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김성삼 임규상 김혜자 정명수 조화은 최윤희 이기남 다. 또한섭취한식이중의탄수화물의소화와흡수를지연시켜식후혈당및혈중인슐린의상승을감소시킴으로써당뇨병의치료효과를나타내는데, 이러한물질로서는식이섬유소및장내소화효소인 α-glucosidase 억제제가있다. 현재임상에서사용하고있는 α-glucosidase억제제인 acarbose는유럽등여러국가에서가장많이이용되고있으며, 장의 brush border에존재하는 α -glucosidase(glucoamylase, sucrase, maltase) 를억제하고 α -amylase의활성도억제한다. Acarbose는인슐린비의손형당뇨병환자의식후혈당과식후혈중인슐린을감소시키며, 단독혹은 sulfonylurea와병용하여장기간투여시는공복시혈당등기초혈당치를감소시킴이밝혀져있고인슐린의존형당뇨병환자에서도유사한효과가있음이알려져있다 3). 그러나이들혈당강하제는젖산축적의위험성, 신부전증상의악화, 간독성, haemodilution, 체중증가등의부작용을나타내는위험요소를포함하고있어장기복용에따른위와같은부작용의위험성을해소할수있는혈당강하소재의개발이절실한실정이다. 이러한현실에발맞추어, 국내뿐아니라일본및미국을중심으로선진국에서도천연물로부터혈당강하소재를개발하기위한연구가활발히진행중이다. 특히최근에는버섯에서분비되는 2차대사산물이생체기능조절및뇌졸중, 심장병등성인병의예방및개선효과가있다고보고됨에따라버섯에대한관심은더욱높아지고있으며송이버섯 (Tricholoma matsutake) 은대표적인약용식용버섯으로 β-glucan 등 polysaccharide 성분이함유되어있어면역력강화, 콜레스테롤저하, 심장질환예방, 혈당강하및항암활성등의성인병예방효과가있는것으로알려져있으며 4-6) 수용성고분자물질이들어있어칼슘대사와항산화기능을 촉진시키는등의약리적기능도있는것으로보고되어있다 7-9). 한편번데기동충하초 (Cordyceps militaris) 는주로나비목 (Lepidoptera) 의유충또는번데기를기주로하여주황색의곤봉형자좌를형성하는곤충기생균 (Entommopathogenic fungi) 의일종으로에너지원인탄수화물이나당의비율은낮지만비타민 A나미네랄등을다른종에비해풍부하게함유하고있어건강기능성식품으로도인지도가높아지고있다 10). 이에본연구에서는 streptozotocin(stz) 으로유발된당뇨흰쥐에송이버섯과동충하초균사체를혼합배양한한방복합배지를유산균과효모를이용하여발효한추출물을경구투여하여혈당에미치는영향을살펴보고자하였다. 양받아실험에사용하였다. 한방복합배지 (Oriental medicine & cereal medium, 이하 OCM) 추출물제조는 Fig. 1과같이한약재와곡물을혼합하여 1.2배의증류수를넣고송이버섯균사체와동충하초균사체현탁액을 5% 접종하여 24 에서 7일간통기성암배양하였다. 균사체가배양된 OCM 배지를 95 에서 30분간살균하여유산균과효모를각각 0.5% 씩접종하여 24 에서 36~48시간발효 ( 최종 ph 4.0) 시킨후 UMPM추출기 (ultra sonic waves, micro wave, Micro bubble, MEDIPS, umex, Korea) 를이용하여 60 에서 4시간추출한후추출물을얻었다. 또한추출물에 4배의 ethanol을가하여 4 에서 24시간침전시킨후증류수를이용하여세척한후다시 4 에서 12시간방치후조다당체를얻었다. Table 1. Composition of medicinal plants and cereals used in the experiment Material Composition(%) Hordeum vulgare var. hexastichon 15 Fagopyrum esculentum 15 Morus alba 14.5 Eucoimmia ulmoides 13.3 Glycyrrhiza urlensis 7.5 Liriope platyphylla 8.8 Dioscorea batatas 8.8 Panax ginseng 6.3 Trichosanthes kirilowii 5.7 Beauveria bassiana 5.1 재료및방법 1. 