제4장 생물공학 연구 제1절 서 언 산림생물공학은 1980년에 조직배양으로 시작되어 현재 DNA chip을 이용한 유 전자 대량기능분석 연구에 이르기 까지 드물게 한 방향으로 꾸준한 투자가 이루 어진 분야이다. 따라서 생물공학 연구는 다른 산림유전자원부의 연구보다 훨씬 짧은 25년의 역사에도 불구하고 빠르게 제 틀을 잡아가고 있다. 돌이켜보면 우리 의 선배들의 장래를 바라보는 선구자적 안목과 그간 어느 정도의 무리를 감수한 과감한 투자가 오늘의 산림생명공학의 터를 닦는데 큰 기여를 했음은 두말할 나 위가 없다. 그러나 투자에 따른 기대도 만만치 않아서 생물공학에 종사하는 우리 연구원들이 미처 대비하기도 전에 세상은 생물공학이 장래에 임목육종의 어려운 부분들을 해결할 것이라는 전망을 내어 놓고 있다. 우리의 생물공학은 포플러의 아배양에서 출발하였고 약배양, 원형질체 배양을 거치면서 재분화 체계가 자연스럽게 확립되었는데 이러한 모델 시스템을 이용한 형질전환 기법은 아직도 우리가 세계에 자랑하는 기술이다. 과거 10년을 돌아보 면, 1995년 식생과에서 유전생리과와 분리된 생물공학과는 갑자기 커진 조직에 비하여 준비가 덜 된 탓에 연구는 질적 성장 보다는 다양한 생물공학 분야를 맛 본 양적 성장의 시기였다. 이 당시 확립된 주목의 세포배양 연구는 발전되어 생 물반응기 응용으로 적용범위를 넓혀가고 있으며 활엽수, 침엽수를 대상으로 다양 한 증식기술을 경험한 조직배양의 대량증식 연구는 세계적인 추세인 체세포배 유 도를 통한 재분화 기술이라는 길로 자연스럽게 진입하게 되었다. 형질전환으로 대변되던 유용유전자 이용분야는 미생물 등의 유전자를 이용하거나 단일 유전자 이용의 수준을 넘어서서 특정 발달단계 혹은 특정 자극에 반응하여 동시에 발현 되는 수백 종의 임목의 유전자를 구명하는 단계에 이르렀다. 2005년 포플러의 완 전한 유전체의 염기서열이 미국에서 발표되면서 이를 디딤돌로 우리의 산림생물 공학은 더욱 발전하게 될 것이다. 우리의 질적 성장의 징후는 이미 나타나고 있 기 때문에 이러한 기세를 잘 유지시킨다면 산림생물공학은 60년사를 준비하게 될 때는 임목육종분야의 주도적인 위치를 차지하고 있을 것이다(노은운).
임목육종 50년 제2절 조직배양 < 1980~1995 > 생물공학과의 조직배양 연구는 1978년 현 경북대학교의 박용구교수가 일본에 서 유학을 마치고 귀국하여 당시 임목육종연구소의 식생과에서 실험을 시작한 것이 효시이며, 1980년부터 경상과제의 시험제목으로 정상적인 연구가 시작되었 다. 이미 고인이 되신 김재헌 연구관이 실험실의 체계를 만드는데 산파 역할을 하였다. 시험연구의 초기에는 분열능력이 높은 포플러류의 아배양에 의한 대량 증식에 연구의 중점을 두었으며, 침엽수는 리기테다 소나무의 배배양을 중심으 로 시작되어 그 후에는 유실수 등 경제적으로 유망한 수종과 희귀수종의 대량증 식, 약배양, 세포배양, 원형질체 배양 및 체세포 배형성 등으로 연구영역을 점차 확대하였다. 주요 연구내용을 살펴보면 다음과 같다. 2-1. 대량증식 목본류의 조직배양 연구의 가장 기초적이며, 보편적인 방법은 아배양이나 액아 배양을 통한 우수 클론의 대량증식이며, 이 분야의 연구 성과가 가장 실용화에 접근되어 있다. 외국에서는 사시나무류, 유칼리나무류, 자작나무류 등 몇몇 수종 에 대하여 이미 실용화가 이루어 졌으며, 1990년 이후에는 우수한 클론의 증식, 즉 영양계 임업(clonal forestry)에 있어 조직배양 기술의 중요성이 인식되어 이 분야의 연구가 활성화되었다. 국립산림과학원에서는 소나무 등의 침엽수종을 대 상으로는 배배양과 엽속배양의 기술개발에 역점을 두어 실험이 진행되었으나 증 식효율이 매우 낮고 더욱이 기내생장이 느려서 실용화에는 어려움이 있는 것으로 지적되었다. 그러나 이러한 침엽수 조직배양의 연구는 1990년 대 이후 미국, 카 나다, 뉴질랜드 등 임업 선진국에서 체세포배를 이용한 묘목생산 기술이 임목개 량을 위한 육종 프로그램에 응용되면서부터 실용화에 접근할 수 있었다. 활엽수종의 조직배양은 1980년 연구의 초기부터 시작된 포플러류의 기초적인 연구를 토대로 여러 수종에서 배양조건의 적정화를 통한 대량증식 기술이 개발되 었다. 상수리나무 등 참나무류의 액아배양, 특히 재유령화 기술을 도입한 수형목 의 기내증식 기술이 개발되어 무성번식에 어려움이 있는 참나무류의 조직배양에
제4장 생물공학 연구 의한 대량번식의 가능성이 제시되었으며, 박달나무, 거제수나무 등 자작나무류는 유묘는 물론 성숙목의 배양기술이 개발되어 수형목의 대량증식의 기반을 조성하 였다. 이러한 활엽수종의 조직배양은 1980년 Lloyd와 McCown이 개발한 WPM 배지를 주로 쓰고 있다. 이밖에도 피나무, 들메나무, 물오리나무, 느티나무 등에 서 기내배양 기술이 개발되어 기내 대량증식의 기반을 조성하였고, 희귀 및 멸종 위기 수종의 보존 및 증식기술로도 유용하게 쓰일 수 있다. 생물공학과에서는 흰 배롱나무, 미선나무, 망개나무 등의 수종에서 아배양을 통한 효율적인 묘목생산 기술을 개발하였으며, 특히 망개나무는 29~150년생의 맹아지를 이용한 배양으로 재유령화 기내 증식이 가능함을 보여주었다. 한편 호도나무와 같은 유실수종은 묘목의 가격이 비싸고 기존의 접 삽목의 방 법이 효율적이지 못하였기 때문에 그에 대한 대안으로 조직배양이 시작되었다. 1989년 당시 임목육종연구소의 심상영 소장의 지시로 유실수과(현 특용수과)에서 도 조직배양실을 설치하여 유실수종의 집중적인 조직배양이 시작되었으며, 그 결 과 밤나무, 호도나무, 대추나무 등의 유실수종과 초피나무, 산사나무 등의 특용수 종의 조직배양 증식기술이 개발될 수 있었다. 호도나무의 조직배양은 Driver와 Kuniyuki(1984)에 의해 개발된 DKW라는 배지가 주로 쓰이고 기타 수종은 일반 적으로 사용하는 WPM 혹은 MS 배지를 사용하였다. 그러나 이러한 많은 연구에 도 불구하고 주요 유실수종에 대한 조직배양은 초피나무 등 한 두 수종 이외에는 실용화하는데 여전히 어려움이 있는 것으로 나타났다. 1990년대 이후 생물공학과의 조직배양은 선발목을 대상으로한 재유령화 번식, 희귀 및 멸종위기 수종의 번식 및 체세포배 유도에 의한 대량증식에 중점을 두고 진행되었다. 재유령화는 유묘로의 반복 접목 및 강도 높은 전정과 벌목을 통한 맹아지 유도를 통해 실시되었고, 희귀수종은 주로 아배양의 기술이 사용되었다. 2-1-1. 아배양(bud culture) 참나무류 수형목 4수종 37가계의 기내배양을 실시하였다. 유묘임에도 불구하고 수종간 및 가계간에 뚜렷한 증식차이를 보여주었고, 배양과정에서 정단괴저가 흔 히 나타났다. 상수리나무는 유묘에 반복 접목된 줄기의 사용 혹은 통나무의 맹아 지를 사용하여 기내증식 가능성을 보였으나 배양이 잘되는 클론 선발이 무엇보다
임목육종 50년 중요한 것으로 나타났다. 자작나무류는 성숙목의 번식도 가능하여, 물박달나무 성숙목의 대량증식과 참다래 x 다래 교잡종의 대량번식 기술을 확립하였고, 내염 성 수종인 유프라티카 포플러의 아배양 및 부정아 유도를 통한 증식, 그리고 오 동나무의 부정아 유도를 통한 증식기술을 확립하였다. 한편 희귀 및 멸종위기 수 종의 기내배양을 통해 산개나리, 금선개나리, 떡버들, 미선나무 등에서 묘목생산 을 통한 자생지 복원이 가능함을 보여주었다. 2-1-2. 체세포배 형성 1990년대에 들어와 가장 보편화된 조직배양 기술은 체세포배 유도를 통한 증식 기술로 이 기술은 침엽수는 1985년 독일가문비에서, 활엽수는 1965년 Sandalwood 에서 처음 발표되었다. 우리 과학원의 생물공학과에서는 1987년 피나무의 미숙배 배양으로 체세포배를 처음 유도하였으며, 1988년 호도나무의 미숙배를 재료로 체 세포배의 유도와 발아를 시험하였으나 완전한 식물체는 얻지 못했다. 그러나 1992 년에 무궁화의 성숙배 혹은 화사조직으로부터 체세포배를 유도하여 완전한 식물체 까지 얻었다. 또한 상수리나무의 성숙배를 절편으로 BA와 IBA를 처리한 MS, WPM 배지에서 체세포배를 유도하였으며, BA가 처리된 WPM 배지에서 발아 후 몇 본을 폿트묘까지 육성하였다. 이 같은 연구결과는 1995년 이후 조직배양의 가장 진 보된 핵심 기술로 자리 잡은 체세포배 연구의 귀중한 토대를 이루게 되었으며, 참 나물, 멧대추, 무궁화, 상수리나무, 굴참나무, 찰피나무, 멀구슬나무, 가래나무 등 수종에서 기술개발이 이루어졌다. 2-2. 약배양 약배양의 연구는 1983년 수원사시나무를 공시수종으로 처음 시작되었다. 4분자 기를 지나 1핵기와 2핵기의 약을 사용하여 생장조절제 처리된 배지에 배양하여 반수성 캘러스 유도, 줄기분화 및 발근묘를 얻었다. 염색체 검경으로 반수체임을 확인하였는데, 이것은 국내에서는 처음으로 목본식물의 반수체를 얻은 고무적인 결과이었다(김 등, 1983). 기타 리기다소나무, 테다소나무, 소나무 및 잣나무 등 침엽수종의 약배양을 시도하였으나 소포자 유래의 반수성 캘러스를 얻는데 그쳤 다. 약배양은 수정을 거치지 않은 반수성 배우체로부터 완전한 나무를 얻을 수
