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Korean J. Pl. Taxon. 44(2): 111-118 (2014) http://dx.doi.org/10.11110/kjpt.2014.44.2.111 ISSN 1225-8318 Korean Journal of Plant Taxonomy Molecular phylogenetic study of Pinus in Korea based on chloroplast DNA psba-trnh and atpf-h sequences data Jeong-Ki Hong, Jong-Cheol Yang, You-Mi Lee and Joo-Hwan Kim 1 * Korea National Arboretum, Pocheon, Gyeonggi 487-821, Korea 1 Department of Life Science, Gachon University, Seongnam, Gyeonggi 461-701, Korea (Received 13 May 2014; Accepted 13 June 2014) 엽록체 DNA psba-trnh와 atpf-h 염기서열에기초한한국산소나무속의분자계통학적연구 홍정기 양종철 이유미 김주환 1 * 국립수목원, 1 가천대학교생명과학과 ABSTRACT: This study aims to define the phylogenetic relationship within Korean Pinus L. and to find the molecular markers which resolve the phylogenetic relationship in genus Pinus. cpdna atpf-h and psba-trnh regions were used as molecular markers. We performed the molecular phylogenetic study on 17 taxa of Pinus in Korea. The combined analyses of two gene loci showed that Korean Pinus was a monophyletic group supported by 100% BP. According to the results of separate analyses, psba-trnh region seems to work better resolving power to clarify the phylogenetic ambiguity in Korean Pinus than those of atpf-h region. Also, we tried to checked the value and resolution of two chloroplast DNA loci on phylogenetic implications. Keywords: Pinus, subgenus Diploxylon & Haploxylon, atpf-h, psba-trnh 적요 : 엽록체 DNA atpf-h, psba-trnh region 을마커로활용하여국내에분포하는소나무속식물들중 17 분류군에대한분자계통학적연구를수행하여한국산소나무속의계통학적유연관계를규명하고, 소나무속의유연관계를잘나타낼수있는분자마커를찾아내고자연구가수행되었다. atpf-h, psba-trnh region 의조합분석결과한국산소나무속은 100% 의 BP 로지지되는단계통군으로확인되었으며, 소나무아속과잣나무아속으로명확히구분되어졌다. 본연구에서이용된두개의분자마커중 psba-trnh region 이 atpf-h region 보다한국산소나무속의계통및유연관계를규명하는데다소높은해상력을나타내었다. 주요어 : 소나무속, 소나무아속, 잣나무아속, atpf-h, psba-trnh 소나무속 (Pinus L.) 은구과목 (Coniferales), 소나무과 (Pinaceae), 소나무아과 (Pinoideae) 에포함되는식물군으로대부분이북반구온대지역에분포하지만남중부아메리카와수마트라, 자바등에도일부종이자라고있다. 소나무속은전세계적으로 9 속 110 종이분포하고있으며 (Fu et *Author for correspondence: kimjh2009@gachon.ac.kr http://www.pltaxa.or.kr Copyright 2014 the Korean Society of Plant Taxonomists al., 1999; Syring et al., 2005), 그중우리나라에는 20여종이자생하거나식재되고있다 (Korea National Arboretum and The Plant Taxonomic Society of Korea, 2007). 소나무속은바늘잎들이속생하고, 속생하는잎의개수는종마다다르며, 잎의기부를감싸는인편엽초가존재하고, 구과실편의끝에돌기특징을갖는다 (Fu et al., 1999; Wang et al., 2000; Lee, 2003; Syring et al., 2005). 소나무과 (Pinaceae) 에대한분자계통학적연구로는 Wang et al. (2000) 이 matk, nad5, 4CL 유전자를마커로이용한소나무과 6속에대한연구를수행하여, 소나무속 111

