한국산업보건학회지, 제27권제3호 (2017) ISSN 2384-132X(Print) ISSN 2289-0564(Online) Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 2017: 27(3): 193-200 https://doi.org/10.15269/jksoeh.2017.27.3.193 Original Article 환경오염원인납의신경독성에대한 NMDA 수용체길항제의보호효과 손영우 1 ㆍ임요섭 2 ㆍ서영미 3* 1 원광대학교의과대학산본병원, 2 순천대학교생명산업과학대학, 3 서남대학교간호학과 Protective Effect of NMDA Receptor Antagonist on the Neurotoxicity Induced by Lead as an Environmental Pollutant Young-Wo-Son 1 ㆍYo-Sup Rim 2 ㆍYoung Mi Seo 3* 1 Sanbon Hospital, School of Medicine, Wonkwang University 2 Department of Bioenvironmental Science, Sunchon National University 3 Department of Nursing Seonam University ABSTRACT Objectives: This study was performed to evaluate the neurototoxicity of the environmental pollutant lead acetate(la) and the protective effect of the D-2-amino-5-phosphonovaleric acid(apv), N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor antagonist on LA-induced cytotoxicity in cultured C6 glioma cells. Materials and Methods: For this study, cell viability in cultured C6 glioma cells was assessed by XTT assay and antioxidative effect, such as lactate dehydrogenase(ldh) activity, by LDH detection kit. Results: LA significantly decreased cell viability in a dose-dependent manner, and the XTT50 value was determined to be 33.3 um of LA. The cytotoxicity of LA was deemed highly toxic according to Borenfreund and Puerner's toxic criteria. The vitamin E antioxidant significantly increased cell viability damaged by LA-induced cytotoxicity in these cultures. For the protective effect of APV on LA-induced cytotoxicity, APV significantly increased not only cell viability, but also inhibition of LDH activity. From these results, it is suggested that oxidative stress is involved in the neurotoxicity of LA, and APV effectively protected against LA-induced cytotoxicity via an antioxidative effect as an inhibotory activity of LDH. Conclusions: Natural resources like APV may be putative therapeutic agents for the toxic diminution of environmental pollutants such as LA correlated with oxidative stress. Key words: cytotoxicity, environmental pollutant, oxidative stress, toxic diminution I. 서론납은오래전부터카드뮴이나수은과같이수질이나대기를오염시키는중금속류의환경독성물질로분류되어왔으며, 특히납독성은동물실험에서염색체의형태적변이를유발함으로써돌연변이원으로도잘알려져있다 (Tiffany et al., 1988). 