대한진단검사의학회지 : 제 23 권제 5 호 2003 Korean J Lab Med 2003; 23: 345-51 진단면역학 HLA-DR DNA 검사용시약 NeoDin SSP TM HLA-DR Typing Kit 의평가 송은영 박혜진 1 박명희 서울대학교의과대학검사의학교실, 서울대학교병원임상의학연구소 1 Evaluation of the NeoDin SSP TM HLA-DR Typing Kit Eun Young Song, M.D., Hyejin Park, M.T. 1, and Myoung Hee Park, M.D. Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine; Clinical Research Institute 1, Seoul National University Hospital, Seoul, Korea Background : For HLA-DR typing, PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) kits are most commonly used in Korea. However, the PCR-SSO method generally shows more ambiguities than PCR-SSP (sequence specific primer) method in generic-level typing of HLA-DRB1 alleles. We evaluated the newly developed NeoDin SSP TM HLA-DR Typing kit based on the PCR-SSP method. Methods : A total of 118 selected samples with known DRB1 alleles were tested with the NeoDin SSP TM HLA-DR Typing kit and the band patterns were interpreted by two investigators in a blind manner. Results : Correct assignment of HLA-DRB1 alleles at a generic level was possible in 117 (99.2%) out of 118 samples tested. Only one sample carrying DRB1*1403 as a homozygote showed ambiguity: DR14 homozygote versus DR14, DR13. Some HLA-DR specificities (DR8, DR11-14) were dividied into 2-11 allelic groups and the typing results (allelic groups) were fully concordant with the known DRB1 allelic specificities. When a proper concentration of DNA with good purity was used, band patterns were clear and easy to read and no false positive or false negative band was observed in the DRB1 assignments. The occasional presence of 1-2 faint nonspecific bands did not much influence the correct assignments of specific bands. In a small proportion (5 samples, 4%) of samples tested, a random occurrence of PCR failure of 1-2 internal control bands was observed; however it did not affect the correct assignments of DRB1 alleles. Conclusions : When a proper concentration of DNA with good purity is used, the correct assignments of HLA-DRB1 alleles at a generic level are possible in >99% of the samples without ambiguity, using the NeoDin SSP kit. (Korean J Lab Med 2003; 23: 345-51) Key Words : HLA-DR, DRB1, Ambiguity, SSP (sequence specific primer) 서 론 Human leukocyte antigen (HLA) 유전자는인간에서알려진 접수 : 2003년 7월 1일접수번호 : KJCP1687 수정본접수 : 2003년 9월 15일교신저자 : 박명희우 110-744 서울시종로구연건동 28 서울대학교병원진단검사의학과전화 : 02-760-3388, Fax: 02-3672-3337 E-mail: parkmhee@snu.ac.kr * 본논문은 2002 년도서울대학교병원위탁임상연구비 (06-2002-007-0) 지원에의해이루어졌음. 가장다형성 (polymorphism) 이심한유전자로서이러한다형성은장기이식과자가면역질환에매우중요한역할을하며따라서 HLA-DR의정확한형별판정이장기이식과질환감수성연구에서매우중요하다 [1, 2]. HLA-DR 검사는크게혈청학적검사와분자유전학적검사로나눌수있다. 혈청학적방법은 B 림프구를분리하기힘든환자, 즉, 혈액질환환자, 뇌사자, 신생아등에서는적용하기힘들고항혈청의교차반응으로인해판독에어려움이있을수있다 [3, 4]. 또한비혈연개체간의장기이식이나질환감수성연구에는대립유전자수준의형별판정이필요한데 [5, 6], 혈청학적방법으로는불가능하다. 이러한단점을해결하고자, 최근 345