재료및추출물제조본연구에사용한한약재와곡물 (Table 1) 은금강제약에서구입하여원광대학교한방병원에서검증후사용하였으며, 송이버섯균사체 (Trichloloma matsutake mycelium) 는국립산림과학원에서, 번데기동충하초균사체 (Cordyceps militaris mycelium) 는전북농업기술원에서분양받아계대배양후사용하였다. 또한발효에사용한유산균 (Lactobacillus plantarum 3108) 과효모 (Saccharomyces cerevisiae 7268) 는한국생명공학연구원에서분 Fig. 1. Extraction method of UM, UME, UF and UFE from OCM culture broth. 2. α-glucosidase 저해활성측정 α-glucosidase 저해활성측정은동결건조한각시료를 10μg / ml로희석후 0.1 unit/ ml의 α-glucosidase(sigma, Co, U.S.A) 효소액 50 μl, 200 mm PBS buffer(ph 7.0) 50 μl에넣고혼합하여 37 에서 15분간반응시킨후 3 mm pnpg(sigma, Co, U.S.A) 를가하여 37 에서 10분간반응시켰다. 1 M glycine-naoh를가하여반응을정지시킨후 405 nm에서흡광도를측정하여저해 - 366 -

송이버섯과동충하초균사체혼합배양추출물의투여가 Streptozotocin 으로유발한당뇨쥐의혈당에미치는영향 율을계산하였다. 추출물에대한양성대조군으로 acarbose를사용하였다. USA) 를이용하여자동분석기 (Advia 1650, Tokyo, Japan) 로측정하였다. 3. 실험동물및당뇨유발실험동물은 6주령의 Sprague Dawley계 ( ) 의흰쥐를 ( 주 ) 샘타코에서분양받아실험실환경 ( 온도 22 ± 2, 습도 50 ± 5%, 암주기 12시간 ) 에서한마리씩 stainless cage에넣어일주일간적응시킨후각군으로분류하였다. 당뇨유발은실험동물을 16시간절식시킨후췌장의 β-세포에만특이적으로작용하여다른기관에영향을미치지않는다고알려진 streptozotocin(stz, Sigma. Co, U.S.A) 을 0.01M citrate buffer(ph 4.5) 에 50 mg/kg body weight 농도로녹여복강에투여하여유도하였다. 정상군은동일한스트레스를주기위해동량의 citrate buffer 용액을주사하였다. 당뇨병의유발확인은 24시간후꼬리정맥에서혈액을채취하여비공복시혈당농도가 300 mg/dl 이상인것을당뇨가유발된것으로간주하여실험에사용하였다. 실험군의분류는정상대조군 ( 이하 NC군 ) 과당뇨유발군으로분류하였으며당뇨유발군은다시당뇨대조군 ( 이하 DC군 ) 과양성대조군 ( 이하 PC군 ), UMPM 비발효추출물투여군 ( 이하 UM군 ), UMPM 비발효추출물의조다당체투여군 ( 이하 UME군 ), UMPM 발효추출물투여군 ( 이하 UF군 ), UMPM 발효추출물의조다당체투여군 ( 이하 UFE 군 ) 총 7군으로나누었다. NC군과 DC군은 0.9% 식염수를, PC군은 acarbose(50 mg/kg body weight), 각추출물은식염수에 300 mg/kg body weight 농도로희석하여 1일 1회일정시간에경구투여하였으며고형사료와물은자유롭게섭취하도록하였다. 4. 혈당측정비공복시혈당측정은일주일간격으로일정시간에꼬리정맥에서채혈하여혈당측정기 (Accuchek Active. Roche Diagnostics Cmb, Germany) 를이용하여측정하였다. 5. 체중증가량, 식이섭취량및식이효율의측정실험기간동안의식이섭취량은매일, 체중은 3일간격으로일정시간에측정하였으며식이효율 (food efficiency ratio, FER) 은전체중증가량을같은기간동안의식이섭취량으로부터계산하였다. 6. 혈액및조직의채취실험동물의혈액을채취하기위해실험종료후 12시간절식시킨후 ether로마취하여개복한후심장에서혈액을취하였다. 채취한혈액은 2시간방치한후 3000 rpm에서 20분간원심분리하여혈청을분리하여분석시료로사용하였다. 채혈후즉시간, 신장, 고환을분리적출하여생리식염수로세척한후거즈로수분을제거하였고각각의무게를측정하였으며체중 100 g 당장기무게로환산하였다. 7. 혈청의지질과 metabolic variables 측정혈청중의 ALT와 AST, ALP, total cholesterol, triglyceride, creatinine, BUN, uric acid의농도는각각의측정용 kit(bayer, 8. 