대한진단검사의학회지 : 제 22 권제 4 호 2002 Korean J Lab Med 2002; 22: 267-77 진단면역학 Dynal RELI TM SSO HLA-DRB Test 키트를이용한 HLA-DR 형별검사의 Ambiguity 분석및한국형해석프로그램의개발 송은영 박성근 김선미 김병철 한복연 임영미 박명희 서울대학교의과대학검사의학교실, 서울대학교병원진단검사의학과 Analysis of Ambiguities of HLA-DR Typing using the Dynal RELI TM SSO HLA-DRB Kit and Development of an Interpretation Program for Koreans Eun Young Song, M.D., Sungkeun Park, B.S.E., Sun Mee Kim, M.T., Byoung Cheol Kim, M.T., Bok Yeon Han, M.T., Young Mi Lim, M.T., and Myoung Hee Park, M.D. Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine and Seoul National University Hospital, Seoul, Korea Background : HLA-DR typing kits using reverse-sso (sequence specific oligonucleotide) method show considerable ambiguities in HLA-DRB1 generic typing. We analyzed the ambiguities of the Dynal RELI TM SSO HLA-DRB test (Dynal DRB test) and developed an Interpretation Program for Koreans. Methods : A total of 3,000 Koreans were typed for HLA-DRB1/B3/B4/B5 using the 36 probe Dynal DRB test and all of the cases showing ambiguities in HLA-DRB1 generic typing were subjected to confirmatory typing using the PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) method. On the basis of these results, an Interpretation Program for Koreans was developed for the 45 probe Dynal DRB test. Results : Among 3,000 Koreans tested by the 36 probe Dynal DRB test, 456 cases (15.2%) showed ambiguities. In 95% of the ambiguity cases (433/456) and 99.2% of the total cases tested (433/3,000), the most probable type could be expected from the DRB1 gene frequencies and DRB1-B3/B4/B5 associations in Koreans and these results were in accordance with the confirmatory typing results as well as the results given by the Interpretation Program for Koreans. Similarly, the Most Probable could be assigned by the program in 99.4% (348/350) of the cases tested with the 45 probe Dynal DRB test. Conclusions : Ambiguity in the Dynal DRB test was observed in >15% of the Korean samples tested. The majority (95%) of the ambiguities could be resolved on the basis of HLA-DRB1 gene frequencies and DRB1-B3/B4/B5 associations in Koreans. Furthermore, using the program developed in this study, the correct assignment of DRB1 generic types was possible without additional typing in the majority (>99%) of the cases tested. (Korean J Lab Med 2002; 22: 267-77) Key words : HLA-DR, DRB1, DRB3, DNA, Ambiguity, Dynal RELI TM HLA-DRB, SSO (sequence specific oligonucleotide), SSCP (single-strand conformation polymorphism) 접수 : 2002년 6월 20일접수번호 : KJCP1587 수정본접수 : 2002년 8월 31일교신저자 : 박명희우 110-744 서울시종로구연건동 28 서울대학교병원진단검사의학과전화 : 02-760-3388, Fax: 02-3672-3337 E-mail : parkmhee@snu.ac.kr 서론 Human leukocyte antigen (HLA) 유전자는인간에서알려진가장다형성 (polymorphism) 이심한유전자로서이러한다형 267
268 송은영 박성근 김선미외 4 인 성은장기이식과자가면역질환에매우중요한역할을하며따라서 HLA-DR의정확한형별판정이장기이식과질환감수성연구에서매우중요하다 [1, 2]. HLA-DR 검사는크게혈청학적검사와분자유전학적검사로나눌수있다. 혈청학적방법은 B 림프구를분리하기힘든환자, 즉, 혈액질환환자, 뇌사자, 신생아등에서는적용하기힘들고항혈청의교차반응으로인해판독에어려움이있을수있다 [3, 4]. 또한비혈연개체간의장기이식이나질환감수성연구에는대립유전자수준의형별판정이필요한데 [5-7], 혈청학적방법으로는불가능하다. 이러한단점을해결하고자, 최근수년간여러가지분자유전학적인 HLA-DR 검사법이개발되어널리적용되고있고 [8-11], 상품화된키트도여러가지가소개되어있다. 국내에서는 PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) 기법을이용하는 INNO-LiPA HLA-DRB (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgium) 와 Dynal RELI TM SSO HLA-DRB Test (Dynal A.S, Oslo, Norway)( 이하 Dynal DRB) 키트가주로사용되고있으나두검사모두일부검체에서는정확한 HLA- DR 형별판정이되지않아, 검사실마다추가적인방법을이용하여형별판정을하는등, 어려움을겪고있다 [12-15]. Dynal DRB 키트는 reverse line blot hybridization[16] 방법을이용하여 PCR 증폭산물을 HLA-DRB1, DRB3, DRB4, 그리고 DRB5 유전자부위의특정대립유전자염기서열에특이적인 SSO probe 가부착된 nylon membrane strip에반응을시키도록제작된것 으로, 서울대학교병원에서는 1997년 7월부터본키트를이용하여최근까지 3,000건이상의 HLA-DRB 형별검사를시행하였다. 그러나본키트의결과판정시앞서언급한바와같이, 많은경우에저해상도수준의형별판정에도애매함 (ambiguity) 이있어추가로 PCR-single strand conformation polymorphism (SSCP) 를이용한확인검사를실시하여이를해결하여왔다. 저자들은그동안의누적된확인검사자료들을통해이러한 ambiguity를유형별로구분하여추가적인검사를시행하지않고도저해상도수준의 HLA-DR 판정을할수있는방안을제시하고자한다. 아울러한국인의 HLA-DRB (DRB1/B3/B4/B5) 대립유전자및일배체형의분포자료와 Dynal DRB 검사상형별판정이잘안되는예에대한 HLA-DRB1 확인검사자료를토대로하여한국형해석프로그램을개발하여적용해본결과를보고하고자한다. 재료및방법 1. Dynal DRB 키트와해석프로그램 1997년 7월부터 2002년 3월까지의연구기간중에본연구에사용한 Dynal RELI TM SSO HLA-DRB Test 키트는 probe 수와해석프로그램에적용된 HLA 명명법에따라 4종류로구분 Table 1. HLA-DRB alleles and allele groups identified by the Dynal RELI TM HLA-DRB test kits No. of probes HLA nomenclature Product 29 probes 1995-1996 Roche Amplicor 29 probes 1998 Dynal RELI TM 36 probes 1998 Dynal RELI TM 45 probes 2001. 1. Dynal RELI TM DRB1*01 0101-0104 (4)* 0101-0105 (6) 0101-0106 (6) 0101-0106 (7) DRB1*03 0301-0307 (9) 03011-0312 (14) 03011-0312 (14) 03011-0318 (20) DRB1*04 0401-0422 (22) 04011-0432 (34) 04011-0432 (34) 04011-0438 (40) DRB1*07 0701 (1) 0107-0704 (3) 0107-0704 (3) 07011-0704 (4) DRB1*08 0801-0813 (13) 0801-0821 (23) 0801-0821 (23) 0801-0822 (26) DRB1*09 0901 (1) 09012 (1) 09012 (1) 09012 (1) DRB1*10 1001 (1) 1001 (1) 1001 (1) 10011-10012 (2) DRB1*11 1101-1126 (26) 11011-1134 (38) 11011-1134 (38) 11011-1140 (47) DRB1*12 1201-1204 (4) 1201-1205 (6) 1201-1205 (6) 1201-1207 (8) DRB1*13 1301-1324 (23) 1301-1334 (36) 1301-1334 (36) 13011-1347 (52) DRB1*14 1401-1425 (25) 1401-1431 (31) 1401-1431 (31) 14011-1440 (41) DRB1*15 1501-1505 (5) 15011-1508 (11) 15011-1508 (11) 15011-1511 (14) DRB1*16 1601-1605 (4) 16011-1608 (9) 16011-1608 (9) 16011-1608 (9) DRB1 total (138) (213) (213) (271) DRB3 0101-0301 (7) 01011-0303 (19) 01011-0303 (19) 01011-0303 (29) DRB4 0101-0103 (3) 01011-0301N (7) 01011-0301N (7) 01011-0204 (13) DRB5 0101-0202 (7) 01011-0204 (13) 01011-0301N (7) 01011-0205 (15) Allele groups differentiated DRB1 69 95 125 146 DRB3 4 9 10 16 DRB4 1 2 2 2 DRB5 4 5 7 8 *The figure in parentheses indicates the number of alleles in each group.
