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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 182-190 (2015) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2015.30.4.182 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 LPS 로유도된 RAW264.7 Cell 과마우스모델에대한잘피에탄올추출물의항염증효과 김민지 1, 배난영 2, 김꽃봉우리 1, 박지혜 2, 박선희 2, 조영제 3, 안동현 2 * Anti-inflammatory Effect of Zostera marina Ethanolic Extract on LPSinduced RAW264.7 Cells and Mouse Model Min-Ji Kim 1, Nan-Young Bae 2, Koth-Bong-Woo-Ri Kim 1, Ji-Hye Park 2, Sun-Hee Park 2, Young-Je Cho 3, and Dong-Hyun Ahn 2 * Received: 22 June 2015 / Revised: 19 August 2015 / Accepted: 21 August 2015 2015 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering 1 부경대학교수산과학연구소 1 Institute of Fisheries Sciences, Pukyong National University, Busan 619-911, Korea 2 부경대학교식품공학과 / 식품연구소 2 Department of Food Science & Technology/Institute of Food Science, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea Tel: +82-51-629-5831, Fax: +82-51-629-5824 e-mail: dhahn@pknu.ac.kr 3 경북대학교식품공학부 3 School of Food Science of Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea Abstract: The Zostera marina ethanolic extract (ZMEE) was tested in this study to investigate the anti-inflammatory activity in LPS-induced RAW 264.7 cells and mouse model. Nitric oxide production and inducible nitiric oxide synthase expression in cells treated with ZMEE was reduced significantly in a dose-dependent manner. Similarly, the secretion of pro-inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-6, IL-1β, and TNFα was inhibited markedly. In addition, the expression of nuclear factor kappa B (NF-κB) and the phosphorylation of JNK, ERK, and p38 MAPKs was suppressed by ZMEE as well. In vivo test, ZMEE attenuated the croton oil-induced mouse ear edema and there were no mortalities in mice administered 5,000 mg/kg body weight of ZMEE during the observation periods. The results in photomicrograph of mice ear tissue showed the reduction of dermal thickness and the number of infiltrated mast cells. These results indicate that ZMEE inhibits the production of LPS-induced pro-inflammatory mediators, suggesting that ZMEE may be a potential material for anti-inflammatory therapies. Keywords: Zostera marina, Anti-inflammation, Ear edema, Nuclear factor kappa B, MAPKs 1. INTRODUCTION 염증반응은내독소, 조직손상, 세균감염등과같은자극에대한손상부위를복구시키려는방어기능으로손상된조직을재생하기위해일어나는필수적인반응이다 [1]. 그러나지속적인염증반응은통증, 발열, 부종등과같은기능장애및점막손상을유발하며관절염및암등의발병을초래하게된다 [2]. 대식세포 (macrophage) 는다양한숙주반응에있어항상성유지에관여하며, 염증반응시에는 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-6, IL-1β 등의 pro-inflammatory cytokine 을비롯하여 inducible nitric oxide synthase (inos) 및 cyclooxygenase-2 (COX-2) 와같은효소의발현을통해 nitric oxide (NO), prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 를생성함으로써염증반응을유발하고염증부위로면역세포의이동을촉진시킨다 [3]. NO 는높은반응성을가진생체생성분자로써활성화된 inos 에의해 L -arginine 으로부터생성된다 [4]. NO 의발현과 pro-inflammatory cytokine 의생산은주로 nuclear factor kappa B (NF-κB) 와 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 를통해일어난다 [5,6]. NF-κB 는핵안으로들어가

