(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (11) 공개번호 10-2016-0012498 (43) 공개일자 2016년02월03일 (51) 국제특허분류(Int. Cl.) C07D 321/06 (2006.01) A61K 31/357 (2006.01) A61K 36/80 (2006.01) A61P 11/06 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2014-0094023 (22) 출원일자 2014년07월24일 심사청구일자 전체 청구항 수 : 총 7 항 2015년07월24일 (71) 출원인 영진약품공업주식회사 서울특별시 강동구 천호대로 1057 (천호동) 한국생명공학연구원 대전광역시 유성구 과학로 125 (어은동) (72) 발명자 이용남 경기도 수원시 영통구 법조로149번길 22, 202호 유지석 경기도 수원시 권선구 매곡로 100, 102동 805호 (금곡동, 동성아파트) (뒷면에 계속) (74) 대리인 신동인 (54) 발명의 명칭 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 알러지, 염증, 천 식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물 (57) 요 약 본 발명은 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 신규 화합물, 상기 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8- 클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히 드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6- (뒷면에 계속) 대 표 도 - 도1-1 -
methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 유효성분으로 포함하는 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물들이 HT1080, H292 또는 EL4 세포에 대한 세포독성실험, TNF-α에 의해 유도된 MUC5AC의 발현에 미치는 영향실험, NF-κB 루시페라제 (Luciferase) 리포터(reporter) 어세이 (assay), NF-κB 전사인자의 활성 저해 효과 실험(실 험예 1)을 통하여, NF-κB 활성 억제를 통한 목표 유전자 (MMP-9, MUC5AC 및 IL-4)의 mrna 발현 억제, NF-κb전 사인자 활성 억제현상을 통하여 천식 및 COPD를 포함한 폐질환 치료에 유용함을 확인하였으며, MUC5AC 단백질 생성에 대한 저해 효과실험을 통하여 농도 의존적으로 MUC5AC 생성을 억제함을 확인하였으며 (실험예 2); 난백알 부민을 이용한 천식유발 실험동물에서의 항천식 효과실험을 통하여 호산구를 비롯한 염증세포의 수의 현저한 감 소현상; 인터루킨-4, 인터루킨-5 와 13 수준의 현저한 감소효과, IgE의 현저한 감소, 염증세포의 침윤의 감소, 기관지상피의 배상세포의 점액분비의 현저한 감소 현상 등을 통하여, 천식예방 및 치료효과를 확인하였으며 (실 험예3), C57BL/6N 생쥐를 이용한 COPD (만성폐쇄성 폐질환) 모델에서 B기관지 폐포세척액 내 염증세포의 수를 현 저하게 감소함을 확인하였으며, 활성산소족의 생성 억제, 호중구 엘라스타제 (elastase) 활성억제, IL-6, TNF-a 수준의 감소, 염증세포의 침윤 감소 현상 등을 확인함으로서 (실험예 4) 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 상기 조성물을 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능식품 또는 건강보조식품으로 유용하다. (72) 발명자 신대희 서울특별시 서초구 효령로77길 20, 1동 1007호 (서 초동, 현대ESA아파트) 류병환 경기도 성남시 분당구 금곡로 39, 104동 303호 (구 미동, 화이트빌) 오세량 대전광역시 유성구 과학로 125 한국생명공학연구원 안경섭 대전광역시 유성구 과학로 125 한국생명공학연구원 이형규 대전광역시 유성구 과학로 125 한국생명공학연구원 이수의 대전광역시 유성구 과학로 125 한국생명공학연구원 송혁환 대전광역시 유성구 과학로 125 한국생명공학연구원 신인식 대전광역시 유성구 과학로 125 한국생명공학연구원 류형원 대전광역시 유성구 과학로 125 한국생명공학연구원 이 발명을 지원한 국가연구개발사업 과제고유번호 10039303 부처명 산업통상자원부 연구관리전문기관 한국산업기술평가관리원 연구사업명 바이오 의료기기산업 핵심기술 개발사업(바이오) 연구과제명 미국의약품 승인기관의 인증을 위한 글로벌선도 천연물신약 개발 기 여 율 1/2 주관기관 동아제약(주)연구소 연구기간 2013.07.01 ~ 2014.12.31이 발명을 지원한 국가연구개발사업 과제고유번호 TGC3241313 부처명 산업통상자원부 연구관리전문기관 한국산업기술평가관리원 연구사업명 바이오 의료기기산업 핵심기술 개발사업(바이오) 연구과제명 천식/COPD치료제 개발을 위한 천연물신약후보 YPL-001의 분석 및 활성연구 기 여 율 1/2 주관기관 동아제약(주)연구소 연구기간 2013.07.01 ~ 2014.12.31-2 -