Dynal RELI TM SSO HLA-DRB 검사의 Ambiguity 분석과해결 269 된다 (Table 1). 1) 29 probes/ 95-96 명명법 ( 이것만 Dynal사로변경되기이전인 Roch사제품 : Amplicor V.3.0 HLA-DRB kit, Roche, U.S.A.)( 97. 7.- 99. 2. 사용 ) 2) 29 probes/ 98 명명법 ( 99. 3.-2000. 4. 사용 ) 3) 36 probes/ 98 명명법 (2000. 4.-2001. 6. 사용 ) 4) 45 probes/2001. 1. 명명법 (2001. 6.-2002. 3. 사용 ) HLA 명명법이개정되는데따라형별판정의대상이되는 HLA-DRB1/B3/B4/B5 대립유전자종류와해당키트의해석프로그램에의해구분되는대립유전자군 (allele groups) 이점차증가함을알수있다. 본연구의 HLA-DRB1 형별판정의 ambiguity 분석은주로 36 probes/ 98 명명법을중심으로하였으며이키트는대상 HLA-DRB1 대립유전자 213종을해석프로그램으로 125종의서로다른 DRB1 대립유전자군으로구분하여판정한다. 본연구의 한국형해석프로그램 개발은 45 probes/ 2001. 1. (HLA sequence alignment date) 명명법을대상으로하였으며이키트의해석프로그램은 HLA-DRB1 대립유전자 271종을 146종의서로다른 DRB1 대립유전자군으로구분하여판정한다. 45 probe 키트는 1-35번의 35종 probe는 36 probe 키트와동일하고, DR2의아형을구분해줄수있는 intron 염기서열을이용한 36번 (DR15에양성 ), 37번 (DR16에양성 ) probe가추가되고 [17] 45번 probe가공통 probe (36 probe 키트에서 36 번 probe에해당 ) 인것만이차이점이다. 따라서 DR2 아형의구분이가능한점이외에는 36 probe 키트와동일하여 36 probe 키트를중심으로 ambiguity를분석한자료를토대로현재사용되고있는 45 probe 키트의 한국형해석프로그램 을개발할수있었다. 2. 연구대상한국골수은행 (Korean Marrow Donor Program: KMDP) 에 골수기증희망자로등록되어 HLA-DR 검사를시행한한국인총 3,809명을대상으로하였다. 이중에서 2,393명은 29종 probe를이용한 Roche Amplicor HLA-DRB 키트와 Dynal DRB 키트로검사를시행하였고 ( 회사, 상품명만다르고동일한제품이므로이후통합하여 29 probe Dynal DRB 키트로칭함 ), 607명은 36 probe Dynal DRB 키트로검사하였으며, 809명은 45 probe Dynal DRB 키트로검사하였다. 3. Dynal DRB 키트를이용한 HLA-DR DNA 형별검사골수은행에등록된한국인 3,809명의 EDTA 혈액에서 phenol/chloroform 추출법또는 의방법 [18] 으로 DNA를분리하였다. 이후과정은모두키트내의설명서대로실시하였는데, 키트내의 HLA-DRB Master Mix (10% glycerol, KCl, <0.001% dntp, biotinylated primers, <0.01% Taq polymerase) 를사용하여검체의 HLA-DRB (DRB1/DRB3/DRB4/DRB5) 유전자를증폭시켰다. PCR은 9600 DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, U.S.A.) 를사용하여 95 에서 5분처리한후 95 15초, 60 45초, 72 15초의과정을 35회반복하고마지막에 72 에서 5분간반응시켰다. PCR 산물로역보합반응 (reverse hybridization) 을실시하였는데, 이과정은각각 29, 36 또는 45 개의 SSO (sequence specific oligonucleotide) probe가부착되어있는 nylon membrane strip에 denaturation solution (3% EDTA, 1.6% sodium hydroxide, thymol blue) 을처리한증폭산물 70 L를분주하여 50 shaking water bath에서 30분간반응시켰다. 세척과정을거친후 Streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) conjugate를실온에서 15분간반응시켜 PCR primer에표지된 biotin에결합하도록하고여기에 HRP의기질 (3,3,5,5 -tetramethylbenzidine) 을반응시켜청색으로발색반응이나타나는밴드를대조선 (control line) 과비교하여같거나진한반응을보이는밴드를양성으로판정하였다. Table 2. Ambiguities of HLA-DR (DR1-14) DNA typing results observed in Koreans tested by the Dynal RELI TM HLA-DRB test kit HLA-DRB test kit Interpretation program (Dynal) No. of patterns Ambiguity (DR1-14) No. of patterns n (%) 29 probes (n=2,393) 95-96 HLA nomenclature 282 48 patterns 359/2,393 (15.0%) 29 probes (n=2,393) 98 HLA nomenclature 282 79 patterns 557/2,393 (23.3%) 36 probes (1)* (n=2,393) 98 HLA nomenclature ND 48 patterns 382/2,393 (16.0%) 36 probes (2) (n=607) 98 HLA nomenclature ND (3 patterns added) 74/607 (12.2%) 36 probes (3) (n=3,000) 98 HLA nomenclature ND 51 patterns 456/3,000 (15.2%) 45 probes (1) (n=459) 2001 HLA nomenclature ND 51 patterns 121/459 (26.3%) 45 probes (2) (n=350) 2001 HLA nomenclature (Pattern Matching Program for Koreans) ND 37 patterns 76/350 (21.7%) *For 36 probes (1), a total of 79 samples (one each selected from 79 ambiguous band patterns among 2,393 samples tested by 29 probes HLA- DRB test) were tested, among which 48 band patterns remained ambiguous. Ambiguity % was calculated as if a total of 2,393 samples were tested; For 36 probes (2), 607 consecutive samples were tested and 3 new ambiguous band patterns were added, which were not belonging to the 48 patterns observed in 36 probes (1) test. For 36 probes (3), 36 probes (1) and 36 probes (2) were combined to calculate the proportion of ambiguity among 3,000 samples tested. Abbreviation: ND, not determined.