잘피에탄올추출물의항염증활성 183 전사인자로서염증매개관련효소 (inos, COX-2) 및염증매개성 cytokine 을합성하며, 일반적으로세포질에서 IκBα 와결합함으로써 NF-κB 의활성이억제된다 [7]. MAPKs 는주요하게 3 가지인자로 extracellualr signal-regulated kinase (ERK), c-jun NH 2 -terminal kinase (JNK), p-38 로구성되며, MAPKs 의활성은대식세포에서 NO 의생성과 pro-inflammatory cytokine 의발현을초래한다 [8]. 따라서 NF-κB 및 MAPKs 의활성을억제하여염증성매개인자들의생산감소에영향을주는것은염증반응을조절하기위한핵심요소로서이러한활성을가지는천연소재를찾기위한연구가활발히진행되고있다. 여러가지천연소재중에서해조류는현재많은연구들로부터항균 [9], 콜레스테롤침착방지 [10], 고지혈증개선 [11] 등의다양한생리활성이보고되고있으며, 갈조류로부터 fucoxantin, fucosterol, phlorotannin 과같은저분자생리활성물질이보고되고있다 [12,13]. 다양한해조류중잘피 (Zostera marina) 는한국연안에서가장풍부한해조류중하나로제주도를포함한전연안에고르게분포하고있다 [14]. 잘피에대한연구로는잘피속에속하는애기거머리말 (Zostera japonica) 의항산화활성, 항염증및암세포증식억제효과 [15-17], 왕거머리말 (Zostera asiatica) 의인체암세포에대한세포독성효과 [18] 에대한것이보고되고있으나, 지금까지우리나라에서식하는잘피에대한생리활성에대한연구는미미한실정이다. 따라서본연구에서는잘피의또다른생리활성인항염증효과를확인하기위해대식세포주인 RAW264.7 cell 과귀부종을유발한마우스모델을이용했으며, 앞으로항염증제개발의새로운천연원료로서의활용가능성을탐색하고자했다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 실험재료본실험에사용한잘피 (Z. marina) 는 2013 년도부산연화리에서채취하였으며이를담수로깨끗이수세하고동결건조한후분말화하고진공포장하여 -20 o C 에서저장하며사용하였다. 2.2. 에탄올추출물제조잘피건조분말에 10 배의 95% 에탄올을가하고, 교반기 (H- 0820, Dongwon Science CO., Busan, Korea) 를이용하여 24 시간동안상온에서교반하여추출하였다. 원심분리기 (UNION 32R, Hanil Co., Incheon, Korea) 를이용하여 3,000 rpm 에서 10 분간원심분리한후상층액을취하였고, 이후남은잔사를이와동일한방법으로 2 회반복추출하였다. 추출한상층액은 37 o C 에서감압농축기 (RE200, Yamoto Co., Tokyo, Japan) 로농축하였으며, 농축하여건조된시료는 -20 o C 에서보관하며실험에이용하였다. 2.3. 실험동물 ICR 마우스 ( 생후 8 주령, 수컷 ) 을오리엔트바이오 (Orient Co., Seongnam, Korea) 로부터구입하여귀부종및귀조직실험에사용하였으며, 단기독성평가실험을위해 Balb/c 마우스 ( 생후 10 주령의암컷 ) 를사용하였다. 마우스는온도 20±2 o C, 습도 50±10%, 12 시간명암주기가유지되는동물실에서 1 주일간예비사육한후실험에사용하였다. 본실험은부경대학교동물실험윤리위원회로부터동물실험승인을 ( 승인번호 2014-01) 받아수행하였다. 2.4. 세포배양한국세포주은행으로부터대식세포인 RAW264.7 (KCLB 40 071) 세포를분양받아사용하였으며, DMEM (GIBCO, Grand Island, NY, USA) 에 10% inactivated fetal bovine serum (Hy- Clone Laboratories, Inc., Logan, Utah, USA) 과 1% penicillinstreptomycin (HyClone Laboratories, Inc.) 을첨가한배지를배양액으로 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 실험과정의모든세포는 80~90% 정도의밀도로자랐을때계대배양하였고, 20 passages 를넘기지않은세포만사용하였다. 2.5. 세포독성평가추출물의세포독성을평가하기위해 MTT assay 를실시하였다. RAW264.7 cell (1 10 6 cells/ml) 를 well plate 에분주하고 20 시간전배양후, 추출물을농도별 (0.1, 1, 10, 50, 100 µg/ ml) 로첨가하여 37 o C, 5% CO 2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서 22 시간배양하였다. 배양후, 5 mg/ml 농도의 MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 시약을첨가하여 2 시간재배양하고이를 4 o C, 2,000 rpm 에서 10 분간원심분리 (UNION 32R, Hanil Co.) 하여상층액을제거하였다. 그후, 각 well 에 DMSO (Sigma Chemical Co.) 를첨가하고이를 microplate reader (Model 550, Bio-rad, Richmond, CA, USA) 를이용하여 540 nm 에서흡광도 (optical density (O.D.)) 를측정하였다. 세포증식능은다음식에의해계산하였다. Proliferation Index (%) = sample 흡광도 / control 흡광도 100 2.6. NO 생성량측정 NO 의농도는배양액내의 nitrite 농도를 griess 반응을이용하여측정하였다 [19]. RAW264.7 cell 은 DMEM 배지를이용하여 2.5 10 5 cells/ml 로조절한후 24 well plate 에접종하고 5% CO 2 incubator (MCO-15AC, Sanyo, Osaka, Japan) 에서 20 시간전배양하였다. 세포에 1 µg/ml 의 lipopolysaccharide (LPS) 와 0.1, 1, 10, 50, 100 µg/ml 의추출물을처리하여 24 시간재배양하였다. 배양액의상층액을얻은후, 동량의 griess 시약 (1% sulfanilamide + 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1) 을첨가하여실온에서 10 분간반응시키고, microplate reader (Model 550) 를이용하여 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 세포배양액내 NO 의농도는 sodium nitrite (NaNO 2 ) 의농도별표

