CHEMISTRY TOPICS 초분자전기화학을이용한바이오센서의개발 신익수 숭실대학교화학과, extant@ssu.ac.kr 서론 초분자프로브를이용한분자인식연구가최근눈부실만한발전을거듭해왔지만, 대부분의연구주제들이초분자프로브의광화학적특성변화에초점을맞춰진행되어온것이사실이다. 그러나만약이러한초분자프로브를광학적접근뿐아니라, 전기화학적조작을통해어떤변화를 프로그래밍 할수있다면, 이는분자수준에서작동하는전기기기혹은전기센서를개발할수있음을뜻하는일일것이다. 초분자인식분야에전기화학적방법을도입하는것은이같은궁금증에대답하기위한연구로서, 초분자프로브를합성하고이에전류혹은전압등의전기적자극을 가함으로서그것이마치전기기기인양작동할수있게끔하는데에연구의초점을두고있다. 이러한접근을통해기존에는광화학적측정에만의존했던초분자인식연구를전기화학적분석의분야로확장할수있으리라예상하고, 나아가새로운형태의전기화학적생체센서를개발할수있으리라기대한다. 본론 전기화학발광음이온감지 : 파이로인산의감지와선별적인식 (Electrogenerated Chemiluminescent Anion Sensing: Selective Recognition and Sensing of Pyrophosphate) 그림 1. 초분자프로브의전기화학적조작을통한분자전기기기. 페로센 - 베타 - 사이클로덱스트린 (Ferrocene-β-cyclodextrin) 을이용한탄수화물 (carbohydrate) 의전기화학적센서 1) 및 초분자프로브의산화 / 환원스위칭을통한표면으로부터의세포방출에관한연구 2) 12 화학세계 2013. 09
초분자전기화학을이용한바이오센서의개발 음이온에대한형광초분자센서는최근몇년사이에많은관심을받고있는분야중하나이다. 특히두개의인산그룹이결합된형태의파이로인산 (pyrophosphate, PPi) 는체내에서다양한대사및에너지전달과정에참여하는물질이고, 더욱이 DNA 복제과정에서필연적으로발생하는결과물로서, DNA 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 의실시간모니터링에있어매우중요한타겟라고할수있다. 3) 본연구진은이에 PPi 에선택적으로결합할수있는초분자프로브를합성하고, 프로브와 PPi 가선택적인결합을형성한뒤, 이결과를전기화학적발광 (Electrogenerated Chemiluminescence, ECL) 을통해확인할수있는새로운형태의센싱방법을연구하여이를 Analytical Chemistry 에보고한바있다. 4) 현재까지 PPi 검출법은주로두가지접근법으로나누어볼수있다. 첫번째는효소면역법을통해 PPi 가연관되어진여러가지효소반응들을연속적으로진행, 그마지막부산물로발생되는인산이온혹은 ATP 의양을형광이나흡광도를통해검출하는방법이있고, 두번쩨로초분자프로브를통해 PPi 와선택적으로결합한후, 그때의형광혹은흡광도를변화를통해검출하는방법이다. 한편, 전기화학적인산화 / 환원과정후, 화학발광을유발하는현상인 ECL 은지난 20여년간생체물질검출에널리사용되어져온전기분석방법이다. 특히대부분의연구가기존의형광분석법에서쓰인형광라벨을루비피 (Ru (bpy)3 2+ ) ECL 라벨로교체하여형광대신전극에서의 ECL 발광으로대체하려는방법들이주를이루고있다. ECL 을통한분석법은형광을이용하는방법과는달리별도의광원을필요로하지않은상태에서전기적인 on-off 만으로화학발광을얻을수있다는장점이있어서소형화된고감도광센서키트를만들수있는좋은장점을지니고있다. 본연구에서는 PPi 에선택적인수용체개발에관한노하우를바탕으로유기합성방법으로붕소디프로메텐 (Boron dipyrromethenes, Bodipy) 분자를 PPi 수용체와결합하여 PPi 에선택적인 ECL 센서를개발하였다. PPi 와수용체간의결합현상을바로 Bodipy 분자의 ECL 발광효율에전달할수있는시스템을개발하여, 기존 ECL 분석법에서의문제점인부수적으로전 / 후처리과정을생략하고, 별도의광원이없이간단한전기화학키트형태로그자리에서 (insitu) PPi 를검출 / 분석할수있는새로운분석법이라고할수있다. (c) (d) 그림 2. PPi 선택적으로결합하여전기화학적발광 (ECL) 변화를유발하는 PPi 초분자센서의분자구조및센싱메카니즘 2013. 09 화학세계 13
