를나타내지않았다. - 65 -
50 40 Swelling power (%) 30 20 10 1st grade 2nd grade 3rd grade 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Heating Temperature( ) Fig. 33. Changes in swelling power of ginseng starches. 25 20 Solubility (%) 15 10 5 1st grade 2nd grade 3rd grade 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Heating temperature( ) Fig. 34. Changes in solubility of ginseng starches. - 66 -
3) 인삼전분의등온흡습곡선 식품속에함유되어있는수분은외부환경조건에따라수증기압차이에의해이 동하는데특히온도가일정한조건하에물분자는식품을중심으로확산과물질이 동에따라일어나는탈습및흡습과정을통해평형상태에도달하게된다. 이러한평 형상태하에서식품에존재하는수분함량을평형수분함량이라고하며이는외부상 대습도의변화에따라진행되는탈 흡습과정에따라 변화하며이러한상대습도변화 에따른식품속의평형수분함량의변화를나타낸것이등온흡 탈습곡선이다. 인삼전분의등온흡습곡선은 Fig. 35에서와같이전형적인 sigmoid형의곡선을 나타내었고 0.11 0.94 범위의수분활성도에서 2등급이 1, 3등급보다전반적으로낮 은평형수분함량을나타내었다. 등온흡습곡선은전분내의결정성영역의표면과무정 형영역에있는 hydroxyl group과물분자사이의 hydrogen bonding 에의한것으로, 전체수분활성도에서 1, 3등급이 2등급보다수분함량이많다는것은각 Aw에서 1, 3 등급이 2 등급보다흡습력이큰것에기인한것으로판단된다. 0.35 moisture content(dry basis, g H 2 O/ g solid) 1st grade 0.30 2nd grade 3rd grade 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Aw Fig. 35. Moisture sorption isotherms of ginseng starches. 4) 인삼전분의 X-선회절도 일반적으로전분입자의결정형태와결정화도를비교하는데 X-선회절도를이용 한다. 즉 X-선회절도의 peak가날카로울수록결정화도가크다는것을의미하며 - 67 -
peak의형태로부터 A, B 및 C type 로구분한다. A type 은회절각도(2θ) 15, 23 부 근에서강한 peak를보이며 18 부근에서두개의 peak을나타내는것으로옥수수 전분과같은곡류전분은일반적으로 A형으로알려진 X- 선회절도를보여주며, 감 자와같은근경류와밤, 바나나전분등은 B형으로알려진 X-선회절도를주는것 으로회절각도 (2θ) 17 부근에서강한 peak와 22 24 에서몇개의작은 peak를나타 내며특히 5 부근에 peak 을나타내는것이특징이다. C형은 A형과 B형을주는전분 들의혼합물에의해얻어지는것으로고구마, 녹두, 완두등이알려져있다. X선회 절에의해서인삼전분의구조를조사해본결과(Fig. 36), 1, 2, 3등급삼전분은모 두회절각도 (2θ) 5.6, 17.1 에서 peak를보이는전형적인 B형의회절양상을나타 내었다. Table 10은 X선회절도형으로결정부분과비결정부분의면적비를계산하 여나타낸상대적결정화도로서 1, 2, 3등급간에유의적인차이를나타내지않았으나 3 > 2 > 1등급의순으로상대적결정화도가크게나타났으며같은 B 형의회절양 상을나타내는감자전분과참마전분의상대적결정화도가 30.0± 0.7%, 32.0±0.2% 인것에비해매우작은것으로나타났다. 17.1 5.6 1st grade 2nd grade 3rd grade 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Diffraction angle 2θ Fig. 36. X-ray diffraction patterns of ginseng starches. - 68 -