184 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 182-190 (2015) 준곡선과비교하여산출하였다. 2.7. Pro-inflammatory cytokines 분비량측정세포배양액내의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β cytokine의분비량을 ELISA kit (Mouse ELISA set, BD Bioscience, San Diego, CA, USA) 를이용하여측정하였다. 이를위해 ELISA microplate 에 capture antibody로 anti-mouse TNF-α, IL-6 및 IL-1β를분주하여 4 o C에서하룻밤동안 coating시켰다. 이를 0.05% Tween 20이포함된 PBST로세척하고 10% FBS 용액으로 blocking 하였다. PBST로세척한뒤, 각 microplate에 NO를측정하였던것과동일한배양상층액을분주하고실온에서 2시간반응시켰다. 다시 PBST로세척한뒤희석한 biotinylated anti-mouse TNF-α, IL-6 detection antibody와 streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를첨가하여실온에서 1 시간반응시켰다. IL-1β의경우, biotinylated anti-mouse IL- 1β detection antibody를첨가하고 1시간반응후, streptavidinhorseradish peroxidase conjugate를첨가하여 30분반응시켰다. 그후, 이를다시 PBST로세척한다음, OPD 용액을첨가하여실온에서 30분동안암반응시켰다. 2 N H 2 SO 4 로반응을종료시킨후, microplate reader (Model 550) 를이용하여 490 nm에서흡광도를측정하였다. 2.8. Western blot 분석에의한단백질분석배양이끝난세포를수집하여 3회 PBS (phosphate buffered saline) 로세척한후, lysis buffer [50 mm HEPES (ph 7.4), 150 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1% deoxycholate, 5 mm phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 µg/ml aprotinin, 1% Triton X-100, and 0.1% NP-40] 를첨가하여 30분간 4 o C에서 lysis 시킨후, 12,000 rpm에서 20분간원심분리하여세포막성분등을제거하였다. 단백질농도는 BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA) 를사용하여정량하였으며, 30 µl의 lysate 를 10% SDS-PAGE로분리하였다. 분리된단백질은 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF, Bio-rad) 에 70 ma에서 1시간 30분동안전사시킨후, 5% skim milk가포함된 TBSS (tris buf- fered saline; ph 7.5) 용액으로상온에서 2시간동안 blocking하였다. inos, COX-2 및 NF-κB의발현양을검토하기위한항체로는 anti-mouse inos, COX-2 및 NF-κB (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) 를사용하였으며, MAPKs의발현량을알아보기위해 anti-mouse JNK, ERK 및 p38 (Cell Signalling Technology Inc., Denvers, MA, USA) 항체를사용하여 1:500으로희석해서사용하였다. 각각상온에서 2시간반응시킨후 TBSS로 3회세정하였다. 2차항체로는 horse radish peroxidase (HRP) 가결합된 anti-mouse IgG 및 anti-rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 를 1:2,000으로희석하여상온에서 1시간반응시킨후, TBSS로 3회세정하여 ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 기질과 1~3분간반응한후각각의단백질밴드는 Gene tool (Syngene software, Synoptics Ltd, Cambridge, UK) 를이용하여가시화및정량하였다. 2.9. 귀부종측정및조직관찰귀부종측정을위해 ICR 마우스에추출물을 10, 50 및 250 mg/kg body weight 농도가되도록 200 µl 씩단회경구투여하고한시간후, 오른쪽귀에 2.5% croton oil (Tokyo Chemical Industry Co. LTD., Tokyo, Japan) 을 20 µl/ear 씩도포하였다. 귀두께는 croton oil 을처리하고 5 시간후에측정하였으며 croton oil 처리한후두께의증가를부종의형성으로간주하였다. 귀조직관찰은 ICR 마우스의오른쪽귀에추출물을 100 mg/ml 농도로 20 µl 씩도포하고 15 분뒤, 5% croton oil 을 20 µl 씩도포하였다. 6 시간뒤, diethylether 로마취시키고, 귀조직을절제하여 10% formaldehyde 에 72 시간고정하였다. 고정후파라핀블록을만들어박편을제조하고 hematoxylin-eosin 및 toluidine-blue 염색을하여조직을관찰하였다. 2.10. 단기독성평가 Balb/c 마우스를실험시작전에 4~6 시간정도절식시킨후에추출물을 300, 2,000 및 5,000 mg/kg body weight 로경구투여하였다. 6 시간동안비정상적인행동등의경과를관찰하였고 2 주까지지속적으로관찰하였다. 2.11. 통계처리모든실험결과에대한유의차검정은 SAS software (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) 에서평균값을분산분석한후, Duncan's multiple range test 법에따라 p<0.05 수준에서검정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 세포독성평가추출물이대식세포에미치는독성을평가하기위해 RAW 264.7 세포 (1 10 6 cells/ml) 에추출물을처리하여 24 시간배양한후 MTT assay 를수행하였다. 