요화학검사시약성능평가 시험방법가이드라인 ( 민원인안내서 ) 2018. 2 의료제품연구부의료기기연구과
지침서 ᆞ 안내서제 ᆞ 개정점검표 명칭요화학검사시약성능평가시험방법가이드라인 ( 민원인안내서 ) 아래에해당하는사항에체크하여주시기바랍니다. 이미등록된지침서ㆍ안내서중동일ㆍ유사한내용의 지침서ㆍ안내서가있습니까? 예 아니오 등록대상 여부 상기질문에 예 라고답하신경우기존의지침서ㆍ안내서의개정을우선적 으로고려하시기바랍니다. 그럼에도불구하고동지침서ㆍ안내서의제정이 필요한경우그사유를아래에기재해주시기바랍니다. ( 사유 : ) 법령 ( 법ㆍ시행령ㆍ시행규칙 ) 또는 행정규칙 ( 고시ㆍ훈령ㆍ예규 ) 의내용을단순편집또는 나열한것입니까? 단순한사실을대외적으로알리는공고의내용입니까? 1 년이내한시적적용또는일회성지시ㆍ명령에해당하는내용입니까? 외국규정을번역하거나설명하는내용입니까? 신규직원교육을위해법령또는행정규칙을알기쉽게정리한자료입니까? 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 상기사항중어느하나라도 예 에해당되는경우에지침서ㆍ안내서등록대상이아닙니다. 지침서ㆍ안내서제ㆍ개정절차를적용하실필요는없습니다. 지침서ㆍ안내서 구분 내부적으로행정사무의통일을기하기위하여반복적으로행정사무의세부기준이나절차를제시하는것입니까? ( 공무원용 ) 대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것입니까? ( 민원인용 ) 예 ( 지침서 ) 아니오 예 ( 안내서 ) 아니오 기타확인 사항 상위법령을일탈하여새로운규제를신설ㆍ강화하거나민원인을구속하는내용이있습니까? 예 아니오 상기질문에 예 라고답하신경우상위법령일탈내용을삭제하시고지침서ㆍ 안내서제ㆍ개정절차를진행하시기바랍니다. 상기사항에대하여확인하였음. 2018 년 2 월 7 일 담당자확인 ( 부서장 ) 이승노 김미정
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제 개정이력 요화학검사시약성능평가시험방법가이드라인 ( 민원인안내서 ) 제 개정번호승인일자주요내용 안내서 -0845-01 2018.02.07. 요화학검사시약성능평가시험방법 가이드라인 ( 민원인안내서 ) 제정
목 차 Ⅰ. 서론 2 1. 제품의개요 2 2. 품목분류체계 4 3. 적용규격및범위 5 Ⅱ. 용어정의 6 Ⅲ. 성능평가시험항목 10 Ⅳ. 성능평가시험방법 11 1. 검체및시약준비 11 2. 정밀도 14 3. 상관성 17 4. 민감도 20 Ⅵ. 참고문헌 25 Ⅶ. 붙임 26 1. 요화학검사시약원리 26 2. 성능평가기록지및평가표예시 28
서 문 요화학검사시약은요화학검사시사용되는시약으로, 요검사시험지 (Urine reagent strip) 를이용하여요당, 요단백, 요잠혈등 10여가지검사항목을검출하는체외진단의료기기이다. 요화학검사시약은개인이나병원에서비침습적방식으로널리사용되며의료현장에서중요한역할을하고있으나, 현재까지국내에서는성능을평가하기위한가이던스가마련되어있지않은상황이다. 이에식품의약품안전평가원에서는요화학검사시약의성능에대한시험방법가이드라인을개발을통해국내의료기기제조업체및시험검사기관에정보를제공하고관련의료기기산업의기술및품질향상에기여할목적으로, 국제조화된요화학검사시약의성능평가기준및시험법을제시하고자한다. 본가이드라인에서는미국 FDA Guidance 및유럽에서발간한 Guidance 를참조하였으며, 국제적으로합의된규격인 CLSI(Clinical & Laboratory Standards Institute) 의의료기기시험방법을반영하였다. 또한, 제조업체기술향상및의료기기시험검사기관의참고자료로사용될수있도록작성되어향후우리나라의료기기국제경쟁력향상을위한유용한평가도구가될것으로기대한다.