Table 10. Relative crystallinity of ginseng starches Sample Relative crystallinity(%) * 1 st grade 12.46±1.68 a 2 nd grade 14.83±2.04 a 3 rd grade 16.33±2.15 a * Relative crystallinity(%) = Ic / (Ia+Ic) 100 Ia = amorphous area on the X-ray diffractogram Ic = crystallized area on the diffractogram 나. 1) 인삼의초고압처리 초고압처리에대한추출수율 각기다른초고압처리압력과시간을처리한인삼분말시료의추출수율은 Table 11 에나타내었다. Table 11에따르면 90% 수분함량시료가다른시료들에비 해높은추출수율을보였다. 이는용질대용매의비율에의해영향을받은것으로 생각된다. 초고압처리에있어용질에비해높은용매의비율은 liquid phase에닿는 solid phase 의면적이증가시킨다고알려져있다. 본연구의결과도이와유사한결 과값을보여 90% 수분함량에서가장높은추출수율이나타난것으로생각된다. 초 고압을처리하지않은 group에있어 methanol에비해 water의추출수율이높은것 으로나타났다. 이는물에수용성물질들이더쉽게녹아나오는것에영향을받은 것으로고려된다. 본연구에서결과치는제시하지않았지만 한시료중 80 water shaking bath에서가열추출 70% 의경우인삼내전분입자로수분이유입이되면서인삼전분의호화 가일어나추출액을분리할수없었던것도관찰할수있었다. 전반적으로초고압을 처리하지않은것에비해초고압을처리한경우가추출수율이늘어난것은관찰하였 으나처리압력과시간에는크게영향받지않은것을관찰할수있었다. 2) 초고압처리에대한조사포닌함량의변화 각기다른초고압처리압력과시간을처리한인삼분말시료의조사포닌함량 을 Table 12 에나타내었다. 조사포닌함량은초고압처리압력과시간에따른유의 적인차이를보이지않았다. 홍삼에서추출한조사포닌의함량은초고압처리에의해 영향을받지않는다고보고와식품을초고압으로처리할경우셀구조의파괴를야기 - 69 -
한다는보고가있는데, 인삼을초고압처리할경우세포구조는변하게되고세포는 확연하게손상을입는것으로알려져있다. 따라서초고압처리를하게되면물에녹 지않는성분들(pectin 과같은) 도수용성성분과함께추출되어나온것으로생각되 며, 이것이조사포닌함량에영향을미친것으로여겨진다. 수포화부탄올로서추출 하는동안에 butanol layer에부탄올에녹지않는불용성물질들이많이존재하는것 을확인하였으며, 증류수 30mL로세척을하는데있어 3회이상을세척해야만눈에 보이는불용성물질들이씻어져나오는것을관찰할수있었다. 이러한결과로초고 압처리에의해추출수율이늘어난것을확인하였으나조사포닌의함량은각수분함 량내에서초고압의처리에별영향을받지않은것으로나타났다. Table 11. Extraction yield of UHP treated ginseng powder at different pressure and time 70% moisture 80% moisture 90% moisture 0 MPa MeOH 401.2(±1.1)a* 224.3(±0.9)h 251.9(±2.0)c Water 189.9(±1.8)i 324.1(±0.9)g 331.5(±1.7)g 5min 350.8(±3.1)f 356.1(±5.6)fg 366.4(±5.7)b 150 MPa 10min 322.3(±6.5)g 358.0(±8.9)efg 375.5(±6.5)ab 15min 358.0(±2.6)e 362.6(±8.3)def 372.9(±6.8)ab 5min 362.6(±1.3)d 376.5(±5.8)a 374.7(±4.8)ab 300 MPa 10min 370.4(±7.0)c 366.8(±3.8)cd 380.3(±5.4)ab 15min 346.7(±4.7)f 364.0(±8.1)cde 379.5(±7.7)ab 5min 360.6(±5.3)de 358.8 (±5.8)efg 372.7(±1.4)ab 450 MPa 10min 361.6(±1.8)de 354.3(±4.5)g 378.3(±4.8)ab 15min 312.2(±3.1)h 356.8(±7.7)fg 387.1(±4.8)a 600 MPa 5min 362.7(±3.6)d 370.9(±4.3)abc 383.3(±5.1)a 10min 385.2(±1.1)b 364.9(±7.8)cde 383.6(±3.7)a 15min 320.8(±1.6)g 369.2(±1.7)bcd 386.7(±1.4)a * Means with the same letter are not significantly different - 70 -