제4장 생물공학 연구 있다는 점에서 새로운 품종육성의 좋은 기술로 인식되었고, 실제로 국내에서도 여러 가지 벼의 품종이 육성되어 실용화된바 있으나 아직까지 목본류에서는 뚜렷 한 결과를 못 얻고 있다. 그간 육성한 포플러류의 약배양묘는 포지 및 산지에 식 재하여 생장특성 등을 조사하고 있으나 특이한 결과는 얻지 못하였다. 2-3. 세포배양 고등식물 세포배양의 주목적은 단세포 수준의 세포를 급속하게 증식시켜 여러 화학물질의 처리로 체세포 변이체를 용이하게 선발하고, 단세포 유래 체세포배를 유도하여 대량증식의 수단으로 이용하며, 여러 유용한 2차 대사산물의 획득과 유 전 변이를 세포수준에서 조사할 수 있다는 것이다. 1984년부터 리기테다소나무 와, 현사시, 양버들에서 세포증식에 미치는 적정배지, 생장호르몬, plating 방법 에 따른 세포생장의 차이, 질소원의 농도 등을 구명하였으며, 수원사시나무는 집 중적인 연구를 통해 세포배양으로 정상식물체를 유도하였다. 한편 나라꽃인 무궁 화에 대해서도 세포배양 연구가 이루어져 개량단심 의 화주로부터 캘러스를 유도 하고 세포배양을 통해 완전한 식물체를 얻었다. 2-4. 원형질체 배양 1985년부터 현사시 및 소나무를 대상으로 원형질체 배양을 시도하였다. 현사시 는 현탁배양된 세포를 재료로 원형질체를 나출하여 배양하였으나 4~5일 이상 배 양체를 생장시키지 못했고, 소나무 역시 자엽을 재료로 원형질체의 나출이 가능 했으나 세포분열은 지속되지 못했다. 1987년 양버들을 재료로 원형질체 배양을 통한 완전한 식물체를 얻었으며, 당시 새로운 기술개발이라는 측면에서 고무적인 성과로 인식되었다. 그러나 이러한 원형질체 유래 식물체는 산지에서 정상적인 생장이 어려운 것으로 나타나 실용적인 결과를 얻기 위해서는 좀 더 많은 연구가 있어야 할 것으로 나타났다(이 등, 1987). < 1996~2005 > 1996년 이후 조직배양에 의한 기내번식의 현저한 특징은 체세포배 유도에 의한 증식기술의 보편화이다. 이 기술은 초저온 저장기술과 연계하여 임목에서도 비교
임목육종 50년 적 단기간에 유전적 개량을 가져올 수 있는 새로운 기술로 보고되고 있으며, 1995 년까지 목본류에서도 150여 수종에서 체세포배 형성이 보고되고 있다(Dunstan 등, 1995). 한편 희귀 및 멸종위기 수종은 주로 아배양의 기술이 적용되고, 수종에 따라서는 체세포배형성 기술이 개발되고 있다. 국립산림과학원에서 그간 개발된 주요 결과는 다음과 같다. 2-5. 체세포 배형성 앞서 전술한 바와 같이 체세포배형성 기술은 대량증식의 측면에서 매우 효율적일 뿐만아니라, 초저온 저장에 의한 생식질보존이 가능하고, 형질전환의 좋은 재료가 된다. 우리 과학원에서도 1995년 이후 체세포배 유도기술을 이용한 증식기술이 여 러 유용한 수종에서 보편적으로 적용되어 왔으며, 최근에는 기내배양이 매우 어려 운 소나무 등에서도 체세포배 유도를 통한 묘목생산이 가능하게 되었다(표 4-1). [표 4-1] 체세포배 형성에 의한 기내번식 년도 수 종 절 편 연 구 결 과 1996 찰피나무 미숙배 약 10%의 PEDC형 SE 유도, pot묘 생산 1996 멀구슬나무 미숙배 BA처리로 SE유도, GA 3 처리로 일부 발아유도 1997 상수리나무 미숙배 BA 및 IBA 처리로 SE 유도, 식물체 유도 1997 가래나무 미숙자엽 체세포배 유도 및 발아유도 1998 두릅나무 동아( 冬 芽 ) SE 유도, 묘목생산 및 포지이식 1999 낙엽송 미숙배 SE 유도, 발아 및 pot묘 생산 1999 낙엽송 미숙배 배발생조직 초저온저장 후 식물체 재분화 1999 두릅나무 2년생 신초 개체목에 따라 33~88% SE 유도, 대량생산 2001 두릅나무 동아( 冬 芽 ) 15개체의 SE 유도능력 비교, 유집분석 비교 2003 백합나무 미숙배 1/2LM배지에 2,4-D 및 BA 처리로 SE유도 2005 백합나무 미숙배 배발생에 미치는 유전자형효과 비교 2005 두릅나무 기내식물체 자오 의 SE 유도, 삼투압제 효과 비교 2005 음나무 미숙배 배발생 조직유도, 발아 및 pot묘 대량생산 2005 소나무 미숙배 0.17%의 배발생 조직유도 및 식물체 재생 2005 소나무 리기테다 미숙배 배발생 조직 유도, 묘목육성 및 포지이식
제4장 생물공학 연구 사용한 절편은 대부분 유시성(jevenility)이 높은 미숙배로부터 배발생 조직을 유도하고 있다. 절편으로 미숙배를 사용하는 것은 침엽수 혹은 활엽수종에서 동일 한 현상으로 나타나지만 기내배양이 까다로운 침엽수종에 있어서는 미숙배의 발달 시기중 특정한 기간에만 배발생이 가능한 time window가 있다. 따라서 수분과 수 정이 된 다음 일정한 시기별로 배양을 실시하여 배발생이 가능한 적정시기를 찾아 야 한다. 한편 활엽수종에 있어서도 절편은 배발생능이 높은 미숙배를 사용하고, 수종에 따라서는 화기조직이나 유묘의 신초를 사용하고 있다. 두릅나무는 특이하 게도 배발생능이 좋아서 유묘의 신초나 동아( 冬 芽 )로부터 배발생이 가능하였으며, 최근에는 약 50년생 모수의 근맹아지로부터 캘러스 및 배발생 캘러스를 유도하여 묘목을 생산한 바 있다. 배지는 주로 MS 배지를 사용하고 있으며, 백합나무에서 는 1/2LM 배지를, 그리고 소나무 및 리기테다소나무에서는 1/2LP 혹은 P6 배지 를 사용하였다. 적정배지는 수종, 유전자형, 배양절편에 따라 다를 수 있다. 배발생 조직의 유도에 있어 생장조절제의 처리는 필수적이다. 대부분의 활엽수 종은 2,4-D의 단독처리가 주효하며, 수종에 따라서는 저농도의 싸이토키닌을 혼 용 처리한다. 멀구슬나무는 특이하게 BA 단독처리로 배발생 조직이 유도되었으 며, 상수리나무의 미숙배로부터 배발생조직의 유도는 BA와 IBA의 혼용처리로 가 능하였다. 일단 배발생 조직이 얻어지면 계대배양을 통해 배발생능이 있는 조직만을 유 지, 증식하는 것이 매우 중요하다. 이러한 배발생 조직은 세포계통에 따라 체세 포배의 유도, 발아 및 식물체 형성이 다르게 나타나므로 다른 세포주와 섞이지 않도록 주의 깊게 다루어야 한다. 배발생 조직이 증식된 다음의 단계는 이러한 조직으로부터 체세포배(somatic embryo)를 유도하는 것이다. 일반적으로는 배발 생 조직의 유지에 첨가시킨 오옥신을 제거한 기본배지로 옮겨 체세포배를 유도하 지만 침엽수종의 경우 고농도의 ABA를 첨가하는 것이 보통이다. ABA는 체세포배의 조기발아를 억제하고, 균일한 체세포배를 유도시켜 준다. 많은 경우 체세포배는 자엽이 붙어있는 것, 단자엽 혹은 다자엽으로 형성된 것, epicotyl이 형성되지 못한 것 등이 나타나는바 ABA의 처리는 이러한 기형의 체 세포배 유도를 억제한다. 또한 ABA의 처리와 함께 보통 고농도의 삼투압제를 사 용하고, 기본배지에 glutamine 등의 아미노산을 첨가하기도 한다. 수종에 따라서
임목육종 50년 는 PEG를 첨가하며 PEG 4000으로 농도범위 7~10%을 주로 사용한다. 체세포배 가 유도되면 다음의 단계는 체세포배를 정상적으로 발아시켜 식물체로 유도하는 것이다. 활엽수종의 체세포배, 특히 오갈피류의 체세포배 발아시에는 GA 3 의 처리 가 효과적으로 보고되고 있으며, 음나무 및 땃두릅나무의 체세포배 발아에 있어 서도 GA 3 처리가 필수적이었다. 2-5-1. 민두릅나무 동아 및 신초 유조직을 재료로 MS 기본배지에 2,4-D를 처리하여 배발생 캘러 스를 유도하고, 일련의 배양과정을 적정화하여 체세포배 유도, 발아 및 식물체 형성을 통한 묘목 생산을 체계화하였다. 1999년부터 2002년까지 폿트묘로 10만 본 이상을 산림청 산하 기관으로 보급하였다. 이상의 결과는 조직배양묘의 실용 화라는 측면에서 의의가 있으며, 2001년에는 국내 기술 특허를 얻었다(문 등, 1999, 2001). 2-5-2. 상수리나무 수정 후 약 5주부터 일주 간격으로 미숙배를 채취하여 glutamine, proline과 생 장조절제 BA와 IBA가 처리된 MS 배지에서 체세포배를 유도하였다. 체세포배는 BA가 처리된 WPM 배지에서 발아 및 식물체로 재생하였다. 총 210본의 재분화 개 체중 120본을 토양에 이식하여 34%가 활착되었다. 이 결과는 기내배양이 까다로운 상수리나무의 체세포배 유도를 통한 식물체 재생의 흥미 있는 결과로, 체세포배의 발아 및 재분화율의 제고는 계속 연구가 필요한 것으로 나타났다(김 등, 1997). 2-5-3. 음나무 8월 중순 미숙배를 재료로 2,4-D가 처리된 MS 배지에서 암배양으로배발생 캘 러스를 유도하였다. 체세포배는 ABA 처리된 배지에서 가능하였고, 정상적인 배 발아 및 재분화를 위하여 저농도의 활성탄 처리가 필요하였다. 체세포배의 발아 과정에서 2차 체세포배를 형성하였고, 정상적인 배발생 경로를 통해 식물체가 형 성되었다. 재분화된 식물체는 인공배양토에서 95% 이상 활착되어 포지에 이식 후 정상생장 하였다(문 등, 2005).