346 송은영 박혜진 박명희 수년간여러가지분자유전학적인 HLA-DR 검사법이개발되어널리적용되고있고 [7-11], 상품화된키트도여러가지가소개되어있다. 국내에서는 PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) 기법을이용하는 INNO-LiPA HLA-DRB1 Typing (Murex IN- NOGENETICS, Zwijndrecht, Belgium) 과 Dynal RELI TM SSO HLA-DRB Test (Dynal Biotech, Wirral, UK) ( 이하 Dynal DRB) 키트가주로사용되고있으나두검사모두일부검체에서저해상도수준에서정확한 HLA-DR 형별판정이되지않아어려움을겪고있다 [12-16]. 이를해결하기위해저자들이 Dynal DRB 검사결과의판정시한국인의 DRB1 대립유전자빈도와 DRB1- DRB3, DRB4, DRB5 유전자간의연관성을이용하여저해상도수준의정확한 HLA-DR 형별을판정할수있는한국형프로그램을개발하여보고한바있다 [16]. 이는주로 PCR-SSO 기법자체의한계에기인하나, 이러한키트들이서양인에흔한 HLA- DR 형별을주로감별하도록고안되었다는요인도있다. 이에본연구에서는최근국내에서개발된 PCR-SSP (sequence specific primer) 기법을이용하는 Neodin SSP TM HLA-DR Typing kit 가개발되었기에이를평가하여보고하고자한다. Blood Mini Kit (Genotein, 안산, 한국 ), 또는 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 로추출한 DNA를사용하였다. 2. NeoDin SSP TM HLA-DR Typing kit 를이용한 HLA-DR DNA 형별검사 DNA 농도는예비실험을통하여 30 ng/ L (test well당 12 ng DNA) 전후가되도록조정하여사용하였다. Genomic DNA 10-15 L와증류수 85-90 ul를키트내의 Neomaster mixture A (150 L) 에혼합하였다. SSP 24 well plate의 A1에서 C7까지의각 well에 mixture를 10 L씩넣고뚜껑을덮은후 HLA-DRB (DRB1/DRB3/DRB4/DRB5) 유전자를증폭시켰다. PCR은 PTC-200 DNA Thermal Cycler (MJ Research, Waltham, MA, U.S.A.) 를사용하여 95 에서 5분처리한후 94 15초, 61 50초, 72 30초의과정을 30회반복하고마지막에 72 에서 5분간반응시켰다. PCR 산물의확인은 Micro SSP Gel Sys- 1 2 3 4 5 6 7 8 1. 연구대상 재료및방법 총 118검체를대상으로하였으며, 이중에 107검체는대립유전자 (4 digit) 수준의 HLA-DR 형별을알고있는검체였고검체선정은크게세군으로구성되었다. 우선한국골수은행에기증희망자로등록되어대립유전자수준의 HLA-DR 형별을알고있는 510명의검체 [17] 중한국인에서유전자빈도 0.1% 이상인 HLA- DR 형별 (28종) 이최소한 1예이상포함되도록 48검체를선정하였으며, 두번째로 Dynal RELI TM SSO HLA-DRB Test로검사된한국골수은행등록자 3,000명의검체중 ambiguity를보인 456검체 (ambiguity 빈도 15.2%, 총 51유형, PCR-SSCP로 HLA- DR generic type을확인함 )[16] 중각유형별로한검체씩모두 51검체를선정하였다. 마지막으로, UCLA Tissue Typing Laboratory에서주관하는 International DNA Exchange' 검체중한국인에빈도가낮아골수은행공여희망자검체에서누락된 HLA- DR 형별을갖고있는 DNA 19검체를포함하였다. 이들 118검체중 DRB1 대립유전자의동형접합체 5건 (DRB1*0301, *0405, *1101, *1301, *1403 각 1건 ) 을제외한나머지검체는모두이형접합체검체였다. 한국골수은행검체중 70검체는기존에추출해놓은 DNA (DTAB-CTAB 방법 )[18] 을그대로사용하였고 29검체는보관된 DNA가없거나보관된 DNA로검사한결과 DNA 순도가낮거나 DNA 오염이의심되어결과판정이어려웠던경우로 column을이용한 DNA 추출용키트인 MIPSafe TM A B C A B C A B C Fig. 1. Examples of SSP band pattern. upper: DR4 & DR11-2 group positive band=b1, B2, B5, B7, C2, C3; nonspecific band=c6. middle: DR15 & DR11-2 group positive band=a6, A7, B5, B7, C2, C3. lower: DR3 & DR11-1 group positive band=b5, B6, B7, C1, C3; nonspecific band=c6.