전기화학적온오프스위칭에의한형광 켜짐 산소센서 (Fluorescence turn-on oxygen sensor by electrochemical on/off switching) 초분자에전기화학적인방법을도입하면기존에알려지지않은새로운형태의센서기법을개발할수있다. 본연구진은생체내에존재하는용존산소를검사하는방법이기존에클라크 (Clark) 전극형태의전기화학적방법과인광소광방식의광학적소광센서두가지방법밖에는존재하지않는것에착안하여, 산소감응성초분자를전기화학적기법으로조작하여일정전압하에산소에만감응하여신호를생성하되, 신호의형태가형광이소광하는방식이아닌, 형광이발광하는방식의완전히새로운형태의용존산소방법을개발하였다. 이방법의개발은사실우연적인계기에의한것이었다. 본연구진에서합성하고있던형광반도 체물질인페릴린디아미드 (perylene diimide, PDI) 화합물의전기화학적물성을측정하던차에, 이것이상당히낮은환원전위에서, 심지어수용액분위기에서도대단히가역적이고안정적인환원거동을보이며, 나아가환원이일어났을때이것의형광이극적으로소멸되는현상을관찰하였다. 이에대한생화학적센싱기법을고민하던터에, 산소와 H2O2 의환원전위가페릴린디아미드보다낮은환원전위라는사실을확인하고이에대한센싱실험을수행하였다 [ 그림 3]. 페릴린디아미드유도체의독특한전기화학적형광 on/off 현상을이용하여새로운방식의형광 켜짐 형태산소센서대한실험방법은간단히다음과같다. 1 페릴린디아미드를전해질과함께용액에녹인후이를 -1.2 V (vs Ag/Ag + ) 하에서전기분해하여완전히환원시킨다. 이러한과정을거쳐매우밝은붉은색의형광을내는용액은어두 O2 No fluorescence -1.2 V Strong fluorescence 그림 3. 전기화학적방법에의한형광증가산소센싱방법에대한개략적인설명 그림 4. PDI 초분자프로브 ( 위그림 3 의화합물 1) 을환원시키는동안 575 nm 파장에서의형광변화와환원전류그래프. 완전히환원된 12- 용액의산소주입농도당형광증가그래프 (inset: 산소가없을때용액의형광이거의나타나지않는다.) 14 화학세계 2013. 09
초분자전기화학을이용한바이오센서의개발 운보라색의무형광용액으로변환된다. 그후 2 산소를용액에주입하면주입된양에따라 O2와환원된페릴린디아미드사이의전기화학반응을통해원래의용액상태로돌아오면서그에따라형광이다시증가하게된다. 이와같은산소농도에따른 형광 ON 센싱방법은아직방법론적으로학계에서는보고된바가없는최초의보고로, 간단한아이디어와전기화학 / 초분자화학의결합을통한새로운센서개념이가능함을단적으로보여주는좋은사례라고할수있다. 이일은지난 2012 년 Analytical Chemistry 에보고되었고, 5) 새로운산소센서방법에대한방법론적중요성으로인한원천특허가능성으로인해현재특허출원을준비중에있다. 전기화학적방법을이용한단백질키나제활성어세이 (Homogeneous electrochemical assay for protein kinase activity) 단백질의인산화 (phosphorylation) 는생체내에서일어나는단백질변형의일정으로, 세포내신호전달과그결과로발생되는세포생장, 분열, 사멸을결정하는중요한역할을하는생체반응의하나이다. 가령성장세포의세포분열을위해서는성장호르몬등의외부자극을통해세포내단백질의인산화가이루어지고, 이렇게인산화된단백질이다른단백질을또인산화하는일련의신호전달과정이필연적으로요구된다. 단백질키나제는단백질을인산화하는역할을하는효소로서만약이키나제의활성이정상적이지않 은경우신체적인장애혹은암등의질병을유발할수있기때문에, 특정단백질키나제의특이성혹은효소활성을분석하는것은암이나당뇨와같은질병을연구하는데있어대단히중요하다고할수있겠다. 단백질키나제의활성을측정하기위해주로사용되는어세이방법은 γ- 32 P 를이용한단백질기질 (substrate) 의방사성동위원소표지법이다. 6) 최근제안되고있는형광표지법은많은양의단백질키나제를동시에측정할수있는대안적방법이라고할수있다. 7) 칩혹은전극표면상에서의전기화학적인분석방법도제안되고있는데, 이는주로짧은펩타이드 (peptide) 기질을전극표면에부착하고, 이기질이효소반응에의해인산화되었을때의전기적형질변화를측정한다. 8) 최근본연구진은새로운형태의전기화학적인단백질키나제분석법을개발하고, 이를학술지에투고했다. 본연구진이개발한방법은인산기 (phosphate) 에특이성을지니는초분자프로브를새로이합성하고이를전극표면에부착한후, 단백질키나제에의해인산화된효소반응생성물을표면에포획한후이때표면에서의전기화학적변화를측정하는형태이다 [ 그림 5]. 이방법은두가지장점을지니는데, 첫번째로전기화학적접근법이지니는고유의소형화, 저렴화의이점과, 두번째로전극에고정된형태가아닌액상에서의균일상효소반응 (homogeneous enzyme reaction) 이기때문에보다단백질키나제의활성이실제세포내에서이뤄지는것과비슷한환경에서분석을할수있다는것이다. 이와같은접근법을통해 Kinase 그림 5. 초분자프로브를이용한단백질키나제활성에관한전기화학적어세이모식도및 그를이용해 ph 7.4 완충용액에서측정된키나제농도에따른활성어세이그래프 2013. 09 화학세계 15