통계처리 모든자료의통계분석은 SPSS program을이용하여 one-way ANOVA로검정하여평균 ± 표준편차로나타내었으며, 유의성검정은 Duncan's multiple range test에따라 p<0.05 수준에서검정하였다. 1. α-glucosidase 저해활성측정 결과및고찰 추출물에대한 α-glucosidase의저해활성을 10 μg/ml의농도측정한결과 Fig. 2와같다. 양성대조군으로사용한 acarbose 의경우 77.28% 의높은저해활성을보였으며 UFE의경우 77.10% 로 acarbose와비교했을때가장유사한활성을보였으며, UF 72.71%, UM 69.93%, UME 67.96% 를보였다. Alpha-glucosidase inbition activity (%) 100 80 60 40 20 0 d b Acarbose UM UME UF UFE Fig. 2. α-glucosidase inhibitory activities of extracts from OCM by extraction condition. Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. 2. 체중증가량, 식이섭취량및식이효율 실험기간동안당뇨유발쥐들의식이섭취량, 체중증가량및식이효율의변화는 Table 2와같다. Table 2. Effects of extracts from OCM on body weight gains, food intake and food efficiency ratio in rats. (g/day) Group Body weight gain Food intake Food efficiency ratio (%) NC 2.75±0.83 c 15.30±1.65 a 19.69±3.91 b DC -1.6±1.30 ab 24.26±1.79 b -7.55±6.65 a PC -0.17±1.33 b 24.20±2.96 b -1.33±6.19 a UM -0.24±1.11 ab 25.46±1.56 b -1.10±4.76 a UME -0.75±1.13 ab 24.92±1.90 b -3.68±5.54 a UF -1.79±0.71 a 25.43±1.17 b -7.89±3.23 a UFE -0.64±1.60 ab 25.97±1.62 b -2.63±6.65 a All values are mean±s.d.different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. NC: normal control group, DC: diabetes control group, PC: positive control group(treated by acabose)um: non-fermented OCM extracts group, UME: crude polysaccharide of non-fermented extracts group, UF: fermented OCM extracts group, UFE: crude polysaccharide of fermented OCM extracts group. 2주간의체중증가량은 NC군에서는 2.75 g/day로체중이증가한반면, DC군 1.6 g/day, PC군 0.17 g/day, UM군 0.24 g/day, UME 0.75 g/day, UF 1.79 g/day, UFE 0.64 g/day으로 a c d - 367 -

김성삼 임규상 김혜자 정명수 조화은 최윤희 이기남 체중이감소되었다. 식이섭취량은 NC군이 15.30 g/day에비해모든군이높게나타났다. 그결과식이효율은 NC군에서는 19.69% 로나타난반면 DC군 -7.55%, PC군 -1.33%, UM군 -1.10%, UME군 -3.68%, UF군 -7.89%, UFE군 -2.63% 로 NC군을제외한모든군에서감소되었다. 이는 STZ처리가실험동물에서췌장의 β-cell을선택적으로파괴하여 insulin 생성의이상을초래하여당대사의불균형을일으켜체지방조직과체단백의파괴로체중이감소하게되고 11), 다식증의현상 12) 이나타난것이라할수있다. 3. 장기무게의변화 실험동물의간, 신장및고환의무게는 Table 3과같으며체중에서오는장기무게의차이를최소화하기위해각장기를체중 100 g당무게로환산하였다. 