NeoDin SSP TM HLA-DR Typing Kit 의평가 347 Table 1. NeoDin HLA-DR PCR-SSP analysis table bp DR group 1 A1 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8 A8 9 B1 10 B2 11 B3 12 B4 259 214 228 165 204 177 203 203 171 205 266 183 242 221 181 174 178 214 208 217 152 216 166 210 13 B5 14 B6 15 B7 16 B8 17 C1 18 C2 19 C3 20 C4 21 C5 22 C6 23 C7 Allele DR1 DR8-1 DR8-2 DRB1*0805/18 DRB1*0808/15 DRB1*0809/21 DRB1*0820 DR10 DR51 DR15 DR16 DR53 DR4 DR7 DR9 DR52 DR3 DRB1*0308 DRB1*0310 DR11-1 DR11-2 DRB1*1105 DRB1*1107 DRB1*1113/17 DRB1*1123/25 DRB1*1126/34 DRB1*1130 DRB1*1131 DR12 DRB1*1204 DR13-1 DR13-2 DRB1*1309 DRB1*1313/47 DRB1*1318 DRB1*1343/45 DRB1*1344 DR14-1 DR14-2 DR14-3 DR14-4 DRB1*1410 DRB1*1411 DRB1*1415 DRB1*1416 DRB1*1419/21 DRB1*1422/25 DRB1*1424/37 DRB1*0101-0108 DRB1*08-1 DRB1*08-2 DRB1*0805/0818 DRB1*0808/0815 DRB1*0809/0821 DRB1*0820 DRB1*10011/10012 DRB5*01011-0205 DRB1*15011-1513 DRB1*16011-1608 DRB4*01011-0201N DRB1*04011-0443 DRB1*07011-0706 DRB1*09012 DRB3*01011-0303 DRB1*03 DRB1*0308 DRB1*0310 DRB1*11-1 DRB1*11-2 DRB1*1105 DRB1*1107 DRB1*1113/1117 DRB1*1123/1125 DRB1*1126/1134 DRB1*1130 DRB1*1131 DRB1*12 DRB1*1204 DRB1*13-1 DRB1*13-2 DRB1*1309 DRB1*1313/1347 DRB1*1318 DRB1*1343/1345 DRB1*1344 DRB1*14-1 DRB1*14-2 DRB1*14-3 DRB1*14-4 DRB1*1410 DRB1*1411 DRB1*1415 DRB1*1416 DRB1*1419/1421 DRB1*1422/1425 DRB1*1424/1437 DR8-1: DRB1*0801/032/06/10/12/14/16/17/22/23. DR8-2: DRB1*0802/04/07-09/11/13/19. DR11-1: DRB1*1101/04/06/08-10/12/15/18/19/24/27-29/32/33/35/37-39/42. DR11-2: DRB1*1102/03/11/14/16/20/21/36/40/41. DR13-1: DRB1*13011-13032/04/08/10/15/16/19/20/22-24/27-29/31-41/48. DR13-2: DRB1*1305-13072,1311/12/14/21/25/26/30/42/46/49. DR14-1: DRB1*1401/04/07/08/26/28/31/32/34/35/38/39. DR14-2: DRB1* 1402/06/09/13/17/20/29/30/33. DR14-3: DRB1*1403/12/27/40. DR14-4: DRB1*1405/14/18/23/36.