그럼에도불구하고납은우리의일상생활에필요한축전지를비롯 하여장난감제조, 안료제조및페인트와같은산업공정의주원료로사용되고있으며그밖에도자동차부품이나염료제조에도유용하게사용되고있다 (Liu et al., 2000). 납은생태계의먹이사슬을통하여인체내에유입이되어지기도하나특히, 산업공정중에발생되는연기 (fume) 나분진에의한피부접촉이나호흡기계를통하여인체내에과량축적됨으로써각종부작용을유발한다 (Jung et al., 2014). 그러나독 *Corresponding author: Young Mi Seo, Tel: 063-620-0102, E-mail: dudn0408@naver.com Department of Nursing Seonam University, 439, Chunhayng-ro, Namwon-si, Jeollabuk-do, 55724 Received: September 1, 2017, Revised: September 13, 2017, Accepted: September 23, 2017 This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License(http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 193
194 손영우ㆍ임요섭ㆍ서영미 성이강하기때문에일단인체내과량이축적된경우, 납중독을유발함으로써심각한부작용을초래하게된다 (Son & Jung, 2012). 특히, 납은피부접촉이나호흡기를통하여인체내로유입된후혈류를통해조혈기능에손상을줄뿐아니라, 혈액-뇌장벽 (blood-brain barrier, BBB) 을통과하여뇌중독을유발한다는것은이미잘알려진사실이다 (Bressler et al., 1994). 납중독에대한임상적징후로는피로나기억감퇴를비롯하여위장장애, 정신적조증 (mania) 및반사소실등과같은현상을나타냄으로써조기진찰과빠른진단을통해치료하지않으면심각한후유증을초래한다 (Busselberg, 1991). 뇌조직중신경교세포 (neuroglial cell) 는납중독시가장빠르게활성화되어손상된뇌의회복을위하여가장먼저반응하는일차적인반응세포이다 (Chen et al., 2002). 특히, 신경교세포중별아교세포 (astrocyte) 는신경원에영양공급을비롯하여 BBB 관여및뇌손상시회복을위한활성세포로알려져있다 (Kim et al., 2013). 납을비롯한크롬이나수은과같은몇몇중금속류는이들이붕괴되는과정에서자유라디칼 (free radicals) 을발생시키지만 (Leonard et al., 2000) 항산화제에의하여방어되었다고보고되었다 (Jung et al., 2014). 산화적손상을유발하는자유라디칼은막의지질과산화사슬 (lipid peroxidation channel) 을촉진시킬뿐만아니라 (Hah et al., 2005), 칼슘채널과연관되어막표면에위치하고있는 N-methyl-D-aspatate(NMDA) 수용체를과활성시켜세포내로다량의칼슘이유입되어세포의퇴화나사멸을초래한다 (Jung, 2009). 세포내로유입된칼슘은 calcium-mediated intercellular free radicals를생성하여세포고사를더욱촉진시킨다 (Pellegrini-Giampietro et al., 1990). 또한, 자유라디칼은흥분성아미노산 (excitatory amino acids, EAAs) 의분비를촉진시켜그결과 NMDA 수용체를과활성시켜결국세포를고사시킨다 (Zeman et al., 1994). 한편, NMDA 수용체길항제는 NMAD 수용체를과활성시키는 EAAs와경쟁적으로작용하여수용체의과활성억제는물론이고이로인한세포내다량의칼슘유입을저지하여세포손상을방어한다 (Hah et al., 2005). 또한, 세포내칼슘유입을억제하는 NMDA 수용체길항제는칼슘증가에대응하는세포내자유라디칼의생성을억제하여산소자유기제거제와같은역할을하기도한다. 그러나납과같은 중금속의독성을산화적손상과관련하여 NMDA 수용체측면에서접근한연구는흔하지않으며더욱이세포배양을방법으로하는연구는소수에불과하다 (Ha et al., 2003). 세포배양의기법은줄기세포를비롯한각종세포종을배양하여병변의모델제작이나또는치료적목적을위해유용한도구로활용하고있다. 배양세포는생체세포에서처럼화학적, 물리적특성을그대로간직하고있어생체에서와동일한실험효과를가지고있다. 또한, 동일세포들로구성되어세포수도많고성질이균일해서여러번반복실험이가능하다는장점이있다 (Choi et al., 2001). 따라서본연구는환경오염원인납에대한신경독성을완화내지는경감할수있는물질의탐색을위하여별아교세포종인배양 C6 glioma 세포를재료로초산납 (lead acetate, LA) 의독성을산화적손상측면에서분석하였으며이와동시에납독성에대한 NMDA 수용체길항제인 APV(D-2-amino-5-phosphonovaleric acid) 의영향을조사하였다. Ⅱ. 