서론 1. 제품의개요 가. 정의 요 ( 소변, urine) 는혈액속의노폐물과수분이신장에서여과된후방광에저장되었다가요도를통하여신체밖으로배출되는체액이다. 요의구성물질은요소, 요산, 크리아틴, 아미노산등의신진대사물질과여러종류의유 무기염류및해독물질, 미량의비타민, 호르몬, 효소등이며, 신체에이상이생기면요성분의조성이변화한다. 색깔, 혼탁정도가변하거나단백질, 당, 적혈구, 세균, 백혈구등의이상물질또는세포들이요에출현한다. 요검사 (urinalysis) 는이러한요의물리화학적변화로부터신체일부의기능을평가하는검사로써건강상태에대한정보를조기에얻을수있으므로건강검진이나질병의진단시가장기초가되는중요한검사이다. 통상적으로요검사는크게물리적성상검사, 화학적검사, 요침사검사와같이 3종류의검사로구성이된다. 그중화학적검사는시험지를이용해요당, 요단백, 요잠혈등을반정량적으로검출하는검사로, 요화학검사시약 1) 은요검사시험지 ( 스트립 ) 를이용한화학적검사시사용되는시약이다. 일반적으로병원에서요검사라고부르는검사는물리적성상검사와요검사시험지를이용한화학적검사를의미한다. 요화학검사시약을이용한요검사는조작이간편하고용이하기때문에병원, 보건소등의각종의료기관에서건강검진, 임신중, 입원혹은수술전검사목적으로모든환자에게일차적으로시행하고있으며, 선별검사로널리이용되고있다. 1) 요화학검사시약은일반적으로요검사시험지위에도포되어사용되므로, 요검사시험지 ( 스트립 ) 또는 요시험지봉 으로부르기도한다. - 2 -
나. 구성 요화학검사시약 ( 요검사시험지 ) 은얇고긴플라스틱판위에요성분을검사할수있는차트가붙어있는형태로제작되며, 각차트에는해당성분의이상유무를판단할수있는시약이도포되어있다. 검사항목으로는잠혈 (Blood), 빌리루빈 (Bilirubin), 우로빌리노겐 (Urobilinogen), 케톤체 (Ketones), 단백질 (Protein), 아질산염 (Nitrite), 포도당 (Glucose), 산도 (ph), 비중 (Specific gravity), 백혈구 (Leukocytes), 비타민 C(Ascorbic acid) 등이있으며, 검사목적에따라 5~10개항목을검사한다. 요, 시험지 ( 스트립 ), 표준비색표만있으면간단히수행할수있으므로일반인도손쉽게검사할수있어자가재택검사도가능하며, 제품에부착된비색표를이용하여검사결과를육안판별한다. 최근에는검사결과의객관화를위해비색반응의결과를자동으로판별하는분석기기가국내외에서개발되고있으며, 거의모든병원검사실에서자동요화학분석기를사용하여검사결과를분석하고있다. [ 그림 1] 요화학검사시약 ( 요검사시험지 ) 및표준비색표 - 3 -
2. 품목분류체계 국내에서는식품의약품안전처고시제2017-6호 의료기기품목및품목별등급에관한규정 에따라대분류 D 체외진단용시약, 중분류 D03000 요또는분변검사용시약 의 D03010.01 요화학검사시약 (IVD reagents for urine chemistry) 으로분류된다. [ 표 1] 요화학검사시약의국내품목분류품목분류번호품목명등급품목설명 요화학검사시약 Urobilinogen, Protein, Glucose, Blood, Bilirubin, Ketone body, ph, 비중, D03010.01 IVD reagents for urine chemistry 2 아질산염, 백혈구등요화학검사시사용되는시약으로요를이용한마약및독성물질대사검사시약은제외 미국 FDA 의의료기기분류는미국연방규정집인 CFR 21(Code for Federal Regulation) Parts 862-992 에따라 ClassⅠ, ClassⅡ, ClassⅢ 의 3 가지등급으로구분되며, 요화학 검사시약은각검사항목별로품목분류되어요잠혈, 요당검사시약은 ClassⅡ, 그외 의검사시약은 ClassⅠ 으로분류되어있다. 요화학검사시약에해당하는품목분류는 아래 [ 표 2] 와같다. 품목코드품목명등급규제번호 JIO Occult blood test Ⅱ 21 CFR 864.6550 JIL Urinary glucose(non-quantitative) test system Ⅱ 21 CFR 862.1340 CDM Urinary urobilinogen(non-quantitative) test system Ⅰ 21 CFR 862.1785 JJB JIR [ 표 2] 요화학검사시약의미국품목분류 Urinary bilirubin and its conjugates (non-quantitative) test system Urinary Protein or albumin (non-quantitative) test system Ⅰ 21 CFR 862.1115 Ⅰ 21 CFR 862.1645 JIN Ketones(non-quantitative) test system Ⅰ 21 CFR 862.1435 NGJ Nitride(non-quantitative) test system Ⅰ 21 CFR 862.1510 LJX Leukocyte(non-quantitative) test system Ⅰ 21 CFR 864.7675 CEN Urinary ph(non-quantitative) test system Ⅰ 21 CFR 862.1550 JRE Specific Gravity Ⅰ 21 CFR 862.2800-4 -