112 Jeong-Ki Hong, Jong-Cheol Yang, You-Mi Lee and Joo-Hwan Kim (Pinus) 이가문비나무속 (Picea), 잎갈나무속 (Larix) 과함께분계조를형성하고, 전나무속 (Abies), 솔송나무속 (Tsuga), 개잎갈나무속 (Cedrus) 이함께분계조를형성하는결과를제시한바있다 (Fig. 1, D). 하지만 Wang et al. (2000) 의연구에서소나무속식물은 3 종만이포함되어소나무속에대한정확한계통분류학적검토는이루어지지못하였다. 한국산소나무속을포함한소나무속의계통학적연구로는 rbcl, matk, trnv 등을마커로활용한 Wang et al. (1999) 의연구중에한국산소나무속 8 종 [ 곰솔 (P. Thunbergii Parl.), 구주소나무 (P. sylvestris L.), 소나무 (P. densiflora Siebold & Zucc.), 스트로브잣나무 (P. strobus L.), 잣나무 (P. koraiensis Siebold & Zucc.), 눈잣나무 (P. pumila (Pall.) Regel), 섬잣나무 (P. parviflora Siebold & Zucc.), 백송 (P. bungeana Zucc. ex Endl.)] 이포함되어다루어진바있다. 이후 Gernandt et al. (2005) 이 rbcl 과 matk 를마커로활용하여, 우리나라에분포하는것으로알려진소나무속 20 종중 12 종 [ 풍겐스소나무 (P. pungens Lamb.), 리기다소나무 (P. ridida Mill.), 테에다 Fig. 1. Strict consensus tree based on the combined chloroplast DNA [psba-trnh+atpf-h] region sequences of Pinus (CI = 0.934, RI = 0.956). Bootstrap value are presented on the branches. a: two needle leaves, b: needle leaves, c : three to five needle leaves. 소나무 (P. taeda L.), 방크스소나무 (P. banksiana Lamb.), 곰솔, 구주소나무, 소나무, 잣나무, 눈잣나무, 섬잣나무, 스트로브잣나무, 백송 ] 이포함된계통학적연구를수행하였다. 이러한유전분석을통한소나무속의계통연구들은 (Wang et al., 1999; Gernandt et al., 2005) 이전의형태형질연구 (Richardson, 1998) 에의해구분되어진두개의유관속을갖는그룹과 (subgenus Diploxylon) 한개의유관속을갖는그룹 (subgenus Haploxylon) 에대한연구결과를지지한다. 국내에서연구된소나무속의분류에있어서는 Min (1995) 이침엽의단면과화분의해부학적특징을기준으로소나무과 6속 ( 소나무속, 전나무속, 가문비나무속, 잎갈나무속, 개잎갈나무속, 솔송나무속 ) 의분류학적연구를수행하였는데, 소나무속에서해송 ( 곰솔 ), 방크스소나무, 육송 ( 소나무 ), 그리고리기다소나무가소나무아속에포함되어졌고, 잣나무, 눈잣나무, 섬잣나무, 그리고스트로브잣나무가잣나무아속에포함되었으며, 백송은어느아속에도속하지못하는결과가나타났다. 이후 Lee (2003, 2004, 2008) 는형태학적특징을기준으로소나무아속과잣나무아속으로구분하였는데, 소나무아속은아린이잎과같이떨어지고, 잎의횡단면의관다발이 2개라는특징으로, 잣나무아속은아린이잎이자란다음떨어지고, 잎횡단면의관다발이 1개라는특징으로구분하였다. 그의연구결과에따르면소나무아속에는테에다소나무, 리기다소나무, 곰솔, 만주곰솔 (P. tabuliformis var. mukdensis Uyeki), 구주소나무, 소나무, 방크스소나무, 풍겐스소나무가포함되고, 잣나무아속에는잣나무, 눈잣나무, 섬잣나무, 스트로브잣나무, 백송이포함된다. 이는 Min (1995) 의결과와유사하였으나, 백송을두아속어디에도포함시키지못한것과는달리백송을잣나무아속에포함시킨명확한차이점을보여주었다. Kim (2008) 은침엽의외부형태와기공의형태에따른소나무속의분류학적연구를통해소나무속을 Lee (2003, 2004, 2008) 와마찬가지로잣나무아속과소나무아속으로분류하였다. 