Table 12. Crude saponin content of UHP treated ginseng powder at different pressure and time 70% moisture 80% moisture 90% moisture 0 MPa MeOH 23.6(±1.6)a* 25.5(±1.9)bc 24.4(±1.7)cd Water 17.5(±1.1)a 20.3(±4.3)d 23.1(±3.6)cd 5min 21.5(±3.7)a 20.3(±1.0)d 32.7(±3.6)a 150 MPa 10min 19.3(±4.8)a 26.6(±2.8)bc 29.3(±0.1)abc 15min 21.9(±1.1)a 25.2(±3.2)bc 29.8(±5.5)abc 5min 20.8(±0.8)a 27.1(±7.6)b 29.3(±0.3)abc 300 MPa 10min 24.8(±4.7)a 27.8(±1.4)b 32.8(±1.5)a 15min 25.4(±4.4)a 34.6(±4.5)a 28.0(±3.4)abc 450 MPa 600 MPa 5min 22.5(±6.5)a 23.9(±1.8)bcd 28.8(±3.7)abc 10min 22.8(±4.9)a 22.2(±2.7)cd 26.0(±0.0)bc 15min 23.3(±6.7)a 27.2(±0.3)b 32.6(±0.2)a 5min 23.9(±6.6)a 27.4(±1.1)b 30.9(±0.0)ab 10min 26.6(±3.8)a 25.4(±0.2)bc 28.3(±0.0)abc 15min 23.1(±5.3)a 28.1(±3.7)b 21.6(±4.1)d * Means with the same letter are not significantly different 3) 초고압처리에대한추출수율과조사포닌함량과의상관관계 초고압처리한인삼분말의추출수율과조사포닌함량사이의상관관계를 Fig. 37 에나타내었다. 둘사이에는상광계수인 R 2 =0.2908이아주낮은수치를나타내어 추출수율과조사포닌함량과의상관관계가아주낮은것으로나타났다. 결과적으로 초고압처리시불용성물질이다량추출되어추출수율을많이증가시키지만조사포 닌의경우상대적으로증가량이크지않아둘사이의상관관계가낮게나타난것으 로판단된다. - 71 -
40 Crude saponin content(mg/g) 35 30 25 20 15 10 0 0 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 E x tra c tio n y ie ld (m g /g ) Fig. 37. Correlation between extraction yield and crude saponin content. 4) 초고압처리시료에대한 HPLC 분석 HPLC를통한 7개 ginsenoside에대한정량분석은아래 Table 13 에나타내었다. 정량은추출수율이가장높고 methanol에녹였을때가장불순물이적은 90% 수분 함량에대하여만정량하였다. 전반적으로 Total ginsenoside의함량은초고압처리에 따라다소증가하는양상을보였다. Fig. 38에나타낸 HPLC chromatogram을살펴보면전반적으로 HPLC chromatogram의전반부의 peak는감소하는경향을보인반면후반부의 peak는증 가하는현상을나타내었다. HPLC 분석에사용된 7개의 ginsenoside 표준품을제외 한나머지미지의후반부 peak 중하나가 ginsenoside Rg3 인것으로확인되었다. 이 러한결과는초고압처리에의해물리적인 transformation이일어난것으로판단되 는데, ginsenoside Rg3는 protopanaxadiol(ppd) 계열의 saponin으로수삼에는그양 이미미할정도로들어있지만홍삼의특이성분인 Rh2와더불어같은 PPD 계열의 ginsenoside인 Rb1, Rc, Rd등으로부터 heat processing이나 mild acid hydrolysis에 의해 glucose분자가떨어져나가는 deglucosylation에의해변환되는것으로알려져 - 72 -