제4장 생물공학 연구 그림 4-1 음나무 체세포배 유도에 의한 식물체 유도 2-5-4. 낙엽송 자엽단계의 접합자 배를 절편으로 LM 배지 등 세 가지 배지에서 배발생 조직을 유도하였다. 미숙배의 발달단계에 따라 배발생율이 크게 달랐으며, 7월 30일에 채 취한 미숙배에서 배발생율이 가장 양호하였다. ABA는 배의 조숙화 발아 억제에 효과가 있었다. 400본 이상의 식물체를 육성하였다(김 등, 1999). 2-5-5. 소나무 약 5,700 개 이상의 미숙종자를 배양하여 10개의 배발생 계통을 얻었다. 7월 5일 에 채취한 종자에서 가장 양호한 결과를 얻었고 0.36%의 배발생 조직을 유도하 였다. 배발생 세포로부터 체세포배의 유도는 세포계통에 따라 차이를 보였으며, 80 um ABA, 0.2M maltose, 1.0% gellan gum 배지에서 체세포배를 유도하여 자엽단계의 배로 성숙하였다. 이러한 성숙배는 0.2% gellan gum의 1/2LM 배지 에서 발아 되었는데, 배성숙배지의 ABA 농도, 활성탄이 첨가된 발아배지의 종류
임목육종 50년 에 따라 0~34%까지 발아되었다. 재분화된 어린 식물체는 인공상토에서 순화하여 묘목으로 육성 중에 있다. 2-5-6. 리기테다소나무 6월 11일부터 7월 30일까지 약 1주 간격으로 미숙종자를 채취하여 절편으로 사 용하였다. 총 3,400개 이상의 종자로부터 5개의 배발생 조직을 얻어 평균 0.14% 의 빈도를 보였다. 13.5 μm 2,4-D와 4.4 μm BA를 첨가한 P6 배지에서만 배발 생 조직이 유도되었으며, 7월 3일에 채취한 종자에서 0.55%의 가장 높은 배발생 조직이 유도되었다. 조직검경 결과 이 시기의 접합자배는 전배(proembryos)에서 초기 자엽단계(precotyledonary)로 전이되는 상태로 나타났다. 그림 4-2 리기테다소나무 체세포배 형성에 의한 묘목생산 배발생 조직은 세포질이 충만하고 잘 발달된 배병(suspenser)을 나타내어 비배 발생 조직과 구별되었다. 얻어진 5개의 배발생 조직은 증식율의 차이가 있었으나 모두 체세포배를 형성하였으며, 80-150 μm ABA 처리가 필요하고, 고농도 gellan
제4장 생물공학 연구 gum(1%)에서 성숙되었다. 체세포배는 생장조절제 무처리 조건에서 정상적인 배발 달 경로를 통해 발아되었다. 2-6. 희귀 및 멸종위기 수종 조직배양 기술은 희귀 및 멸종위기 수종의 번식 및 보존에 있어 매우 유용한 수단이 될 수 있다. 일반적으로는 희귀종은 개체수가 제한적이고 종자결실이 이 루어지지 않는 경우가 많으므로 잎, 줄기, 뿌리 등 체세포 조직을 절편으로 보통 배양을 시작한다. 목본류는 신초 정아조직 혹은 액아를 절편으로 배양이 가능할 수 있다. 국립산림과학원에서는 1995년 이후 희귀수종에 대한 조직배양 기술을 개발하고 있는데 수종에 따라서는 증식에 의한 자생지 복원이 가능함을 보여주고 있다. 아쉬운 점은 기내증식을 통해 많은 묘목이 생산된다 하더라도 식물체를 현 지외 복원 혹은 자생지복원을 통해 계속 모니터링하고 관리하는 시스템이 거의 없었다는 사실이다. 따라서 앞으로는 기내배양을 통해 증식된 묘목을 현지외 혹 은 자생지에 복원하여 관리하는 체계가 요청되는 시점이다. 그간에 수행된 내용 중에서 주요 결과를 표 4-2에 정리하였다. [표 4-2] 희귀 및 멸종위기 식물의 기내번식 년도 수 종 절 편 결 과 1997 산개나리 액아 줄기증식, 대량생산 및 산지이식 1999 미선나무 액아 줄기증식, 발근 및 pot 묘 생산 2002 히어리나무 액아 줄기증식, 묘목생산 및 포지이식 2003 왕자귀나무 기내뿌리 부정아 유도, 식물체 형성 2004 피뿌리풀 액아 줄기증식, 발근, pot 묘 생산 2004 시로미 기내식물체 2-6-1. 산개나리 약 3년생의 산개나리 신초액아를 절편으로 MS 배지에 세 가지 싸이토키닌(BA, Kinetin, Zeatin)의 농도별 효과를 조사한 결과, 줄기 증식은 싸이토키닌 종류별 혹은 농도별 효과가 뚜렷하지 않았으나 zeatin 처리시 줄기 및 잎의 발달에 효과
임목육종 50년 가 있었다. Kinetin의 처리시에는 줄기 생장과 더불어 동시적으로 모든 절편에서 발근이 이루어졌다. 줄기는 기내에서 3년 이상 계대배양을 통해 정상적으로 증식 이 가능하였고, 발근 후 산지에 이식하여 정상 생장되었다(문 등, 1997). 2-6-2. 미선나무 신초지 액아를 절편으로 MS 배지에 세 종류의 싸이토키닌을 처리하여 증식을 시험하였다. 줄기유도는 BA가 효과적으로 나타났고, 생장은 zeatin 처리가 양호 하였다. Kinetin은 고농도(2.0 및 5.0mg/L)에서 증식효과가 있었으나 그 효과는 BA, zeatin에 비해 저조하였다. 증식된 줄기는 1/2GD 배지에 IBA 처리로 가능 하였고, 인공상토에 이식하여 100% 활착되었고 정상생장을 나타냈다. 이상의 결 과로 미선나무의 액아배양을 통한 기내증식 가능성을 보여주었다(문 등, 1999). 2-6-3. 히어리 1년생 및 10년생 액아를 절편으로 MS배지에 zeatin 0.5~3.0 mg/l, BA 0.2 mg/l 처리로 줄기증식이 양호하였다. 1년생이 10년생보다 전반적으로 증식 및 생장이 양 호하였으며, 배양 6 개월 후에는 10 년생에서도 매월 3배의 증식이 가능하였다. 기 내발근은 1년생 97%, 10년생 62%를 나타내었고, 토양이식 시 1년생 배양묘는 67%, 10년생은 48% 생존되어 모수령에 따른 차이를 나타냈다(문 등, 2002). 2-6-4. 왕자귀나무 기내발아 후 10일이 지난 유묘의 뿌리를 절편으로 신초를 유도하여 기내증식 체 계를 확립하였다. Thidiazuron(0~4.5 μm)과 NAA, 2,4-D 등이 첨가된 B5 배지 에서 배양 8주 후 60~93%의 신초가 형성되었다. 그러나 자엽, 하배축, 잎 등의 절편체에서는 뿌리조직에 비해 신초 형성이 매우 저조하였다. TDZ 처리배지에서 유도된 신초는 GA 3 1.44 μm이 첨가된 배지에서 57.5%가 식물체로 발달하고, 생 장조절제무처리 배지에서 발근되어 정상적인 형태로 생장하였다(박 등, 2003). 2-6-5. 피뿌리풀 기내발아묘를 재료로 MS 배지에 BA와 zeatin을 처리하여 다경(multiple shoot)을
제4장 생물공학 연구 유도하고 기내발근에 미치는 오옥신 효과를 조사하였다. 다경유도는 BA가 현저히 양호한 반면 줄기의 생장은 zeatin이 BA보다 효과적이었다. 기내 발근은 오옥신의 처리로 가능하였으나 발근율은 대체로 저조하였고 IBA 1.0mg/L 15일간 전처리로 30%까지 발근되었다. 발근묘는 인공토양에서 31%가 활착되었다(한 등, 2004). 2-6-6. 시로미 액아 마디를 절편으로 MS 및 WPM 배지에 BA를 처리하여 줄기 유도 및 발근 에 미치는 배지와 호르몬의 효과를 조사하였다. 다경유도는 zeatin이 BA보다 다 소 효과적인 반면 줄기생장에는 BA가 zeatin보다 양호한 것으로 나타났다. 증식 줄기의 기내발근은 1/2MS 배지보다 WPM 배지가 효과적으로 5.0mg/l IBA 처 리시 53% 까지 발근되었다. 발근묘는 인공배양토에서 93% 이상 활착되었다. 2-7. 아배양 목본류의 조직배양에서 가장 보편적으로 사용하는 절편은 눈조직, 특히 액아나 신초 정아를 사용한다. 최근의 기내배양 연구는 주로 체세포배형성을 통한 방법이 보편화 되고 있으나, 기존의 번식방법이 효율적이지 못한 수종이나, 선발목의 증식 에 있어 반복접목 등의 방법으로 재유령화된 조직의 배양에 아배양을 주로 이용한 다. 열대림의 조성에 있어 선발개체의 영양번식에 의한 클론임업이 상업적인 목적 으로 실행되고 있으며, 특히 유칼리속 수종의 아배양 증식기술은 보편적으로 적용 되고 있다. 우리과학원에서 그간 수행된 아배양의 주요결과는 표4-3과 같다. [표 4-3] 아배양에 의한 기내번식 년도 수종 절 편 결 과 1997 상수리나무 유시, 성목의 액아 증식 및 발근, pot 묘 생산 1997 유프라티카 포플러 기내발아묘 1999 물박달나무 성목의 맹아액아 증식 및 발근, pot 묘 생산 2002 음나무 유묘의 액아 2003 E. pellita 유묘의 액아 증식 및 대량생산 조건구명 2003 히어리 2년생 액아 증식, 발근 및 pot 묘 생산
임목육종 50년 2-7-1. 상수리나무 유묘 및 수형목을 대상으로 액아배양을 통한 기내증식을 시험하였다. 5가지 배 지 가운데 WPM 배지에서 줄기 분화 및 생장이 가장 양호하였다. 싸이토키닌 중 에서는 zeatin 3.0 mg/l에서 줄기 분화 및 생장에 효과를 보였으나 대체로 BA 처리가 다경유도 및 생장에 주효하였다. BA와 zeatin 공조처리가 증식 및 생장 에 더욱 시너지 효과를 보였으며, 적정농도는 BA 0.5 mg/l, zeatin 0.05-1.0 mg/l 이었다. 기내발근은 1/2GD 배지에 0.5 mg/l IBA 처리로 90% 이상 발근 되고, 인공상토에서 70% 이상 생존하였다. 어린대목에 2회 접목된 27개 수형목 클론을 배양한 결과 4개 클론에서 증식 가능성을 보여 클론에 따른 차이를 크게 나타냈다. 가장 좋은 반응을 보인 전북 17호 클론은 증식 후 90% 이상 기내발근 되어 재유령화 되었음을 보여 주었다. 이상의 결과는 상수리나무 수형목의 기내 증식을 위해서 보다 많은 클론을 대상으로 재유령화 처리가 필요하고 증식이 가 능한 클론을 선발해야 될 필요성을 보여주었다(문 등, 1997). 2-7-2. 물박달나무 50년생 물박달 성숙목을 재료로 수관하부에서 당년생 가지를 채취하여 액아배 양을 실시하였다. 증식은 DKW 배지에서 양호하였고, 줄기의 증식에는 액아배양 이, 생장에는 정아배양이 양호하게 나타났다. 발근은 IBA보다 NAA가 효과적이 었으며, 1/2DKW 배지에 1.0 mg/l NAA 처리로 80% 발근되었다. 기내증식된 줄 기는 기외삽목의 방법으로도 효과적으로 발근되어 물박달나무 성숙목의 기내증식 이 가능함을 보여주었다(문과 문, 1999). 2-7-3. 음나무 2년생 음나무의 액아배양을 통해 배지 및 싸이토키닌 처리별 효과를 시험하였 다. 잎의 생장은 MS 배지에서, 엽병의 생장은 WPM에서 양호하였고 kinetin 처리 로 다경유도가 가능하였으나 절편 당 2-3개의 줄기가 유도되어 증식효율은 저조 하였다. 증식된 줄기는 기외삽목의 방법으로 60% 까지 발근되었다(문 등, 2002). 2-7-4. Eucalyptus pellita E. pellita의 실생묘 액아 배양은 DKW, 1/2MS 및 WPM 배지의 사용으로 줄
제4장 생물공학 연구 기증식이 가능한 것으로 나타났다. 그중 DKW 배지에서 다경유도 및 생장이 양 호하여 E. pellita 기내증식의 적정배지로 선정할 수 있었다. 증식된 줄기의 발근 은 NAA 0.2mg/L 및 0.5mg/L 농도에서 100% 발근되었고, 특히 0.2mg/L 처리 시 1차근(primary root)의 발달이 좋았다. 발근묘는 상토로 이식하여 3주간 순화 후 100% 활착되고, 균일하고 비교적 빠르게 생장하였으며 2개월 후에는 묘고 40cm 이상으로 생장하였다(문 등, 2003). 2-8. 캘러스배양 및 부정아 유도 유용한 유전자를 이용한 식물 형질전환을 위해서는 대상수종의 재분화 체계, 이를테면 캘러스 및 부정아 유도를 통해 줄기를 재생하여 식물체를 유도하는 일 련의 기법이 체계화 되어야한다. 최근 유용한 유전자의 탐색과 식물 형질전환을 위한 vector가 다수 개발되고 있으나 주로 포플러류에 한정되어 형질전환이 이루 어지는 이유는 목적하는 다양한 수종의 재분화 체계가 확립되지 못하였기 때문이 다. 우리 과학원에서는 여러 수종에서 체세포배 형성을 통한 식물체 재생기법이 확립되고 있어 앞으로는 이 분야의 형질전환 연구가 기대된다. 그간 수행된 캘러 스 및 부정아유도의 주요결과는 표 4-4와 같다. [표 4-4] 부정아 및 캘러스 유도를 통한 식물체 재분화 년도 수 종 절 편 결 과 1997 참오동 기내묘 잎 부정아 유도, 줄기증식, 발근 1999 유프라티카포플러 기내묘 잎 2002 참다래 다래 교잡종 기내 액아 혹은 잎 액아증식, 캘러스에서 재분화 2003 E. pellita 기내발아묘 잎, 배축 부정아 유도 및 줄기증식 2005 양다래 다래 엽육조직 캘러스유도, 세포배양, 줄기 재 분화 및 묘목 육성 대부분의 수종에서 기내발아묘 혹은 기내식물을 절편으로 한 유시재료를 사 용하고 있으며, 주로 생장조절제의 적정화를 통한 부정아 유도를 시험하였다 (문흥규).