상기한연구등이한국산소나무속을대상으로한분류학적연구의대부분이고, 한반도에서이루어진연구에서는소나무과식물의수종별분포도, 수형적인특성, 침엽의형태및목질의특성등의분포조사및형태학적특성을조사하는연구가대부분으로 (Nakai, 1909, 1911; Uyeki, 1926; Yim and Kim, 1975; Yim and Kwon, 1976; Yim et al., 1977; Yim and Lee, 1978; Yim and Lee, 1979; Kim et al., 1981; Kim and Kil, 1983; Lee, 1986), 한국산소나무속에대하여서는현대적계통학적연구방법을이용한분류학적검토는이루어진바없다. 또한, 나자식물의분자계통학적연구에엽록체 DNA rbcl, matk, trnv, nad5 등의분자마커가주로이용되었으나, 본연구에서분자마커로활용한엽록체 DNA atpf-h, psba-trnh region을이용한계통학적연구는수행된바없

Molecular phylogeny of Korean Pinus 113 Table 1. The List of taxa, voucher information, and accession numbers for plant materials used in this study. Taxa Voucher No. atpf-h psba-trnh Pinus densiflora f. densiflora 소나무 S-H Park, 71828 (KH) KJ661347 KJ661365 P. densiflora f. congesta 여복송 K-S Kim, 110033 (KH) KJ661354 KJ661372 P. densiflora f. erecta 금강소나무 J-K Hong, 120017 (KH) KJ661355 KJ661373 P. densiflora f. multicaulis 반송 K-S Kim, 110064 (KH) KJ661356 KJ661374 P. densiflora f. pendula 처진소나무 J-K Hong, 120023 (KH) KJ661357 KJ661375 P. koraiensis 잣나무 ANH0410211 (KH) KJ661350 KJ661368 P. parviflora 섬잣나무 G-H Lee, 9-11 (KH) KJ661358 KJ661376 P. pumila 눈잣나무 K-S Kim, 110118 (KH) KJ661359 KJ661377 P. thunbergii 곰솔 NGH50470 (KH) KJ661349 KJ661367 P. banksiana 방크스소나무 J-K Hong, 120001 (KH) KJ661353 KJ661371 P. bungeana 백송 s.n. KJ661352 KJ661370 P. rigida 리기다소나무 Park, SH 70429 (KH) KJ661348 KJ661366 P. rigida X P. taeda 리기테다소나무 J-K Hong, 110157 (KH) KJ661360 KJ661378 P. strobus 스트로브잣나무 K-S Kim, 110076 (KH) KJ661361 KJ661379 P. sylvestris 구주소나무 Su, Youngwoo s.n (KH). KJ661351 KJ661369 P. tabuliformis 흑송 Zhang Xi Liang 22 (KH) KJ661362 KJ661380 P. taeda 테다소나무 K-S Kim, 110030 (KH) KJ661363 KJ661381 Larix kaempferi 일본잎갈나무 NAPI-20090377 (KH) KJ661364 KJ661382 : native plants, : introduced plants 으며, CBOL Plant Working Group (2009) 이 38 분류군의나자식물을포함한육상식물 (land plants) 에대한 DNA barcoding 연구에서 atpf-h, psba-trnh 를포함한 7 개분자마커의활용성정도를확인하는연구가이루어진사례가있을뿐이다. CBOL Plant Working Group (2009) 의연구결과에의하면, 그동안나자식물의분자계통학적연구에널리이용된 matk, rbcl 이각각 66% 와 61% 의계통학적해상력을제공하는것으로나타났고, 본연구에이용된 psba-trnh 는약 70%, atpf-h 는약 55% 의해상력을갖는것으로알려져있다. 따라서본연구는우리나라소나무속에대한 DNA atpf- H, psba-trnh region 의계통학적해상력을검토하고, 이를기초로우리나라에분포하는소나무속의정확한계통체계를정립하는것을목적으로하였다. 재료및방법 1. 