270 송은영 박성근 김선미외 4 인 29 probe Dynal DRB 키트로검사한한국인 2,393명의결과는 Roche Amplicor V.3.0 해석프로그램 ( 95-96 HLA 명명법 ) 과새로추가된 HLA 유전자를포함시킨 29 probe Dynal DRB 해석프로그램 ( 98 HLA 명명법 ) 두가지모두를사용하여판독하여결과를비교하였다 (Table 2). 36 probe Dynal DRB 키트로검사한 607명과 29 probe 키트로검사한 2,393명의결과중 ambiguity를보인각유형에대해한예씩을 36 probe 키트로검사하여이들총 3,000 명의결과를 36 probe 키트로검사한것으로간주하여 ambiguity의빈도와유형을분석하였다. 45 probe Dynal DRB 키트로검사한 809명중 459명은 45 probe Dynal DRB 해석프로그램 (2001. 1. HLA 명명법 ) 을이용하여판독하였고 350명은저자들이개발한 한국형해석프로그램 (2001. 1. HLA 명명법 ) 을이용하여판독하였다. 또한 36 probe Dynal DRB 키트판독결과 ambiguity를보인 51개유형에대해유형별로한예씩양성밴드패턴을 한국형해석프로그램 에입력하여판독하였다 (DR15는 36번 probe를 DR16은 37번 probe를양성으로입력함 )(Table 2). 4. Ambiguity 를보인예에대한 HLA-DRB1 형별확인검사 HLA-DRB1 형별확인은 Bannai 등 [9] 이사용한 PCR-SSCP 방법에약간의변형을가하여시행하였다. HLA-DRB1의각 DR 군특이 (group-specific) primer를이용하여증폭한 PCR 산물 1 L과 95% formamide 혼합액 (95% formamide, 20 mm EDTA, 0.05% bromphenol blue, 0.05% xylene cyanol FF) 7 L를혼합하고, 95 에서 5분간방치하여외가닥 (single strand) 상태로만든후즉시얼음에담갔다. 5% glycerol을첨가한 (DRB1*12는 glycerol 첨가안함 ) 12.5% 의 polyacrylamide gel (acrylamide:bisacrylamide=49:1) 에혼합액 2 L를걸어 22 (DRB1*12는 30 ) 로 5 Tris-borate-EDTA buffer에서 20 ma로 2시간 30분간전기영동을시행하였다. 영동후은염색을시행하여외가닥 DNA의전기영동에서나타난밴드로 DRB1의대립유전자형을판정하는데이때검체와나란히전기영동시킨 DRB1 표준 DNA의영동패턴과비교하여판정하였다. 표준 DNA는 International Cell Exchange (UCLA Tissue Typing Lab 주관 ) 에서그특성이잘규명된것을사용하였다. 5. 45 probe Dynal DRB 검사의형별판정을위한 한국형해석프로그램 의개발및사용 Visual C++ 6.0 (Microsoft, USA) 을사용하여제작하였다. 데이터베이스는 Access (Microsoft, USA) 를이용하였으며 Window 9x, NT 계열의운영체제에서실행가능하다. 프로그램은 45 probe Dynal DRB 키트를이용하여검사한결과해석에있어서한국인의 HLA-DRB1 유전자빈도와 DRB1과 DRB3/ DRB4/DRB5 유전자의연관성으로부터한국인에서가능한 HLA 형별을판정할수있도록다음과같이고안하였다. 1) SSO probe 패턴각 HLA-DRB (DRB1/DRB3/DRB4/DRB5) allele/allelic group에대해서양성 probe 패턴을 45 probe Dynal DRB 검사의판독표 (2001. 1. HLA 명명법 ) 에근거하여입력하였다. Probe 패턴중에양성 / 음성의반응양상이명확히알려지지않아? 표시가있는것에대해서는 DRB1*1408 (22번 probe가? +,- 두가지가능성입력 ) 이외의형별 ( 예, *01022, *0309 등 ) 은한국인에거의존재하지않을것으로간주하여입력에서제외하였다. 2) HLA-DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 유전자빈도한국인의 HLA-DRB1 유전자빈도에대해기존에발표된 Park 등 [19] 의 510명의자료와이등 [20] 의 741명의자료 (Table 3) 에근거하여 HLA-DRB1 allele/allelic group의빈도를입력하였다. 이들자료에없는대립유전자중그간에본연구진의경험으로드물게한국인에서검출된적이있는대립유전자 ( 예, DRB1*1103, *1104, *1106, *1307, *1410 등 ) 의빈도는매우낮을것으로예상되나, 임의로 0.1% 로입력하였다. DRB3, DRB4, DRB5 유전자에대해서도한국인에서알려진유전자빈도 [21, 22] 를입력하였다. 이상과같이한국인에서검출되는 DRB1, DRB3, DRB4, DRB5의 allele/allelic group 이외의형별은모두 Rare 로표기될수있도록하였다. 3) HLA-DRB1과 DRB3/DRB4/DRB5 유전자의연관성 DRB1*04, *07, *09는 DRB4와, DRB1*15, *16은 DRB5와각각연관되어있는것으로입력하고 DRB1-DRB3 연관성을보이는형별에대해서는한국인에서알려진 DRB1-DRB3 일배체형 (haplotype) 의빈도를입력하였다 (Table 4). 본연구진의경험으로드물게한국인에서검출된적이있는 DRB1-DRB3 연관을보이는일배체형에대해서는 0.1% 로입력하였다 ( 예외 DRB1*1404-DRB3*0101 0.07%, DRB1*1404-DRB3*0202 0.03%). 이렇게 DRB1-DRB3 일배체형의빈도를프로그램에넣은것은, ambiguity를보이는 DRB1 형별중대부분은 2) 항의 DRB1 유전자빈도로부터한국인에서가능한형별이판정되지만일부 ambiguity는 DRB1-DRB3 연관성과일배체형빈도로부터한국인에서가능한형별을판정할수있기때문이다. 4) HLA-DRB1 형별에대한 Most Probable/Less Probable type의판정과 DRB3/B4/B5 형별판정위에기술한바와같이한국인의유전자및일배체형자료에기초하여입력된자료를근거로 SSO probe 양성밴드판독결과로부터한국인에가능한 HLA-DRB1 형별을판정하여 Most Probable 로제시할수있도록하였다. 한국인에서가능한 DRB1
Dynal RELI TM SSO HLA-DRB 검사의 Ambiguity 분석과해결 271 Table 3. Gene frequencies of HLA-DRB1, DRB3, DRB4, and DRB5 alleles in Koreans HLA Gene frequency (%)* HLA Gene frequency (%)* DRB1 Park[19] Lee[20] DRB3 Song[21] 0101 6.4 3.1 0101 6.8 0301 2.0 1.5 0202 15.5 0401 1.0 0.5 0301 12.1 0402-0.1 0403 2.0 3.6 DRB4 Song[21] 0404 1.6 1.6 0103 34.3 0405 7.3 8.3 0103102N 0.5 0406 6.0 3.9 0407 0.2 0.3 DRB5 Song[22] 0408 0.1 0.1 0101 8.0 0409-0.1 0102 3.2 0410 1.4 0.3 0202 0.9 0413-0.1 0419-0.1 0420-0.1 0421-0.2 0701 6.0 5.3 0802 2.8 3.9 0803 7.3 7.6 0901 9.5 11.1 1001 1.5 1.7 1101 3.4 5.3 1103 - - 1104 - - 1106 - - 1111 0.1-1201 4.1 5.6 1202 3.1 2.8 1301 2.3 1.8 1302 10.9 8.8 1307 - - 1339 0.1-1401 3.1 2.7 1402 0.1 0.4 1403 0.6 0.2 1404 0.1 1405 2.7 2.4 1406 0.9 0.2 1407 0.2 0.4 1408-0.3 1410 - - 1412 0.2-1414 - 0.1 1501 8.2 7.6 1502 2.9 4.7 1601-0.1 1602 0.9 0.1 *Park[19], n=510; Lee[20], n=741; Song[21], n=207; Song[22], n=800, Presence of other rare alleles (DRB1*1103, *1104, *1106, *1307, and *1410) among over 6,000 KMDP donors tested has been detected in authors laboratory (each < 0.1%). 