추출물을 0.1, 1, 10, 50 및 100 µg/ml 의농도로첨가하여배양한결과, 세포의생존율은모든처리농도에서유의적인차이를보이지않음을관찰하였다 (Fig. 1). 따라서세포독성으로인해 RAW264.7 세포가사멸되는것이아님을확인한후실험을진행하였다. 3.2. NO 생성억제효과 NO 는피부손상및노화의주요원인이되며매우불안정한화합물로서 LPS 와같은염증유발물질에의한과도한증가는염증을유발하고조직의손상을초래한다 [20]. 따라서추출물처리에의한 NO 생성억제효과를측정하기위해 RAW 264.7 세포를 LPS 로활성시킨후, 추출물을각농도별로 (0.1, 1, 10, 50 및 100 µg/ml) 첨가하고생성된 NO 를 griess 시약을이용하여측정하였다. 그결과 (Fig. 2), 추출물을처리하였을경우, NO 생성량이 LPS 처리구보다농도의존적인감소를보임을확인하였다. 특히 50 µg/ml 이상의농도로추출물을처리하였을때그분비량이 LPS 처리구보다 50% 이상감

잘피에탄올추출물의항염증활성 185 Fig. 1. Effect of Zostera marina ethanolic extract on the proliferation of RAW264.7 cells. Proliferation index (%) = (sample O.D./ control O.D.) 100. ND : not significantly different. Fig. 2. Inhibitory effect of Zostera marina ethanolic extract on the production of nitric oxide in LPS-induced RAW264.7 cells. a-f Means with different superscript are significantly different (p<0.05). 소함을보여탁월한 NO 생성억제효과를확인하였다. 본연구결과는김등 [21] 의모자반에탄올추출물의항염증효과에서 NO 생성량이 50 µg/ml 및 100 µg/ml 에서 50% 이상감소한연구결과와유사하다. 또다른연구에서강등 [22] 은같은실험조건에서다시마뿌리에탄올추출물을 100 µg/ml 처리시약 28% 의 NO 생성억제효과를보인다고보고했으며, 이와비교해보았을때본연구에사용된잘피에탄올추출물이탁월히높은 NO 생성저해능을가진다고사료된다. 3.3. Pro-inflammatory cytokine 생성억제효과 Pro-inflammatory cytokine 은염증면역반응에서필연적으로동반되는매개물로서정상조직에서발현될뿐만아니라병리적인조건하에서그발현정도가증가되며, 피부염증및암발생등에서중요한역할을한다. 대표적인 pro-inflammatory cytokine 으로는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 가있다 [23]. LPS 에의해자극된 RAW264.7 세포는종양괴사인자인 TNF-α 를생성하며, 분비된 TNF-α 및 LPS 는 IL-6 와 IL-1β 의생성을유도 Fig. 3. Inhibitory effect of Zostera marina ethanolic extract on the production of TNF-α (A), IL-6 (B), and IL-1β (C) in LPS-induced RAW 264.7 cells. a-g Means with different superscript are significantly different (p<0.05).

186 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 182-190 (2015) 하여 NO 생성과국소염증을발행시킴으로써염증반응을지속시키게된다 [24,25]. 따라서허등 [26] 은초기면역반응과염증단계에서중요한역할을하는 pro-inflammatory cytokine 의저해를통해염증반응을조절할가능성이높다고보고하였다. 본연구에서는잘피추출물이 pro-inflammatory cytokine 의생성에미치는영향을알아보기위하여 RAW264.7 세포에 LPS 처리후추출물을농도별로처리하여 ELISA 방법으로측정하였다. 그결과 (Fig. 3A-C), LPS 자극에의해유도되는 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 의생성이농도의존적으로유의적감소를보였다. 특히, TNF-α 의경우추출물을 1 µg/ml 이상처리하였을경우 LPS 단독처리비교시약 56% 분비량감소효과를보였으며, IL-6 및 IL-1β 의경우에는추출물을각각 50 및 10 µg/ml 농도로처리하였을때그분비량이 50% 이상현저히감소함을나타냈다. 이는잘피에탄올추출물이 RAW 264.7 세포에서염증성 cytokine 을효과적으로억제하여항염증효과에관여하는것을의미한다. 3.4. 잘피에탄올추출물의 inos, COX-2, NF-κB 발현억제효과체내에염증반응이일어나게되면관련세포에서 inos 의발현이증가하여다량의 NO 가생성되며이는유전자변이, 신경손상, 조직손상등과함께혈관투과성을증가시켜부종등의염증반응을촉진시킨다 [27]. 또한, COX-2 는염증매개물질인 PGE 2 의형성에관여하며 [28], NF-κB 는염증반응과관련된유전자의 promoter 에결합하며 cytokine 및 LPS 등에의해활성화되어 COX-2 및 inos 발현에관여하는것으로알려져있다 [29]. 따라서이들매개인자 (inos, COX-2 및 NF-κB) 의발현량에미치는추출물의항염증효과를확인하였다. RAW264.7 세포에추출물을 0.1~100 µg/ml 농도로처리하고각단백질의발현량을측정한결과 (Fig. 4), LPS 단독처리구에의해각단백질의발현량이현저히증가하였으나, 추출물을처리하였을때그발현량이농도의존적으로감소하는것을확인할수가있었다. 특히 50 및 100 µg/ml 농도에서 PBS 처리구와유사한발현량을보여우수한항염증효과를가짐을확인하였다. 또한, inos 의단백질발현감소결과는 inos 의활성화로부터생성되는 NO 의분비량감소결과 (Fig. 2) 와도관련이있음을나타냈다. 이러한결과를바탕으로볼때, 잘피추출물은 NF-κB 의활성억제를통해 COX-2 및 inos 발현을억제함으로써 PGE 2 와 NO 의생성을저해함에따라항염증효과를나타낸다고사료된다. 3.5. 잘피에탄올추출물의 MAPKs 발현억제효과 MAPKs (ERK, JNK, p-38) 의활성은인산화에의해서나타나며대식세포에서 NF-κB 의활성화에중요한역할을한다고보고되어져있다 [30]. 