명 세 서 청구범위 청구항 1 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (a)의 신규 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5- (2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트 {(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6- methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 화합물, 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물: (a) 청구항 2 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum ) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)- 8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4- 디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h- 3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin -7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 유효성분으로 포함하는 알 러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. 청구항 3 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum ) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)- 8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4- 디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h- 3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 및 약학적으로 허용 가능한 담 체 또는 부형제를 함유한 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. 청구항 4 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum ) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)- 8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4- 디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h- 3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 유효성분으로 함유하는 알 러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품. - 3 -
청구항 5 제 4항에 있어서, 상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백 제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품. 청구항 6 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 및 개선효과를 갖는 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum ) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히 드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트 {(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6- methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 주성분으로 함유하는 건강보조 식품. 청구항 7 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 및 개선효과를 갖는 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum ) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히 드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트 {(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6- methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 주성분으로 함유하는 식품첨가 물. 발명의 설명 [0001] 기 술 분 야 본 발명은 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] 배 경 기 술 [문헌 1] Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104. [문헌 2] Elias JA, et al., J. Clin. Invest., 111, pp291-297, 2003 [문헌 3] Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001 [문헌 4] Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev., 50, pp515-596, 1998 [문헌 5] 한국특허등록 제 10-860080호 [문헌 6] 한국특허공개 제10-2006-125499호 [문헌 7] 한국특허출원 제 10-2013-84167호 [문헌 8] 한국특허출원 제 