연구재료국내에자생하거나도입되어식재되고있는소나무속 17 분류군에대하여국립수목원식물표본관 (KH) 에소장하고있는건조표본의침엽을실험재료로사용하였고, 중국산으로알려져있는백송 1 개체는직접채집한생체를이용하였다. 또한근연분류군으로써같은과에속해있는잎갈나무속 (Larix Mill.) 의일본잎갈나무 [Larix kaempferi (Lamb.) Carrire] 를군외군 (outgroup) 으로이용하였다. 본연구에서사용한식물재료의표본정보는 Table 1 에정리하였다. 2. DNA 추출 DNA 추출을위해확보된재료의잎을사용하였고, Total genomic DNA는 Doyle and Doyle (1987) 의 CTAB 방법을일부변경한 Kim et al. (2008) 과 Kim et al. (2009) 의방법을이용하여추출하였다. 건조된식물의잎 40 mg을조직분쇄기 (Tissue Lyser II, QIAGEN) 로분쇄하여 1.5 ml 튜브에옮긴후, 500 µl의 2X CTAB extraction buffer (2% Hexadecyl-trimethyl-ammonium bromide, 1.4 M NaCl, 20 mm EDTA, 100 mm Tris (ph 8.0), 5 µl의 0.2% β-mercaptoethanol) 와 20 mg의 PVP-40을넣고, 55 o C의 water bath에서 1~2시간중탕하였으며 10분마다꺼내어잘섞어주었다. 중탕후 500 µl의 SEVAC 용액 (chlorofom : isoamylalcohol = 24 : 1) 을넣어잘섞어준후, 4 o C 13,200 rpm (5415R, Eppendorf Co., Germany) 으로 10분간원심분리하였다. 원심분리후얻어진상등액을새로운 Eppendorf 튜브에옮긴후, 미리준비되어있는 7.5 M ammonium acetate를 0.08 volume 추가하고, 최종 volume의 0.54 volume 만큼의냉동보관된 isopropanol을추가하여 -70 o C deep freezer에서하루동안침전시켰다. 침전이완료된후, 13,200 rpm으로 3분간원심분리하여상등액을제거하였다. 남아있는 pellet에

114 Jeong-Ki Hong, Jong-Cheol Yang, You-Mi Lee and Joo-Hwan Kim 700 µl 의 alcohol (70%, -20 ) 을추가한후 13,200 rpm 으로 1 분간원심분리하여다시상등액을제거하고, 700 µl 의 alcohol (95%, -20 o C) 을추가하여 13,200 rpm 으로 1 분간원심분리하였다. 상등액을제거한 pellet 은실온에서 3 시간정도건조시켜여분의 alcohol 을제거한후, pellet 의양에따라 50~100 µl 의 1X TE buffer 를추가하여용해시켰다. 추출한 DNA 는 1% agarose gel 로전기영동하여추출여부를확인하였으며, 정확한 DNA 의농도는 GeneQuant pro (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. USA) 를이용하여결정하였다. 3. 염기서열분석지역본연구에서한국산소나무속의분자계통학적분석을위해엽록체 DNA atpf-h region, psba-trnh region 을이용하였다. 4. PCR을이용한유전자증폭반응유전자증폭을위한중합효소연쇄반응은 70-80 ng의정제된 template DNA, 1 unit Taq DNA polymerase (Solgent Co., Korea), 10 reaction buffer (100 mm Tris-HCl, ph 8.0, 500 mm KCl, 15 mm MgCl 2 ) 2.5 µl, 2.5 mm의 dntp (Solgent Co., Korea) 와양방향 primer (5 pmol/µl) 각각 0.5 µl에멸균된 3 차증류수를첨가하여최종 volume 25 µl의반응액으로실시하였다. 유전자증폭반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc., USA) 을사용하였으며, PCR 반응산물은 LoadingSTAR (DYN-EBIO Co., Korea) 와혼합된 PCR product를 1% agarose gel에서전기영동하여증폭여부를확인하였다. 각각의유전자지역을증폭하기위해사용한 primer의 sequence 등은 Table 2에정리하였다. 