3. 적용규격및범위 요화학검사시약의성능평가에적용가능한기준규격으로는국제진단검사표준및임상검사실품질협회 (Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 의체외진단용의료기기성능평가방법이있다. 이에따라 [ 표 3] 과같이 CLSI GP16-A3, Urinalysis; Approved Guideline, 3 rd Edition, CLSI EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline, 2 nd Edition, CLSI EP15-A3, User Verification of precision and Estimation of Bias; Approved Guideline, 3 rd Edition, CLSI EP17-A2, Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline, 2 nd Edition 을성능평가규격설정시참고할수있다. 이외에도제조자가품질요구사항에충족함을입증할수있는경우에는대체방법을사용해도된다. [ 표 3] 성능평가적용규격발행기관규격번호규격명발간일 Urinalysis; Approved Guideline, 3 rd Edition CLSI GP16-A3 This document addresses procedure for testing urine, including materials and equipment; macroscopic/physical evaluation; chemical analysis; and microscopic analysis. User Protocol for Evaluation of Qualitative Test 2009 Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI EP12-A2 CLSI EP15-A3 Performance; Approved guideline, 2 nd Edition This document contains a protocol that optimizes the experimental design for the evaluation of qualitative tests, to better measure performance and provide a structured data analysis. User Verification of precision and Estimation of Bias; Approved Guideline, 3 rd Edition This document describes the demonstration of method precision and trueness for clinical laboratory quantitative methods utilizing a protocol designed to be completed within five working days or less. 2008 2014 Protocols for Determination of Limits of Detection and CLSI EP17-A2 Limits of Quantitation, Approved Guideline, 2 nd Edition This document provides guidance for determination the lower limit of detection of clinical laboratory methods, for verifying claimed limits, and for the proper use and interpretation of the limits. 2012 본가이드라인은요화학검사시약 ( 요화학검사지 ) 에대한성능평가시험방법가이드 라인이다. 단, 1) 요검사와관련된질병진단에대한의학적측면을다루지않으며, 2) 진단검사실에서사용되는요화학분석기및검체에대한평가에는적용되지않는다. - 5 -
용어정의 본장의용어는이해를돕기위해사용되는것이므로단순참고용이다. 진단검사 (Diagnostic test) 특정질환의진단, 예방, 치료또는개개의환축에서의건강이나건강의손상정도를평가하기위한목적 * 진단적검체의측정또는검사를칭한다. 선별검사 (Screening test) 특정질환의증상이없어의학적주의를받지못하는동물들중에해당질환의고 위험군을발견하여추가적인관찰이나직접적예방활동을위한체계적인검사 정성분석 (Qualitative assay) 분석물질의농도가아니라단지분석물질이있고없음을알려주는검사시스템 * 양성검사결과는검사신호가분석역치를넘는것만을의미하고판단기준치 (cut-off value) 는진단민감도와특이도의인위적조합에의해구해진다. 반정량분석 (Semiquantitative assay) 정성검사법에반응강도의추가옵션을제공하는검사시스템. 검사법에의해검출된양성신호의변이는흔히증가되는정도 (titer, grade 또는 class) 로표현됨. * 임상검사에서는이방법을스크리닝에이용하며필요에따라서더욱더정확한정량법을행함. 분석물질 (Analyte) 검사실이수행하는검사의물질또는구성요소 대조물질 (Control / Control material) 체외진단용시약의성능을확인하기위해제조된물질 (substance), 재료 (material) 또는물건 (article) - 6 -
참고물질 (Reference material) 1) 하나또는그이상의특성값이충분히균일하고기구의보정, 측정방법의평가또는물질에값을할당하기위해서사용되는물질 2) 인증참고물질 (CRM) 은기술적으로입증된과정에의해공인되었고인증서나다른인증기관에의해발행된서류가있거나추적가능한하나또는그이상의값을갖는참고물질 a) 인증참고물질 (CRM) 은 인증서가있는참고물질로서하나또는그이상의특성값이절차에따라공인되며, 그절차는특성값이표현되는단위의정확한구현에대한추적을할수있고, 그것에대해각공인된값은신뢰의명시된수준에서의불확실성과함께한다 라고정의한다. b) 표준참고물질 (SRM) 은인증참고물질 (CRM) 의한이름으로서과거에국립표준원 (NBS) 으로알려졌던미국정부기관으로, 국립표준기술연구소 (NIST) 에의해인증되고배포되는인증참고물질의상품명이다. 시험회차 (run) 검사시스템의진도및정밀도가안정적일것으로예상되는구간. 그지속시간은 24시간을초과할수없음 * 어떤정성적특성에대한일련의관측에서, 동일한속성이중단되지않고연속해서발생하는경우를말함. 정밀도 (Precision) 규정된조건하에서얻어진독립적인검사결과들가운데일치도의근접성 * 정밀도는전형적으로수치로표현되지않지만비정밀도는반복측정값결과들의 표준편차 또는 변이계수 라는용어로정량적으로표현 반복성 (Repeatability) 동일한방법으로동일한측정대상을같은조건에서비교적짧은시간에반복 측정한경우, 개개의측정치가일치하는정도 - 7 -