348 송은영 박혜진 박명희 tem (One Lambda, Inc., USA) (96 well plate를 well 간전기영동길이를늘리기위해 72 well 로조정하여사용함 ) 을이용하여제작한 2.5% agarose gel (0.5 g/ml의 ethidium bromide 첨가 ) 에 5 L씩분주하여 150 volt로 5분 30초간전기영동하여확인하였다. 결과판정시 internal control band보다훨씬강도가약한 band는음성으로간주하였다 (Fig. 1). 두명의연구자가이중맹검으로결과를분석하여키트내에포함되어있는판정표 (Table 1) 를이용하여형별판정을하였다. 결과총 118예에대해두명의연구자가이중맹검방식으로판정한결과는모두일치하였다. 총 118예중 117예 (99.2%) 에서정확한 HLA-DRB1 generic level의형별판정이가능하였고 118검체의 236 개대립유전자 ( 동형접합체는 2개로산정 ) 중 1개를제외한 235 개대립유전자의형별을확정할수있었다 (Table 2). 1예 (DRB1 *1403, *1403 동형접합체 ) 에서만 ambiguity 결과를보였는데이는 Dynal RELI TM SSO HLA-DRB Test kit에서 1) *14 동형접합체, 2) *14, *03, 3) *14, *13의 ambiguity를보인검체로, NeoDin SSP TM HLA-DR Typing kit에서는 1) *14-3 (1403/ 12/27/40) 동형접합체, 2) *14-3, *13-2의 ambiguity를보였다. NeoDin kit에서 HLA-DR8, 11-14의경우는 2-11개의 alleleic group으로세분되어판정되는데 (Table 1), NeoDin kit로형별판정이가능하였던 117검체중 4 digit DR형별을알고있는 107 검체에서모두 allelic group의판정과일치되는결과를보였다. 또한 DRB3/DR52 (n=127), DRB4/DR53 (n=49), DRB5/DR51 (n=17) 는 DRB4 위음성 1예를제외하고는전례에서정확히검출되었고 DRB4 위음성 1예도재검사에서는양성으로검출되었다. 118검체중 DRB4 위음성 1예를제외하고는특이밴드의판정 Table 2. HLA-DRB1/B3/B4/B5 typing results of 118 samples using NeoDin SSP TM HLA-DR Typing kit* NeoDin DR group DRB1*alleles (No. of samples) tested DRB1 typing results DR1 0101 (7), 0102 (2), 0103 (2) DR1 (11/11) DR3 0301 (12), 0302 (2) DR3 (14/14) DR4 04 (4), 0401 (4), 0403 (6), 0404 (5), 0405 (7), DR4 (44/44) 0406 (6), 0407 (6), 0410 (4), 0411 (2) DR7 0701 (11) DR7 (11/11) DR8-1 08032 (6) DR8-1 (6/6) DR8-2 0802 (13), 0802group (1), 0804 (2), 0811 (1) DR8-2 (17/17) DR9 0901 (4) DR9 (4/4) DR10 1001 (5) DR10 (5/5) DR11 1101 (15), 1103 (2), 1104 (2), 1106 (1), 1111 (1) DR11 (21/21) DR12 12 (1), 1201 (6), 1202 (3) DR12 (10/10) DR13-1 1301 (15), 1302 (16), 1303 (2) DR13 (33/33) DR14-1 1401 (6), 1401group (3) DR14-1 (6/6) DR14-2 1402 (2), 1406 (8), 1402group (1) DR14-2 (10/10) DR14-3 1403 (9), 1412 (2) DR14-3 (10/11) DR14-4 1405 (12) DR14-4 (12/12) DR15 1501 (7), 1502 (4), 1503 (2) DR15 (13/13) DR16 1602 (4) DR16 (4/4) Total (235/236) *Most of the samples tested for DRB3 (127/127), DRB4 (48/49) and DRB5 (17/17) gave accurate typing results by NeoDin DR typing kit, except one case of false negative result for DRB4 on initial test, which gave positive result on additional test. Total of 236 DRB1 allelic calls (homozygote counted twice) from 118 samples. HLA-DRB1 alleles from HLA DNA Exchange samples, which are rare in Koreans. One sample (DRB1*1403 homozygote) out of 118 samples tested for DRB1 alleles gave ambiguous typing result by NeoDin DR typing kit: 1) DR14-3 homozygote, 2) DR14-3, DR13-2. Table 3. Failure of PCR amplification among 118 samples typed by NedDin SSP TM HLA-DR Typing kit and their HLA-DRB typing results No. DRB1*alleles Positive bands PCR failure bands IC Specific DRB1 Typing results DRB3/B4/B5 1 0405, 0407 B1, B2 C1 DR4 DR53 2 0103, 0407 A1, B1, B2 C2 DR1, DR4 DR53 3 0802, 1503 A2, A3, A6, A7 C1 DR8-2, DR15, DR51 4 0804, 1406 A2, A3, B5, C1, C6 A4, B2 DR8-2, DR14-2 DR52 5 0101, 0406 A1, B2 (B1 false negative) B1 B1 DR1, DR4 (DR53 false negative) IC: internal control.