10-2014-36245호 [문헌 9] Ishiyama et al., Talanta, 44, pp.1299-1305, 1997; [문헌 10] Tominaga et al., Anal. Commun., 36, pp.47-50, 1999 [문헌 11] Kim et al., Journal of Cellular Biochemistry, 104, pp.1906-1917, 2008 [문헌 12] Busse, P. J., Zhang, T. F., Srivastava, K., Lin, B. P., Schofield, B., Sealfon, S. C. & Li, X. M. (2005) Chronic exposure to TNF-alpha increases airway mucus gene expression in vivo, The Journal - 4 -
of allergy and clinical immunology. 116, 1256-63 [0014] [0015] [0016] [0017] [문헌 13] Smirnova, M. G., Birchall, J. P. & Pearson, J. P. (2000) TNF-alpha in the regulation of MUC5AC secretion: some aspects of cytokine-induced mucin hypersecretion on the in vitro model, Cytokine. 12, 1732-6 [문헌 14]Sikder, MA. et al., Phytotherapy research : PTR. 28, 62-8. 2014 [문헌 15]Shin, I. S., Hong, J., Jeon, C. M., Shin, N. R., Kwon, O. K., Kim, H. S., Kim, J. C., Oh, S. R., Ahn, K. S. (2013) Diallyl-disulfide, an organosulfur compound of garlic, attenuates airway inflammaion via activation of the Nrf-2/HO-1 pathway and NF-kappaB suppression, Food and Chemical Toxicology. 62, 506-13 [문헌 16]Bhavsar, T., Liu, X. J., Patel, H., Stephani, R., Cantor, J. O. (2008) Preferential recruitment of neutrophils by endothelin-1 in acute lung inflammation induced by lipopolysaccharide or cigarette smoke, International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 3, 477-81 발명의 내용 [0018] [0019] [0020] 해결하려는 과제 본 발명은 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 일반적으로 염증 반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려고 하는 생체의 방어 반응과정이다. 따라서 이러한 일련의 반응에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조 직세포, 면역관여 세포 등이 포함된다. 최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인(cytokine) 이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다. 알레르기 반응은 그 반응 형태에 의해 I형, II형, III형 및 IV형의 4 가지 유형으로 분류될 수 있고, 또는 항원 에 의한 재감작( 感 作 ) 후 발증까지의 시간에 의해서 I형, II형 및 III형 알레르기는 즉시형 알레르기라고 불리 며, IV형 알레르기는 지연형 알레르기로 분류될 수 있다. [0021] 이 중, I형 알레르기는 IgE 항체가 관여하는 반응으로서, 아나필락시형 알레르기라고 불리우며, 여기에는 기관 지 천식, 아토피성 질환(피부염, 장염 등), 화분증 등의 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 음식물 알레르기 등이 포함된다. [0022] 천식(asthma)이란 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민성을 그 특징으로 하는 질환으로 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명( 喘 鳴 ), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들은 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다. 대부분의 천식은 알레르기성이며, 만성 기도염증(chronic airway inflammation)과 기도 과민반응성 (bronchial hyperresponsiveness)이 특징이다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, 1999, pp97-104). [0023] 천식은 그 원인에 따라 외인성 천식과 내인성 천식으로 나누어질 수 있다. 외인성 천식의 경우 원인 항원에 노 출되었을 때 증상이 나타나는 천식을 말한다. 원인 항원에 대한 피부시험이나 기관지 유발시험이 양성반응을 보 이며 발병 연령이 어린 것이 일반적이다. 집 먼지, 진드기가 가장 많은 원인 항원이며, 그밖에 꽃가루, 동물의 상피, 곰팡이 등이 원인 항원으로 작용한다. 내인성 천식의 경우에는 상기도 감염, 운동, 정서불안, 한랭 기후 및 습도의 변화 등이 천식을 유발하거나 악화시키는 경우인데, 성인형 천식에서 흔히 볼 수 있다. 그 외에도 약 물에 의해 유발되는 천식, 운동 유발성 천식 및 직업성 천식 등이 있다. - 5 -