실험실내정밀도 (within-laboratory precision) 동일한기관내에서동일한장비를사용하는한정된시간및조작자에대한 정밀도. 보정및시약은다를수있음. 재현성 (Reproducibility) 다른측정조건에서수행된동일한측정물의결과값사이의일치도의근접성 정확도 (Accuracy) 측정치와참값사이의일치도 * 평가대상검사법에의한다수의연속적인결과값들에서얻은평균값과공인된참고값 (accepted reference value) 사이의일치근접도 (closeness of agreement) 비정밀도 (Imprecision) 특별한조건하에서얻어진측정값의독립적결과들의분산 * 표준편차나변이계수등의숫자로표시된다. 양성일치율 (Positive percent agreement, PPA) 양성결과를보이는검사법이대조검사법과양성검사결과가일치하는비율 음성일치율 (Negative percent agreement, NPA) 음성결과를보이는검사법이대조검사법과음성검사결과가일치하는비율 진양성결과 (True-positive result / True positive, TP) 환자의질병 / 보균상태와검사의양성판정이일치하는결과 진음성결과 (True-negative result / True negative, TN) 환자의질병 / 보균상태와검사의음성판정이일치하는결과 위양성결과 (False-positive result / False positive, FP) 질병이나증상이없는상태에서이를시사하는양성검사결과 * 질환에이환되지않은개체에서비정상결과 - 8 -
위음성결과 (False-negative result / False negative, FN) 양성환자나양성검체에서의음성검사결과 검출한계 (Limit of detection, LoD) 주어진측정방법에의해검출될수있는분석물질의최소량으로서정성분석 에있어서키트에서양성으로구분하는측정가능한가장낮은농도 - 9 -
성능평가시험항목 요화학검사시약성능평가시험의주요항목은체외진단검사와관련된 CLSI 의 가이드라인을참고하였다. 성능평가시험항목은아래 [ 표 4] 에서제시하는예 시를참고하여품목의특성에따라업체에서자율적으로설정해도된다. 순번시험항목시험내용관련규격 1 정밀도 각검사항목측정결과의재현성평가 음성및양성표준물질을이용해검증 CLSI EP15-A3 2 상관성 참고요화학검사시약과평가요화학검사시약 간비교를통해측정값간동등성을분석하기 위한시험 CLSI EP12-A2 3 민감도 [ 최소검출한계 ] 주어진측정방법에의해검출될수있는분석물질의최소량 최소검출한계근처농도에서최소 20회이상반복측정시 95% 검출율을보이는최저농도측정 CLSI EP17-A2 [ 검출단계별감도 ] 각검사항목의검출단계별감도 (Sensitivity) 측정 검출단계농도의표준물질을제조하여최소 40회이상반복측정 CLSI EP12-A2-10 -
Ⅴ 성능평가시험방법 본장에서는요화학검사시약의국내외규격및가이던스를바탕으로성능평가를위한시험항목별시험방법에대해상세히설명하고자한다. 본가이드라인에서제시하는성능시험방법이외에도제조자가품질요구사항을충족함을입증할수있는경우에는대체방법을사용해도된다. 1. 검체및시약준비 1. 검체준비 1) 소변검체 1 적절한튜브나검체수집용기를이용하여검체를채취한다. * 비고 : 검체수집용기는잘세척되어깨끗하게건조된용기를사용해야한다. 2 채취한소변은수집후 2시간이내에검사를실시한다. * 비고 : 원심분리하지않은신선한소변검체를사용한다. 3 소변검체에보존제를첨가하지않아야한다. 4 소변검체를직사광선에노출시키지않아야한다. < 예시 1> 용기에채취한소변검체 - 11 -
주의사항 1) 소변수집후 2시간이내에검사를못할시에는 4 에서냉장보관하고사용전에잘섞어주어야한다. 2) 검사전소변을오랜시간방치하는경우, 박테리아증식및분해에서유발된암모니아로인한 ph 상승으로인해잘못된결과가나타날수있다. 3) 검체수집용기의미흡한세척, 세제잔량등에의해잠혈 (Blood), 포도당 (Glucose), 아질산염 (Nitrite) 등의시험지에서위양성결과를유발할수있다. 4) 산성환경에서붉게변하는특성을가진시약 ( 예 : 페나조피리딘 (phenazopyridine)) 은아질산염 (Nitrite), 단백질 (Protein), 유로빌리노겐 (Urobilinogen) 및빌리루빈 (Bilirubin) 시험에대하여위양성결과를유발하거나스트립을붉게착색시킬수있다. 5) 직사광선에검체를노출시키는경우, 유로빌리노겐 (Urobilinogen) 및빌리루빈 (Bilirubin) 의산화를유발시킬수있어노출시키지않도록주의한다. 직사광선에노출되어산화가일어나는경우, 유로빌리노겐 (Urobilinogen) 및빌리루빈 (Bilirubin) 의값이인위적으로낮게나타난다. 2) 정도관리물질상품화된정도관리물질또는제조사에서제공하는정도관리물질을이용한다. * 비고 : 정도관리물질은음성 (Negative) 및양성 (Positive) 농도의조건으로 2종또는 3 종으로구성된다. < 예시 2> 정도관리물질 [2 종으로구성된정도관리물질 ] [3 종으로구성된정도관리물질 ] - 12 -
2. 시약의준비 1) 요화학검사시약요화학검사시약을준비한다. * 비고 : 요화학검사시약의정상참고치 ( 임상적으로이상이없는수치 ) 는아래 [ 표 5] 에나타내었다. [ 표 5] 요화학검사시약의정상참고치 ( 예시 ) 검사항목 정상참고치 Glucose ( 포도당 ) 음성 (<30mg/ dl ) Blood ( 잠혈 ) 음성 (<5RBCs/ μl ) Protein ( 단백질 ) 음성 (<20mg/ dl ) Bilirubin ( 빌리루빈 ) 음성 (0.2mg/ dl ) Urobilinogen ( 유로빌리노겐 ) ± ~ 1+ (0.1~1mg/ dl ) Ketone ( 케톤체 ) 음성 (<5mg/ dl ) Nitrite ( 아질산염 ) 음성 Leukocytes ( 백혈구 ) 음성 (<10WBCs/ μl ) ph ( 산도 ) 5 ~ 7 Specific Gravity ( 비중 ) 1.005~1.030-13 -