간의무게는 NC군에비해 STZ 로유발된실험군이유의적으로높게나타났으며이는당뇨유발시간의크기가정상에비해비대해진다는보고 13,14) 와같으며 STZ 당뇨유발시인슐린분비저하로인해포도당이용이어려워생체내요구되는에너지가체내의지방분해로충당됨으로써 acetyl-coa로부터형성된에너지가간장에지질성분으로축적된결과로추정할수있다 15). 신장및고환의무게는 NC군에비해모든당뇨실험군에서유의적으로높게나타났다. 특히신장의경우 Kwang 등 15) 은 STZ유발당뇨쥐에서정상군에비해신장의무게가모두증가하였다고하였으며 Lim과 Han 16) 도 STZ 유발당뇨쥐에서정상군보다간과신장이유의적으로높다고보고하였다. Table 3. Effects of extracts from OCM on organs weight in rats (g/100g body weight) Group Liver Kidney Testis NC 2.70±0.40 a 0.73±0.05 a 1.13±0.09 a DC 3.47±0.28 b 1.11±0.10 c 1.26±0.15 ab PC 3.42±0.20 b 1.01±0.06 b 1.28±0.10 ab UM 3.45±0.26 b 1.06±0.08 bc 1.26±0.11 ab UME 3.62±0.23 b 1.08±0.05 bc 1.34±0.11 b UF 3.40±0.11 b 1.11±0.07 c 1.32±0.62 b UFE 3.45±0.23 b 1.10±0.05 bc 1.29±0.15 b All values are mean±s.d. Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. Abbreviations are same as Table 2. 4. 혈당에미치는영향 시료추출물투여에따른혈당농도를측정한결과는 Fig. 3 과같다. 실험시작시의혈중포도당농도는각군간에유의적인차이없이시작되었다. NC군의경우실험기간시작부터종료시까지정상혈당을유지하였으며 DC군역시 STZ유발후 471.80 ~ 563.00 mg/dl 수준으로고혈당을유지하였다. Acarbose 를투여한 PC군은당뇨유발시킨후 1일째의혈당이 336.66 mg/dl 수준이었으며이는마지막 14일째 344.33 mg/dl수준으로약물의효과로인해마지막까지변화없이유지되었다. 마지막 14일째의혈당은 NC, DC, PC, UM, UME, UF, UFE군의순으로 133.20 mg/dl, 563.00 mg/dl, 344.33 mg/dl, 391.80 mg/dl, 444.16 mg/dl, 370.20 mg/dl, 333.33 mg/dl로 4가지시료투여군이 DC군보다유의적으로낮은혈당수준으로나타났으며, 특히과 UF군과 UFE군의경우지속적으로혈당이저하되는 PC군 의혈당과유사한경향으로나타났다. Blood glucose (mg/dl) 600 500 400 300 200 100 0-3 1 8 14 (d a y ) NC DC PC UM UME UF UFE Fig. 3. Effects of extracts from OCM on blood glucose levels in rats. Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. Abbreviations are same as Table 2. 5. 혈청중 AST, ALT 및 ALP 활성도 추출물의경구투여가혈청중 AST, ALT 및 ALP 활성에미치는영향을 Table 4에나타내었다. AST, ALT 및 ALP는독소의투여, 간경화증, 간장염및간암과같은간기능이비정상적일때증가하는것으로알려져있다 17). 또한당뇨시에간장내지질대사이상을초래하여간장손상을일으켜 ALT와 AST가증가하는것으로알려져있다 18). 본실험에서 AST 활성도가 NC군에비해실험군모두에서감소하였으나유의적인차이는보이지않아이는 Choi 등 19) 은당뇨쥐에 nicotinamide를투여한실험군의혈장 AST 및 ALT 활성도가유의적인차이를보이지않았음은당뇨에의한간의합병증이이어나지않았기때문이라고보고한것과일치한결과라볼수있다. 또한 ALT활성도에서는 NC군에비해모든실험군에서다소증가하였으며특히 PC군에서유의적으로높아지는결과를보였다. 