[0024] 천식은 TH2(T helper 2) 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화 되어 기도 및 기도 주변 조직으로 이동, 침윤하기 때문에 만성 염증질환으로도 인식되고 있다(Elias JA, et al., J. Clin. Invest., 111, pp291-297, 2003). 천식을 앓고 있는 환자의 기관지에서 활성화된 호산구, 비만 세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포는 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비 하면서 강력한 기관지 수축작용에 관여한다(Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev., 50, pp515-596, 1998). [0025] 따라서 염증세포 활성화에 관여하는 IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인 및 면역글로불린 E의 생산과 이들의 작용 으로 호산구 등 염증세포에서 분비되는 시스테인 류코트리엔 생합성 등은 염증 및 알레르기 반응과 이로 인한 천식을 유발하는 주요 원인이므로 이들의 생산을 억제하기 위한 약물을 개발하고자 많은 연구가 진행되고 있다. [0026] 만성폐쇄성 폐질환 (Chronic Obstructive pulmonary disease, COPD)는 전세계적으로 해마다 증가하고 있는 질 환으로, 인류의 건강을 위협하는 원인 중 하나이다. 현재, 만성폐쇄성 폐질환은 많은 나라에서 사망의 주요원인 으로 주목되고 있으며, 특히 2020년에는 만성폐쇄성 폐질환이 인류의 사망원인 중 3번째 원인이 될 것으로 예측 되고 있다 (Vestbo, J., Hurd, S.S., Agusti, A.G., Jones, P.W., Vogelmeier, C., Anzueto, A., Barnes,P.J., Fabbri, L.M., Martinez, F.J., Nishimura, M., Stockly, R.A., Sin.D.D., Rodriguez-Roisin, R., 2013. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187, 347-365.). 일반적으로 만성폐쇄성 폐질환은 지속적인 폐조직내 공기흐름을 억제 및 폐쇄시켜 결국 환자를 사망에 이르게 한다 (Le, A., Zielinski, R., He, C., Crow, M.T., Biswal, S., Tuder, R.M., 2009. Pulmonary epithelial neutrophilin-1 deletion enhances development of cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 180, 396-406.). 이러한 만성폐쇄성 폐질환은 담배연기, 먼지, 화학물질, 대기오염, 세균감염 등의 다양한 원인에 의해서 발생된다 (Li, Y., Li, S.Y., Li, J.S., Deng, L., Tian, Y.G., Jiang, S.L., Wang, Y., Wang, Y.Y., 2012. A rat model for stable chronic obstructive pulmonary disease induced by cigarette smoke inhalation and repetitive bacterial infection. Biol. Pharm. Bull. 35, 1752-1760.). 특 히, 흡연은 만성폐쇄성 폐질환의 가장 큰 원인으로 간주되고 있으며, 실제 만성 폐쇄성 폐질환에 걸린 환자의 80% 이상이 흡연자로 밝혀졌다 (Rabe et al., 2007). 담배연기에는 수많은 독성화학물질 포함되어 있어, 흡연시 에폐조직 내 해로운 변화를 야기한다 (Stampfli, M.R., Anderson, G.P., 2009. How cigarette smoke skews immune responses to promote infection, lung disease and cancer. Nat. Rev. Immunol. 9, 377-384.). 이러 한 독성화학물질은 폐조직내호중구 (Neutrophils) 를 비롯한 다양한 염증세포의 침윤을 일으키고, 이로 인하여 폐염증이 발생하게 된다 (Terashima, T., Wiggs, B., English, D., Hogg, J.C., van Eeden, S.F., 1997.Phargocytosis of small carbon particles (PM10) by alveolar macrophages stimulated the relaease of polymorphonuclear leukocytes from bone marrow. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 155, 1441-1447). 임상연 구에서도 만성폐쇄성 폐질환 환자의 기관지폐포세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 혹은 객담 (Sputum) 에서 호중구 및 대식세포 (Macrophages)의 수가 현저하게 증가하였다 (O Donnell, R., Breen, D., Wilson, S., Djukanovi, R., 2006. Inflammatory cells in the airway in COPD. Thrax 61, 448-454.). 