2. 정밀도 1. 시험목적 동일한실험실에서동일자가일간반복성및재현성시험을수행하여측정 결과를해석한다. 2. 적용규격 [CLSI EP15-A3]: User Verification of precision and Estimation of Bias; Approved Guideline, 3 rd Edition 3. 시험조건 1) 검체의준비상품화된정도관리물질또는제조사에서제공하는정도관리물질을이용한다. * 비고 : 1 정도관리물질은음성 (Negative) 및양성 (Positive) 농도의조건으로 2종또는 3종으로구성된다 ([ 표 6] 참고 ). 2 제조사가제시한사용방법에따라정도관리물질을사용한다. [ 표 6] 정밀도시험을위한각검사항목의정도관리물질농도 ( 예시 ) 검사항목 / 농도 음성 (Negative) 양성 (Positive) Glucose( 포도당 ) Neg. 100 ~ 250mg / dl Blood( 잠혈 ) Neg. Moderate ~ Large Protein( 단백질 ) Neg. Trace ~ 100mg / dl Bilirubin( 빌리루빈 ) Neg. +(Small) Urobilinogen( 유로빌리노겐 ) 0.2 ~ 1mg / dl 2mg / dl Ketones( 케톤체 ) Neg. Trace Nitrite( 아질산염 ) Neg. Pos. Leukocytes( 백혈구 ) Neg. Trace ~ Moderate ph( 산도 ) 6.0 ~ 7.0 8.0 Specific gravity( 비중 ) 1.010 ~ 1.025 1.000 ~ 1.015-14 -
2) 시약의준비 요화학검사시약을준비한다. 4. 시험방법 1) 요화학검사시약및검체 ( 음성 (Negative) 및양성 (Positive) 농도 ) 를준비한다. * 비고 : 요화학검사시약은검사전까지포장이나용기에서미리꺼내지않는다. 2) 검사결과판정을위해제조사에서제공하는표준비색표를준비한다. 3) 음성 (Negative) 검체를요화학검사시약의시험부분에점적한다. * 비고 : 제조사에따라검체를점적하거나검체에요화학검사시약을담가서측정하기도하므로, 제조사가제시한방법에따라시험을수행한다. 4) 검체점적후과잉의검체는흡수지등에흡수시켜제거하고, 일정반응시간후각시험부분의발색정도를비색표와비교하여판정한다. * 비고 : 각검사항목마다발색반응시간의차이를보이므로각각의반응시간을준수하여발색정도를판정하도록한다. 5) 동일한검체를이용하여단계 3) ~ 4) 를반복수행한다. 6) 양성 (Positive) 검체를이용하여단계 3) ~ 5) 를수행한다. 7) 단계 1) ~ 6) 을일 2회 ( 오전, 오후 ) 수행한다. 8) 최소 5일간단계 1) ~ 7) 을반복할것을권장한다. 참고 1 일간 4 회 (2 번씩일 2 회 ( 오전 / 오후 )) 의측정결과를얻으므로 5 일간 20 회의측정결과를얻게된다. - 15 -
[ 참고 ] CLSI EP15-A3, User Verification of precision and Estimation of Bias(2014) < 정밀도성능의검증 > 1 일반사항 - 정밀도는일반적으로반복성 ( 시험회차내정밀도 ) 또는실험실내정밀도인것으로간주된다. - 반복성은모든측정이동일한조건에서 ( 또는단일시험회차내에서 ) 이루어질때일련의반복검증측정치사이의불일치를나타내는정량적인값이다. - 실험실내정밀도는측정오차에대한실험실내의모든알려진주요원인 ( 대규모유지보수, 재보정또는시약로트변경제외 ) 을고려했을때더긴시간에걸친반복검증측정치사이의불일치를나타내는정량적값이다. 실험실내정밀도에는오차에대한다양한원인 ( 반복성포함 ) 의누적이반영되어있다. 2 정밀도평가절차 - 5일동안매일두개의농도각각에서 3개의반복검증시료를통해하루에 1회의시험회차를분석한다. - 품질관리절차또는운영상의어려움으로인해한시험회차를수행하지못하는경우, 해당데이터를폐기하고추가적으로 1회의시험회차를실행한다. - 일반적으로사용되는일일품질관리시료를포함시킨다. - 진도실험을위한시료는동일한시험회차에서시험할수있다. - 제조자의조작자설명서에명시된것과같이보정한다. 제조자가여러번의보정주기에걸쳐정밀도데이터를생성했다는내용을주장에표시한경우, 조작자는재량에따라실험중에재보정을실행할수있다. 5. 결과제시 1) 각검사항목의검체별결과일치율을 % 로기재한다. 2) 평가에포함된검사실수, 검사자수, 수행일수, 수행횟수, 시약의 lot 등을제시한다. [ 표 7] 정밀도평가결과제시예시 ( 단위 : %) 검사항목 Blood Bilirubin Urobili nogen Ketones Protein Nitrite Glucose ph S.G Leuko cytes 음성 (Negative) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 양성 (Positive) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100-16 -
3. 상관성 1. 시험목적 참고요화학검사시약과평가요화학검사시약간비교를통해측정값간동 등성을분석하기위한시험이다. 2. 적용규격 [CLSI EP12-A2]: User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline, 2 nd Edition 3. 시험조건 1) 검체의준비환자소변검체를준비한다 * 비고 : 1 신선한소변검체를연령대나성별의구분없이고르게분포하도록선별수집한다. 2 각검사항목당최소 50개의양성및음성검체가포함되어야한다. [ 표 8] 검체의준비예시 [ 검체채취 ] 처음에나오는 30ml 가량의소변을흘려보내고중간뇨 (30~50ml 정도 ) 를용기에채취한다. [ 검체보관 ] 소변검체는채취후 2시간이내에검사를실시할것을권장한다. 2) 시약의준비참고및평가요화학검사시약을준비한다 * 비고 : 요화학검사시약은기판매중인요화학검사시약을참고검사시약으로준비하고, 평가할요화학검사시약을평가검사시약으로준비한다. - 17 -