각유전자에따른 PCR 조건은다음과같다. atpf-h region : atpf(cbol Plant Working Group, 2009) 와 atph(cbol Plant Working Group, 2009) primer를이용하여 atpf-h region을증폭하였다 (Table 2). atpf-h의증폭은 94 o C에서 2분동안 pre-denaturation을시킨후, 94 o C에서 1 분의 denaturation, 55 o C에서 1분의 annealing, 72 o C에서 1분 Table 2. Sequences and reference of primers for amplifying and analyzing the sequences of the chloroplast DNA of atpf-h, psbatrnh region. Region Primer Sequences (5'-3') Reference atpf-h atpf ACTCGCACACACTC CCTTTCC atph GCTTTTATGGAAGCT TTAACAAT psba-trnh trnh CGCGCATGGTGGATT CACAATCC psba GTTATGCATGAACGT AATGCTC CBOL Plant Working Group (2009) 의 extension으로이루어지는 thermal cycle 과정을 40회반복하였으며, 마지막으로 72 o C에서 final extension 과정으로구성된 PCR을통해이루어졌다. psba-trnh region : trnh (CBOL Plant Working Group, 2009) 와 psba (CBOL Plant Working Group, 2009) primer를이용하여 psba-trnh region을증폭하였다 (Table 2). psba-trnh 의증폭은 94 o C에서 2분동안 pre-denaturation을시킨후, 94 o C에서 1분의 denaturation, 64.5 o C에서 1분의 annealing, 72 o C에서 1분의 extension으로이루어지는 termal cycle 과정을 40회반복하였으며, 마지막으로 72 o C에서 final extension 과정으로구성된 PCR을통해이루어졌다. 5. PCR product의정제와염기서열결정 PCR products는 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, USA) 를이용하여공급자의매뉴얼에따라정제하였으며, 정제된 PCR products를 cycle sequencing 반응의주형으로사용하였다. Cycle sequencing 반응은 BigDye Terminator V3.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc. USA) 를사용하여 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems Inc. USA) 에서공급자의메뉴얼에따라실시하였다. Post reaction clean-up 과정은 Montage SEQ96 sequencing reaction cleanup kit (Millipore Corporation, Bedford, MA) 를이용하여공급자의메뉴얼에따라정제하였다. 염기서열의분석 (sequencing) 은 ABI 3700 automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc. USA) 를이용하였다. 6. 염기서열정렬과계통수구축 Sequencing 된각유전자의염기서열은 Sequencher (ver. 4.5, Gene Codes. USA) 를이용하여조합 (assembly) 하였다. 염기서열의분석을위하여 Clustal X program (ver. 1.83, Thompson et al., 1997) 을이용하여일차적으로염기를정렬시킨후, 최종적으로나안으로직접염기서열을수정하여확인하였다. PAUP* program (ver. 4.0b10, Swafford, 2002) 을이용하여 Uncorrected pairwise distance 로각분류군들사이의염기변이양상을분석하였다. 계통수구축을위하여형질에있어서가중치는모두동일하게처리하였고, 전체염기서열중 gap 은모두결여형질 (missing character) 로처리하였으며, 정렬된염기서열의모든 character 는 unordered, unweighted character 로설정하였다. PAUP* 에의해가장짧은경로를가지는계통수를산출하기위해 heuristic search 를통해최대절약분석 (maximum parsimony analysis) 을실시하였으며, Bootstrap 분석 (Felsenstein, 1985) 을 1,000 회반복하여계통도가지의지지도를확인하고자 Bootstrap value 를산출하였다. Maximum likelihood analysis 는 GTR+I+Γ 모델을적용하여 RAxML BlackBox(http://phylobench.vital-it.ch/raxml-bb/) 를이용하였다.