연구방법 1. 세포주본실험에사용한대뇌신경교세포인 C6 glioma 세포주 (American Type Culture Collection, Rockville, U.S.A., CCL 107) 를분양받아사용하였다. 2. 약제제조본실험에사용한시약으로 LA를비롯한 trypsin, vitamin E(Vit. E), phosphate buffered saline(pbs), D-2-amino-5-phosphonovaleric acid(apv), dimethylsulfoxide (DMSO), methanol, ethanol, hydrogen peroxide(h 2 O 2 ) 는 Sigma사 (St Luios. MO, U.S.A.) 에서구입하였다. LA의제조는 fetal bovine serum(fbs, Gibco, BRL, Grand Island, NY, U.S.A.) 이없는 minimum essential medium(mem, Gibco Rockville, MD, USA) 을사용하여각각 10 um, 50 um, 100 um 및 150 um의저장액을만들어실험전까지냉암소에보관한다음실험당일필요에따라최종농도로희석한후본실험에사용하였다. 2,3-bis-[2-methoxy-4- nitro-5-sulfophenyl]-2htetrazolium-5-caboxanilide, disodium salt(xtt, Sigma http://www.kiha.kr Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 2017: 27(3): 193-200
환경오염원인납의신경독성에대한 NMDA 수용체길항제의보호효과 195 Chemical Company, St. Louis, MO, U.S.A.) 는 PBS를이용하여 50 ug/ml의저장액을만든후필요한양을직접배양액에첨가하여사용하였다. 3. 세포배양 C6 glioma 세포의배양은 Park et al.(1996) 의방법에따라배양용기에부착된세포를세포해리술에의해 0.025% trypsin을사용하여분리하였다. 분리된세포들은원심분리후 10% FBS가함유된 MEM 배양액에넣고 1 x 10 5 cells/well이되도록조절한후배양용기 (96-well) 에분주하였다. 분주된세포들은 36, 5% CO 2 로일정하게조절된배양기 (incubator) 내에서 72시간동안배양하였다. 4. 초산납 (LA) 처리배양중인 C6 glioma 세포에 LA가 20 40 um 농도로각각함유된배양액에서세포를 48시간동안배양한후세포생존율에의하여대조군과비교조사하였다. 5. NMDA 수용체길항제 (APV) 처리배양중인 C6 glioma 세포에 APV가 60 um과 90 um 농도로각각함유된배양액에서세포를 2시간동안전배양한후세포생존율에의하여대조군과비교조사하였다. 농도별로처리한다음실험당일제조한 XTT(50 ug/ml) 를 well당 20 ul씩넣고 36 로조절된항온기에서 4시간동안배양하였다. 배양완료후 DMSO를넣어실온에서정치한다음 ELISA reader로 450 nm 에서흡광도를측정하였다. XTT 50 값은회귀직선식 (regression equation) 에의하여산출하였다. 9. Lactate dehydrogenase(ldh) 활성측정배양세포에 LA나길항제를각각처리한다음배양액을 250 x g에서 10분동안원심분리시켰다. 원침완료후 50 ul의상등액을취한다음 LDH CytoTox detection kit(asan Co. Seoul, Korea) 의반응액 (0.05 U/ml) 50 ul를넣은다음실온에서 30분동안방치하였다. 반응후 ELISA reader로 490 nm에서흡광도를측정하였다. LDH 활성은대조군에대한백분율로표시하였다. 10. 통계처리실험결과는 SPSS/WIN 18.0을사용하였으며 mean± SD로표시하였다. 실험결과에대해 one way ANOVA test를행하였으며, 사후분석은 Tukey HSD로하였다. 또한, p-value가 0.05 미만의경우를유의한것으로하였다. Ⅲ. 결과 6. Vit. E의항산화활성측정 Vit. E의항산화활성을조사하기위하여활성산소의일종인 H 2 O 2 20 um를배양세포에처리하기 2시간전에 Vit. E가 30 50 um 농도로각각포함된배양액에서세포를처리한다음세포생존율에의하여대조군과비교조사하였다. 7. LA에대한 Vit. E의영향 XTT 50 농도의 LA를배양세포에처리하기 2시간전에 Vit. E가 40 um과 50 um로각각포함된배양액에서세포를배양한다음세포생존율에의하여대조군과비교조사하였다. 8. 세포생존율분석세포생존율의분석은 Mosmann(1983) 의방법에따라행하였다. 즉, 배양세포에약제나시료추출물을 1. LA의독성효과 LA의농도에따른독성분석결과는 Table 1과같다. 