이러한 염증세포들은 활성산소족 (Reactive oxygen species), 염증성싸이토카인 (Cytokines), 케모카인 (Chemokines), 및 조직손상을 야기하는 다양한 효소를 생산한다 (Profita, M., Sala, A., Bonanno, A., Riccobono, L., Ferraro, M., La Grutta, S., Albano, G.D., Montalbano, A.M., Gjomarkaj, M., 2010. Chronic obstructive pulmonary disease and neutrophil infiltration: role of cigarette smoke and cyclooxygenase products. Am. J. Physiol. Lung Cell.Mol. Physiol. 298, L262-L269.). 특히, 호중구는 만성폐쇄성 폐질환이 발병하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Hiemstra, P.S., van Wetering, S., Stolk, J., 1998. Neutrophil serine proteinases and defensins in chronic obstructive pulmonary disease: effects on pulmonary epithelium. Eur. Respir. J. 12, 1200-1208.). 호중구는 많은 염증성싸이토카인, 케모카인 및 화학주성인자를 생성할 뿐만아니라, 엘라스틴 분해효소 (Elastase)를 분비하여, 정상적인 폐포형태를 파괴하고 결국에는 폐기종 (Emphysema)을 야기한다 (Hoenderdos, K., Condliffe, A., 2013. The neutrophils in chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 48, 531-539.). 따라서, 담배연기로 인한 염증세포 특히 호중구의 침윤을 억제하는 것은 만성폐쇄성 폐질환의 치료에 있어 매우 중요한 치료수단으로 인식되고 있다. - 6 -
[0027] 따라서, 만성 폐쇄성 폐질환은, 가역적인 기류 폐쇄와 알러지성 기관지 염증 반응을 주된 특징으로 나타내는 천 식과는 구분되어서 적합하게 치료되어야 하지만, 현재의 치료법은 단지 증상의 경감을 제공함에 불과하고, 최근 치료법 중 어느 것도 만성 폐쇄성 폐질환의 근본적인 치료 효과를 임상적인 결과로 나타내지 못하고 있다 (Hele DJ, Belvisi MG. 2003. Novel therapies for the treatment of inflammatory airway diseases. Expert Opin Investig Drugs 12: 5-18; Fox JC, Fitzgerald MF. 2009. The role of animal models in the pharmacological evaluation of emerging anti-inflammatory agents for the treatment of COPD. Curr Opin Pharmacol. 9: 231-242) [0028] 천식과 COPD는 원칙적으로 상이한 병리기전을 나타내는데, 예를 들어, (1) 염증세포 면에서, 천식은 비만세포 (mast cell), 호산구(Eosinophils), CD4+ 세포 (Th2), 대식세포(Macrophages) 등이 주로 작용하는데 반하여, COPD는 호중구(Neutrophils), CD8+ 세포 (Tc) 등이 주로 작용한다는 점에서 상이하며; (2) 염증매개인자 면에서, 천식은 류코트리엔(Leukotriene B), 히스타민(Histamine), IL-4, IL-5, IL-13, 에오탁신(Eotaxin), RANTES, 산화적 스트레스(Oxidative stress) 등이 주로 관여되는데 반하여, COPD는 TNF-alpha, IL-8, GROalpha 등이 주로 관여된다는 점에서 상이하며; (3) 염증현상 면에서, 천식은 전체 기도에 작용하여, AHR(기도 과민반응 과민), 상피성 쉐딩(Epithelial shedding), 섬유증(Fibrosis), 조직질실상 발전이 없으며(no parenchymal involvement), 점액분비(muscus secretion), 비교적 가역적 기류장애 현상, 기침, 재채기, 호흡곤 란(dyspnea)를 주로 어린 시기에 발생하는 데 반하여, COPD는 말초 기도에 작용하여, 상피성 변성(Epithelial metaplasia), 조직질실상 손상 (parenchymal destruction), 비교적 비가역적 기류장애 현상, 만성 기관지염, 폐기종을 주로 성인기에 발생하는 점에서 상이한 점 등의 별개의 병리기전을 갖는 것으로 알려져 있다 (Barnes PJ. 2000. Mechanisms in COPD: differences from asthma. Chest 117: 10S-14S; Seatta M, Turato G, Maestrelli P, Mapp CE, Fabbri LM. 2001. Cellular and structural base of chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 163: 1304-1309) [0029] [0030] [0031] 최근 분자생물학의 발달과 더불어 염증성 질환이 사이토카인 (cytokine)이라는 분자 수준에서의 이해가 시도되 고 있으며, 이러한 질환에 영향을 주는 인자들도 하나씩 규명되고 있다. 