NeoDin SSP TM HLA-DR Typing Kit 의평가 349 에서위양성이나위음성밴드는없었으나 18검체에서 internal control 밴드보다는훨씬약한비특이밴드가관찰되었고비특이밴드의출현은 DNA 추출방법에따라별다른차이는관찰되지않았다 (DTAB-CTAB 9/70, Genotein 1/19, Qiagen 1/10, DNA Exchange 7/19). 이중대부분인 15검체에서 C6에비특이밴드를나타냈다 (Fig. 1). DR1에해당하는 A1 밴드는 DR1, DR4인검체 (2예) 모두에서다소약하였다. 또한, 5검체에서는일부 SSP well에 PCR 증폭이안되어나와야할밴드가안보였는데, 4검체에서는 1-2개의 internal control 밴드가, 1검체에서는 1개 well의 internal control 및특이밴드가모두증폭되지않았다 (Table 3). 1-4번예는 internal control의증폭실패가있었으나특이밴드가나온결과만으로도 DR 형별의판정을정확히할수있었다. 4번예에서 A4 internal control과함께 A4 특이밴드가증폭되지않았다면 DR8-2가아닌 DR8-1 형별의가능성도있겠지만 DR8로형별을확정하기에는문제가없었다. 또한 5번예에서 B1 위치의 internal control 및특이밴드가모두증폭되지않아 DR53이위음성결과를보였으나 DR1, DR4의형별판정은정확히할수있었고재검한결과 DR53도양성으로검출되었다. 따라서이들 5검체모두에서혈청학적수준의 DR 형별은정확히판정할수있었고따라서재검사가필요하지는않았다. 고찰국내에서는 PCR-SSO 기법을이용하는 INNO-LiPA HLA- DRB와 Dynal HLA-DRB Test 키트가주로사용되고있다. 두검사모두초기에개발된키트에서는 DR2 (DR15, DR16) 아형의구분이안되었고 DR13, DR14가포함된형별판정에서애매한결과로나오는빈도가높아 [12-16] 이를해결하기위해 SSP 를추가로시행하였음을보고한바있다 [13, 14]. 이두종류의 SSO 키트는이후몇단계에걸쳐개선되면서 probe 수를증가시켜형별판정에서애매한결과가나오는빈도를줄이기위한노력이있었으나새로운 HLA-DR 대립유전자가추가됨에따라동일한 probe 수를사용하여도형별판정에서애매한결과가나오는빈도가점차증가함을알수있다 [16]. 일반적으로 SSO 방법에비해 SSP 방법은형별판정에서애매한결과가나오는빈도가훨씬적은것으로알려졌는데본연구에서도 NeoDin SSP kit는적절한 DNA 농도와적절한판정기준을사용하는경우매우정확한 HLA-DR 형별판정결과를보였다. 즉, 본연구에서는예비실험으로 12검체를사용하였는데, DNA 농도가 50 ng/ L 이상인경우엔비특이밴드가증가하는경향이있어, DNA 농도를측정하여 30 ng/ L 정도로맞추어 (well당 DNA량이 12 ng 정도가되도록 ) 사용하였다. 보관된검체중일부 DNA 오염이있거나 DNA 순도가낮은검체에서는정확한결과판정을하기어려웠으나 Genotein kit 또는 Qiagen kit를이용하여새로추출한 DNA 를이용한검사에서는명확한결과를얻 을수있었다. 또한예비실험에서밴드판정시 Fig. 1에서볼수있는 internal control 보다훨씬약한비특이밴드는음성으로간주해야하는점을잘익히고판정기준을두판독자간에일치시킨후본실험에서밴드판정을하였다. NeoDin SSP Kit를이용한 HLA-DR 검사에서전체 118검체중 117검체 (99.2%) 에서정확한 HLA-DRB1 형별을판정할수있었다. Dynal SSO kit에서 ambiguity를보인 51유형 [16] 중에서 1종류를제외한 50유형에서 HLA-DR generic level 형별을정확히판정하여 SSO 방법에비해결과판정이애매하여추가검사가필요한경우가현저히감소됨을알수있다. 따라서결과판정및보고에있어한국인의 HLA-DR 항원빈도를고려해야하는경우도없었다. Ambiguity를보인유형은 DRB1*1403 동형접합체로한국인에서예상빈도 0.1% 이하 (0.6 0.6%) 이므로, 본키트를이용하면한국인검체의 99% 이상에서한국인의항원빈도를고려하지않아도, ambiguity 없이 HLA-DR generic level 의판정이가능할것으로생각된다. SSP 검사법은간혹일부 well에 PCR 증폭이안되는경우가있는데이를알기위해모든 well에특이밴드를검출하기위한 primer쌍과함께 internal control primer쌍을넣어증폭시킨다. SSP kit에서는간혹일부 well에 PCR 실패로 internal control 밴드가안나오는경우가있는데본연구에서평가한 NeoDin SSP kit도 118검체중 5검체에서 1-2개 well의 internal control 밴드가나오지않았다 (Table 3). 