형별이 2가지인경우는한국인의빈도에근거하여가능성이더큰형별을 Most Probable, 가능성이더적은형별을 Less Probable 로제시하도록하였고아울러이들 DRB1 형별에연관 Table 4. Association of HLA-DRB1 with DRB3/B4/B5 alleles in Koreans Haplotypes* HF (%) LD (%) Chi-sq DRB1 DRB3 Song[21] 0301 0202 1.7 1.4 38.9 1101 0202 3.6 3.1 85.1 1201 0101 4.1 3.8 204.0 1201 0202 0.7 0.0 0.0 1202 0202 1.4 0.7 4.0 1202 0301 3.1 2.6 59.5 1301 0101 1.2 1.1 56.6 1301 0202 0.2 0.0 0.0 1302 0301 8.9 7.9 295.8 1401 0202 3.4 2.9 79.2 1402 0101 0.2 0.2 6.0 1402 0202 0.2 0.2 1.8 1403 0101 1.2 1.1 69.8 1405 0202 3.9 3.3 91.0 1407 0202 0.2 0.2 5.5 DRB1 DRB4 Song[21] 0403 0103 2.4 1.6 19.6 0404 0103 1.0 0.6 7.7 0405 0103 8.9 5.9 77.8 0406 0103 5.6 3.7 50.9 0407 0103 0.5 0.3 3.9 0410 0103 1.2 0.8 9.7 0701 0103 6.5 4.1 47.8 0701 010302N 0.5 0.4 22.5 09012 0103 8.2 5.4 70.9 DRB1 DRB5 Song[22] 1501 0101 8.0 7.4 1600.0 1502 0102 3.2 3.1 1600.0 1602 0202 0.9 0.9 1600.0 *Presence of other rare DRB1-DRB3 haplotypes among over 6,000 KMDP donors tested has been detected in authors laboratory: DRB1* 1103-DRB3*0202, DRB1*1104-DRB3*0202, DRB1*1106-DRB3*0202, DRB1*1307-DRB3*0202, DRB1*1401-DRB3*0101, DRB1*1403-DRB3* 0202, DRB1*1404-DRB3*0101, DRB1*1404-DRB3*0202, DRB1*1410- DRB3*0202. Song[21], n=207; Song[22], n=800. 되어나오는 DRB3/B4/B5 형별군을제시해줄수있도록고안하였다 (Fig. 1). 한검체에서 Most Probable 과 Less Probable 의두가지 DRB1 형별이나오는경우에정확한 DRB1 형별판정을위해서는추가로다른검사를실시하여확인하여야하므로 참고 항에이런내용을제시할수있도록하였다. Most/ Less Probable 의판정은한국인의 DRB1 유전자빈도를고려하되 DRB3와연관을보이는 DRB1에대해서는 DRB1-DRB3 일배체형빈도 (Table 4) 에근거하여판정하도록프로그램을작성하였다. 예를들면 Table 6의밴드유형 35, 47에서 2가지 DRB1 형별이한국인에가능한것으로나오는데밴드유형 47번의경우에는한국인에서가능한형별이 1) DRB1*13, *14 (13BMR, 14DBE에해당 ), DRB3*02, *03과 2) DRB1*13 (13BMR에해당 ), DRB3*02, *03의두가지인데 1) DRB1*1302-DRB3*0301, DRB1*1405-DRB3*0202의빈도가 2) DRB1*1301-DRB3*0202,
272 송은영 박성근 김선미외 4 인 Table 5. NMDP codes in ambiguous patterns (51 patterns) of the Dynal RELI TM HLA-DRB test (36 probe interpretation software) DRB gene Codes* HLA alleles Fig. 1. Two examples of interpretation results of Dynal RELI TM HLA-DRB test using the Pattern Matching Program for Koreans. Output of Allelic Type was omitted in example B (pattern No. 35 in Table 6). DRB1*1302-DRB3*0301의빈도에비해 10배이상높으므로전자와후자를각각 Most/Less probable 로제시하게된다. 이예에서확률상전자의가능성이후자의 10배이상이지만개별검체에서는드물게후자의가능성이있으므로다른검사를실시하여정확한형별을판정하여야한다. 결 과 1. Dynal DRB 키트의 HLA-DRB1 형별판정의 ambiguity 빈도 29 probe와 36 probe Dynal DRB 키트로검사한 DR1-DR14 형별판정결과와, 45 probe Dynal DRB 키트로검사한 DR1- DR16 형별판정결과에대해분석하였다 (Table 2). 29 probe Dynal DRB 키트로검사한 2,393명의결과를 Roche Amplicor V.3.0 해석프로그램 ( 96 HLA 명명법 ) 을이용하여판독한결과양성밴드유형에따라모두 282유형으로구분되었다. 전체 282 유형가운데 DR1-DR14 결과가 ambiguity를보이는유형은 48 유형으로 359명 (15.0%) 이해당되었다. 이들 2,393명의 282유형을 29 probe Dynal DRB 해석프로그램 ( 98 HLA 명명법 ) 을이용하여판독한결과 31유형 (198예) 에서추가로 ambiguity를나타내어모두 79유형, 557예 (23.3%) 에서 ambiguity를나타내었다. 이들 79유형에서한예씩을임의로선택하여 36 probe Dynal DRB 키트로검사한결과 48유형, 382예 (16.0%) 에서만 ambiguity를나타내었고 31유형은 ambiguity 없이 HLA 형별판정이가능하였다. 추가로 36 probe Dynal DRB 키트로검사한 607 명의결과에서앞의 48유형에해당하지않는새로운유형의 ambiguity가 3종류추가되어총 3,000명을대상으로는 36 probe A B DRB1 01MV 0101, 0104, 0105 03GS 03011, 0305, 0306 03BC 03021, 0303 03XXXX 03022, 1326, 1418, 1424 04BMS 04011, 04012, 0413, 0416, 0421, 0426 04BK 0402, 0414 04DAX 0403, 0406, 0407, 0420 04DAY 0404, 0408, 0419, 0423, 0432 04DAZ 04051, 04052, 0410, 0428-0430 04DY 0411, 0417 07MT 0701, 0703, 0704 08DBF 0801, 0806, 0816, 0817 08AP 08021, 08022, 08041-3, 0807, 0811 08DB 08032, 0810 08BGG 0809, 1415 11DBB 11011, 11012, 11041, 11042, 1115, 1124, 1127, 1129 11GX 1103, 1111 11YR 1116, 1120 11DBC 1118, 1119 11YS 1123, 1125 13BMR 1301, 1302, 