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임목육종 50년 제3절 생물반응기 대량배양 < 1995~2005 > 1980년 이후 식물의 세포, 조직 및 기관을 무균배양체로 조성하여, 기내에서 대량배양을 통한 유용 생리활성물질 생산방법이 세계적으로 널리 이용되고 있다. 즉 색소체인 시코닌(shikonin)과 베르베린(berberine), 항암제인 택솔(taxol), 캠 토테신(camptothecin) 및 의약 및 공업용 원료인 테르펜노이드(terpenoid), 사포 닌(saponin), 알카로이드(alkaloid) 등의 생산, 이용이 추진되고 있다. 생물반응기 대량배양연구는 산림자원식물로부터 고부가가치의 유용한 생리활성 물질(유용물질)을 개발하여, 산림자원의 효율적 이용 및 농산촌 주민의 소득증대 를 기하기 위하여 1994년 생명공학을 이용한 택솔연구 로부터 시작되었다. 연구 초기에는 각종 생리활성물질의 탐색용으로 사용하기위하여 전국에 생육하는 자생 및 외래 도입수종과 유용 초본류 등 1,500여종의 식물을 채취하였다. 1996년도에 는 산지자원식물의 신약물질 생산시험 과 산지자원식물의 천연보존제 생산시험 이 실시되었다. 이것은 채취된 1,500여종의 식물추출물을 이용하여 천연보존제 생산을 위한 항균검정과 다양한 용도의 유용생리활성물질을 개발하기 위한 연구 의 일환으로 실시하였다. 천연보존제 생산은 식생활에서 흔한 각종 육류, 생선 및 음식물에 대한 식품부 패와 인체내에서 식중독, 장티푸스 등 주 질병발생원인인 세균, 곰팡이, 효모 등 유해미생물의 증식, 억제를 위한 천연항균물질을 개발하기 위하여 식물 추출물로 탐색하였다. 그 결과 신나무, 단풍나무, 산딸나무, 층층나무, 구실잣밤나무, 말채 나무, 참오동나무, 황벽나무, 쪽동백나무, 좀작살나무, 안개나무, 참식나무, 산수 유나무, 복분자딸기 등이 각종 유해미생물의 억제 효과가 우수하였다(그림 4-3). 그리고 식품저장력을 검정한 결과(그림 4-4) 소나무, 황벽나무 및 참나무류의 추 출물 처리가 처리하지 않은 식품에 비하여 2-6일 정도 더 식품의 부패를 막았 다. 차나무류와 층층나무는 효모균과 세균에 대하여 각각 우수한 항균력이 있었 다. 이 밖에 치아를 손상시키는 충치균의 생육억제와 비만 및 당뇨병의 예방, 치 료 물질을 탐색한 결과 적피단풍나무, 좀작살나무, 석류나무, 유구적송, 소나무 및 차나무 등의 추출물에서 충치균 생육억제 효과가 높았다. 화장품 소재(천연미
제4장 생물공학 연구 백제)를 개발하기위한 티로시나이즈(tyrosinase)효소활성 억제검정에서는 뽕나무 류 및 산겨릅나무 추출물이 우수하였다. 앞으로 이러한 수종의 추출물을 분리, 동정하고, 화학적 구조확인 및 각종 안전성 검정을 통하여 천연보존제 등 목적에 맞는 소재개발이 가능할 것으로 생각된다. 1302 1369 801 673 그림 4-3 항균활성 검정 여러 가지 산림식물에서 추출한 추출물 이 적셔진 페이퍼디스크를 미생물번식 배지위에 올려 놓으며, 항균물질이 포함 된 페이퍼디스크 주위에는 미생물이 자 라지 못한다. 그림 4-4 천연보존제 저장시험 여러 가지 산림식물의 추출물에 대한 항 균 활성 검정 결과 항균력이 우수한 산림 식물추출물에 대하여 여러 가지 식품의 저장시험을 실시하였다. 앞쪽: 추출물 처 리구-식품의 보존상태 양호 뒤쪽: 추출 물 무처리구-식품의 부패가 심함 또한 옻나무의 우루시올 성분이 암세포 증식억제효과(시판항암제에 비해 혈액 암세포 3배, 폐암세포 약 100배)와 플라보노이드 성분의 항암, 항산화, 숙취해소, 위염억제효과를 확인하고 국내 및 국제특허(미국 등 4개국) 출원하였다. 그리고 헛개나무에 대하여 유전자원 수집 및 우량개체 선발(100본)과 증식법을 개발하고, 과병 및 어린가지 조직의 열수 및 메탄올 추출물이 뛰어난 간독성 해소 및 숙취 해소효과를 확인하였다. 가시오갈피나무의 뿌리, 줄기, 잎은 흥분완화 및 스트레 스 해소, 당뇨병과 항암제의 부작용 경감, 위궤양 보호 효과가 있다. 주요 성분은 엘루세르사이드류(eleuthrosides) 및 클로로제니 액시드(chlorogenic acid) 등이 다. 또한 분포집단, 수체부위 등에 따라 정량, 정성한 결과, 약효성분함량이 산지 별, 부위별 및 줄기 굵기 별로 차이를 보여 선발 가능성을 확인하였다(안 등, 2002; 이 등, 2003, 2004, 2005).
임목육종 50년 3-1. 유용물질 대량배양 생물반응기 대량배양은 1980년대에 들어서면서부터 유전공학(genetic engineering), 분자생물학(molecular biology), 생물공학(bio-engineering) 및 생명과학(life science) 의 다양한 연구분야에서 일반인들의 관심이 고조되었다. 생물로부터 생 산, 이용되는 생리활성물질의 대부분을 차지하는 식물의 이차대사산물은 조직이나 기관에서 독자적으로 발현되거나, 주어진 환경에 적응하는 과정에서 생산되는 것 으로 알려져 있다. 이들은 기내에서 대량생산의 가능성이 확인되어 생물반응기에 의한 대량배양이 실시되었다. 3-1-1. 주목나무 배양 택솔(taxol)은 주목의 수피에서 추출한 물질로, 1992년에 난소암 등에 효과가 인정되어 미국식량의약국(FDA)으로부터 약품공인을 받아 항암제로 널리 이용되 고 있다. 그러나 주목나무 수피의 택솔함량이 0.02~ 0.05% 정도의 수준에 지 나지 않으므로 산림과학원에서는 생물공학기법 중의 하나인 세포배양법을 통한 택솔 생산법이 연구되었다(Son 등, 2000). 1995년도에 시작된 주목나무 종자의 씨눈배양에 의한 택솔 및 그 유도체를 생 산하기 위한 연구 에서 가장 중점을 두었던 사항은 세포주 선발이다. 주목종자로 부터 약 30만개의 배를 적출하여 시기별로 배양한 결과 9월 이후의 종자에서 적출 된 배에서만 캘러스 유도율이 양호하였다. 세포현탁배양시 세포생장배지는 mb5 에 2,4-D를 2-4ppm 첨가하는 것이 좋았고, 물질생산배지로서는 MS 배지에 NAA를 6ppm 정도 넣어주는 것이 좋은 결과를 가져왔다. 배양세포의 대량배양을 위해서는 교반식 생물반응기(stirred tank reactor)보다 공기부양식 생물반응기 (air lift bioreactor :20L)에서 가장 좋은 결과를 얻을 수 있었는데, 이때 세포의 생장은 침적량(PCV)으로 측정한 결과 배양 2주후 약 8배에 달하였다. 소규모 생 물반응기(20L)의 연구결과 가장 효과적인 것으로 판명된 풍선형 생물반응기 (balloon type air bubble bioreactor)를 각각 100L, 300L, 500L규모로 제작하여 주목세포를 배양한 결과, 20L급보다 더 빠른 세포생장을 보임으로써 향후 대량배 양에 관한 가능성을 확인하였다. 그러나 주목세포 배양체의 택솔성분은 함량이 저 조하여 경제성이 낮아 산업적인 생산은 어려웠으나, 앞으로 계속하여 생산성 향상
제4장 생물공학 연구 을 위한 연구를 계속한다면 산업화도 가능할 것으로 생각된다. 본 연구는 주목 씨눈 세포배양법에 의한 택솔생산법 개발 로 특허출원(1994. 6) 및 등록(1995. 8) 하여, (주)보락에 매각금액 12억원에 국유특허권을 공매하였다. 3-1-2. 산삼배양 인삼, 산삼, 오갈피, 가시오갈피, 섬오갈피, 두릅 등으로 분류되는 오갈피나무 과 식물들은 식물체내에 인체에 유익한 다양한 생리활성물질을 함유하고 있다. 또한 독성이 없어 약용으로 널리 이용되고 있다. 특히 뿌리 부분은 유용물질이 집적되어 가장 우수한 약효를 나타낸다. 1997년에 시작된 산삼세근배양 연구는 2001년 생물반응기에서 산업화가 가능한 5000L급에서 배양이 가능하도록 발전시켰다(그림 4-5). DNA 감식 등 전문가들에 의해 분석된 산삼과 인삼의 유전적 차이는 단정 할 수 없을 정도로 미비한 차이로 나타난다고 한다. 그러나 산삼은 인삼에 비하여 독특한 성분이 있을 것으로 추정하 고 있었다. 산삼은 인삼과 마찬가지로 다양한 성분들이 함유되어 있다. 이들 중에서 도 가장 중요한 성분은 진세노사이드(Ginsenoside)로 불리는 사포닌 인데, 지금까 지 Ro, Rb1, Rb2, Rg1, Rh2 등 30개 이상의 사포닌 성분이 과학적으로 확인되었 다. 이들 성분들은 하나 하나가 우수한 약효를 가지고 있지만, 각 성분들간의 함유 비율 및 전체 사포닌 물질이 차지하는 함유비율 등도 약효에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이 성분은 신장기능 개선과 혈압강하 작용에 탁월한 효과를 나타낸다. 또한 간기능 활성화, 면역기능 회복, 환경 호르몬 억제 등의 효과도 확인되었다. [그림 4-5] 생물반응기에서 주목세포(왼쪽:20L), 산삼세근(가운데: 20L) 배양 및 5,000L급 대형 생물반응기(오른쪽)
임목육종 50년 산삼세근의 기내무균배양 과정은 시료를 구입하여 소독 및 캘러스 조직을 유기 한 후, WPM + IBA 2-5ppm배지에서 세근을 분화시킨다. 분화된 세근을 0.5-1.5cm로 조제하여 생물반응기에 넣어 배양한다. 배양 결과 500L 생물반응기에서 70kg, 5000L 생물반응기에서 109kg을 수확하였고, 유효성분인 사포닌 함량도 0.70% - 1.06%가 생산되어 인삼보다 약간 높거나 비슷하였다(Son 등, 1999). 본 연구는 생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근)의 대량생산방법 으로 특허출원 (1998.10) 및 등록(2001. 12)하여, (주)비트로시스에 매각금액 1850만원에 국유특 허권을 공매하였다. 3-1-3. 가시오갈피 배양 가시오갈피나무는 한국, 러시아, 중국, 일본 등에서 자생하며, 뿌리와 줄기에는 인삼에 버금가는 약효가 있어 siberian ginseng 으로 알려져 있다. 우리나라는 해발고가 높은 심산지역 산지곡간에 자생하나 최근 남획으로 인하여 멸종 또는 개체수가 현저히 줄어드는 심각한 수준에 이르고 있어 멸종위기식물로 지정하고 있다. 예로부터 오갈피속 식물들은 중국과 우리나라에서 식물종간의 구별이 없이 오가피( 五 加 皮 )나무로 통칭되어 약용으로 사용되어 왔다. 주로 강장, 강정, 신경 통, 중풍, 이뇨, 고혈압, 저혈압, 노화현상, 병후나 산후의 자양걍장제 및 치료제 로 사용되고 있다. 지금까지 가시오갈피나무에서 알려진 생리활성물질은 근피, 수피 및 잎에서 eleutherosides A, B, B1, B4, C, D, E, I, K, L, M과 chlorogenic acid 등 50 여 성분이 분리, 구명되었다. 가시오갈피나무의 기내무균배양은 우량한 식물체를 선발한후 성숙한 종자를 채 취한다. 그러나 종자내에 있는 접합자배(씨눈)은 미숙한 상태이기 때문에 종자의 성숙 및 휴면타파를 위하여 6개월에서 2년정도의 저온 층적처리가 필요하다. 그 러나 온도 15 C에서 2개월 정도의 습윤층적저장법을 사용한다. 종자를 소독 후 성숙배를 적출하여 GA 3 1.0 mg L -1 이 첨가된 1/2MS 고체배지에 치상하여 생육에 적합한 배양실에서 줄기와 뿌리를 완전히 갖춘 기내무균 식물체로 2개월간 배양 한다. 배양된 식물체에서 뿌리를 채취 1.0-1.5cm의 길이로 절단하여 삼각플라 스크에서 IBA가 첨가된 1/2MS배지에 배양하였다. 2-3주간 배양(10일 간격으