그러나이중 4검체는특이밴드가나올위치와무관한 well의 PCR 실패로특이밴드만으로도정확한 HLA-DR 형별의판정이가능하였고, 판독표의밴드조합으로결과판정시 internal control의 PCR 실패를보인 well에특이밴드가나올가능성이없으므로추가검사를하지않고 HLA-DR 형별판정이가능한경우였다. Internal control과함께해당 well 의특이밴드가 PCR 실패를나타낸경우는 1검체 (Table 3, 5번검체 ) 였으며 DR1, DR4는정확히판정되었고 DR53의위음성결과를보였다. 따라서일부 internal control의 PCR 실패가있는경우에도대부분 HLA-DRB1 형별판정에는추가검사를할필요가없는것으로판단할수있었고 118 검체중 1검체에서만추가검사가필요하였다. 이들일부 well에 PCR 실패를보인 5검체를재검한결과, 4검체에서는 internal control 밴드가모두증폭되었고, 1검체 (Table 3, 2번검체 ) 에서는처음에 PCR 실패를보였던 C2 밴드는잘증폭되었으나 A7의 internal control 밴드가증폭되지않은것으로보아, PCR 실패가특정한 well에반복적으로발생하는것은아니었다. 본연구이후에일부 primer를교체하고 86 codon의 glycine/valine 다형성검출을위한 well을추가한 24 well형의개선된키트를 2003년 1월부터출시하고있다고한다. PCR-SSO 방법을이용한키트와달리교잡반응 (hybridization) 을거치지않기때문에 DNA를분리한후 2시간내에결과를알수있는장점이있었으며, 소수의검체를취급하는검사실에사용하기에적합한제품이라고생각된다. 매 well마다검체분주시나전기영동시별도의 tip을사용해야하기때문에 8 channel multi-
350 송은영 박혜진 박명희 pipette을사용하면작업시간이단축되며편하게검사할수있다. 뇌사, 장기이식등에서빠른검사결과를얻을수있는등장점이있어외국의 HLA 정도관리 (CAP, Internaional DNA Exchange 등 ) 결과분석에서보면 SSP 방법이가장많이이용되고있으며, 대부분의임상검사실에서는하루에검사하는건수가많지않으므로 SSP 검사법을적용하는데어려움이없을것으로생각된다. 요약배경 : 국내에서는 HLA-DR DNA 검사법으로 PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) 기법을이용한키트가주로사용되고있으나, PCR-SSO 방법은 PCR-SSP (sequence specific primer) 방법에비해일반적으로결과판정에 ambiguity가더많이생긴다. 본연구에서는최근국내에서개발된 PCR-SSP 기법을이용한 NeoDin SSP TM HLA-DR Typing kit를평가하여보고하고자한다. 방법 : HLA-DRB1 대립유전자형별을알고있는총 118검체를선정하여 NeoDin SSP TM HLA-DR Typing kit로검사하여두명의연구자가이중맹검방식으로결과를판독하였다. 결과 : 총 118예중 117예 (99.2%) 에서정확한 HLA-DR generic level의형별판정이가능하였다. Ambiguity를보인 1예는 DRB1*1403 동형접합체인검체로 NeoDin SSP kit에서는 DR14 동형접합체인지, 또는 DR14, DR13 형별인지가구별되지않았다. 일부 HLA-DR (DR8, DR11-14) 은밴드패턴에따라각각 2-11 개의 alleleic group으로세분되어판정되는데, NeoDin SSP kit를이용한검사결과 (allelic group) 는대립유전자형별을알고있는검체의형별과완전일치하였다. 적절한농도와좋은순도의 DNA 를사용하는경우밴드패턴은명확하였고판정하기쉬웠으며 DRB1 형별판정에서위양성이나위음성밴드는관찰되지않았다. 간혹 1-2개의매우약한비특이밴드가관찰되었으나특이밴드판정에는문제가없었고, 소수의검체 (5예, 4%) 에서 1-2개의 internal control 밴드가증폭되지않았으나정확한 DRB1 형별판정에영향을미치지는않았다. 결론 : NeoDin SSP kit는적절한농도와순도를갖는 DNA를사용하고적절한판정기준을사용하는경우 99% 이상의검체에서매우정확한 generic level의 DR 형별판정결과를보였다. 참고문헌 1. Johnson AH, Hurley CK, Hartzman RJ, Wade JA. The major histocompatibility of the man. In: Henry JB, ed. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th ed. Philadelphia: WB Saunders, 2001: 927-48. 2. Goodman JW. Antigen presentation & the major histocompatibility complex. In: Stites DP, Terr AI, Parslow TG, ed. Basic & clinical immunology. 