왔다. 또한장내미생물이생성하는효소에의해서도 deglucosylation이효과적으로 일어나며그중간 metabolite중하나로서 Rg3 가생성된다고알려져있다. 하지만이 러한연구들은모두열이필요하거나생체내 metabolism 이필요한방법이다. 본연 구에서는비가열공정인초고압을이용하여이때까지보고된연구들과는다른물리 적인방법으로 Rg3의함량을증가시키는 transformation 방법의가능성을확인하였 다. Table 13. Ginsenoside contents of UHP treated 90% moisture ginseng powder at different pressure and time Extract 150MPa 300MPa 450MPa 600MPa Rg1 Re Rf Rb1 Rc Rb2 Rd total MeOH 1.55 0.82 1.03 4.76 2.15 1.69 0.57 22.63 Water 1.63 0.93 0.96 3.47 1.71 1.18 0.58 10.45 5min 2.19 1.20 1.66 4.30 2.48 1.23 0.97 14.03 10min 1.88 0.92 1.20 3.47 1.89 1.23 0.73 11.31 15min 2.80 1.14 2.21 2.10 1.79 0.62 0.71 11.36 5min 2.09 1.10 1.20 3.93 1.98 1.42 0.61 12.34 10min 2.40 1.33 1.47 4.38 2.26 1.48 0.60 13.91 15min 1.75 0.94 1.08 3.53 1.76 1.15 0.84 11.04 5min 2.43 0.91 1.32 4.88 1.71 1.24 0.70 13.20 10min 1.83 0.94 1.33 4.19 2.06 1.39 0.99 12.72 15min 2.14 1.16 1.40 4.50 2.07 1.51 1.02 13.79 5min 2.10 1.18 1.10 4.49 2.15 1.52 1.01 13.54 10min 1.41 0.70 0.97 2.96 1.37 0.83 0.48 8.73 15min 1.87 0.97 0.72 3.42 1.68 1.18 0.82 10.66-73 -
(a) (b) Fig. 38. HPLC Chromatograms of Control and UHP Treated Ginseng Powder, (a) Control (b) 600MPa, 15min, 90% moisture. 다. 열및산처리후의 ginsenoside의변화 1) 열및 ph 안정성 일정한품질의시료를얻기위해인삼분말로부터 80%MeOH을사용하여유효성 분을추출하고 vacuum rotary evaporator(büchi rotavapor R-124, BÜCHI water bath B-481, Switzerland) 를사용하여 60Brix 로농축하여시료를준비하였고, ph에 따른 ginsenoside의안정성을알아보기위한실험시증류수를이용하여 25Brix 용 액으로만든뒤구연산(sigma, USA) 을사용하여 ph를각각 4.0, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0으 로맞추었다. 열처리에따른 ginsenoside의안정성을알아보기위해각각의시료를 25, 60, 80 항온수조( 비전과학, 한국) 에서각각 2 시간동안열처리를하였으며, 120 는 autoclave를사용하여 2 시간동안처리하였다. 인삼속에존재하는 dammarane계 saponin인 ginsenoside는열처리나산처리에의해서잔기의배치가틀 려지게되며새로운약리활성을가지는 ginsenoside 로전환이되게된다. 잔기가단 순화될수록체내에서의소화흡수율이높아지게되어그생리적인활성이증가하게 - 74 -