제4장 생물공학 연구 로 계대배양)으로 뿌리 절편체에서 부정근 원기를 유도한 후 생물반응기 접종용 시료로 사용하였다. 생물반응기를 이용한 가시오갈피의 부정근 배양은 5L 용량의 공기부양식 생물 반응기에 1.0-1.5cm로 절단된 가시오갈피 부정근을 배지 1L당 2.5-4g 정도 접종하는 것이 좋다. 공기부양식 생물반응기에서 가시오갈피 부정근을 배양할 경 우 배양온도가 부정근의 증식에 가장 민감한 반응을 보이는데 21±1 o C 정도가 가 장 빠른 생장을 보였다. 배양온도가 25 o C 이상이 되면 아주 저조한 생장을 보인 다. 생장 중 공기의 공급은 초기에는 배양체가 느리게 이동할 정도로 공급하다가 부정근이 자라면 엉키지 않을 정도로 공기의 공급량을 늘린다. 배지의 공급은 배 양 부정근이 생장하는 상태로 보아 중간에 1-2회 (접종 후 1개월 이후 첨가)정도 첨가해주는 방식이 1회만 공급하는 회분식 배양(one batch culture)보다 훨씬 효 과적인 것으로 나타났다. Pilot급 또는 대용량 생물반응기를 이용하여 다량의 부 정근을 얻기위한 요건 중의 하나는 가시오갈피 시료를 1.0-1.5 cm크기로 조제 하여 접종용 생물반응기에서 2주일 정도 배양하면서 오염여부를 확인하고 큰 규모 (100L 급 이상)의 생물반응기에 안전하게 이송하는 기술이다(안 등, 2003, 2004). 3-1-4. 섬오갈피 배양 섬오갈피나무는 제주도 자생종으로 바닷가에서부터 해발 1400m에 이르는 계곡 이나 숲속에서 높이 2m까지 자라는 낙엽활엽관목이다. 독성이 없고 약효가 우수 하여 오랜 옛날부터 주민들의 민간약으로 널리 이용되어왔다. 최근 다양한 생리활 성물질이 분리되었는데, 특히 아칸토산, 엘루세르사이드 등 섬오갈피 뿌리에 함유 된 약용성분은 항염활성 및 면역체계의 항상성 유지 등에 뛰어난 약리작용이 있 다. 또한 패혈증, 관절염, 염증, 류마티스 관절염, 간경변, 규폐증 등의 치료 및 예 방 효과가 우수한 것으로 보고 되어 있다. 섬오갈피나무의 기내무균배양은 우량한 식물체를 선발한 후 신초지를 채취, 표면소독은 실시한 후 액아나 동아가 부착되도록 0.5-1.0cm 길이로 절단하여 BA 3.0-5.0 mg L -1 및 NAA 0.1-0.5 mgl -1 L 를 첨가한 MS배지에 치상, 다신초 및 줄기생장을 유도한다. 유도, 생장된 줄기를 절단하여 IBA 0.3-1.0 mg L -1 가 첨가된 1/2MS 배지에 치상, 발근시켜 기내무 균 식물체로 육성한다. 기내무균 식물체의 순화에 적합한 토양은 펄라이트(perlite)
임목육종 50년 +피트모스(peatmoss)+퇴비(원예용)=1:1:1 또는 버미큐라이트(vermiculite)+퇴비 (원예용)=2:1의 부피비로 혼합한 배양토가 우수하였다(안 등, 2005). 생물반응기를 이용한 섬오갈피의 부정근 배양은 육성된 기내무균 식물체의 뿌 리를 절단하여 삼각플라스크에서 IBA, NAA 및 2,4-D가 첨가된 1/2MS배지에 배양하였다. 3-5주간 배양(10일 간격으로 계대배양) 후 부정근을 유도한 후 1.0-2.0 cm 길이로 잘라 생물반응기 접종용 시료로 사용하였다. 5L 용량의 공 기부양식 생물반응기에 1.0-1.5cm로 절단된 섬오갈피 부정근을 배지 용량의 0.3 %(배지 1L당 3g)정도로 접종하는 것이 적당한 농도 이었다. 공기부양식 생물 반응기에서 섬오갈피 부정근을 배양할 경우 배양온도가 부정근의 증식에 가장 민 감한 반응을 보이는데 23±1 o C정도가 가장 빠른 생장을 보였다. 배양온도가 28 o C 이상이 되면 아주 저조한 생장을 보인다. 생장 중 공기의 공급은 초기에는 배양 체가 느리게 이동할 정도로 공급하다가 부정근이 자라면 엉키지 않을 정도로 공 기의 공급을 늘린다. 배지의 공급은 배양 부정근(세근)이 생장하는 상태로 보아 중간에 1-2회(접종 후 1개월이후 첨가)정도 첨가해주는 방식이 회분식 배양 (one batch culture)보다 훨씬 효과적인 것으로 나타났다. 파이롯트급 또는 대용량 생물반응기를 이용하여 다량의 부정근(세근)을 얻기 위 한 요건 중의 하나는 섬오갈피 시료를 1.0-1.5 cm크기로 조제하여 접종용 생물 반응기에서 2주일 정도 배양하면서 오염여부를 확인하고 큰 규모의 생물반응기에 안전하게 이송하여 배양하는 기술이 필요한 것으로 판단되었다. 확립된 오갈피류 부정근의 대량생산 방법은 2005년 11월 가시오갈피 기내식물체 및 생물반응기를 이용한 가시오갈피나무의 부정근의 대량생산방법 과 생물반응기를 이용한 섬오갈 피의 부정근의 대량생산방법 및 섬오갈피나무 묘목의 대량생산방법 으로 특허 등 록하였다. 기내에서 식물 무균배양체를 배양하여 생물반응기에 접종, 단기간에 대량배양 으로 유용생리활성물질을 생산하는 연구는 연구기간의 일천과 식물 무균배양체의 조성과 배양 및 유용한 2차대사산물의 유도가 어려운 관계로 거의 대부분이 실험 단계에 머물고 있다. 따라서 앞으로 생리활성물질의 생산 연구는 유용한 생리활 성물질을 생산하는 식물체의 선정에서 기내에서 식물배양체 하나하나가 최대의 생장을 유지하기 위한 최적배양환경조건의 구명이 선행되어야 한다. 또한 유용물
제4장 생물공학 연구 질의 지속적인 생산을 위한 elicitor처리 등 각종 연구와 분석조건의 확립이 해결 되어야 될 것이다. (안진권). 가시오갈피나무와 열매(좌), 가시오갈피 부정근 배양(우) 섬오갈피나무 섬오갈피 기내식물체 섬오갈피 부정근 배양 그림 4-6 가시오갈피나무와 섬오갈피나무의 부정근 배양 <참고문헌> 1. 박소영, 안진권, 이위영, 박혜진. 2004. 산마늘 다신초 덩어리로부터 인경 형 성과 비대에 미치는 methyl jasmonate의 영향. 식물생명공학회지 31: 79-82. 2. 박소영, 안진권, 이위영. 2003. 왕자귀나무의 뿌리절편에서 고도의 식물체 재분화. 한국임학회지 92(6) :626-631. 3. 박소영, 이위영, 안진권, 권영지, 박혜진. 2004. 산마늘 다신초 증식과 인경 형성에 효율적인 생물반응기 배양방식. 식물생명공학회지 31: 127-132. 4. 박영기, 이위영, 박소영, 안진권, 한무석. 2005. Anticariogenic activity of Callistemon citrinus extract against streptococcus mutans. Journal of the Wood Science and Technology 33(2):72-77 5. 박영기, 이위영, 박소영, 안진권, 한무석. 2005. Antioxidant activity and total phenolic content of Callistemon citrinus extracts. Food Science
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임목육종 50년 제4절 유용유전자 분리 이용 및 QTL mapping 분석 1987년 미국 Calgene 사에서 근사미 저항성 유전자(EPSP)가 도입된 최초의 형질전환 포플러가 개발된 이래 대략 30여종의 임목에서 유전자변형 임목이 개발 되었다. 목본식물과 대부분 초본성인 농작물간에 생리대사, 유전현상 등에서 거 의 차이가 없기 때문에 농작물에서 이미 증명된 새로운 기술들이 별다른 어려움 없이 바로 도입 적용이 가능하다. 단지 식량작물과는 달리 임목의 유전자변형은 임지 생산성 향상을 위한 재질 및 수형개량, 고속생장 유도 등이 일차 목표이며 이러한 품종의 적응성 향상을 위해 내병충성, 내스트레스성 등의 형질을 부가시 키고자 하는 특징이 있다. 따라서 식물의 개화, 노화, 생장 및 내병충성 등에 관 여 하는 유전자를 분리한다면 임목의 형질개량에 이용될 수 있을 것으로 생각된 다. 그러나 지금까지 임목의 형질개량에 필요한 재질, 생장, 형태 등에 관련되어 분리된 유전자의 수는 매우 적은 실정이므로 유용 유전자를 분리하기 위한 유전 자 탐색은 매우 절실하게 요구되고 있다. 국립산림과학원 생물공학과의 유용유전자 분리이용 연구는 1980년대 초기의 임 목조직배양연구에 그 뿌리를 두고 있다. 조직배양, 형질전환을 거쳐서 임목의 유 전자 탐색 및 분리로 연구의 영역이 다변화되고 심화된 결과라고 할 수 있다. 이 미 2005년 포플러 유전체 전체의 염기서열이 외국에서 공개되고 있는 상황을 감 안하면 현재 우리의 연구는 적어도 시대의 변화에 적응하고 앞서 나가려고 노력 하고 있음을 확인하게 해 준다. 다음은 우리가 이 단계에 도달하기까지 거쳐 온 단계들을 요약 정리한 것으로 90년대부터 현재까지 미생물, 다른 모델식물 및 포 플러로 유전자 급원이 달라지고 있는 것은 이 분야의 발달과정을 잘 반영하고 있 다. 현재 생물공학과의 유용유전자 분리이용 연구는 임목의 생장, 재질, 형태를 개량하기 위한 기초연구로서 임목 특유의 유전자를 분리하고 그 특성을 규명하여 이를 임목의 개량에 다시 이용하자는 것이다. < 1986-1995 > 임목으로의 유전자 이식실험은 1987년에 아그로박테리아(Agrobacterium tumefaciens) 의 야생형을 이용한 형질전환 시험이 그 시작이었다고 할 수 있다. 이 당시의 실