1316, 1328, 1331 13YT 13071, 13072, 1311, 1314 13YV 1322, 1323 14APF 1401, 1407, 1426 14BF 1402, 1406 14CA 1403, 1412 14DBE 1405, 1414, 1423 14BMH 1409, 1417, 1430 15DAW 15011, 15012, 15021, 15022, 15023, 1504-1508, 16011, 1603 16EJ 1605, 1607 DRB3 01AD 01011-01014, 0104 02DBG 0201, 0202, 0203, 0207 03AC 0301, 0303 DRB4 01DBH 01011, 0102, 0103, 0104, 0105, 0201N DRB5 01xx 01011, 0105, 0109 01CAA 0102, 0103, 0108N, 0203 02BD 0202, 0204 *NMDP codes shown in bold characters include DRB1/B3/B4/B5 alleles, which have been found to be present in Koreans; HLA alleles (frequency in Koreans): Bold 1%; <1%. Dynal DRB 키트에서모두 51유형의 ambiguity가관찰되었고 456예 (15.2%) 가이에해당되었다. 45 probe Dynal DRB 키트로검사한 809명가운데 459명의결과를 45 probe Dynal DRB 해석프로그램 (2001. 1. HLA 명명법 ) 을이용하여판독한결과, 51유형, 121예 (26.3%) 에서 ambiguity를나타내었다. 이중 25유형, 75예 (16.3%) 는 36 probe Dynal DRB 키트에서관찰된 ambiguity 51유형에포함되었으나, 26유형, 46예 (10.0%) 는 36 probe 키트에서는없었던새로운 ambiguity 유형이었다. 즉 98년 HLA 명명법을사용한해석프
Dynal RELI TM SSO HLA-DRB 검사의 Ambiguity 분석과해결 273 Table 6. Ambiguities of HLA-DRB1 (DR1-14) DNA typing results tested by the Dynal RELI TM HLA-DRB (36 probes) test (51 patterns, 456 samples out of 3,000 samples tested) Pattern No. Positive probes (common probe No. 36 omitted) Most probable type* Unlikely types Confirmatory type 1 (n=5) 1.3.10.12. 7.20.25.30 01MV, 13BMR 01, 14 01, 13 (1301) 2 (n=37) 1.3.9.13.17.18.25.30 01MV, 13BMR 01, 14 01, 13 (1302) 3 (n=4) 1.3.9.13.14.17.30 01MV, 14BF 01, 03/13 01, 14 (1406) 4 (n=8) 2.3.10.11.12.13.16.17.20.26.33 02, 14CA 02, 03/13 02, 14 (1403) 5 (n=1) 3.9.12.14.17.34 03GS 03, 13 03 (03011) 6 (n=4) 3.9.12.14.17.24.32.34 03GS, 11DBB 03, 13 03, 11 (1101) 7 (n=8) 3.6.9.10.12.14.17.19.20.27.34.35 03GS, 1201 12, 13 03 (03011), 12 8 (n=1) 3.9.12.14.17.25.34 03GS, 13BMR 13 03, 13 (1301) 9 (n=16) 3.9.12.13.14.17.18.25.34 03GS, 13BMR 13, 13/14 03 (03011), 13 (1302) 10 (n=2) 3.9.10.12.13.14.17.20.26.33.34 03GS, 14CA 14CA, 14, 13/14 03 (03011), 14 (1403) 11 (n=5) 3.9.12.14.17.18.34 03GS, 14DBE 03GS, 03, 03/13 03 (03011), 14 (1405) 12 (n=2) 3.9.12.14.17.18.22.34 03GS, 14APF 03, 03/13 03 (03011), 14 (1401/7) 13 (n=22) 3.4.9.14.21.24.32 04DAX, 11DBB 04, 13 04, 11 (1101) 14 (n=6) 3.4.10.12.17.20.21.25 04DAX, 13BMR 04, 03/13 04, 13 (1301) 15 (n=1) 3.4.10.12.17.20.21.25.30 04DAY, 13BMR 04, 14 04, 13 (1301) 16 (n=1) 3.4.9.14.17.21.23.25.30 04, 13BMR (04DAY/DAZ) 04, 14 04, 13 (1301) 17 (n=40) 3.4.9.13.17.18.21.25 04DAX, 13BMR 04, 03/14 04, 13 (1302) 18 (n=3) 3.4.9.13.17.18.21.25.31 04BMS, 13BMR 04, 14 04, 13 (1302) 19 (n=48) 3.4.9.13.17.18.21.23.25.30 04DAZ, 13BMR 04, 14 04, 13 (1302) 20 (n=12) 3.4.9.13.17.18.21.25.30 04DAY, 13BMR 04BK, 14BF, 04, 14 04, 13 (1302) 21 (n=1) 3.4.9.13.14.17.21.23.30 04, 14BF (04DAX/DAY/DAZ) 04, 03/13 04, 14 (1406) 22 (n=3) 3.4.9.13.14.17.21.30 04, 14BF (04DAX/DAY) 04, 03/13 04, 14 (1406) 23 (n=12) 3.4.9.14.18.21.22 04DAX, 14APF 1410, 14APF/DBE 04 (0403/6), 14 24 (n=11) 5.6.18.21.33 07MT, 08AP 07, 14 07, 08 (0802) 25 (n=6) 3.6.9.14.24.32.33 08AP, 11DBB 11, 11 08, 11 (1101) 26 (n=17) 3.6.9.14.23.24.27.32.33 08DB, 11DBB 11, 13 08 (0803), 11 27 (n=1) 6.9.13.18.19.33.35 08AP, 1202 12, 14 08 (0802), 12 28 (n=12) 3.6.9.13.17.18.25.33 08AP, 13BMR 13, 13/14 08, 13 (1302) 29 (n=7) 3.6.9.14.18.22.33 08AP, 14APF/DBE 14, 14 08 (0802), 14 30 (n=1) 3.6.10.12.18.20.22.33 08AP, 14APF/DBE 14, 14 08 (0802), 14 31 (n=14) 3.6.9.14.18.22.23.27.33 08DB, 14APF 13, 08/14 08 (0803), 14 32 (n=1) 3.6.10.12.13.17.20.26.33 08AP, 14CA 08, 3/13 08, 14 (1403) 33 (n=12) 3.6.9.14.18.23.27.33 08DB, 14DBE 13, 08/14 08, 14 (1405) 34 (n=6) 3.6.9.14.18.33 08AP, 14DBE 14 08, 14 (1405) 35 (n=8) 3.9.14.24.32 1) 11DBB 11 (1101) 2) 11DBB, 13YT** 36 (n=13) 3.6.9.10.12.14.19.20.24.27.32.35 11DBB, 1201 12, 13 11 (1101), 12 37 (n=5) 3.9.10.12.14.17.20.24.25.32 11DBB, 13BMR 11, 11 11, 13 (1301) 38 (n=13) 3.9.13.14.17.18.24.25.32 