Molecular phylogeny of Korean Pinus 115 결 과 염기서열변이양상엽록체 DNA atpf-h region 의염기서열변이 : 17 분류군에대한 atpf-h region 을분석하였으며, 557 bp 의염기 site 로정렬된자료행렬을이용한계통학적분석결과, 전체염기서열중 510 bp 는일정하고, 47 bp 는변이가있었으며, 이중 25 bp 가계통학적으로유용한형질이었다. 분석구간의 G+C 함량은 35.6% 였다 (Table 3). 엽록체 DNA psba-trnh region 의염기서열변이 : 17 분류군에대한 psba-trnh region 을분석하였으며, 687 bp 의염기 site 로정렬된자료행렬을이용한계통학적분석결과, 전체염기서열중 620 bp 는일정하고, 67 bp 는변이가있었으며, 이중 23 bp 가계통학적으로유용한형질이었다. 분석구간의 G+C 함량은 38.7% 였다 (Table 3). 분자계통학적분석결과염기서열분석을통해얻어진자료행렬을기초로최단거리계통도를작성하였고, 각유전자별및유전자간조합분석을실시하였으며, 이를통해분류군간의계통학적유연관계를검토하고자하였다. 엽록체 DNA atpf-h region : 17 분류군에대한계통학적 분석결과 47 step 의 tree length 를갖는 3 개의 MP tree(ci, RI = 1.000) 가도출되었으며, 이를통해 Strict consensus tree 를작성하였다. Strict consensus tree 에서소나무속전체는 100% 의 BP 값으로강하게지지되었으나, 잣나무아속인잣나무가소나무아속과분리되지못하고소나무아속에포함되는결과를보여주었다 (Fig. 3, A). Table 3. Values and statistics of the data matrices. atpf-h (I) psba-trnh (II) (I+II) Number of taxa analyzed 17 17 17 Aligned length of sequences 557 687 1,244 Mean of G+C (%) 35.6 38.7 37.3 Number of informative site 25 23 48 Number of constant site 510 620 1,130 Number of variable site 47 67 114 Number of mostparsimonious trees 3 2 7 Tree length 47 68 122 Consistency index (CI) of MP tree 1.000 0.985 0.934 Retention index (RI) of MP tree 1.000 0.990 0.956 Fig. 2. ML tree based on the combined chloroplast DNA [psba-trnh+atpf-h] region sequences of Pinus. Bootstrap value are presented on the branches.

116 Jeong-Ki Hong, Jong-Cheol Yang, You-Mi Lee and Joo-Hwan Kim Fig. 3. Strict consensus trees based on the chloroplast DNA atpf-h (A) region and psba-trnh (B) region sequences of the Pinus. Bootstrap value are presented on the branches. 엽록체 DNA psba-trnh region : 17 분류군에대한계통분석결과 68 step 의 tree length 를갖는 2 개의유사한 MP tree(ci = 0.985, RI = 0.990) 가도출되었으며, 이를통해 Strict consensus tree 를작성하였다. Strict consensus tree 에서 atpf-h region 과마찬가지로소나무속전체가 100% 의높은 BP 값으로지지되었다. 또한소나무아속은 100%, 잣나무아속은 92% 의다소높은 BP 값에의해지지되는각각의분계조를형성하였다 (Fig. 3, B). 엽록체 DNA atpf-h 와 psba-trnh region 의조합분석 : 17 분류군에대한 1,244 개의염기 site 로조합된엽록체 DNA 분석결과, 122 step 의 tree length 를갖는 7 개의 MP tree(ci = 0.934, RI = 0.956) 가도출되었으며, 이를통해완전합의계통수 (Strict consensus tree) 를작성하였다. Strict consensus tree 에서방크스소나무가리기다소나무, 리기테에다소나무 (P. rigia Mill. X P. taeda L.), 테에다소나무와함께 57% 의 BP 값으로지지되는분계조를형성하였다는점과잣나무아속내에서의분지순서, BP 값등에서차이를보일뿐 psba-trnh region 에서의결과와유사한 topology 를형성하였다 (Fig. 1). ML tree 에서는각분계조를지지하는 BP 값의차이를제외하고전체적인 topology 는 strict consensus tree 와유사하였다 (Fig. 2). 