4. 시험방법 1) 요화학검사시약및소변검체를준비한다. * 비고 : 요화학검사시약은검사전까지포장이나용기에서미리꺼내지않는다. 2) 참고요화학검사시약을이용하여소변검체를검사하고결과를판정한다. 1 소변검체에요화학검사시약을짧은시간동안담근다. 2 요화학검사시약을꺼내어과잉의검체를흡수지등에흡수시켜제거한다. 3 일정반응시간후각시험부분의발색정도를비색표와비교하여판정한다. * 비고 : 제조사별로반응시간의차이가있으며, 각검사항목마다발색반응시간의차이를보이므로, 제조사가제시한반응시간을준수하여발색정도를판정하도록한다. 3) 동일한검체를평가요화학검사시약을이용하여검사하고결과를판정한다. 4) 모든검체는 2시간이내에참고검사 ( 단계 2)) 및평가검사 ( 단계 3)) 를실시한다. 5) 최소 10일동안단계 1) ~ 4) 를반복수행할것을권장한다. 6) 상관성을평가하기위한최소한의지침으로, 각각의검사항목에서양성검체및음성검체가 50개이상얻어질때까지검사를지속할것을권장한다. [ 참고 ] CLSI EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance(2008) < 검사법간비교 > 1 일반사항 - 검사법간비교평가시, 두가지이상의검사법에의하여동일한검체를이용하여검사하고그결과를비교한다. - 검사법간비교평가를통해산출된결과인양성일치율 (PPA) 과음성일치율 (NPA) 은정확도가아니라후보검사법과참고검사법의일치도가반영된결과로, 후보검사법의정확성에대한정보는직접적으로추정될수없다. 대신, 검사실의타당한목적이후보검사법그리고참고검사법과충분히일치하는지를입증하기위한것이다. 2 검체수 - 최소한 50개의양성검체가얻어질때까지검사가지속되어야한다. 후보검사법의특이도를결정하기위해서는참고검사법을이용하여적어도 50개의음성검체를얻어야한다. 2 검사기간 - 10~20일동안매일수행되어야하며, 여러날동안나누어검사를실시한다. - 18 -
5. 결과제시 1) 참고요화학검사시약으로부터얻은검사결과와평가요화학검사시약으로부터얻은검사결과를비교하여평가한다. 2) 상관성시험결과는 [ 표 9] 의예시와같이기록표 (2X2 분할표 ) 를이용하여표기하고, 각검사항목의총일치율, 양성일치율, 음성일치율을구한다. - 총일치율 = 100 (a+d)/n - 양성일치율 (percent positive agreement) = 100 a/(a+c) - 음성일치율 (percent negative agreement) = 100 d/(b+d) [ 표 9] 상관성시험기록표 양성 참고검사 ( 대조군 ) 음성 합계 평가검사 ( 실험군 ) 양성 a b a+b 음성 c d c+d 합계 a+c b+d N [ 참고 ] CLSI EP12-A2, User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance(2008) <Comparator Is Diagnostic Accuracy Criteria> - [Table 1] is a 2 X 2 contingency table that compares results of a qualitative test with the outcome of the diagnostic accuracy criteria. The entry in each cell of the table represents the number of specimens corresponding to the labels in the margins. [Table 1] 2 X 2 Contingency Table Method X Diagnostic Accuracy Criteria Total Positive Negative Positive # true positive TP # false positive FP TP + FP Negative # false positive FN # true positive TN FN + TN Total TP + FN FP + TN N - 19 -
4. 민감도 [1] 최소검출한계 1. 시험목적 측정방법에의해검출될수있는분석물질의최소농도를측정한다. 2. 적용규격 [CLSI EP17-A2]: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline, 2 nd Edition 3. 시험조건 1) 검체의준비각검사항목의표준물질을제조한다. * 비고 : 각검사항목의추정되는검출한계전후의농도값을포함하여최소 5단계이상희석한다. [ 표 10] 민감도 ( 최소검출한계 ) 시험을위한검체제조의예시 민감도 ( 최소검출한계 ) 시험용표준물질제조방법예시 1 평가하고자하는검사항목에서사용가능한시약을확보한다. 2 시약을이용하여각검사항목의표준물질을제조한다. 3 단계 2에서제조된검체를추정되는검출한계전후의농도값을포함하여최소 5단계이상희석한다. 4 단계 3에서제조된검체를요화학검사시약으로측정한다. 2) 시약의준비 요화학검사시약을준비한다. - 20 -
4. 시험방법 1) 요화학검사지및검체를준비한다. * 비고 : 요화학검사시약은검사전까지포장이나용기에서미리꺼내지않는다. 2) 검사결과판정을위해제조사에서제공하는표준비색표를준비한다. 3) 준비된검체를추정되는검출한계전후의농도값을포함하여최소 5단계이상희석한다. 4) 요화학검사시약을이용하여검체를검사한다. 1 검체를요화학검사시약의해당시험부분에점적한다. 2 검체점적후과잉의검체는흡수지등에흡수시켜제거한다. 3 일정반응시간후시험부분의발색정도를비색표와비교하여판정한다. * 비고 : 각검사항목마다발색반응시간의차이를보이므로각각의반응시간을준수하여발색정도를판정하도록한다. 5) 단계 3) 에서희석하여준비한검체별로단계 4) 를최소 3회이상반복측정한다. 6) 최소검출한계근처농도에서는측정횟수를증가시켜단계 4) 를최소 20회이상반복측정하여 95% 이상양성판독율을나타내는농도를제시한다. 7) 검출한계에영향을줄수있는여러변수를고려하기위해검사일은 3일이상, 측정시 2번이상반복검사를권장한다. - 21 -