제4장 생물공학 연구 험은 두가지 야생형 Ti plasmid 벡터인 ptic58과 ptibo542를 이용하여 소나무, 피나무, 버드나무, 양버들 및 상수리 나무의 조직에 접종하고 종양조직(tumor)이 형성되는지를 확인하는 정도였다. 이 종양조직은 아그로박테리아의 T-DNA 상의 식물호르몬 합성유전자들이 식물의 DNA로 이식되어 식물체에 의하여 형성되기 때문에 이로써 그 조직이 형질전환 되었음을 확인할 수 있으나 이 조직은 종양만 을 형성할 뿐 식물체를 발생시키지는 못하는 특성을 가지고 있었다(최 등 1988). 이 실험은 그 후 몇 해 동안 되풀이 되어 1989년에는 형질전환된 식물체의 재분 화에 성공하였다(이 등, 1989). 이는 식물체에 삽입된 호르몬합성 유전자가 간혹 돌연변이를 일으켜 제 기능을 못함에 따라 정상식물체가 발생된 경우라고 볼 수 있다. 1989년부터는 다른 계통의 아그로박테리아인 Agrobacterium rhizogenes를 이 용한 모상근( 毛 狀 根 ) 유도도 시도되어 유도된 모상근에서 오파인의 일종인 아그 로파인과 만노파인을 검출하였는데 이 물질들은 호르몬 합성유전자와 함께 아그 로박테리아에서 식물 세포내로 옮겨진 유전자들에 의하여 합성되는 것으로 알려 져 있다. 1991년에는 야생형이나 표지 유전자만을 가지는 T-DNA 벡터로부터 벗어나 살 충성독소를 만드는 BTT (일종의 토양 박테리아 Bacillus thuringiensis의 특성 계통에서 만들어 짐)와 사람의 Proinsulin 유전자가 들어있는 벡터를 이용한 형 질전환이 시도되어 이들 중 Proinsulin 유전자로 형질전환된 세포에서 식물체가 유도되었다. 이렇게 형질전환된 양황철나무에서 항생제 kanamycin 에 대한 저항 성 유전자(NPTⅡ)의 발현은 ELISA(enzyme linked immunosorbant assay) 기 법을 이용하여 확인하였으며 Southern hybridization 기법을 사용하여 이 유전 자의 삽입을 확인하였다(김 등. 1995). 그러나 이상의 몇 년간의 실험은 사실상 뚜렷한 목표 없이 구할 수 있는 유전 자들을 이용하여 임목의 형질전환실험의 가능성을 확인한 정도였다고 요약될 수 있다. 따라서 임목육종연구소에서 벡터를 직접 개발하려는 실험이 1992년 시작되 었다. 그 첫 번째 실험의 주요 대상 유전자로 살충성 독소 단백질을 만드는 BTK 유전자를 선택하였는데 이 독소단백질은 알칼리성 환경에서 여러 조각으로 분해 되어 독소의 기능을 나타내는 특성이 있다 (Schnepf 등 1985). 이 BTK 유전자를
임목육종 50년 Bacillus thuringiensis var. kustaki로부터 분리하여 T-DNA 벡터를 제작한 후 수원포플러에 삽입시켜 식물체를 재생시켰다(노 등 1994). 1995년은 형질전환을 이용하여 생분해성 플라스틱을 생산하려는 실험이 시작되 었다. 이는 박테리아에서 생분해성 플라스틱을 생산하는데 관여하는 유전자를 분 리하여 탄소원이 풍부한 식물의 엽록체에서 발현되도록 조작하여 포플러에서 생 분해성 플라스틱을 생산하려는 것이다. 먼저 첫 단계의 실험으로 콩에서 분리한 transit peptide 코딩유전자와 박테리아에서 phbb를 분리하여 T-DNA 벡터에 클로닝하여 현사시에 삽입시켰으며 식물체 분화까지 성공하였다 (노 등 1995). < 1996-2005 > 4-1. 형질전환식물의 기능성 4-1-1. 미생물 유전자 분리 이용 대부분의 생물에서 기본적인 대사회로는 공유되고 있기 때문에 생물체간의 유전 자 호환이 가능하다. 따라서 다른 생물의 기능이 밝혀진 유전자를 적절하게 조작하 여 사용할 경우 물질 생산, 스트레스 저항성, 내병충성 등 특수 기능이 보강된 우량 품종 개발이 가능하다. 유전자의 정보가 많지 않았던 90년대 중반에는 미생물의 유 용 유전자를 분리하여 임목에 삽입시켜서 임목의 형질개량을 하려는 시도가 이루어 졌다. 이들 중 icda(isocitrate dehydrogenase), ADC(arginine decarboxylase), PhoB (nucleotidee phosphatase), SpeD(S-adenomycine phosphotransferase) 유전자가 가나마이신 또는 하이그로마이신을 선발표지로 하여 T-DNA 벡터로 개 발되었다. 이 벡터를 현사시에 도입하여 형질전환 식물체를 생산하였다. 또한 내염성에 관여하는 유전자로 알려진 beta(choline mono-oxygenase), betb (betaine aldehyde dehydrogenase), mtld(mannitol dehydrogenase), gutd(glucitol -6-phosphate dehydrogenase) 등이 대장균에서 분리되어 포플러에 도입되었으 나 이들 유전자 발현효과는 대부분 기대에 못 미치는 것들이었다. 무엇보다도 도 입유전자들의 발현효과가 크지 않았고 미세한 발현효과를 검증할 체제가 아직 확 립되지 않았기 때문이었다. 그러나 그 중에서는 미세한 발현으로 큰 효과를 내는 유전자도 있는데 호르몬합성 유전자들이 여기에 속한다고 할 수 있다.
제4장 생물공학 연구 아그로박테리아에서 싸이토카닌 합성유전자인 tmr(isopentenyl trans-ferase) 과 식물 생장호르몬인 zeatin을 생산하는 tzs(trans-zeatin secretion) 유전자를 분리하였다. 이 tzs 유전자가 도입된 포플러에서 발현된 경우 뿌리형성이 억제된 반면 빗자루 모양의 많은 줄기가 발생하였으며, 이 유전자의 발현을 최소한으로 낮출 경우 줄기비대생장이 관찰되면서도 나이테 형성이 억제되는 현상이 나타나 서 유전자 도입에 의한 재질의 변형이 가능함을 보여주고 있다. 임업생명공학에서 내병충성 유전자를 도입하는 이유는 임지의 생산성 향상이 그 목적이라고 할 수 있다. 생산성은 생물 자체의 빠른 생장 이외에도 병충해 및 자연 재해로부터의 손실을 줄이는 것으로 제고시킬 수 있는데 이는 내병충성 유 전자, 재해저항성 유전자의 집적 및 발현 조절로 해결 가능할 것이다. 생물공학 과에서도 bt 유전자 등을 도입한 포플러가 개발되었으나 bt의 대상해충 범위가 매우 좁은 반면 포플러의 경우 알려진 해충만 16종에 이르는 넓은 스펙트럼 때문 에 내충성이라고 할 만한 품종의 개발은 지연되고 있다. 4-1-2. 생분해성 플라스틱 생산 석유화학 제품인 플라스틱은 사용이 편리하나 썩지 않기 때문에 환경공해가 되고 있다. 이를 대체할 생분해성 플라스틱의 여러 종류가 개발되었다. PHB라는 플라스 틱은 미생물유래의 생분해성으로 미생물에서는 phba, phbb, phbc(polymerase) 가 알려져 있다. 이미 미국 등에서 이 유전자들은 애기장대 식물에 도입하여 식물 에서 이를 생산한 바가 있다. 생물공학과에서도 이 유전자들을 엽록체로 전달하는 transit peptide 염기를 접속하고, 선발마커로 가나마이신저항성 유전자나 하이그 로마이신 저항성 유전자를 붙여서 각각 또는 두 가지 유전자를 하나의 T-DNA상에 위치하도록 벡터를 제작하여 현사시에 도입하였다. 한 가지 또는 두 가지의 유전자가 삽입된 형질전환된 식물체에 중복 형질전환 하여 세 개의 유전자가 모두 들어간 식물체를 확인하였다. 형질전환된 수십 개체 의 식물체에서 잎을 채취하여 플라스틱 함량을 측정하여본 결과 건중량의 0-0.85%로 다양하게 나타났다. 그러나 더 이상의 함량 증가는 이루어지지 않았다. 이는 세포내에서 특정물질의 과도한 집적을 억제하는 기작이 있기 때문으로 추측 된다. 이와 유사한 몬산토의 과제도 같은 해에 함량증가에 실패하고 종결되었다.
임목육종 50년 그러나 이 과제를 통하여 다수유전자 탑재 벡터개발, 이중형질전환 등의 다양한 분자적 기술을 습득한 것이 하나의 성과라고 할 수 있다. 4-1-3. 환경정화용 형질전환체 육성 식물을 이용하여 환경오염을 제거하는 phytoremediation 기술은 식물유전공학 의 떠오르는 분야중 하나인데 여기서도 임목은 가장 현실적인 target이 되고 있 다. 특히 포플러 같은 속성수의 경우 토양오염물질의 흡수가 빠르고 공해에도 비 교적 강하여 다양한 환경오염을 정화하는 최적의 식물로 평가받고 있다. 최초로 이용된 유전자는 개구리의 ferritin 유전자와 쥐의 MT (metallothionein) 유전자로 2가의 중금속과 결합하여 중금속의 독성을 무독화시키는 유전자이다. 이 유전자들은 전북대학교 유전공학연구소에서 벡터로 개발된 것들로서 이 유전자들 을 도입시킨 포플러가 개발되었고 카드뮴 등에 제한적인 내성을 부여하는 것으로 확인되었다. 중금속 중 특히 수은은 그 독성이 심각하기 때문에 제일 먼저 정화되어야 할 오염원이다. 수은대사 유전자 중 mera 유전자는 인체에 유해한 Hg 2+ 를 독성이 없는 Hg0 상태로 바꿔주는 유전자이며, merb 유전자는 극소량으로도 인체에 치 명적인 질병을 유발하는 phenyl mercurical acetate의 탄소결합을 절단함으로써 무독화 시키는 기능을 가진다. 생물공학과에서는 두 가지 유전자를 각각 다른 선 발표지(가나마이신 및 하이그로마이신)에 부착시킨 식물형질전환 벡터를 개발하 여 한 식물체에 중복 형질전환하여 유전자 도입 포플러를 개발하였다. 이 중복형 질전환체는 배지 내에 무기수은과 유기수은을 첨가하고 callus 배양과 아배양으 로 수은에 대한 내성이 검정되었다. 또한 액체 현탁배양 방법으로 배지에 수은을 처리하였을 때 세포의 생장량 뿐만 아니라 세포내의 생화학적 변화 또한 수은에 대하여 내성이 있음을 확인하였다(최 등, 2001). 그리고 화분에 식재된 식물체를 이용하여 내성을 검정한 결과 또한 수은 제거 능력이 우수한 것으로 나타났다. 이 유기수은 유전자는 항생제 유전자를 대치하여 형질전환체를 선발하는 선발표 지자로 개발하여 특허를 획득하였다(최 등, 2005). 형질전환 실험실에서는 세포배양을 이용하여 세포의 생장과 생화학적반응을 조 사하는 방법을 식물 형질전환체의 내성검정에 최초로 도입하였다(최 등, 2001).