그러나 UFE군을제외한 UM군, UME군 UF군에서는 DC군에비해약간의감소함을보였다. ALP활성도는 DC군에서가장높게나타났으며 ALT활성도와마찬가지로 UFE군을제외한나머지실험군에서 DC군에비해유의적으로낮게나타났다. 본실험에서는정상시보다는당뇨일때추출물의투여가 AST활성도를낮추는경향을보였으며 ALT, ALP활성도역시 UFE군을제외한나머지실험군에서감소하였으며이는 STZ로인한간손상이어느정도까지회복시킨것으로사료된다. Table 4. Effect of OCM extracts on serum AST, ALT and ALP activities in rats.(u/l) Group AST ALT ALP NC 280.00±53.83 24.17±4.30 a 139.67±30.21 a DC 269.67±52.82 48.33±21.27 ab 295.33±179.89 b PC 252.50±106.88 89.00±52.41 b 288.50±127.82 b UM 252.00±124.01 36.33±14.23 ab 197.33±51.60 ab UME 262.17±42.10 40.67±25.07 ab 193.17±76.41 ab UF 232.50±27.50 43.00±10.70 ab 233.00±85.68 ab UFE 232.33±156.51 72.17±86.50 ab 259.67±75.47 ab All values are mean±s.d. Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. Abbreviations are same as Table 2. 6. 혈청중 creatinine, blood urea nitrogen(bun) 및 uric acid의함량 혈청중신기능지표로사용되는 creatinine, BUN, uric acid - 368 -

송이버섯과동충하초균사체혼합배양추출물의투여가 Streptozotocin 으로유발한당뇨쥐의혈당에미치는영향 함량에미치는영향을관찰한결과 Table 5와같다. DC군의 creatinine의함량은 NC군과비교하여증가하는경향은보였으나통계적유의성은없었다. 이는당뇨가유발된흰쥐의혈청중 creatinine의함량이증가한다고보고한 Yun 등 20) 과 Kwack 등 21) 의결과와는다르게나타났다. 시료투여군의경우 DC군에비해 creatinine의함량이감소하였으나유의적인차이는나타나지않았다. 또한혈청중 BUN 함량은 DC군의경우매우높은수준이었으며실험군의경우 NC군과비교했을때유의적인수준으로나타났으며, DC군에비해유의적감소를보였다. Uric acid의경우 DC군에비해 acarbose를투여한 PC군에서유의적으로높게나타났으며각추출물의에탄올침전조다당체인 UME군과 UFE군에서도유사하게나타나이는추후좀더세밀한분석을필요할것으로보여진다. 또한 UM군과 UF군의경우 NC군과유사한수준으로나타났다. 혈중 creatinine과 BUN, uric acid는신장질환과관계가대단히커서신장기능의지표로중요시되고, creatinine은근육단백의최종대사산물로서근육의수축에너지로 creatine phosphate에서생성된 creatine이탈수되어생긴것으로요독증, 만성신장염, 당뇨병및갑상선기능항진증등에서혈청중의농도가증가하는데알려져있다. BUN은아미노산의탈아미노반응으로생성된암모니아로주로간의요소회로를거쳐생성되는데간경변, 장관출혈, 당뇨병성 acidosis 및당뇨병성신증, 탈수, 급만성신장염등과같이조직단백의붕괴가발생할때과잉으로생성되거나신장배설기능장애가일어날때증가하는것으로알려져있다. Uric acid는 purine의정상적인대사산물로신기능이감소하면혈청요산수준이높아진다 22). 본실험의결과로볼때 NC군과비교했을때 acarbose를투여한 PC군과발효추출물을투여한 UF군과 UFE군에서유사한수준으로나타나발효추출물의투여가당대사장애를회복시켜단백이화작용을감소시키고, 당뇨합병증이 acidosis를완화시킬수있을것으로보여지며이는좀더심도있는연구가이루어져야할것으로사료된다. Table 5. Effect of OCM extracts on serum creatinine, BUN and uric acid in rats(mg/dl) Group Creatinine BUN Uric acid NC 0.75±0.05 20.98±2.47 a 2.05±0.29 a DC 1.16±0.76 96.81±87.26 b 2.85±0.51 a PC 0.80±0.08 39.03±6.67 a 3.96±0.76 b UM 0.90±0.40 49.68±29.00 a 2.76±0.55 a UME 0.80±0.06 36.05±5.38 a 3.88±1.08 b UF 0.87±0.17 44.90±6.54 a 2.75±0.61 a UFE 0.80±0.10 40.20±8.87 a 4.28±1.06 b All values are mean±s.d. Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. Abbreviations are same as Table 2. 결 론 본연구에서는 streptozotocin(stz) 으로유발된당뇨흰쥐에송이버섯균사체와동충하초균사체를혼합배양한한방복합배지를유산균과효모를이용하여발효한추출물을경구투여하여혈당에미치는영향을관찰한바다음과같은결과를얻었다. 각각의추출물에대한 α-glucosidase의저해활성을 10 μ g/ml의농도측정한결과 UFE에서 acarbose와가장유사한활성을보였으며, UF> UM> UME순으로나타났다. 실험기간동안당뇨유발쥐들의체중증가량, 식이섭취량, 식이효율은 NC군에서는높게나타난반면 STZ로유발된실험군에서감소되었으나간, 신장및고환의무게는 NC군에비해 STZ로유발된실험군이유의적으로높게나타났다. 시료추출물투여에따른혈당농도를측정한결과는 NC군은정상혈당을유지하였으며 DC군역시 STZ유발후고혈당을유지하였다. Acarbose를투여한 PC 군은당뇨유발시킨후 1일째의혈당이 336.66 mg/dl 수준이었으며약물의효과로인해마지막까지큰변화없이유지되었다. 실험종료시 4가지시료투여군은 DC군보다유의적으로낮은혈당수준으로나타났으며, 특히 UF군과 UFE군의경우지속적으로혈당이저하되는 PC군의혈당과유사한경향으로나타났다. 혈청중간기능지표로사용되는 ALT, AST, ALP는정상보다는당뇨일때추출물의투여가 AST활성도를낮추는경향을보였으며 ALT, ALP활성도역시 UFE군을제외한나머지실험군에서감소하였으며이는 STZ로인한간손상이어느정도까지회복시킨것으로사료된다. 신기능지표로사용되는 creatinine, BUN, uric acid로 creatinine의함량은 NC군과비교하여증가하는경향은보였으나통계적유의성은없었다. BUN 함량은실험군들의경우 NC군과비교했을때유의적인수준으로나타났으며 Uric acid는 DC군에비해 acarbose를투여한 PC군에서유의적으로높게나타났으며 UME군과 UFE군에서도유사하게나타나이는추후좀더세밀한분석이필요할것으로사료된다. 감사의글 이논문은원광대학교 2006년도교내연구비의지원에의해수행됨 참고문헌 1. The Bureau of statistics. Statistical annual of mortality cause. p 37, 1996. 2. 許浚. 東醫寶鑑國譯委員會, 對譯東醫寶鑑. 서울, 法仁文化史, p 1331, 1339, 1998. 3. Hillebrand, I., Boehme, K., Frank, G. The effects of the alpha-glucosidase inhibitor BAYg5421(Acarbose) on meal-stimulated elevations of circulating glucose, insulin and triglyceride levels in man. Res Exp Med. 175: 81-86, 1979. 4. Korean Forestry Reports. Reports on the pinemushroom in Korea forest Research Institute, Seoul. Korea. 18: 44-46, 1981. 5. Newman, R.K., Lewis, S.E., Newman, C.W., Boik, R.T., Parnage, R.T. Hypercholesterolmic effect of bareley foods on healthymen. Nutr. Rep. Inc. 39: 749-760, 1989. 6. Oh, H.J., Lee, S.R. physiological function in vitro of beta-glucan isolated from barely. Korean J Food Sci - 369 -

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