본연구진은 0.1 u/ml 수준의낮은활성까지단백질키나제를측정해낼수있었고, 세포액에서도기대할만한수준의성공적효소어세이를얻어낼수있었다. 9) 결론 초분자프로브를이용한생분자인식연구, 혹은분광학적활성을지니는단분자태그를이용한생체이미징에관한연구들은최근눈부실만한발전을거듭해왔다. 그러나그러한괄목할만한연구성과들이대부분대형기기에의존하는분광학적방법들에초점을맞추고있는현실은여전히극복해야할과제중하나라고할수있다. 한편그와는별개로다양한금속나노구조체의전기화학적촉매현상을관찰하거나, 전기적인자극을통해물질의 산화 / 환원거동변화및그를이용한전기화학적분석, 혹은센서개발등의연구역시도최근학계의새로운관심을받고있는분야중하나라고할수있다. 따라서초분자인식연구와전기화학적분석법을하나로융합하여새로운형태의바이오센서를개발하는것역시매우새롭고도흥미로운분야중하나라고할수있겠다. 본연구진의사전연구에따르자면, 지금까지학계에알려진상당수의분광학적분자인식연구들을전기화학적분석법으로전환하는것이가능할것이라예상되고있다. 이러한연구를통해앞으로다양한생체물질에대한전기화학적센서개발이이루어지길기대하며, 나아가혈당센서와같은새로운상업용바이오센서개발연구에있어중요한밑거름이될수있기를감히기원해본다. 참고문헌 1. Casas-Solvas, J.M. et al., Chemistry: A European Journal, 15(33), 8146-8162 (2009) Ferrocene-β-cyclodextrin conjugates: synthesis, supramolecular behavior, and use as electrochemical sensors 2. An, Q. et al., Angewante Chemie International Edition 51(49), 12233-12237 (2012) A Supramolecular System for the Electrochemically Controlled Release of Cells 3. Kim, S. K. et al., Account of Chemical Research 42(1), 23-31 (2009) Chemosensors for Pyrophosphate 4. Shin, I.-S. et al., Analytical Chemistry, 82(19), 8259-8265 (2010) Electrogenerated Chemiluminescent Anion Sensing: Selective Recognition and Sensing of Pyrophosphate 5. Shin, I.-S. et al., Analytical Chemistry, 84(21), 9163-9168 (2012) Efficient Fluorescence Turn-On Sensing of Dissolved Oxygen by Electrochemical Switching 6. Geahlen, R. L. et al., Analytical Biochemistry 153(1), 151-158 (1986) Detection of protein kinase activity in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels 7. Rhee, H.-W et al., Angewandte Chemie International Edition 49(29), 4919-4923 (2010) Detection of Kinase Activity Using Versatile Fluorescence Quencher Probes 8. Martic, S. et al., Analyst 136(1), 107-112 (2011) Enzymatically modified peptide surfaces: towards general electrochemical sensor platform for protein kinase catalyzed phosphorylations 9. Shin, I.-S et al., Homogeneous electrochemical assay for protein kinase activity submitted 신익수Shin, Iksoo 서울대학교화학교육과, 학사 (1999) 서울대학교화학과, 석사 (2001, 지도교수 : 김하석 ) 서울대학교화학과, 박사 (2007, 지도교수 : 김하석 ) University of Texas at Austin, 박사후연구원 (2008, 지도교수 : Richard M. Crooks) 삼성토탈 ( 주 ), 선임연구원 (2008 2009) 서울대학교화학과, 박사후연구원및 BK 조교수 (2009 2012, 지도교수 : 홍종인 ) 숭실대학교화학과, 조교수 (2012.09 현재 ) Email: extant@ssu.ac.kr 16 화학세계 2013. 09