제4장 생물공학 연구 이러한 방법은 스트레스에 대한 세포의 기계적 변화뿐만 아니라 세포내의 생화학 적 변화를 구명함으로써 빠르고 손쉽게 형질전환체의 스트레스에 대한 반응을 조 사할 수 있게 되었다. 알루미늄은 아마도 모든 토양에 가장 많이 함유되어 있으며 식물의 생장에 치명 적인 피해를 주는 중금속일 것이다. 유기산은 이러한 알루미늄의 독성으로부터 뿌 리를 보호해 주는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 미생물에서 유기산 citrate 합성에 관여하는 csb 유전자를 현사시에 도입한 형질전환체를 육성하였다. 포지에 식재한 csb 형질전환체는 특이하게도 주변의 다른 형질전환체와 비교하여 저조한 생장을 보이거나 정아부분이 고사하는 개체가 관찰되어 과도한 유기산의 생산이 생장에는 좋지 않은 효과를 주고 있음이 확인되었다. 위에서 설명한 유전자들은 모두 목표(target) 오염원 제거나 무독화를 염두에 둔 유전자 조작이라고 할 수 있다. 그러나 이 보다는 모든 스트레스에 고루 반응하여 내성을 부여하는 유전자들이 있다. 주로 항산화 기작에 관련된 유전자로서 SOD, APX, GR 등이 대표적인 유전자들이다. 본 실험실에서는 대장균의 gor 과 sod 유 전자를 cloning 한 후 다른 선발표지자인 hygromycin 저항성 유전자를 이용하여 기존의 형질전환체에 중복 형질전환하였다. 얻어진 중복형질전환체는 control이나 유전자가 한개 삽입된 형질전환체와 비교하여 중금속 내성이 증가하였음이 확인되 었다. 4-1-4. 다른 식물 유전자 이용 최근 애기장대, 벼 등의 식물 유전자 염기서열이 완전히 결정되면서 식물의 기 능성 유전자가 쏟아져 나오고 있다. 이러한 유전자는 식물의 유전자이므로 식물 에서의 발현이 거의 검증된 것이라고 할 수 있어서 그 효용 가치는 미생물이나 동물의 유전자보다는 더 높다. Bt 독소단백질의 좁은 대상해충의 약점을 대체하기 위한 유전자로 해충의 소화 를 방해하는 proteinase inhibitor 유전자를 도입한 효과가 농작물에서 이미 입증 된 바 있다. 토마토와 감자의 proteinase inhibitor 유전자를 분리하여 형질전환 벡터를 제작한 후 포플러에 이들을 각각 도입하였다. 이들 형질전환체의 내충성 검정은 야외 식재지에서 이루어질 예정이다. 또한 bt 유전자이외에도 강남콩의 내
임목육종 50년 병성 유전자 chi(chitinase), 감자의 내충성 유전자 popi (proteinase inhibitor), 벼에서 병원성관련 단백질로 알려진 OLP(osmotin like proein) 유전자를 분리하 여 식물형질전환 벡터를 제작하고 이를 이용하여 형질전환된 포플러를 생산하였으 나 내충성이라고 할 만한 품종은 아직 개발되지 않고 있다. 이는 더 많은 유전자 의 집적으로 해결해야할 문제라고 여겨진다. 내염, 내건성은 분리되기 어려운 형 질로서 다른 식물에서는 한두개의 유전자 도입으로 상당한 효과가 있는 것으로 발 표되고 있다. 애기장대의 AtGSK1 유전자 형질전환체가 NaCl 등의 피해에 비교적 강한 것으로 나타나고 있으며 내건성도 증진된 것으로 확인되었다. 임목의 발달과정에서 바람직하지 않은 형질은 과도한 측지의 발생이라고 할 수 있다. 토마토의 측아억제 유전자(Lateral Suppressor)를 도입시킨 국화에서 측아 발생이 억제되었다는 보고가 있었다. 본 실험실에서도 이 토마토의 LS 유전자를 도입시킨 포플러를 육성하였으나 측아형성 억제는 되지 않은 것으로 확인되었다. 최근 포플러 유전체 전체 염기서열이 밝혀짐에 따라 LS 유전자의 포플러 homology를 탐색하였으나 성공하지 못하였다. 이는 포플러와 토마토의 유전적 유사성이 작음에서 기인되는 것으로 생각되며 이러한 결과는 모든 식물의 유전자 가 포플러의 발달조절에 작동되지는 않는다는 것을 암시한다. 4-1-5. 포플러 유전자의 이용 앞의 토마토 LS 유전자의 예처럼 다른 식물의 유전자는 포플러에서 작동하지 않을 경우가 많으며 그 이유는 첫째 DNA 혹은 protein의 homology가 낮아서 인식이 되지 않거나, 둘째 작동이 된다고 하더라도 서열의 불일치에서 오는 어느 정도의 기능손실이 예상되기 때문이다. 따라서 대상 식물의 유전자를 직접 분리 하여 조작하는 것이 최상의 방법이라고 할 수 있다. 지금까지 임업생명공학은 애 기장대, 벼 등의 유전체 정보를 근거로 수행되었다. 그러나 2005년 마침내 포플 러의 유전체 정보가 전부 밝혀지면서 임업생명공학도 이제는 포플러의 유전자를 이용할 수 있게 되었다. 그러나 포플러 게놈 프로젝트가 완결되기 이전부터 생물 공학과에서는 cdna Library를 구축하여 포플러 유전자를 분리하고 있었다. cdna는 발현되는 유전자의 mrna를 다시 DNA로 전환시킨 것으로 원래의 유전 자와 염기서열이 거의 일치하는 것으로 특정 환경에서 만들어진 cdna는 결국 발
제4장 생물공학 연구 현된 유전자이다. 이것의 염기서열을 밝힌 것을 EST(Expressed sequence tag) 라고 하는데 이것을 이용하여 특정 세포 및 조직 내에서 어떤 유전자들이 발현되 는가 알 수 있다. 포플러 EST의 염기서열을 기초로 하여 스트레스 관련 유전자 ascorbate peroxidase, Cu/Zn SOD, glutathione S-transferase, protein kinase, pitative steroid membrane protein, kunitz trypsine inhibitor 등 6종의 유전자가 분리되었다. 이 유전자들을 이용하여 형질전환 벡터를 제작하고 포플러에 도입하여 유전자의 기 능을 구명 중에 있다. Copper chaperone 및 Cu/Zn SOD 도입 형질전환체들이 구 리 첨가 배지에서 더 좋은 생장을 나타내어 이들 유전자들이 구리 내성을 부여함을 확인하였다. 또한 세포생장 단계 중에서 특이 유전자인 포플러 thioredoxin H 등 5종의 염 기서열을 구명하고 단백질 발현 domain 분석 후 형질전환용 vector를 제작하고 형질전환 중에 있으며, 포플러 EST clone 중 기능이 확인되지 않은 유전자의 기 능을 구명하고자 포플러에서 유전자 발현을 차단하는 미동정 유전자 RNAi vector를 제작하였으며, 포플러에 형질전환 하여 발현이 급격하게 저하되는 개체 를 선발하여 그 유전자의 기능을 구명할 것이다. 4-1-6. 형질전환 포플러의 유전자발현의 안정성 지금까지 유전자 조작된 식물들은 1년생 작물들로 대부분 종자를 수확하여 파 종함으로써 차대의 유전적 분리비 등을 통하여 도입유전자의 안정된 유지와 발현 을 검정하고 있다. 그러나 개화기까지 10년 이상 걸리는 임목의 경우 장기적으로 생장하는 과정에서 도입유전자가 소실되거나 돌연변이 되거나 하여 발현이 되지 않을 수도 있다는 우려가 있는 것도 현실이다. 따라서 장기적인 유전자 발현의 안정성을 확인하고자 형질전환 포플러의 보존포지를 조성하였다. 형질전환된 포플러를 포지에 식재한 후 6년 및 9년이 경과하였을 때 미성숙잎, 성숙잎, 줄기 등을 사용하여 유전자 발현을 항생제 저항성, 도입유전자 효소의 활성, Southern blot 등을 통하여 조사하였다. 그 결과 미성숙잎은 가나마이신 150mg/l가 첨가된 배지에서도 캘러스가 왕성하게 발생되었으나, 성숙잎이나 가 지에서는 캘러스가 발생하지 않았으며 NPTII assay 결과에서도 미성숙잎이 활성
임목육종 50년 이 높게 나타났다. Southern blot의 결과도 도입유전자들이 유지되고 있는 것을 보여주고 있었다. 따라서 도입유전자는 시간이 경과해도 안정적으로 발현되며, 비록 CaMV 프로모터와 같은 항상성 프로모터를 사용하여도 식물체의 부위에 따 라서 발현양에 차이가 있다는 것을 확인하였다(노 등, 2004). [그림 4-7] 유전자 변형 포플러 (2년생부터 4년생까지) [그림 4-8] 유전자변형 포플러 (온실이식 전단계)
제4장 생물공학 연구 [그림 4-9] 포플러 줄기조직을 이용한 유전자변형 포플러 제작과정 4-2. 임목유전자 대량 기능분석 4-2-1. 포플러 cdna library 구축 본격적인 포플러 유전자 이용을 위하여 포플러 유전자 발현 도서관인 cdna library 가 먼저 구축되었다. 여기에서 8,962개의 EST(발현유전자)클론의 염기서열을 결 정하여 유전자 기능을 분석하였다. 이렇게 분석된 포플러 유전자 중 기능이 알려 진 유전자가 2,091개였고 지금까지는 알려지지 않은 기능을 가진 유전자가 949개 였다(Lee 등, 2005). 이러한 유전자들은 다양한 처리를 통하여 발현되는 특성으로 먼저 분류를 하게 되는데 현사시 배양세포에 납을 처리하여 여기서 특이적으로 발현이 유도되는 유 전자 672개를 다시 선발하였다. 외부 자극에 의하여 발현되는 유전자뿐만 아니 라 생장단계별로 발현되는 유전자도 분리되었다. 3개월된 현사시 삽목묘의 성숙 잎과 미숙잎에서 특이적으로 발현이 유도되는 유전자를 구명하였다. 이들 유전자 들은 형질전환을 통하여 그 기능이 확인될 것이다.