[ 참고 ] CLSI EP17-A2, Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures(2012) < 시험프로토콜 > - 최소검출한계는극소량의검체를검사하여질병의존재여부와독소, 오염및발암물질의유무를판별하기위해사용되고있다. - 측정방법에는 classical, precision profile 및 probit 접근법이있으며, 전통적인방법의경우화학및면역화학측정과정에널리사용되고있다. - pobit 접근법은검출율 ( 전체반복시험중양성횟수 ) 로평가되는측정절차에유용하다. <probit 접근법에따른최소시험설계 > - 준비된양성검체를추정되는검출한계전후의농도값을포함하여최소 5단계이상희석하여, 각검체당하루에 20회이상반복측정하는것을권장한다. 검사일반복횟수검사시약로트양성검체 3일 20회 2종 3종 - 제조자는충분한수의측정결과를제공하기위해최소시험설계항목별요소및횟수등을추가 / 확장할수있다. 5. 결과제시 1) 최소검출한계로예상되는농도범위의검체를최소 20회이상반복측정하여 95% 이상양성판독율을나타내는농도를각검사항목별로제시한다. * 예시 ) Glucose 검사항목에서 95% 이상의양성결과를나타내는분석물질의농도는 30 mg / dl이다. 2) 통계적으로유효한검출한계치와설정에사용된검체종류, 검체수, 반복횟수, 계산법등을함께제시한다. - 22 -
[2] 검출단계별감도 1. 시험목적 요화학검사시약의검사항목에대한감도 (sensitivity) 를평가하기위한시험으 로, 각검사항목의검출단계별농도의표준물질을제조하여평가한다. 2. 적용규격 [CLSI EP12-A2]: User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline, 2 nd Edition 3. 시험조건 1) 검체의준비각검사항목의표준물질 ( 검출단계별농도 ) 을제조한다. * 비고 : 검사항목의양성판정농도이상의검출단계별 (ex. 1+, 2+, 3+) 농도로제조한다. [ 표 11] 민감도시험을위한검체제조의예 소변검체를이용한민감도시험용표준물질제조방법예시 1 평가하고자하는검사항목에서음성및양성으로판별된신선한소변검체를각각확보한다. 2 각검사항목의검출단계별농도를확인한다. Ex) Glucose 검사항목의 1+ 농도 : 250mg/ dl, Protein 검사항목의 1+ 농도 : 30mg/ dl 3 단계 1의음성검체에양성검체를혼합하여 2의농도로제조한다. * 임상화학자동화장비를이용해농도를확인한다. 4 단계 3에서제조된검체를요화학검사시약으로측정한다. * 비고 : [ 표 11] 은요검체를이용한표준물질의제조예시이며, 상용화된시약을이용하 여표준물질을제조하여사용할수있다. 2) 시약의준비 요화학검사시약을준비한다. - 23 -
4. 시험방법 1) 요화학검사지및검체 ( 검사하고자하는농도의표준물질 ) 을준비한다. * 비고 : 요화학검사시약은검사전까지포장이나용기에서미리꺼내지않는다. 2) 검사결과판정을위해제조사에서제공하는표준비색표를준비한다. 3) 요화학검사시약을이용하여검체를검사한다. 1 검체를요화학검사시약의해당시험부분에점적한다. 2 검체점적후과잉의검체는흡수지등에흡수시켜제거한다. 3 일정반응시간후시험부분의발색정도를비색표와비교하여판정한다. * 비고 : 각검사항목마다발색반응시간의차이를보이므로각각의반응시간을준수하여발색정도를판정하도록한다. 4) 각검출단계별농도의검체를이용하여단계 3) 을최소 40회이상반복측정한다. 5) 검출단계별감도에영향을줄수있는여러변수를고려하기위해검사일은 3일이상반복검사를권장한다. 5. 결과제시 1) 검사를시행한농도에서의검사결과일치율을제시한다. 2) 결과의일치율을 ( 검사결과가해당농도와일치한검사수 ) / ( 전체검사수 ) * 100 로구한다. [ 식 1] 민감도 ( 검출단계별감도 ) 산출식 검사결과가일치한검사수일치율 전체검사수 3) 통계적으로유효한검출한계치와설정에사용된검체종류, 검체수, 반복 횟수, 계산법등을함께제시한다. - 24 -
Ⅵ 참고문헌 [1] CLSI guideline GP16-A3: Urinalysis; Approved Guideline, 3rd Edition, 2009 [2] CLSI guideline EP12-A2: User Protocol for Evaluation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline, 2nd Edition, 2008 [3] CLSI guideline EP15-A3: User Verification of Performance for precision and Trueness; Approved Guideline, 3rd Edition, 2014 [4] CLSI guideline EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures, 2nd Edition, 2008 [5] European Confederation of Laboratory Medicine, European Urinalysis Guidelines, 2000 [6] 식품의약품안전처고시제2017-6호 의료기기품목및품목별등급에관한규정 [7] 보건복지부, 대한의학회, 소변검사 (Urinalysis) - 25 -