대조군의세포생존율은 0.47±0.02, 20 um LA는 0.34±0.03, 30 um LA는 0.26±0.02, 그리고 40 um LA는 0.20±0.02로농도에의존적으로세포생존율이유의하게감소되어세포독성이있는것으로나타났다 (p<0.000). 또한, 이처리과정에서 XTT 50 값은 33.3 um 에서나타났다. 사후검정결과 40 um LA, 30 um LA, 20 um LA의순으로독성이높은것으로나타났다. 2. Vit. E의항산화활성측정아무런처치를하지않은대조군에비하여 20 um H 2 O 2 만을처리한경우세포생존율이 43.2%(0.16±0.02) 로나타난반면, 30 um, 40 um, 50 um의 Vit. E의처리에서는각각 70.3%(0.26±0.01), 75.7%(0.28±0.03), 86.5% (0.32±0.03) 로나타났다 (p<0.000). 20 um H 2 O 2 에대한 Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 2017: 27(3): 193-200 http://www.kiha.kr/
196 손영우ㆍ임요섭ㆍ서영미 Table 1. The cell viability of LA on cultured C6 glioma cells by XTT assay (LA * )Group 20LA b 30LA c 40LA d * LA: Lead acetate, p<.000 XTT assay(450nm) 0.47±0.02 0.34±0.03 0.26±0.02 0.20±0.02 189.58.000 a>b>c>d Table 2. The antioxidative activity of Vit. E on the H 2O 2 in cultured C6 glioma cells (Vit. E * )Group 20H 2O 2 b 30 Vit.E c 40 Vit.E d 50 Vit.E e XTT assay(450nm) 0.37±0.04 0.16±0.02 0.26±0.01 0.28±0.03 0.32±0.03 * Vit. E: vitamin E, H 2O 2: Hydrogen peroxide. p<.000 73.57.000 a>e>cd>b Vit. E의항산화활성의사후검정결과 50 um Vit. E, 30 um Vit. E와 40 um Vit. E, 20 um H 2 O 2 순으로높은것으로나타났으며, 30 um Vit. E와 40 um Vit. E의항산화활성은차이가없었다 (Table 2). 3. LA에대한 Vit. E의영향 XTT 50 농도의 LA만의처리에서는세포생존율이대조군에비하여 43.8%(0.07±0.02) 로나타난것에비하여 40 um과 50 um의 Vit. E의처리에서는각각 68.8%(0.11±0.02) 와 75.0%(0.12±0.02) 로나타났다 (p<0.000). LA에대한 Vit. E의항산화능의사후검정결과 40 um Vit. E, 50 um Vit. E, 20 um H 2 O 2 순으로높은것으로나타났으며, 40 um Vit. E와 50 um Vit. E의항산화능은차이가없었다 (Table 3). 4. LA의세포독성에대한 APV의영향 APV가 LA의세포독성에미치는영향을조사하기위하여배양세포에 XTT 50 농도의 LA를처리하기전 Table 3. The effect of Vit. E on the cytotoxicity induced by LA in cultured C6 glioma cells (Vit. E * )Group LA b 40 Vit.E c 50 Vit.E d * Vit. E: vitamin E, LA: Lead acetate. p<.000 XTT assay(450nm) 0.16±0.02 0.07±0.02 0.11±0.02 0.12±0.02 33.41.000 a>cd>b Table 4. The protective effect of APV on LA-induced cytotoxicity in cultured C6 glioma cells (APV * )Group LA b 60 APV c 90 APV d XTT assay(450nm) 0.25±0.02 0.10±0.03 0.17±0.02 0.18±0.03 * APV: D-2-amino-5-phosphonovaleric acid, LA: Lead acetate. p<.000 56.04.000 a>cd>b http://www.kiha.kr Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 2017: 27(3): 193-200