11DBB, 13BMR 11, 11 11, 13 (1302) 39 (n=1) 3.9.10.12.14.17.20.24.25.32.35 1106, 13BMR 11, 11 11 (1106), 13 (1301) 40 (n=1) 3.9.13.14.17.24.30.32 11DBB, 14BF 11, 11/13 11 (1101), 14 41 (n=11) 3.9.14.18.24.32 11DBB, 14DBE 11DBB, 11, 13 11 (1101), 14 (1405) 42 (n=1) 3.10.12.17.20.25 13BMR 03, 13 13 (1301) 43 (n=25) 3.9.13.17.18.25 13BMR 13BMR, 14DBE, 13, 03 13 (1302) 44 (n=9) 3.9.10.12.13.17.18.20.25 13BMR 13BMR, 14DBE, 13, 03 13 (1301+1302) 45 (n=2) 3.9.10.12.14.17.18.20.22.25 13BMR, 14APF 03, 14 13 (1301), 14 46 (n=1) 3.9.10.12.14.17.18.20.25 13BMR, 14DBE 13BM, 03, 13 13 (1301), 14 (1405) 47 (n=15) 3.9.13.14.17.18.25 1) 13BMR, 14DBE 03, 13 13 (1302), 14 (1405) 2) 13BMR** 48 (n=17) 3.9.13.14.17.18.22.25 13BMR, 14APF 14, 03/14 13 (1302), 14 49 (n=1) 3.9.10.12.13.14.17.20.26.33 14CA 14, 03/13 14 (1403) 50 (n=1) 3.9.10.12.13.14.17.18.20.26.33 14CA±14DBE 14, 03/13 14 (1403), 14 (1405) 51 (n=2) 3.9.13.14.17.18.30 14BF±14DBE 14, 03/13 14 (1405), 14 (1406) *Most probable type based on known DRB1 allele frequencies in Koreans; Unlikely types including one or more rare alleles in Koreans; Alleles in parentheses are confirmatory DRB1 genotyping results by PCR-SSCP; Most probable type considering DRB1-DRB3 associations in Koreans; Unlikely type considering DRB1-DRB3 associations in Koreans; Most probable type considering DRB1-DRB4 associations in Koreans; **Less probable type based on known DRB1 allele frequencies and DRB1-DRB3 associations in Koreans.
274 송은영 박성근 김선미외 4 인 로그램에서는 ambiguity가없이명확히판정되었던예가 2001년 1월 HLA 명명법을사용한해석프로그램에서는 ambiguity를나타내는경우가 10% 나되었다. 2. HLA-DR 형별판정의 ambiguity 유형및 HLA-DRB1 유전자형확인검사결과 HLA-DR 형별판정에서 ambiguity를보이는유형을표시하기위해 36 probe Dynal DRB 해석프로그램 ( 98 HLA 명명법 ) 에서 ambiguity를보인 51유형을출력한결과에서제시되는각 allele group과이에해당하는 NMDP code[23] 를 Table 5에제시하였다. 한국인에서있는것으로알려진 DRB1 형별 [19, 20] 과, 그밖에저자들의기관에서검출된적이있는 DRB1 형별을포함하고있는 NMDP code를한국인에서검출가능한것으로일단규정하고진한글씨로표시하였다. 36 probe 키트에서 ambiguity를보인 51유형 (456예) 의판독결과를 Table 6에제시하였고이들예에대해 PCR-SSCP로 HLA-DRB1 형별을확인검사한결과를우측에표시하였다. 전체 51유형중 42유형 (364/456예, 79.8%) 에서는한국인에서알려진 HLA-DRB1 유전자빈도 [19, 20](Table 3) 를참조하여, 8유형 (80/456예, 17.5%) 에서는한국인에서알려진 DRB3 유전자빈도 (Table 3) 와 DRB1-DRB3 연관성 (Table 4) 을참조하여, 1유형 (12/456예, 2.6%) 에서는 DRB1-DRB4 연관성을참조하여가장가능성이높은 most probable type 과가능성이매우희박한 unlikely type 으로분류하였다 (Table 6). 51유형중유형 35, 47을제외한 49유형 (433/456예, 95.0%) 에서는모두 DR1-DR14 형별판정에서 most probable type 한가지를제시할수있었고 PCR- SSCP로확인한결과와일치하였다. 유형 35 (8/456예, 1.8%) 의경우에는한국인의 HLA-DRB1 유전자가 *1101 (NMDP code: 11DBB) 과 *1307(NMDP code: 13YT) 이모두존재하므로 ( 유전자빈도각각 3.4%, <0.1%) 한가지로확정하여제시할수는없었다. 그러나 DRB1*1307은매우드물기때문에 PCR-SSCP로확인한결과 8예모두가 DR11 (*1101) 로확인되었다. 유형 47 (15/456예, 3.3%) 의경우에는한국인에서 1) DRB1*13, *14 (13BMR, 14DBE에해당 ), DRB3*02, *03과 2) DRB1*13 (13BMR에해당 ), DRB3*02, *03 등두가지가모두가능한데전자 (DRB1*1302-DRB3*0301, DRB1*1405- DRB3*0202) 가후자 (DRB1*1301-DRB3*0202, DRB1*1302- DRB3*0301) 에비해 10배이상높은가능성 ( 빈도 ) 을갖고있고실제로 PCR-SSCP로확인한결과 15예모두가 DR13 (*1302), DR14 (*1405) 로확인되었다. DRB1-DRB3 연관성을참조하여가장가능성이높은 most probable type 을판정한경우는유형 10, 11, 20, 41, 43, 44, 46, 47이해당된다. 예를들어유형 10의경우한국인에서가능한 DRB1은 1) 03GS, 14CA와 2) 14CA 동형접합체가모두가능하나 DRB3까지참고한다면 Dynal DRB 해석에서 03GS, 14CA 의경우엔 B3*0101과 B3*0202가있어서한국인에서알려진 DRB1-DRB3 연관성을참조하여 DRB1*0301-DRB3*0202, DRB1*1403-DRB3*0101로연관될것으로기대할수있으나 14CA 동형접합체의경우에는 DRB1*1403-DRB3*0101은가능하나 DRB1*1403-DRB3*0204는 DRB3*0204가한국인에서발견된적이없는대립유전자로가능성이떨어진다. 따라서 03GS, 14CA를 most probable type 으로분류하였고확인검사결과도 DRB1*03011, *1403으로일치하였다. DRB1-DRB4 연관성을참조하여 most probable type 을판정한유형 23의경우 1) 04DAX, 14APF와 2) 1410, 14APF/DBE가둘다가능하나 DRB1*1410은 DRB4를동반하지않으므로 04DAX, 14APF를 most probable type 으로분류하였고확인검사결과도 DRB1*04 (0403/0406), *14로일치하였다. 3. 45 probe Dynal DRB 검사의 한국형해석프로그램 적용 36 probe Dynal DRB 키트에서 ambiguity를보인 51유형의양성밴드패턴을 한국형해석프로그램 으로판독한결과 49유형 (433/456예, 95%) 에서 Most Probable 이한종류로표시되었고한국형해석프로그램의개발에서언급한바와같이 Table 6의유형 35(8/456예, 1.8%) 와유형 47(15/456예, 3.3%) 에서는 Most Probable 과 Less Probable 이함께표시되었으며 (Fig. 1) 36 probe로검사한전체 3,000예중 0.8%(23예 ) 에해당하였다. 