고 찰 본연구에서마커로활용된 2 개유전자에대한분석결 과, 구과실편의끝에돌기가있다는공통형질을갖는소나무속이단계통군이라는것을일부지지하고있다. 또한 Fig. 1와 2에서제시된바와같이, 엽록체 DNA간조합분석 (psba-trnh + atpf-h region) 에서제시된분류군간의계통학적유연관계는이전에수행되어진소나무속에대한분자계통학적연구와대부분일치하였고, 속내에서소나무아속과잣나무아속이뚜렷이구분되는점또한이전의연구결과를지지하고있다 (Wang et al., 1999; Gernandt, 2005). 또한이번연구에사용된 atpf-h region 유전자가속내에서의분류보다는과내에서의분류군에적합하다고생각했을때, 소나무속은독립적인단계통군으로판단되어지며, 속내에서는소나무아속과잣나무아속으로뚜렷하게구분된다고생각된다. 지금까지소나무속내유연관계에대한연구는형태학적, 분자계통학적방법을통하여행하여졌으며, 대부분소나무속은소나무아속과잣나무아속으로구분된다는전반적으로유사한결과를도출해내고있다 (Min, 1995; Wang et al., 1999; Lee, 2003, 2004, 2008; Gernandt, 2005; Kim, 2008). 본연구결과 ( 소나무속내에서의계통유연관계를살펴보면 ), 소나무아속에서는소나무와구주소나무는 2년지의수피가불규칙적으로갈라지는형태적특징과본연구를통해이루어진분자계통학적연구결과, 두종은소나무아속내에서가장가까운분류군으로생각되며, 이는 rbcl, matk, trnv 등의마커를활용한소나무속의분자계

Molecular phylogeny of Korean Pinus 117 통연구를실시한 Wang et al., (1999) 과 rbcl, matk를마커로활용하여유라시아산소나무속의분자계통연구를실시한 Gernandt, (2005) 의연구결과와도일치한다. 리기다소나무 + 리기테에다소나무 + 테에다소나무 + 방크스소나무분계조는 57% 의다소낮은 BP에의해지지되었으나소나무, 구주소나무, 곰솔등과명확히구분되어지고, 리기다소나무 + 리기테에다소나무 + 테에다소나무분계조가 96% 의높은 BP값으로지지되어선행된연구결과들 (Wang et al., 1999; Gernandt, 2005) 과일치하였다 (Fig. 1). 잣나무아속의경우 atpf-h와 psba-trnh의조합분석에서잣나무아속이 65% 의다소낮은 BP에의해지지되었는데 (Fig. 1), 이는 atpf-h의분석결과잣나무가소나무아속으로포함되는결과에의한것으로생각되며, psba-trnh 의분석결과에서는잣나무아속이 92% 의높은 BP에의해지지되는분계조를형성하였다 (Fig. 3). 또한 psba-trnh에서의잣나무아속분계조는선행된여러분자계통학적연구결과들과도유사한결과를나타내고있다 (Wang et al., 1999; Gernandt, 2005). Min (1995) 의연구결과에서소나무아속과잣나무아속중어디에도포함되지않았던백송은본연구결과잣나무아속에포함되는것으로나타났다 (Fig. 1, 2). 백송은침엽이 3장씩속생하여 5엽인다른잣나무아속의식물들과차이가있지만유관속이 1개인특징으로잣나무아속과공통점을가진다. 이처럼백송은형태학적으로소나무아속과잣나무아속의중간형질을가지고있으며향후소나무속내두아속간의진화학적연구에중요한종으로판단된다. 본연구에서계통분석에이용된 2개의유전자는각각의분석결과가다소상이했다. 엽록체 DNA psba-trnh region은선행연구에비해계통학적으로유효한염기site 가상대적으로적음에도불구하고 (3.4%), 다른유전자들을이용한선행연구와유사한 topology를보이며소나무속의계통학적유연관계분석에서높은해상력을제공할수있을것으로나타났다. 반면, atpf-h region은 psba-trnh region에비해계통학적으로유효한 site가많았음에도불구하고 (4.5%) 소나무속내의유연관계를규명하는데있어서다소낮은해상력을제공하였다. 이는 CBOL Plant Working Group (2009) 의연구에서 psba-trnh region은 70%, atpf-h region은 55% 의해상력을가진다는결과와도유사한결과이다. 새로운분자마커를활용한본연구결과, 소나무속은뚜렷한단계통군으로생각되고, 한국산소나무속은소나무아속과잣나무아속으로구분하는것이타당하고, 소나무아속은소나무 + 구주소나무분계조, 곰솔, 만주곰솔의세그룹으로분류하는것이타당할것으로생각된다. psbatrnh region은나자식물의분자분류학적연구에있어서속수준의분석에다소유용한것으로나타났지만, 과수준에서더욱높은해상력을제공할수있을것으로생각되며, atpf-h region은과수준이나과이상의상위분류군분석에 유용할것으로생각된다. 