환경오염원인납의신경독성에대한 NMDA 수용체길항제의보호효과 197 Table 5. The LDH activity of APV measured wavelength of 490 nm (APV * )Group LA b 60APV c 90APV d XTT release(490nm) 0.32±0.02 0.46±0.06 0.39±0.05 0.30±0.02 * APV: D-2-amino-5-phosphonovaleric acid, LA: Lead acetate. LDH: lactate dehydrogenase, p<.000 24.81.000 b>c>ad Figure 1. C6 glioma cell were pretreated 60 um/ml and 90 um APV for 2 hours. The data indicate the mean±sd for triplicate experiments. Significantly different from the positive control(la) Figure 2. C6 glioma cell were pretreated 60 um/ml and 90 um APV for 2 hours. The data indicate the mean±sd for triplicate experiments. Significantly different from the positive control(la) 에 60 um과 90 um의 APV를각각처리한결과는다음과같다 (Table 4, Figure 1). LA만의처리에서는세포생존율이대조군에비하여 40.0%(0.10±0.03) 로나타난데비하여 60 um APV 처리에서는 68.0%(0.17± 0.02) 로나타났으며, 또한 90 um APV 처리에서는 72.0%(0.18± 0.03) 로나타났다 (p<0.000). 세포생존율의사후검정결과 60 um APV와 90 um APV, LA 순으로높은것으로나타났으며, 60 um APV와 90 um APV의항산화능력은차이가없었다. 5. LDH 활성측정 LDH 활성을조사하기위하여 XTT 50 농도의 LA를배양세포에처리하기전에 60 um과 90 um의 APV를각각전처리한결과는다음과같다 (Table 5, Figure 2). LA만의처리에서는 LDH 활성이대조군에비하여 143.8%(0.46±0.06) 로나타난데비하여 60 um APV 처리에서는 121.9%(0.39± 0.05) 로나타났다. 또한 90 um APV 처리에서는 LDH 활성이 93.8%(0.30±0.02) 로나타났으며, 모두 LA만의처리에비하여유의한감소를보였다 (p<0.000). 또한사후검정결과 90 um APV, 60 um APV, LA 순으로세포막손상방어율이높은것으로나타났다. 대조군과 90 um APV의세포막손상방어율은차이가없었다. Ⅳ. 고찰환경오염원중납을비롯한수은이나크롬과같은중금속들은독성이매우강하기때문에이들에의해중독될경우치명적인손상을초래함은이미잘알려진사실이다 (Leonard et al., 2000). 따라서, 이들독성에대한정량적분석이나기전규명이이들의중독으로부터예방이나치료적측면에서매우중요한관심의대상이되었다. 따라서, 본연구에서는환경오염원의하나인초산납 (LA) 의신경독성을배양 C6 glioma 세포를 Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 2017: 27(3): 193-200 http://www.kiha.kr/
198 손영우ㆍ임요섭ㆍ서영미 대상으로정량분석하였다. 본실험에서 LA의 XTT 50 값은 33.3 um에서나타남으로써 Borenfreund & Puerner (1984) 에의한독성판정기준에따라고독성 (highlytoxic) 으로나타났다. 이들의약제독성판정규정은 XTT 50 값이 100 um 이하인경우고독성, 100~1,000 um인경우중간독성 (mid-toxic), 1,000~2,000 um 범위인경우저독성 (lower-toxic), 2,000 um 이상인경우무독성 (non-toxic) 으로각각판정한다. 본연구결과는 Jung et al.(2014) 이 NIH3T3 배양세포에 LA를처리한결과세포독성을나타냈다는연구결과와 Son & Jung (2012) 이배양대뇌신경교종세포에서 LA가세포독성을나타냈다는보고와도일치함을알수있었다. 이같이 LA가배양 C6 glioma 세포에독성을보인것은 LA 가세포내의단백합성이나핵산물질의합성을방해하면세포의성장이나분화를저해하여세포생존율에영향을미쳤을가능성을생각할수있으나 (Kern et al., 1993), 그보다 LA에의한산화적손상으로 EAAs의분비가촉진되고 NMDA 수용체가과활성화된다는근거를고려해볼때 (Zeman et al., 1994), Lim et al.(1995) 의 Ca 2+ -chelator가산화적손상을방어하였다는보고와같이 LA에의한산화적손상에의해분비된 EAAs 가세포내칼슘채널에영향을미침으로써세포손상을유발하였을가능성이클것으로사료된다 (Busselberg et al., 1991). 