8th ed. Connecticut: Appleton & Lange, 1994: 58-65. 3. Mytilineos J, Scherer S, Dunckley H, Chapman J, Middleton D, Opelz G. Comparison of serological and DNA HLA-DR typing results for transplantation in Western Europe, Eastern Europe, North America and South America. Transpl Int 1994; 7 (Suppl 1): S519-21. 4. Tiercy JM, Goumaz C, Mach B, Jeannet M. Application of HLA-DR oligotyping to 110 kidney transplant patients with doubtful serological typing. Transplantation 1991; 51: 1110-4. 5. Takahara S, Sada M, Hatori M, Wang JD, Tsuji T, Kokado Y, et al. Importance of HLA-DRB1 molecular matching between recipient and donor in cadaveric renal transplantation. Transplant Proc 1996; 28: 1255-6. 6. Petersdorf EW, Longton GM, Anasetti C, Martin PJ, Mickelson EM, Smith AG, et al. The significance of HLA-DRB1 matching on clinical outcome after HLA-A, B, DR identical unrelated donor marrow transplantation. Blood 1995; 86: 1606-13. 7. Jordan F, McWhinnie AJ, Turner S, Gavira N, Calvert AA, Cleaver SA, et al. Comparison of HLA-DRB1 typing by DNA-RFLP, PCR-SSO and PCR-SSP methods and their application in providing matched unrelated donors for bone marrow transplantation. Tissue Antigens 1995; 45: 103-10. 8. Olerup O and Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens 1992; 39: 225-35. 9. Bannai M, Tokunaga K, Lin L, Kuwata S, Mazda T, Amaki I, et al. Discrimination of human HLA-DRB1 alleles by PCR-SSCP (singlestrand conformation polymorphism) method. Eur J Immunogenet 1994; 21: 1-9. 10. Ota M, Seki T, Fukushima H, Tsuji K, Inoko H. HLA-DRB1 genotyping by modified PCR-RFLP method combined with group-specific primers. Tissue Antigens 1992 ; 39: 187-202. 11. Allen M, Eriksson I, Liu L, Gyllensten U. High resolution genetic typing of the class II HLA-DRB1 locus using group-specific amplification and SSO-hybridisation in microplates. Hereditas 1998; 129: 161-7. 12. 양윤선및김대원. HLA-DR Genotyping 키트 INNO-LiPA HLA DRB 의평가. 대한임상병리학회지 1996; 16: 228-37. 13. 박준석, 한태진, 오흥범. Sequence-specific primer-중합효소연쇄반응을이용한 HLA-DR15와 HLA-DR16 항원형판정. 임상병리와정도관리 1998; 20: 407-10. 14. 최수진, 원진연, 오흥범. PEL-FREEZ DR4 TEST-SSP UNITRAY TM 를이용한 HLA-DR 검사. 임상병리와정도관리 1999; 21: 237-41. 15. Thonnard J, Deldime F, Heusterspreute M, Delepaut B, Hanon F,
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