임목육종 50년 [그림 4-10] 포플러 배양세포에서 발현되는 포플러 유전자 5,337개가 탑재된 유전자의 기능별 분류(좌) cdna chip 분석(우) 4-2-2. 포플러 유전자의 microarray 분석 1990년대의 분자생물학의 도구가 cdna와 PCR이었다면 2000년대에는 단연 DNA -chip으로 알려진 microarray 분석기법이라고 할 수 있다. microarray는 작은 slide에 몇 천개의 다른 유전자를 탑재하고 이들 유전자들이 특정환경, 자극에서 어떻게 발현되고 상호작용을 하는지에 대한 정보를 제공한다. 따라서 지금까지 단일 유전자의 발현에 관심을 가지던 연구 유형을 동시 다발적으로 발현하여 상 호작용을 하는 서로 다른 유전자들을 조감할 수 있게 한다. 현사시 배양세포 EST 분석에서 얻어진 독립클론 3,378개의 cdna를 PCR로 증 폭한 다음 슬라이드그래스에 집적한 cdna chip, K-Pop1이 제작되었다. Chip 분석의 target으로 배양세포의 생장단계별로 정지기, 지수기, 안정기의 3기를 대 표하는 12개의 time point로부터 RNA를 분리하여 chip에 hybridization한 결과 유전자 발현 양상을 이용한 각 생장단계의 구분이 가능하였고, 세포분열이 왕성 한 지수생장기의 초기 및 중기에 발현이 특이적으로 증가하는 클론들이 선발되었 다. 이 유전자들은 임목의 세포분열 및 생장관련 특성구명을 통하여 유용유전자 선발에 이용될 수 있을 것이다. 이보다 더 진보된 chip으로 subtracted cdna library 분석에서 얻어진 독립클 론 5,337개의 cdna를 집적한 cdna chip, K-Pop2도 제작되었다. Microarray 분석의 target으로 포플러 배양세포에 저온, NaCl, Mannitol 및 ABA를 처리한
제4장 생물공학 연구 다음 RNA를 분리하여 chip에 hybridization 한 결과 스트레스 처리에 의해 발현 양이 2배 이상 증가하거나 감소한 유전자들을 분리 구분할 수 있었다. [그림 4-11] 유전자칩을 이용한 환경자극 특이발현 유전자 분리(좌) 및 확인(우) 4-2-3. 포플러 유전자특성 구명 EST 분석 등을 통하여 처음으로 분리된 유전자는 현사시의 copper chaperone (PoCCH) 유전자인데 이 유전자의 특성을 조사한 결과 cdna는 540bp로 이루어 져 있고, 85개의 아미노산으로 구성된 8.9kDa의 단백질을 암호화하는 것으로 나 타났으며, 아미노산 수준에서 애기장대의 CCH와 82.8%, 벼의 CCH와는 74.6%의 높은 상동성을 보여주었고, 중금속 결합부위가 잘 보존되어 있는 것으로 나타났 다. Southern blot 분석 결과 현사시의 게놈상에 PoCCH 유전자는 2-3 copy로 구성된 small gene family의 형태로 존재하는 것으로 나타났다(Lee 등, 2005). 두 번째 분리된 유전자는 현사시의 Bacterial induced peroxidase 유전자로 1,230bp로 이루어져 있고, 313개의 아미노산을 암호화하는 것으로 나타났으며, 다양한 스트레스 처리시 유전자의 발현증가는 관찰되지 않았으며 Bacterial elicitor인 laminarin을 처리했을 때 급격한 발현량 증가를 보였다. Southern blot 분석 결과 현사시의 게놈 상에 1 copy로 존재하는 것으로 나타났다(Bae 등, 2006).
임목육종 50년 4-2-4. 임목유전자 대량기능 분석의 금후 전망 과거 20여년의 형질전환 및 유전자 분리이용 연구는 미생물에서 시작하여 다른 식물의 유전자를 거쳐 마침내 목본 모델식물인 포플러로 들어서게 되었다. 아직 괄목할만한 품종이 나오지 못하는 것은 임목유전자의 도입, 검정의 사이클이 반 복적으로 이루어지지 못한 짧은 역사 때문이다. 포플러 게놈의 완결로 가속도가 붙은 유용유전자 분리연구는 그와 연결된 형질전환을 통한 신품종 개발의 가능성 을 한층 높여줄 것으로 예상된다. 앞으로 10년간 해결해야할 과제는 유전자 변형 임목의 환경방출 문제의 해결점을 찾는 것과 모델식물 포플러 이외의 다른 유용 경제 활엽수 및 침엽수로 연구개발 영역을 확장하는 것이다. 이미 기내 재분화 연구과제가 별도로 개설되어 진행되고 있으므로 이에 대한 해결도 그리 큰 문제 는 아닐 것이다(이재순). 4-3 임목의 유전자(연관)지도 작성과 QTL mapping 분석 < 1996~2005 > 유전양식이 규명된 다양한 DNA 표지를 이용하여 인공 교배 차대 또는 반수체 게놈을 지닌 침엽수류의 배유조직으로부터 얻은 DNA에 대한 분석을 수행함으로 써 DNA 표지들의 염색체에서의 위치와 상대적 거리 등을 표시한 유전자(연관)지 도를 작성하고, 상기 차대들의 생장에 대한 표현형적 변이와 밀접한 관계를 지닌 DNA 표지들이 염색체의 어느 부위에 있는지를 조사하면, 육종하고자 하는 목표 형질의 발현에 몇 개의 유전자가 관여되어 있는 지 그리고 최대의 표현형 성적을 나타낼 수 있는 유전자형 조합이 무엇인지를 확인할 수 있다. 이러한 형질관련 DNA 표지들을 선발육종에 이용한다면, 보다 높은 개량 효과를 얻을 수 있을 뿐 아니라 어린 유묘시기에도 우수 개체를 선발할 수 있어 육종 사업의 기간을 단축 시킬 수 있으며, 특히 최대 생장 성적을 나타낼 수 있는 개체를 만들기 위해 어 떤 유전자형을 지닌 수형목을 선정하여 인공교배에 이용해야 하는 지에 대한 해 답을 제시해 주기에 형질관련 DNA 표지 또는 기능성 유전자의 유전자형에 입각 한 분자육종설계(Molecular breeding by design)를 가능케 하여 고부가가치의 기능성 신품종 육성을 실현할 수 있다. 1997년부터 2004년까지 8년간 수행된 임목의 유전체 연구 를 통해 RAPD,
제4장 생물공학 연구 I-SSR 및 AFLP 표지를 이용하여 소나무, 리기테다소나무, 테다소나무 및 사시 나무에 대한 유전연관지도를 작성하였고, QTL mapping 분석을 통해 테다소나무 및 사시나무에 대한 수고 생장 등과 관련된 DNA 표지를 동정하여 DNA 표지의 유전자형에 따른 생장효과를 구명하는 데 성공하였다. 2005년부터는 임목의 뿌 리생장 특성에 대한 QTL mapping 연구 를 통하여 사시나무 3년생 전형매 가계 차대들에 대해 지상부 생장과 뿌리 생장 및 내건성 특성에 대한 형질관련 DNA 표지 및 유전자를 동정하는 데 주력하고 있는데, 특히 이 연구과제에서는 수분 스트레스 유발시 발현되는 기능성 유전자에서 유래된 ESTP(Expressed sequence taq polymorphism) 표지를 개발하여 QTL 분석에 활용함으로써 유전자의 발현 양과 염기서열의 차이에 따른 표현형 변화를 기능유전체학 연구 측면에서 구명하 고 있다. 4-3-1. 소나무 DNA 표지 개발 및 연관지도 작성 소나무 경북 4호에서 얻은 반수체 게놈 샘플 96개에 대한 AFLP 분석을 수행 하여 513개의 DNA 표지를 개발하였고, 152개 표지로 25개 연관지도(framework map)를 만들었다(그림 1). 연관지도 전체의 크기는 2,341 cm으로 평균 18.4cM 마다 1개의 DNA 표지가 위치하도록 작성되었는데, 이를 바탕으로 추정된 소나무 의 게놈 크기는 2,662cM이었으며, 상기 연관지도는 전체 게놈의 약 82%에 해당 하는 것으로 조사되었다. 4-3-2. 리기테다소나무 연관지도 작성 경남 1호 수형목 클론에서 얻은 96개의 배유 DNA에 대한 AFLP 분석을 수행 하여, 218개의 AFLP 표지를 개발하였고, 122개의 표지로 16개의 연관지도를 작 성하였다. 연관지도의 전체 크기는 799.8 cm이었으며, 이는 기 보고된 테다소나 무 게놈 크기의 40%에 해당하는 크기였다.
임목육종 50년 [그림 4-12] 소나무 AFLP 유전연관 지도 4-3-3. 테다소나무 수고 및 흉고직경 생장관련 QTL 확인 테다소나무 7-1037 수형목 클론에서 얻어진 6년생 반형매 풍매 차대에 대해 AFLP 분석을 수행하여 532개의 AFLP 표지를 개발하였고, 121개의 표지로 전체 길이 1,869 cm의 20개 연관지도를 작성하였다. 6년생 때의 수고 및 흉고직경 생
제4장 생물공학 연구 장에 대한 QTL을 동정한 결과, 수고에서는 4번 연관그룹의 92.49 cm 위치에서 1 개의 QTL을 확인하였고, 흉고직경 생장에서는 4번(104.8 cm), 10번(10.0 cm) 그 리고 11번 연관그룹(73.3 cm)에서 각각 1개씩의 QTL을 확인하였다(그림 4-13). 각 형질별 QTL의 대립유전자간 평균효과는 수고생장에서 최대 39.6cm이었고, 흉 고직경 생장에서는 9.4mm 이었으며, 전체 표현형 변이의 5.9 % 및 5.6%를 QTL에 의해 설명할 수 있는 것으로 확인되었다. *rcag343.1 *rcag294.7 *raag338 20.6 24.5 38.0 *CAG241.0 *GAG85 *raag404 24.5 22.0 *rcag69.6 *rcag356.4 20.6 22.7 52.4 *GCA74 *rcag98.4 22.0 14.1 *rgag173 *rgag160 10.3 *CAG526.5 15.0 26.0 *GAG250 *GTC318.0 12.2 *rgca526 22.3 15.3 *rgaa255 12.5 23.4 *raag398 12.0 *GTC475.6 *GAG555 *rtag149.9 Framework map 4 (124.7 cm) 22.0 *raag664 16.6 *CAG81.1 Framework map 4 (165.6 cm) *AAG377 Framework map 10 (159.1 cm) ; QTL for height ; QTL for DBH [그림 4-13] 테다소나무 반형매 풍매 차대의 수고 및 흉고직경 생장관련 QTL 위치
임목육종 50년 4-3-4. 사시나무 생장관련 QTL 확인 사시나무 선발 클론 오대 19호와 봉현 4호를 교배하여 얻은 2년생 차대를 대 상으로 수고생장량, 근원경, 줄기와 뿌리 건중량 및 전체 건중량에 대한 QTL (quantitative trait loci)을 동정하였다. 215개의 AFLP(amplified fragment length polymorphism) marker를 이용하여 전체 유전연관거리 545 cm 및 평균 marker 밀도 12.8cM의 16개 유전연관지도를 작성하였다(그림 4-14). QTL 분석결과, 8 번 연관군(21.8 cm)에 위치하는 과 12번 연관군(4 cm)에 위치하는 이 수고 및 뿌리생장과 관련이 있음을 확인하였다. 는 수고생장 전체 변 이의 11.1%를 설명하였고, 은 근원경, 뿌리건중량, 주근건중량 및 전체 biomass 건중량에 대해 pleiotropic 효과를 보였으며, 변이 설명율은 형질에 따 라 11.6~12.3%이었다. QTL의 상호작용 효과는 없는 것으로 확인되어, 이들이 독립적으로 수고생장량과 그 밖의 형질 발현에 관여하는 것으로 조사되었다. 상 기 QTL들의 우성대립유전자는 종자친인 오대 19호로부터 차대로 유전된 것으로 확인되었다. Map 1 Map 2 Map 3 Map 4 Map 5 Map 6 Map 7 Map 8 11.9 *GM2 *GM127 14.5 21.8 *rgm155 *GM4 *GM104 6.7 13.7 18.1 *GM9 *GM11 *GM8 *GM205 18.8 9.1 7.8 *rgm124 17.3 *GM46 5.1 *GM19 13.1 *GM54 *GM52 *GM69 *GM100 *rgm195 11.8 11.8 6.4 15.9 *GM119 *GM118 *GM137 *GM23 6.4 3.9 *GM122 *GM59 *GM27 21.8 9.1 *GM44 *GM215 *rgm34 23.4 25.0 18.8 *GM132 *GM22 *GM18 *GM85 Map 9 Map 10 Map 11 Map 12 Map 13 Map 14 Map 15 Map 16 10.4 9.1 5.1 3.9 *rgm135 6.4 3.9 *rgm171 *rgm92 20.3 *GM40 *GM115 *GM68 *GM163 *rgm89 *rgm131 1.3 11.8 *GM70 *GM73 20.3 *rgm185 1.3 *rgm166 17.3 *GM75 *rgm81 23.4 *rgm101 *GM76 25.0 *GM97 *GM88 21.8 9.1 *rgm214 *GM126 *GM123 11.8 7.8 *GM140 *rgm142 *GM141 23.4 Marker name *GM206 *rgm150 Map distance(cm, Kosambi function) [그림 4-14] 사시나무 AFLP 유전연관지도