이와동시에 Ca 2+ 로매개되는세포내자유라디칼의생성억제에도영향을주었을것으로생각된다 (Pellegrini-Giampietro et al., 1990). 한편, 납의독성이산화적손상과관련이있다고제시되면서항산화측면에서독성을치료하려는연구가시도되고있다 (Jung et al., 2014). 따라서, 본연구에서는이를위하여먼저 vitamin E의항산화능을조사하였다. 본실험의결과에서 Vit. E의처리가 H 2 O 2 만의처리에비하여세포생존율이유의하게증가한것은 Vit. E가높은항산화능을가지고있음을증명하고있다. 본연구결과는 Kim & Jekal(2016) 이 Vit. E와같은항산화제의일종인 BHT가 H 2 O 2 에대하여높은항산화능을보였다고보고한연구결과와도서로상통함을알수있었다. 위의분석과관련하여납의독성과산화적손상과의연관성을조사하기위하여 vitamin E를 LA 처리전에배양세포에전처리한후세포생존율을조사하였다. 본연구결과 Vit. E 처리가 LA만의처리에비 하여세포생존율이유의하게증가한것은 Vit. E에의하여 LA의세포독성이방어된것을의미하며, LA 의세포독성에산화적손상이관여하고있음을제시하는것으로판단된다. 본결과는 Jung et al.(2014) 이배양 NIH3T3섬유모세포를대상으로한연구보고와도일치하였다. 한편, 본연구결과 LA의신경독성에대한 NMDA 수용체길항제인 APV가 LA의독성을방어했다. 이는 Ha et al.(2003) 이 LA와같은중금속인메틸수은의세포독성을 APV가방어하였다는연구보고와도유사하였다. 또한 LA 독성에의해감소된세포생존율이 APV 에의하여유의한증가를나타낸것은 LA의독성이산화적손상과관련이있다는결과로판단된다. 따라서, 산화적손상이 EAAs를분비한다는연구보고 (Zeman et al., 1994) 와 EAA-dependent Ca 2+ -channel을고려해볼때 (Jung, 2009), LA의산화적손상에의해분비된 EAAs가 Ca 2+ -channel과관련이깊은 NMDA 수용체를과활성시키는것을 APV가방어함으로써세포내다량의칼슘유입이저해돼세포손상이유의하게감소된것으로판단된다. APV는 EAAs와경쟁적으로 NMDA 수용체에부착하여 EAAs에의해 NMDA 수용체가과활성되는것을효과적으로방어할수있다 (Jung, 2009). 세포내다량의칼슘유입은세포를과도히팽창시켜막손상을초래할뿐만아니라세포내 Ca 2+ 매개자유라디칼의생성을촉진함으로써이로인한세포내환경변화는물론, 막을통한정상적인물질수송의저해및막의지질과산화로인해세포는퇴화내지는사멸하게된다 (Buchan et al., 1994). 이에 LA의산화적손상으로유발된막손상에대한 APV의영향을알아보기위해 LDH 활성을조사하였다. LDH 활성은산화적손상으로야기되는막지질의산화정도를측정하는정량적인항산화능의분석방법의하나로알려져있다 (Han et al., 2001). 본연구결과에서 APV가 LA에의해증가된 LDH 활성을유의하게감소시킴으로써 LA에의한세포막의손상을효과적으로방어하였다. 이는 Jung(2009) 이산화적손상에의한 LDH 활성을 NMDA 수용체길항제인 CKA(7-chlorokynurenic acid) 가방어하였다는보고와유사함을알수있었다. 위의타연구나본연구의결과는 LA의산화적손상이 APV나 CKA 에의해막손상이방어된것을증명하고있다. 이는다시말해, LA의산화적손상에의한 EAAs의분비로 http://www.kiha.kr Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 2017: 27(3): 193-200
환경오염원인납의신경독성에대한 NMDA 수용체길항제의보호효과 199 야기되는 NMDA 수용체과활성을 APV가억제함으로써세포내칼슘유입을차단하여막의팽창은물론, Ca 2+ -dependent free radical 생성을저해하여결국 LA의산화적손상에의한지질과산화를 APV가방어한결과임을제시하고있다. 이상의결과는 NMDA 수용체길항제인 APV가 LA의독성을방어한것으로써이를더욱뒷받침하기위해서는 LA를처리한배양세포에서 APV와같은길항제의처리전과처리후에대한 glutamate 생성량을측정할 (Bakker et al., 1991) 필요성이요구된다. 또하나는 glutamate나 kainic acid와같은 agonist로배양세포를손상한후길항제의처리전과처리후의영향을측정하는것이다 (Kikuchi & Kim, 1993). 또한, 납은칼슘채널과밀접한관련이있어결국 NMDA 수용체와도연관되어있는것은잘알려져있다 (Busselberg et al., 1991). 그러나납독성과 NMDA 수용체길항제간의상호관계를자세히밝히기위해서길항제의처리전과처리후에대한세포내칼슘통로의측정을 glutamate 생성량과상호비교하여 NMDA 수용체의활성조사나자기영동, 면역세포염색법에의한수용체의발현정도를측정분석할 (Busselberg et al., 1991) 필요성이요구된다. 