따라서인산화된 MAPKs 의발현량을 western blot 으로분석한결과 (Fig. 5), LPS 로유도된 RAW 264.7 세포에서 p-erk 및 p-p38 의발현이잘피에탄올추출물처리에의해농도의존적으로감소하였으며, 특히, p-p38 의발현이확연히억제됨을확인하였다. p-jnk 의발현은잘피추출물 50 및 100 µg/ml 농도에서약간감소하였다. LPS 는 MAPKs 와 NF-κB 를활성화시켜 NO 및 pro-inflammatory cytokine 을생성시킴으로써염증반응에관여한다. 따라서본연구의결과를종합해볼때, 잘피추출물의염증매개성물질의감소효과는 NF-κB 의활성화및 MAPKs 인산화억제 Fig. 4. Effect of Zostera marina ethanolic extract (ZMEE) on LPS-induced inos, COX-2, and NF-κB p65 expression in LPS-induced RAW246.7 cells. The levels of inos, COX-2 in the cytosolic protein and the p65 subunit of NF-κB in nuclear protein were determined by a western blot analysis. RAW264.7 cells were treated with the indicated concentrations of ZMEE (0.1, 1, 10, 50, and 100 µg/ml) and LPS (1 µg/ml) for 18 h or 30 min and the proteins were detected using specific antibodies.

잘피에탄올추출물의항염증활성 187 Fig. 5. Effect of Zostera marina ethanolic extract (ZMEE) on MAPKs expression in LPS-induced RAW246.7 cells. The levels of p-p38, p-erk, and p-jnk in the cytosolic protein were determined by western blot analysis. RAW264.7 cells were treated with the indicated concentrations of ZMEE (0.1, 1, 10, 50, and 100 µg/ml) and LPS (1 µg/ml) for 30 min, and the proteins were detected using specific antibodies. 로인한항염증효과로사료된다. 3.6. 귀부종억제효과및조직관찰피부염증에서일어나는대표적인반응으로혈관확장, 부종등의생리현상이있으며, 이는외부환경에의한손상된부위를복구시키려는일련의생체과정이다 [31]. 또한, mast cell 은세포질내과립을풍부하게가진면역세포로서외부자극으로부터활성화된 mast cell 은프로테아제나히스타민등과같은혈관확장물질들을분비하며다양한 pro-inflammatory 매개물질들의분비를자극한다 [32]. 따라서염증반응의하나인부종에대한잘피에탄올추출물의부종완화효과및조직내의 mast cell 침윤억제효과를확인하기위해동물실험을진행하였다. 먼저, 현재사용되고있는합성스테로이드제인 prednisolone 은 10 및 50 mg/kg body weight 로, 잘피에탄올추출물은 10, 50 및 250 mg/kg body weight 가되도록 200 µl 씩단회경구투여한후, croton oil 로염증을유발하고귀두께를측정하였다. 그결과 (Fig. 6), control 과비교하여모든농도에서유의적으로귀두께가감소한것을확인하였다. 특히, 추출물 250 mg/kg body weight 처리구에서 positive control 인 prednisolone 처리구와비교하였을때, prednisolone 10 mg/kg body weight 처리구와유사하게감소함을보였다. 추출물의귀부종억제효과는조직관찰결과에서도나타났는데, croton oil 로부종을유발한마우스귀조직에서 croton oil 만을처리한경우에비해추출물을 100 mg/ml 농도로처리한경우경피및진피두께가얇아진것을확인하였다 (Fig. 7A). 또한, toluidine-blue 염색을통해조직내 mast cell 침윤정도를확인한결과 (Fig. 7B), 추출물의처리가조직내 mast cell 침윤을현저히억제함을보였다. 본연구결과는잔가시 Fig. 6. Inhibition of Zostera marina ethanolic extract against croton oil-induced mouse ear edema. a-f Means with different superscript are significantly different (p<0.05). 에탄올추출물의항염증효과에서추출물 250 mg/kg body weight 처리구에서대조구인 prednisolone 50 mg/kg body weight 로처리했을때와비슷한귀두께감소및조직학적변화를보인연구결과와유사하다 [33]. 또다른연구결과에서김등 [34] 은비틀대모자반에탄올추출물의항염증효과에서추출물 250 mg/kg 처리구에서약 46% 귀부종완화효과를보고한바있으며, 정등 [35] 은외톨개메탄올추출물이미치는귀부종완화및조직학적변화관찰결과추출물 250 mg/kg 처리구에서약 24% 귀의부종이완화됨을보였으며, 추출물로부터분리된 mojabanchromanol b 라는물질의탁월한항염증효과를보고하였다. 따라서이상의결과들을종합