45 probe Dynal DRB 키트로검사하고한국형해석프로그램 (2001. 1. HLA 명명법 ) 을이용하여판독한 350명의판독결과 (Table 2) 에서는 37유형, 76예 (21.7%) 에서 ambiguity를나타내었고, 이중 25유형, 53예 (15.1%) 는 36 probe 키트에서관찰된 ambiguity 51유형에포함되었으나, 12유형, 23예 (6.6%) 는 36 probe 키트에서는없었던새로운 ambiguity 유형이었다. 즉, 이들 23예는 36 probe 해석프로그램 ( 98 HLA 명명법 ) 에서는 ambiguity를나타내지않고명확한형별로판정되는예에속했다. Ambiguity 76예중 74예에서 Most Probable 이하나로표시되었고, 2예에서는 Most Probable 과 Less Probable 이같이표시되었는데총검사건수의 0.6% (2/350) 에해당하였다. 고 PCR-SSO 방법을이용하는 Dynal DRB 키트는널리사용되고있으나, DR2 (DR15, DR16) 나 DR13, DR14가포함된형별판정에서는애매한결과로나오는빈도가높아, 최등은한국인 450명을 Dynal DRB 키트로검사하여 DR15/16 ambiguity가 20.7%, DR13/14의 ambiguity가 7.1%, DR11/14의 ambiguity 가 0.2% 존재하며, 이를해결하기위해 SSP를추가로시행하였음을보고한바있다 [14]. 이러한문제점은국내에서많이이용 찰
Dynal RELI TM SSO HLA-DRB 검사의 Ambiguity 분석과해결 275 되는또다른키트인 INNO-LiPA HLA-DRB에서도발견되어 13% (3/23예) 에서역시저해상도수준의 HLA-DR 형별판정에 ambiguity가있음이보고된바있다 [12]. 또한, 이러한 ambiguity는같은키트를사용하더라도새로운 HLA 유전자가계속추가됨에따라더욱증가하게되어, 본연구에서도 2,393명을대상으로 29 probe 키트로분석한결과를 Roche Amplicor HLA-DRB의 V.3.0 해석프로그램 ( 95-96 HLA 명명법 ) 으로판독하였을때는 DR1-DR14 판정의 ambiguity가 15.0% 에서관찰되었으나, 같은결과를새로운대립유전자가추가된 Dynal DRB 해석프로그램 ( 98 HLA 명명법 ) 으로판독하였을때는 23.3% 에서 ambiguity가관찰되었다 (Table 2). 이러한 ambiguity를해결하고자 probe 수를늘려키트를개선하고있어, 36 probe Dynal DRB 키트 ( 98 HLA 명명법 ) 에서는 29 probe에서 23.3% 를차지하던 ambiguity 결과가 16.0% 로감소되었다. 그러나 45 probe Dynal DRB 키트에서는 DR15, DR16을감별할수있는 2종의 probe가추가되고나머지 probe는 36 probe 키트와동일한데도불구하고해석프로그램에더최근의명명법 (2001. 1. HLA sequence alignment) 을사용함에따라 ambiguity를보이는결과가다시 26.3% (121/459예) 로증가하였다. 즉 HLA DRB1 대립유전자가 1998 명명법에서 213종으로부터 2001. 1. 명명법에서 271종으로증가함에따라 ambiguity를보이는결과가 16.0% 에서 26.3% 로현저히증가함을알수있다. 동일한 45 probe Dynal DRB 검사결과를한국형해석프로그램으로판독한경우에는 ambiguity가 21.7% (76/350예) 로약간감소하였는데이는 probe 패턴중에양성 / 음성반응이명확히알려지지않아? 표시가있는형별에대해서한국형해석프로그램에서는 DRB1*1408 (22번 probe가? +,- 두가지가능성입력 ) 이외의형별 ( 예, *01022, *0309 등 ) 은한국인에거의존재하지않을것으로간주하여입력에서제외하였기때문으로설명되었다. 이와같이 HLA-DRB1 결과판정의 ambiguity를감소시키기위해 probe 수를증가시켜키트를개발하여도새로이발견되는대립유전자종류가증가함에따라 ambiguity는오히려증가하여검사결과판정에어려움이많다. 따라서다른확인검사를실시하여결과를보고하여야하는데이러한확인검사를통해서도정확한형별판정을하기어려운경우가종종있게된다. 그러나어떤인종에존재하는 HLA 형별의종류는비교적제한되어있어한국인에존재하는 HLA-DRB1 대립유전자종류는 50종미만 (Table 3, 47종 ) 으로 2001. 1. HLA 명명법에서알려진 271종의 18% 정도에불과하다. 이러한한국인에존재하는 HLA-DRB1 형별은본연구진에의해새로운형별로보고된 DRB1*1339 (1999. 11. 명명 ) 를제외하고는모두 1996년 HLA 명명법에포함되어있는형별이다. 따라서 ambiguity를보이는 DRB1 형별의조합중에한국인에존재하지않는형별을제외시키면대부분의경우에서한국인에가능한 DRB1 형별을판정할수있을것이다. 본연구에서한국인 3,000명을 36 probe Dynal DRB 키트 ( 해 석프로그램 98 HLA 명명법 ) 로검사한결과 456예 (15.2%) 에서형별판정에 ambiguity가관찰되어 (Table 2), 이들 ambiguity를보이는검체를모두 PCR-SSCP로확인하여보았다. 그결과이러한 ambiguity 증예의대부분 (95%, 433/456예 ) 은한국인에서알려진 HLA-DRB1 유전자빈도와 DRB1-B3/B4/B5 연관성 [19-22] 을참조하여가장가능성이높은 most probable type 을한가지로결정할수있었고 (Table 6), PCR-SSCP로확인한결과와일치하였다. 이러한원리를적용하여개발한한국형프로그램으로 36 probe Dynal DRB 검사에서 ambiguity를보인 51유형중한예씩을판독해본결과 ambiguity 증례의 95% (49유형, 433/456예 ) 에서결과화면에 Most Probable 이한가지로표시되어전체 3,000예중 2,977예 (99.2%) 에서추가검사없이정확한 HLA-DR 판정이가능할것으로생각되었다. 또한 ambiguity를보이는결과중 5% (23/456예), 전체검사결과중에서는 0.8% (23/3,000예) 만이 Most Probable 과 Less Probable 이각각한가지씩표시되었으나추가검사를시행하여확인한결과는모두확률적으로가능성이더높은 Most Probable 이표시된결과와일치함을알수있었다. 그러나드물게는 Less Probable 로표시되는형별도나올수있으므로이러한결과에대해서는정확한형별판정을위해추가검사가필요하다는내용이참고항에표시되도록하였다 (Fig. 1). 또한 45 probe Dynal DRB 검사를한국형해석프로그램으로판독한결과도거의유사하여전체 350예중에 76예 (21.7%) 의 ambiguity가존재하였지만 74예에서 Most Probable 이한가지로표시되었고 2 예 ( 유형 47에해당 ) 에서만 Less Probable 이추가로표시되어추가검사가필요한것으로나타나전체검사결과의대부분 (348/350예, 99.4%) 은추가검사없이정확한 HLA-DR 형별을판정할수있었다. PCR-SSO 검사법을이용한 HLA 형별검사에서간혹일부 probe의반응양상이위양성혹은위음성결과를나타낼수있고그중에일부에서는위양성, 위음성 probe에의해저해상도수준의 HLA 형별판정에오류가생기는경우가있다. 한국형프로그램을사용하여판독한 Dynal DRB 결과에서 Most Probable 이표시되지않는경우에는밴드판정상에오류가있을가능성을검토해보아야한다. 실제로본연구에서 45 probe Dynal DRB 검사를한국형해석프로그램으로판독하는과정에서 350 예중 6예에서처음판독시에는한국인에드문 HLA-DR 형별이제시되면서 Most Probable 이표시되지않아밴드를다시검토하여오류 ( 예 : 20, 30, 32번밴드위양성 ) 를수정한결과모두 Most Probable 이한종류로확정되었다. 따라서한국형해석프로그램으로판독하는경우 ambiguity를보이는 HLA-DRB1 검사결과의대부분에서추가검사없이정확한형별판정이가능할뿐아니라일부검사결과의오류도알아낼수있어잘못된결과를보고하는빈도를줄일수있을것으로생각된다. 한편본연구에서개발한한국형해석프로그램은한국인의 HLA-DRB 유전자빈도와연관성에기초한것이므로한국인이외의다른인종