따라서추후연구에서는본연구에서추가요구되는실험이함께검증될수있기를제언한다. V. 결론환경오염원인 LA의신경독성과이에대한 NMDA 수용체길항제의영향을알아보기위하여배양대뇌신경교종세포인 C6 glioma 세포를대상으로 LA의독성을산화적손상측면에서조사하였으며, 또한 LA의세포독성에대한 APV의영향을분석하였다. 본실험에서배양 C6 glioma 세포에 20 40 um의 LA 농도각각을처리한결과, 처리농도에의존적으로세포생존율의감소양상을보였으며이는대조군에비하여유의하게감소하였다. 이과정중 LA의 XTT 50 값은 33.3 um로고독성 (highly-toxic) 인것으로나타났으며, 또한항산화제인 vitamin E는 LA의세포독성을효과적으로방어하였다. 한편, LA의세포독성에대한 APV의영향을조사한결과 LA에의하여감소된세포생존율을 APV는유의하게증가시켰으며, 또한 LDH 활성저해를보임으로써 LA의세포 독성을방어하였다. 위의결과로부터 LA의세포독성은산화적손상과관련이있으며, NMDA 수용체길항제인 APV는 LA의독성을효과적으로방어하는것을알수있었다. 따라서, APV와같은수용체길항제는산화적손상으로매개되는독성을칼슘채널측면에서차단하여세포손상을보호할수있어차후산화적손상과관련된독성을수용체수준에서방어할수있는물질의개발에대한기초적자료를마련하는데있어활용적가치가클것으로생각된다. 감사의글 이논문은 2016 학년도원광대학교의교비지원에의해수행됨 References Bakker MH, Mckernan RM, Wong EM, Foster AC. [ 3 H] MK-801 binding to N-methyl-D-aspartate receptors sloubilized from rat brain: Effects of glycine site ligands, polyamines, ifenprodil, and desipramine. J Neurochem 1991;57:39-45 Borenfreund E, Puerner JA. A simple quantitative procedure using monolayer culture for cytotoxicity assay (HTD/NR-90). J Tiss Cult Meth 1984;9(1):7-9 Bressler J, Forman S, Goldstein GW. Phospholipid metabolism in neural microvascular endothelial cells after exposure to lead in vitro. Toxicol Appl Pharmacol 1994;126:352-360 Buchan A, Gertler SZ, Li H, Xue ZG, Chaundy KE. A selective N-type Ca 2+ channel blocker prevent CA1 injury 24 hr following severe forebrain ischemia and reduces in fraction following focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 1994;14:903-910 Busselberg D, Evans ML, Rahmann H, Carpenter DO. Lead and zinc block a voltage-activated calcium channel of aplysia neurons. J Neurophysiol 1991;65:786-795 Busselberg D, Evans ML, Haas HL, Carpenter DO. Blockade of mammalian and invertebrate calcium channels by lead. Neurotoxicol 1993;14:249-258 Chen YJ, Yang BC, Hsieh WC, Huang BM, Liu MY. Enhancement of TNF-α expression does not trigger apoptosis upon exposure of glial cells to lead and lipopolysaccharide. Toxicol 2002;178:183-191 Choi YS, Ha DH, Jeong SJ, Lee JH, Kim SS, et al. Effects of acanthopancis cortex on osteo- blasts damaged by Journal of Korean Society of Occupational and Environmental Hygiene, 2017: 27(3): 193-200 http://www.kiha.kr/
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