188 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 182-190 (2015) Health Organization (WHO) [36] 에따라추출물을 300, 2,000 및 5,000 mg/kg body weight 가되도록 200 µl 씩경구투여하고 2 주간행동변화및치사율을관찰하였다 (Table 1). 경구투여후 4 시간까지행동변화를관찰하였을때, 20 분정도약간흥분상태를보였으나 1 시간이후진정하였으며, 2 주간치사율은 0% 로나타났다. 따라서동물실험을통해추출물이인체에도무해할것으로사료되며새로운기능성식품소재로이용이가능할것으로사료된다. 4. CONCLUSION Fig. 7. Photomicrograph of transverse sections of mice ears sensitized with topical application of 5% croton oil (v/v) in acetone (a-c) or vehicle acetone (d, non-inflamed), stained with hematoxylin-eosin (A) and toluidine-blue (B) examined under light microscopy (magnification: 200 ). Treatments: vehicle 2% Tween 80 (a), prednisolone 0.08 mg/ear (b) and Zostera marina ethanolic extract 20 µl/ear (c). The numbers 1 and 2 indicate dermis and epidermis, respectively and the arrows indicate mast cells. 대식세포에대한잘피에탄올추출물의독성은나타내지않았으며, LPS 에의해유도된 NO 와 pro-inflammatory cytokine 의분비량은잘피에탄올추출물에의해농도의존적으로억제됨을확인하였다. 또한, 잘피에탄올추출물로인한염증매개성물질의발현억제력이 NF-κB 와 MAPKs 신호전달억제에기인한것인지를알아본결과, LPS 는 inos, COX-2, NF-κB 및 MAPKs 의발현을증가시켰으나, 잘피에탄올추출물처리는 LPS 에의해유도되는각단백질의발현량을억제하였다. 따라서잘피에탄올추출물은염증반응에관여하는신호전달체계인 NF-κB 와 MAPKs 의활성을억제함으로써염증매개인자들의생성을효과적으로억제하였다. 마지막으로, 추출물이미치는조직학적변화를알아본결과, 대조군은진피와경피의두께가확장되어있었고 mast cell 의침윤이정상군에비하여현저하게증가함을확인하였다. 그러나잘피에탄올추출물처리군은대조군에비하여진피와경피의두께가상대적으로줄어들었고비만세포의침윤이현저하게감소하는것으로관찰되어조직두께및 mast cell 의침윤감소에추출물처리에대한효과가있음을확인하였다. 본연구결과들을종합해볼때잘피에탄올추출물을이용한새로운항염증에유용한고부가가치제품개발이가능한소재로판단된다. Table 1. Mortality of mice treated orally with Zostera marina ethanolic extract Days after treatment 0 2 4 6 8 10 12 14 Control 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 300 mg/kgbody weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2,000 mg/kgbody weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5,000 mg/kgbody weight 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 해볼때, 잘피에탄올추출물은귀부종을효과적으로완화시킴으로써염증을예방하거나치료하는천연항염증제로이용가능함을확인하였다. 3.7. 단기독성평가기능성식품소재로써이용가능성을알아보기위해 World Acknowledgements 이논문은 2014 년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업입니다 (No. 2012R1A6 A1028677). REFERENCES 1. Lee, H. J., E. A. Hyun, W. J. Yoon, B. H. Kim, M. H. Rhee, H. K. Kang, J. Y. Cho, and E. S. Yoo (2006) In vitro anti-inflammatory and anti oxidative effects of Cinnamomum camphora extracts. J. Ethnopharmacol. 103: 208-216. 2. Ljung, T., S. Lundberg, M. Varsanyi, C. Johansson, P. T. Schmidt,

잘피에탄올추출물의항염증활성 189 M. Herulf, J. O. Lundberg, and P. M. Hellstrom (2006) Rectal nitric oxide as biomarker in the treatment of inflammatory bowel disease: responders versus nonresponders. World J. Gastroenterol. 12: 3386-3392. 3. Zhang, G. and S. Ghosh (2000) Molecular mechanism of NF-kappaB activation induced by bacterial lipopolysaccharide through Toll-like receptors. J. Endotoxin. Res. 6: 453-457. 4. Nathan, C. and Q. W. Xie (1994) Regulation of biosynthesis of nitric oxide. J. Biol. Chem. 269: 13725-13728. 5. Chan, E. D. and D. W. Riches (2001) IFN-γ +LPS induction of inos is modulated by ERK, JNK/SAPK, and p38 (mapk) in a mouse macrophage cell line. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280: C441-450. 6. Ghosh, S. and H. S. Hayden (2008) New regulators of NF-κB in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 8: 837-848. 7. Majdalawieh, A. and H. S. Ro (2010) Regulation of IκBα function and NF-κB signaling: AEBP1 is a novel pro-inflammatory mediator in macrophages. Mediators Inflamm. 2010: 1-27. 8. Jang, B. C., J. H. Paik, S. P. Kim, D. H. Shin, D. K. Song, J. G. Park, M. H. Suh, J. W. Park, and S. I. Suh (2005) Catalase induced expression of inflammatory mediators via activation of NF-kappaB, PI3K/AKT, p70s6k, and JNKs in BV2 microglia. Cell Signal 17: 625-633. 