된다 (Fig. 39). 열처리와 ph처리가진행이될수록 HPLC chromatogram의초반부가감소되고 후반부가증가되는양상을나타내었다. 같은온도에서 ph가낮아지면 PPD type의 ginsenoside가전환되어나타나게되는 Rg3와 C-K의함량이증가하는것을확인할 수있었다.(Fig. 40) 또한같은 ph일때처리온도가높아지면산처리보다는덜하지만 산처리와마찬가지로 HPLC chromatogram의전반부의피크가줄어들고후반부의 피크가생성되는것을관찰할수있었다.(Fig. 40) 이와같은결과로볼때열처리 및산처리가 의해 ginsenoside의안정성에큰영향을준다는것을알수있었고산처리에 ginsenoside 의안정성이더영향을받는다는것을알수있었다. Group Ginsenoside R1 R2 R3 Rb1 -Glc-Glc H -Glc-Glc Rb2 -Glc-Glc H -Glc-Ara(pyr) PPD PPT Rc -Glc-Glc H -Glc-Ara(fur) Rd -Glc-Glc H -Glc Rg3 -Glc-Glc H H C-K H H -Glc Re H -O-Glc-Rha -Glc Rg1 H O-Glc -Glc Fig. 39. Structure of Ginsenosides. - 75 -
Fig. 40. HPLC Chromatograms of (A) : control at 25, (B) : ph2.0 at 2 5, (C) : control at 120 2) PPD type ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, C-K 의변화 PPD type의 ginsenoside중수삼에다량함유된 Rb1과 Rb2, Rc와 Rd는열과 ph 에따라전체적으로감소하는비슷한경향을나타내었다. 80 이하의열처리에서는 열처리온도에의한영향보다는, ph 에의한영향을더욱크게받았으며, ph가낮아 - 76 -
질수록더욱함량의감소가크게일어난것을확인하였다.(Fig. 41) 120 가넘어가 는경우 Rb1을제외한 Rb2, Rc, Rd이모두분해가되어검출되지않는것으로나타 났다. Rg3 의경우, 25 에서는산처리를할수록그함량이증가하는것을관찰할수있 었으나(Fig. 41E), 온도가높아지면산처리에따라함량이증가하다가오히려감소하 였다. 이는산처리와열처리가함께적용할경우 ginsenoside의전환보다는 ginsenoside 의파괴가더욱활발하게일어나그함량이줄어드는것으로나타났다. 60, 80 에서는 ph 3.5 까지는함량이증가하는것을확인하였으나, ph 3.5보다낮 을시에는전환보다는파괴가더욱크게일어나그함량이줄어들다 ph 2.5부터는 다분해되어검출되지않았다. 120 의경우 ph 4.0까지만증가하고그이하에서는 감소하기시작해 ph3.0 에서다분해되어검출되지않았다. C-K 의경우, Rg3보다는열처리와산처리에의한전환이더욱크게일어나는것 을확인할수있었다. Rg3와는다르게 25 는물론이고, 60 에서도 ph가낮아질수 록그함량이증가하는것으로나타났다. 80 에서는 Rg3보다는산에대한안정성이 커서 ph 3.0 까지낮아질수록그함량이증가하는것으로나타났으며, ph 3.0보다낮 을시그함량이줄어들다 ph 2.5 부터는다분해되어검출되지않았다. 120 의경 우 Rg3와마찬가지로 ph 4.0까지만증가하고그이하에서는감소하기시작해 ph 3.0 에서다분해되어검출되지않았다. - 77 -
Fig. 41. PPD type ginsenoside contents after treatment with citric acid and heating. (A):Rb1, (B):Rb2, (C):Rc, (D):Rd, (E):Rg3, (F):C-K. 3) PPT type ginsenoside Re, Rg1 의변화 수삼에다량함유된 PPT type인 ginsenoside Re, Rg1 역시 PPD type의 - 78 -
ginsenoside인 Rb1과 Rb2, Rc와 Rd와마찬가지로열과 ph에따라전체적으로감소 하는비슷한경향을나타내었다.(Fig. 42) 60, 80 의경우 ph3.0이하에서는 Re, Rg1 둘다모두파괴되어검출되지않았으며, 120 에서는이보다높은 ph4.0에서 이미거의파괴되어 ph3.5 부터검출되지않았다. 감소가되는동안 PPD type과마 찬가지로잔기가열과산에의해떨어져나가면서새로운형태로전환이되는것으 로추측이되나 standard 의부재로인해규명을하지못하였다. 다만, 문헌을통해 retention time 78분과 84분사이에열과산처리를하여생긴피크가 Rg1과 Re가분 해되어생길수있는 Rh1과 F1 이라는것을추측할뿐이다. 이부분에있어서는추 후 standard 의확보를통해좀더연구가진행되어야할것이다. Fig. 42. PPT type ginsenoside contents after treatment with citric acid and heating. (A):Re, (B):Rg1. 4) 온도와 ph에따른 Total ginsenoside의변화 온도와는상관없이 ph가낮을수록 ginsenoside의파괴가일어나 total ginsenoside 의함량이줄어드는것으로나타났다.(Fig. 43) 80 일경우 ph 2.5부터 다파괴가되어서검출이되지않았으며, 120 의경우그보다높은 ph 3.0에서모 두파괴되어검출이되지않는것으로나타났다. - 79 -