또한, 향후본연구에포함되지않았던전세계에분포하는소나무속또는소나무과의분류군들을포함하는추가적인연구를수행하여이에대한더명확한결과가재검토되어야할것으로생각된다. 인용문헌 CBOL Plant Working Group. 2009. A DNA barcode for land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106 (31): 12794-12797. Chaw, S. M., A. Zharkikh, H. M. Sung, T. C. Lau and W. H. Li. 1997. Molecular Phylogeny of Extant Gymnosperms and Seed Plant Evolution: Analysis of Nuclear 18S rrna Sequences. Molecular Biology and Evolution 14: 56-68. Chaw, S. M., C. L. Parkinson, Y. Cheng, T. M. Vincent and J. D. Palmer. 2000. Seed plant phylogeny inferred from all three plant genomes: Monophyly of extant gymnosperms and origin of Gnetales from conifers. Proc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97 (8): 4086-4091. Fu, L-K., L. Nan, and R. R. Mill. 1999. Flora of China. Vol. 4. Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis. Pp. 11-25. Gernandt, D. S., G. Lopez, S. O. Garcia and A. Liston. 2005. Phylogeny and classification of Pinus. Taxon 54: 29-42. Helander, J. 2000. Phylogeny of Gymnosperms: Fact and Fiction. Gymnosperms, Gnetales, Coniferales, Pinaceae, Pinus, Abies. Poul Mollers Vej 7, Copenhagen. Kim, H. J. 2008. Systematic Studies on Stomatal Type of Genus Pinus. MS thesis. Sangji University. (in Korean) Kim, J. H. D.-K. Kim and J.-H. Kim. 2009. Genetic variation and relationships of Artemisia capillaris Thunb. (Compositae) by RAPD analysis. Korean Journal of Plant Resources 22 (3): 242-247. (in Korean) Kim, J. U. and B. S. Kil. 1983. A Study on the Distribution of Pinus thunbergii in the Korean Peninsula. Journal of Ecology and Environment 6(1): 45-54. (in Korean) Kim, Y.-H., K.-H. Tae and J.-H. Kim. 2008. Genetic variations and relationships of Persicaria thunbergii (Sieb. & Zucc.) H. Gross ex Nakai (Polygonaceae) by the RAPD analysis. Korean Journal of Plant Resources 21(1): 66-72. (in Korean) Kim, Y. S., S. C. Ko, and B. H. Choi. 1981. Distribution Atlas of plants of Korea (4) Atlas of Pinaceae in Korea. Korean Journal of Plant Taxonomy 11(1,2): 53-75. (in Korean) Korea National Arboretum and The Plant Taxonomic Society of Korea. 2007. A Synonymic List of Vascular Plants in Korea. Korea National Arboretum. Pocheon. (in Korean) Lee, T. B. 2003. Coloured Flora of Korea. Hyangmunsa. (in Korean)

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