9. Nagayama, K., Y. Iwamura, T. Shibata, I. Hirayama, and T. Nakamura (2002) Bactericidal activity of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome. J. Antimicrob. Chemother. 50: 889-893. 10. Kim, H. S. and G. J. Kim (1998) Effects of the feeding Hizikia fusiforme (Harvey) Okamura on lipid composition of serum in dietary hyperlipidemic rats. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 27:718-723. 11. Lee, J. h., N. D. Kim, J. S. Choi, Y. J. Kim, M. Y. Heo, S. Y. Lim, and K. Y. Park (1998) Inhibitory effects of the methanolic extract of an edible brown alga, Ecklonia stolonifera and its component, phloroglucinol on aflatoxin B1 mutagenicity in vitro (Ames test) and on benzo(a)pyrene or N-methyl N-nitrosourea clastogenicity in vivo (mouse micronucleus test). Nat. Prod. Sci. 4: 105-114. 12. Kim, K. N., S. J. Heo, W. J. Yoon, S. M. Kang, G. Ahn, T. H. Yi, and Y. J. Jeon (2010) Fucoxanthin inhibits the inflammatory response by suppressing the activation of NK-κB and MAPKs in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophages. Eur. J. Pharmacol. 649: 369-375. 13. Jung, H. A., H. J. Jung, H. Y. Jeong, H. J. Kwon, M. S. Kim, and J. S. Choi (2014) Anti-adipogenic activity of the edible brown alga Ecklonia stolonifera and its constituent fucosterol in 3T3-Li adipocytes. Arch. Pharm. Res. 37: 713-720. 14. Lee, S. Y., S. M. Lee, J. H. Kim, and C. I. Choi (2003) Phonology and morphometrics change of Zostera marina L. population at Duksan Port in the eastern coast of Korea. J. Kor. Soc. Oceanogr. 8: 70-77. 15. Kwak, M. K., D. S. Kim, K. S. Oh, and Y. Seo (2014) Antioxidant activity of the seagrass Zostera japonica. Korean Soc. Biotechnol. Bioeng. J. 29: 271-277. 16. Hua, K. F., H. Y. Hsu, Y. C. Su, I. F. Lin, S. S. Yang, Y. M. Chen, and L. K. Chao (2006) Study on the anti-inflammatory activity of methanol extract from seagrass Zostera japonica. J. Agric. Food Chem. 54: 306-311. 17. Jung, M. E., J. W. Hong, J. I. Lee, C. S. Kong, J. S. Chang, and Y. Seo (2012) Inhibitory effect of Zostera japonica on growth of human cancer cells. Ocean Polar Res. 34: 385-394. 18. Hong, J. W., M. E. Jung, J. I. Lee, H. Kim, J. S. Chang, Y. Seo (2012) Cytotoxic effect of Zostera asiatica on growth of human cancer cells. Korean Soc. Biotechnol. Bioeng. J. 27: 227-231. 19. Yee, S. T., Y. R. Jeong, M. H. Ha, S. H. Kim, M. W. Byun, and S. K. Jo (2000) Induction of nitric oxide and TNF-α by herbal plant extract in mouse macrophage. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 29: 342-348. 20. Nathan, C. (1992) Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J. 6: 3051-3064. 21. Kim, M. J., K. B. W. R. Kim, D. H. Jeong, and D. H. Ahn (2013) Inhibitory effect of Sargassum fulvellum ethanolic extract on LPSinduced inflammatory reaction in RAW 264.7 mouse macrophages. J. Appl. Biol. Chem. 56: 249-255. 