Fig. 43. Total ginsenoside contents after treatment with citric acid and heating. 라. 결론 본연구에서는비가열처리공정인초고압을이용하여인삼분말의추출에있어 추출시간을단축시키고보다효율적인초고압처리시간과압력에대한영향을살펴 보았다. 먼저추출수율에있어 90% 수분함량이다른수분함량에비해높은추출수율을 보였다. 이는용질대용매의비율에의해영향을받은것으로보이며, 전반적으로 초고압을처리하면추출수육이늘어나는것으로나타났으나초고압의처리시간과압 력에는크게영향받지않는것으로나타났다. 조사포닌의함량에있어초고압처리 압력과시간에따른유의적인차이는보이지않았다. 초고압처리에따른물에녹지 않는성분들(pectin 과같은) 도함께추출되어나오는것에영향을받아비록초고압처리에의해초고압을처리하지않은것에비해추출수율이늘어났음에도불구하고조사포닌의함량은각수분함량내에서초고압의처리에별영향을받지않은것으 로나타났다. 따라서초고압처리한인삼분말의추출수율과조사포닌함량사이의 correlation은 R 2 =0.2222 정도로아주낮은 correlation 을보였다. HPLC 결과에서는 초고압에따라 total ginsenoside 의함량이증가하는것으로나타났으며, PPD계열의 ginsenoside의 deglucosylation에따른비가열적인 transformation의가능성을관찰하 - 80 -
였다. 눈에띄는큰함량의변화는아니지만이제까지의가열공정이나효소처리공정 과는다른인삼내 ginsenoside의 transformation 가능성을발견한것이본연구의 가장큰수확이라하겠다. 열과산을동시에처리하여인삼내유효성분인 ginsenoside 의전환을알아보았다. 연구결과열처리보다는산처리가 ginsenoside의 전환에더욱큰영향을미치는것을확인하였다. 높은열처리와함께산처리를하는 경우에는전환보다는파괴가더욱진행이되어 ginsenoside가검출이되지않는것 으로나타났다. 홍삼내유효성분인 Rg3와장내에서소화되어흡수되기좋은형태인 C-K 를얻기위해서는높은온도(80, 120 ) 처리보다는 60 가적당한것으로생 각된다. 5. 시제품개발 가. 시제품제조공정 생산계획 생산량결정 원료구입 로스팅 추출 효소처리 침전 여과( 원심분리) 농축 숙성 배합 살균 포장 검사 출하 나. 홍삼농축액작업소요기간 1) 디자인및부재료준비일정 ( 20 일 ) 1) 디자인설계및교정 (10 일) 2)) 부재료발주및입고 (10 일) 2) 생산일정 ( 21 일 ) 1) 원료입고 2) 로스팅 (1 일) 3) 추출 (6 일) 4) 효소처리 (1 일) 5) 침전및여과 (1 일) 6) 농축및숙성 (2 일) 7) 살균및포장 (2 일) 8) 제품검사 (8 일) - 81 -
다. 세부생산과정 원료입고 : 6년근홍삼세미및근류 로스팅 ( 배소) : 건열 120 에서 2~3 시간건조잔맛제거, 풍미증가 추 출 : 원료의 5~6배수정제수를가하여 80 에서 4회추 출 1 차농축 : 30brix까지농축 효소처리 Pectinase : 50~55, 2% w/w, 8hr-분량의효소를첨가한후교반 효소의불활성화 : 일정시간이지난후 80 이상으로가열하여효소를불활성화시킴 침전및여과 : 1일동안침전한후불용성물질은 1μm의필 터로여과 농축및숙성 : 홍삼농축액기준농축액 (60brix) 이상으로농축한후사포닌등검사 살균및포장 : 85 이상으로가열하여살균하고알콜로소독건조된병에충진한후스티커등포장하여완성 제품검사 : 완제품에대하여포장상태및위생상태에관하여 샘플검사 완성 - 82 -
라. 제품생산및품질관리 그림 1. 추출기그림 2. 농축기 그림 3. 완제품포장그림 4. 품질관리실 - 83 -
마. 1) 제품디자인 효홍삼정겉케이스및스푼케이스 2) 병라벨및뚜껑디자인 - 84 -
3) 설명서및카톤디자인 4) 제본및완성품 - 85 -
5) 자매품개발 효홍삼정을이용하여액상제품개발되었다(80ml 30 포, 60 포). - 86 -