Ⅶ 붙임 1. 요화학검사시약의원리 요화학검사시약의각항목별검사원리는제조사별로차이가없으나지시약이나발색제가약간의다른경우가있고검출민감도에도다소차이가발생한다. 일반적으로요화학검사시약의종류는백혈구, 우로빌리노겐, 잠혈, 빌리루빈, 케톤체, 포도당, 단백질, ph, 아질산염, 비중등이다. 요화학검사시약의주요 10개검사항목의원리에대해서아래 [ 표 12] 에나타내었다. [ 표 12] 요화학검사시약검사항목및검사원리 검사항목 Glucose ( 포도당 ) Blood ( 잠혈 ) Protein ( 단백질 ) Bilirubin ( 빌리루빈 ) 검사원리 - 요당검사는 glucose oxidase법을이용 - 소변의포도당과산소를 glucose oxidase를이용하여산화시켜과산화수소를발생시키고, 이과산화수소와발색제를반응시켜포도당을측정 - 효소반응이기때문에온도의영향을받으며, 제조사에서정해진시간 (30초혹은 60초 ) 에측정해야함. 시간이경과한후측정하면반응이더진행되면서더높은값이나올수있음. - 혈색소에존재하는가성과산화효소 (pseudoperoxidase) 가시약의과산화수소를분해시켜나온산소로테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 을산화시켜발색반응을나타냄. - 요단백검사는지시약의단백오차원리 (Protein-error reaction) 를이용. - 단백이시험지봉의테트라브로모페놀블루 (tetrabromophenol blue) 에의해일정 ph(ph 3.0) 에서펩티드의전하와만나면서 ph 지시제의오류를유발시켜발색됨. - 단백이없을경우오렌지색을띄고단백이있게되면녹색-청색을띔. - 빌리루빈은폐쇄황달과간성황달을초기진단하는데중요하며, 용혈황달과폐쇄황달의감별진단에도중요. - 빌리루빈이시험지봉의 diazonium염과반응하여갈색이되는반응을이용해서측정 (diazo coupling reaction). - 담갈색내지짙은갈색을나타내게됨. - 26 -
Urobilinogen ( 유로빌리노겐 ) Ketone ( 케톤체 ) ph Nitrite ( 아질산염 ) Leukocytes ( 백혈구 ) Specific Gravity ( 비중 ) - 우로빌리노겐이요화학검사시약스트립의 diazonium염과반응하여담갈색내지짙은갈색을나타내게됨 (diazo coupling reaction). - 케톤체는혈액내 2-4mg/dL 존재하며사람에따라상당한차이가있으나 2% 의 acetone, 20% 의 acetoacetic acid, 78% 의 β-hydroxybutyric acid로구성. 요화학검사시약검사는앞의두가지를측정하며, 베타하이드로부틸산 (β-hydroxybutyric acid) 은반응하지않음 - 니트로프루시드 (sodium nitroprusside) 와 acetoacetic acid의반응을기반으로하며, 연분홍색에서자색으로변함 - 전체소변 ph 범위를다양한종류의색으로나타내는이중지시약원리를기반으로함. - Methyl red와 bromothymol blue를지시약으로이용하여 ph 5.0부터 ph 9.0까지측정하며, 제조사에따라 0.5 혹은 1.0 단위로보고됨 - 소변그람음성균의작용에의해 nitrate( 음식물에서유래된 ) 가 nitrite로변환되는것에좌우됨. - 검사영역의산성 ph에서, 소변내 nitrite는 ρ-arsanilic acid와반응하여디아조늄화합물 (diazonium compound) 을형성함. 이디아조늄화합물은다시 1,2,3,4-tetrahydrobenzo(h)quinolin-3-ol 과결합하여분홍색내지는붉은색을띠게됨 (Griess reaction). - 아질산염과같이요로감염의선별검사로이용 - 백혈구의호아주르과립 (azurophil granule) 에있는에스테라제를이용하여검사. 스트립패드의 pyrrol amino acid ester를에스테라제가분해하여나온 pyrrol이 diazonium염과반응하여자색을띄게됨 - 요의이온농도에다라시험지봉의반응부에있는중합전해질 (polyelectrolyte) 의 pka 값의변화가지시약의비색변화를일으키게됨 - 27 -
2. 성능평가기록지및평가표예시 * 이양식은참고용이며, 제품에맞게재구성할수있음 A. 정밀도 [ 표 13] 정밀도평가기록지의예정밀도평가기록지 시험자성명 : 시험일자 : 시험장소 : 시험기기 : 날짜 / 횟수 Blood Bilirubin Urobilin Pos1 ogen Ketones Protein Nitrite Glucose ph S.G Leukoc ytes 오전 Pos2 Neg1 1 Neg2 Pos1 오후 Pos2 Neg1 Neg2 Pos1 오전 Pos2 Neg1 2 Neg2 Pos1 오후 Pos2 Neg1 Neg2 Pos1 3 오전 Pos2 Neg1 Neg2-28 -
Pos1 오후 Pos2 Neg1 Neg2 Pos1 오전 Pos2 Neg1 4 Neg2 Pos1 오후 Pos2 Neg1 Neg2 Pos1 오전 Pos2 Neg1 5 Neg2 Pos1 오후 Pos2 Neg1 Neg2 [ 표 14] 정밀도평가결과제시표의예 검사항목 Blood Bilirubin Urobili nogen Ketones Protein Nitrite Glucose ph S.G Leuko cytes 음성 (Negative) 양성 (Positive) - 29 -
B. 상관성 [ 표 15] 상관성평가기록지의예 상관성평가기록지 시험자성명 : 시험일자 : 시험장소 : 시험기기 : 평가항목검체번호 참고검사시약 평가검사시약 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14... [ 표 16] 상관성평가결과제시표의예 양성 평가검사 ( 실험군 ) 음성 합계 기준검사 ( 대조군 ) 양성 음성 합계 - 30 -
C. 민감도 [ 표 17] 민감도평가기록지의예 민감도평가기록지 시험자성명 : 시험일자 : 시험장소 : 검사항목검사농도 검체번호 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 검사판정결과... 38 39 40-31 -
요화학검사시약성능평가시험방법가이드라인 ( 안 ) 발행일 2018 년 2 월 발행인이선희 편집위원장 서경원 편집위원김미정, 이인수, 이승노, 김지은, 김보라 도움주신분 고신대학교이운형 발행처식품의약품안전평가원의료제품연구부의료기기연구과 본가이드라인은 2017 년도식품의약품안전처의연구개발사업 ( 요화학검사시약성능평가 시험방법가이드라인개발연구, 17171 의평연 362) 의결과를활용하였습니다.
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