22. Kang, B. K., K. B. W. R. Kim, M. J. Kim, S. W. Bark, W. M. Pak, B. R. Kim, N. K. Ahn, Y. U. Choi, and D. H. Ahn (2014) Antiinflammatory activity of an ethanol extract of Laminaria japonica root on lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW 264.7 cells. Korean J. Food Sci. Technol. 46: 729-733. 23. Park, S. G., K. H. Jegal, J. Y. Jung, Y. D. Back, S. H. Byun, Y. W. Kim, I. J. Cho, S. M. Park, and S. C. Kim (2014) Leonuri fructus ameliorates acute inflammation via the inhibition of NF-κB-mediated nitric oxide and pro-inflammatory cytokine production. Korean J. Orient. Physiol. Pathol. 28: 178-185. 24. Beutler, B. and A. Cerami (1989) The biology of cachectin/tnf-α primary mediator of the host response. Annu. Rev. Immunol. 7: 625-655. 25. Masters, S. L., A. Simon, I. Aksentijevich, and D. L. Kastner (2009) Horror auto-inflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammatory disease. Ann. Rev. Immunol. 27: 621-668. 26. Heo, S. J., W. J. Yoon, K. N. Kim, G. N. Ahn, S. M. Kang, D. H. Kang, A. Affan, C. Oh, W. K. Jung, Y. J. Jeon (2010) Evaluation of anti-inflammatory effect of fucoxanthin isolated from brown algae in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. Food Chem. Toxicol. 48: 2045-2051. 27. Lim, H. R. and S. W. Shin (2010) Effects of the essential oil components from Ligusticum chuanxiong on proinflammatory mediators of RAW264.7 macrophage cells. Korean Sci. Pharm. 16: 259-264. 28. Duerksen-Hughes, P. J., D. B. Day, S. M. Laster, N. A. Zachariades, L. Aquino, L. R. Gooding (1992) Both tumor necrosis factor and nitric oxide participate in lysis of simian virus 40-transformed cells by activated macrophages. J. Immunol. 149: 2114-2122. 29. Celec, P. (2004) Nuclear factor kappa B-molecular biomedicine: the next generation. Biomed. Pharmacother. 58: 365-371. 30. Guha, M. and M, Mackman (2001) LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell. Signal. 13: 85-94. 31. Hahm, D. H., B. J. Sur, D. O. Han, J. H. Park, E. T. Jung, H. J. Lee, Y. J. Koh, and H. D. Choi (2008) Anti-inflammatory activity of Dandelion in mice. J. Ori. Med. Physiol. Pathol. 22: 810-814. 32. Seo, U. K., J. I. Lee, J. H. Park, and Y. K. Park (2008) The ethylacetate extract of north kangwhal (Ostericum koreaum) attenuates the inflammatory responses in PMA/A23187-stimulated mast cells.

190 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 182-190 (2015) Kor. J. Herbology 23: 81-89. 33. Jeong, D. H., K. B. W. R. Kim, M. J. Kim, B. K. Kang, and D. H. Ahn (2013) Anti-inflammatory activity of ethanolic extract of Sargassum micracanthum. J. Microbiol. Biotechnol. 23: 1691-1698. 34. Kim, M. J., K. B. W. R. Kim, D. H. Jeong, and D. H. Ahn (2013) Anti-inflammatory activity of ethanolic extract of Sargassum sagamianum in RAW 264.7 cells. Food Sci. Biotechnol. 22: 1113-1120. 35. Jeong, D. H., K. B. W. R. Kim, M. J. Kim, B. K. Kang, and D. H. Ahn (2014) Anti-inflammatory activity of methanol extract and n- hexane fraction mojabanchromanol b from Myagropsis myagroides. Life Sci. 114: 12-19. 36. World Health Organization (1992) Research guidelines for evaluating the safety and efficacy of herbal medicine. pp. 1-38. Regional Office for Western Pacific, Manila, Philippines.