276 송은영 박성근 김선미외 4 인 이나한국인과다른인종의혼혈인대상에적용하는경우잘못된결과가나올수있다. 결론적으로, 저자들은한국인 3,000예를대상으로실시한 36 probe Dynal DRB 검사결과의 ambiguity 빈도와유형을확인검사를실시하여분석하고그결과와한국인의 HLA-DRB1/B3/ B4/B5 유전자빈도및연관성을참조하여 45 probe Dynal DRB 검사의한국형해석프로그램을개발하였다. 이러한한국형해석프로그램을이용하여 45 probe Dynal DRB 검사결과를판독시 99% 이상에서한국인에서가장가능한형별이 Most Probable 한가지로표시되고 1% 이하에서만 Most Probable 과 Less Probable 의두가지로표시되어확인을위한추가검사가필요한것으로나타났다. 이번에개발된프로그램은한국인의 HLA-DRB 유전자빈도와연관성등에대한전문적인지식이부족한검사실에서도쉽게 Most Probable 형별을판단해줌으로써향후여러검사실에이를보급한다면 45 probe Dynal DRB 키트검사결과의정확한 HLA-DR 형별판정에큰도움을줄수있을것으로생각되고, 또한본논문에서기술된 Most Probable 형별을선정하는원리를적용한다면다른종류의키트를이용한 HLA-DR 검사결과의 ambiguity를해결하는데도많은도움을줄수있을것으로기대된다. 요약배경 : Reverse-SSO (sequence specific oligonucleotide) 를이용하는 HLA-DR 검사키트가널리사용되고있으나, 이를이용할경우결과의상당부분에서저해상도수준의 HLA-DRB1 형별판정에애매함 (ambiguity) 을보여정확한결과판정에어려움이있다. 본연구에서는 Dynal RELI TM SSO HLA-DRB ( 이하 Dynal DRB) 검사의 ambiguity에대해분석한후한국형해석프로그램을개발하여적용해보았다. 방법 : 한국인 3,000명을대상으로 36 probe Dynal DRB 키트 (1998 HLA 명명법 ) 를이용하여 HLA-DRB1/B3/B4/B5 형별검사를실시하였고 HLA-DRB1 형별판정에서 ambiguity를보인예에대해모두 PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) 로확인한결과와비교하였다. 이를바탕으로 45 probe Dynal DRB (2001. 1. HLA 명명법 ) 검사에대한한국형해석프로그램을개발하였다. 결과 : 전체 3,000명에대한 36 probe Dynal DRB 검사결과 456예 (15.2%) 에서 DRB1 형별판정에 ambiguity를보였다. Ambiguity를보인경우에실제로 PCR-SSCP를시행하여확인한결과는한국인의 DRB1 대립유전자빈도와 DRB1-DRB3/ B4/B5 연관성에근거하여예상한결과 ( most probable type ) 와모두일치하였으며이러한원리를응용한한국형해석프로그램을 Dynal DRB 검사판독에적용하여 36 probe Dynal DRB 검사의 ambiguity 중 95.0% (433/456예), 전체검사건수의 99.2% (433/3,000예) 에서, 그리고 45 probe Dynal DRB 검사의 99.4% (348/350예) 에서추가검사없이정확한 HLA-DR 형별판정이가능하였다. 결론 : Dynal DRB 검사에서나타나는 DRB1 형별판정의 ambiguity 빈도는 15% 이상으로상당히높지만한국인의 HLA-DRB1 대립유전자빈도와 DRB1-B3/B4/B5 연관성을적용하면 ambiguity를보이는예의 95% 에서정확한 DRB1 형별판정이가능하였고이러한원리를응용한 한국형해석프로그램 을사용하면전체검사건수의 99% 이상에서추가검사없이정확한 HLA-DRB1 형별판정이가능하였다. 참고문헌 1. Johnson AH, Hurley CK, Hartzman RJ, Wade JA. The major histocompatibility of the man. In: Henry JB, ed. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th ed. Philadelphia: WB Saunders, 2001: 927-48. 2. Goodman JW. Antigen presentation & the major histocompatibility complex. In: Stites DP, Terr AI, Parslow TG, ed. Basic & clinical immunology. 8th ed. Connecticut: Appleton & Lange, 1994: 58-65. 3. Mytilineos J, Scherer S, Dunckley H, Chapman J, Middleton D, Opelz G. Comparison of serological and DNA HLA-DR typing results for transplantation in Western Europe, Eastern Europe, North America and South America. Transpl Int 1994; 7 (Suppl) 1: S519-21. 4. Tiercy JM, Goumaz C, Mach B, Jeannet M. Application of HLA-DR oligotyping to 110 kidney transplant patients with doubtful serological typing. Transplantation 1991; 51: 1110-4. 5. Takahara S, Sada M, Hatori M, Wang JD, Tsuji T, Kokado Y, et al. Importance of HLA-DRB1 molecular matching between recipient and donor in cadaveric renal transplantation. Transplant Proc 1996; 28: 1255-6. 6. Petersdorf EW, Longton GM, Anasetti C, Martin PJ, Mickelson EM, Smith AG, et al. The significance of HLA-DRB1 matching on clinical outcome after HLA-A, B, DR identical unrelated donor marrow transplantation. Blood 1995; 86: 1606-13. 7. Sada M, Hashimoto M, Kinoshita T, Ichikawa Y, Takahara S, Tada M, et al. Importance of HLA-DRB1 amino acid residue matching between recipient and donor in cadaveric renal transplantation. Transplant Proc 1995; 27: 698-700. 8. Olerup O and Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens 1992; 39: 225-35. 9. Bannai M, Tokunaga K, Lin L, Kuwata S, Mazda T, Amaki I, et al. Discrimination of human HLA-DRB1 alleles by PCR-SSCP (singlestrand conformation polymorphism) method. Eur J Immunogenet 1994;
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