이들 사이토카인들은 세포가 특정한 상 황에서 세포밖으로 분비되는 단백질들로서, 주로 인터루킨(interleukin; IL) 계열이 많이 알려져 있다. 사이토 카인들은 다양한 세포에서 분비되어 염증세포의 이동을 유도하고, 세포의 활성화에 관여하여 염증반응을 조절한 다. 이렇게 사이토카인들의 역할은 아주 다양하여 면역기능의 일부를 담당하거나, 세포의 분화를 유도하기도 한 다. 특히, IL-4는 기도 염증성 질환인 천식과 관련된 중요한 사이토카인이다. 천식의 기도염증에서는 type 2 helper T(Th2)세포가 우세한데 그 기전은 확실히 규명되지 않았지만 Th0세포의 일차 분화시기에 알레르기항원에 의해 자극된 전구 CD4 T-세포에서 분비되는 IL-4에 의해 Th2 세포로 분화된다. Th2세포에서는 IL-4, 5, 6, 9, 13 등이 분비되며 이들은 알레르기성 기도염증을 유발시키며, 특히 IL-4는 B-세 포를 자극하여 IgE의 생산을 증가시킨다. 그러므로, IL-4의 발현과 생성은 천식 질환의 메커니즘을 규명하는데 중요한 요인으로서, 이를 억제하는 약물의 탐색은 상기 질환의 예방 또는 치료의 전략이 될 수 있다. 지금까지 본 발명자들은 염증, 알레르기 및 천식 질환에서 특징적으로 나타나는 다양한 종류의 사이토카인 및 케모카인에 대한 항체를 이용한 치료제로써 여러 가지 자원, 특히 안전성 및 유효성이 이미 알려진 천연물 자원 을 이용한 치료제 개발을 중점으로 하여 개발되어 오고 있어 온 바, 특히 본 발명자들은 꼬리풀속 식물 추출물 의 항염, 항알레르기 및 항 천식 활성을 확인하여 특허출원하고 (한국특허등록 제 10-860080호) 상기 추출물로 부터 분리된 카탈폴(catalpol) 유도체 성분, 예를 들어, 베프로시드 (verproside, 6-O-3,4-Dihydroxybenzoyl catalpol), 피크로시드 Ⅱ (picroside Ⅱ, 6-O-4-hydroxy-3-methozybenzoyl), 베르미노시드 (verminoside, 6- O-3,4-dihydroxy cinnamoyl catalpol), 6-O-베라트로일카탈폴 (6-O-veratroylcatalpol, 6-O-3,4-Dimethoxy benzoyl), 미네코시드 (minecoside, 6-O-3-hydroxy-4-methozycinnamoyl catalpol), 카탈폴 (catalpol) 등의 성분을 분리하고 이들 성분들이 항염, 항알레르기 및 항 천식 활성을 나타냄을 확인하여 특허출원한 바가 있으 며 (한국특허공개 제10-2006-125499호); 카탈폴 유도체들의 함량이 매우 소량으로 산업상 대량으로 생산하기에 어려운 문제점을 안고 있는 상기 기존 발명의 후속으로 고함량의 카탈폴 유도체를 다량 함유한 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum)유래 산꼬리풀 신규 정제물을 발명하고 이의 염증, 알레르기 및 천식의 치료제로서의 효능을 확인하여 출원하고 (한국특허출원 제 10-2013-84167호); 또한 상기 산꼬리풀 신 - 7 -
규 정제물의 만성 폐쇄성 폐질환 치료제로서의 효능을 확인하여 후속으로 출원한 바가 있다 (한국특허출원 제 10-2014-36245호). [0032] "산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum = Veronica rotunda var. subintegra)은 현삼과 (Scrophulariaceae)에 속하는 다년생 초본으로서, 산꼬리풀의 높이는 40~80 cm 정도이고, 줄기는 곧게 서 있으 며, 굽은 털이 있다. 산꼬리풀의 잎은 마주나기를 하며 좁은 달걀형이거나 긴 타원형이다. 산꼬리풀 잎의 끝은 뾰족하며 기부는 좁아지고, 가장자리에는 불규칙한 톱니가 있고, 잎의 길이는 5~10 cm이다. 잎의 뒷면의 맥위로 는 털이 약간 있다. 산꼬리풀의 꽃은 가지와 줄기 끝에 파란빛을 띤 자주빛의 꽃이 총상꽃차례로 달린다. 꽃받 침과 꽃잎은 각 4개이며 끝은 뾰족하다. 수술은 2개이며 꽃밥은 짙은 자주색이다. 산꼬리풀의 열매는 삭과로 넓 은 달걀 뒤집은 모양이다. 산꼬리풀은 한국, 일본, 만주, 사할린섬, 우수리강 등지에 분포한다 (Flora of China 18; 1-212. 1998). [0033] 이에, 본 발명자들은 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 신규 화학구조를 갖는 새로운 신규 화합물을 분리하고 이를 대상으로 HT1080, H292 또는 EL4 세포에 대한 세포독성실험, TNFα에 의해 유도된 MUC5AC의 발현에 미치는 영향실험, NF-κB 루시페라제 (Luciferase) 리포터(reporter) 어세이 (assay), NF-κB 전사인자의 활성 저해 효과 실험(실험예 1)을 통하여, NF-κB 활성 억제를 통한 목표 유전자 (MMP-9, MUC5AC 및 IL-4)의 mrna 발현 억제, NF-κb전사인자 활성 억제현상을 통하여 천식 및 COPD를 포함한 폐질환 치료에 유용함을 확인하였으며, MUC5AC 단백질 생성에 대한 저해 효과실험을 통하여 농도 의존적으로 MUC5AC 생성을 억제함을 확인하였으며 (실험예 2); 난백알부민을 이용한 천식유발 실험동물에서의 항천식 효과 실험을 통하여 호산구를 비롯한 염증세포의 수의 현저한 감소현상; 인터루킨-4, 인터루킨-5 와 13 수준의 현저 한 감소효과, IgE의 현저한 감소, 염증세포의 침윤의 감소, 기관지상피의 배상세포의 점액분비의 현저한 감소 현상 등을 통하여, 천식예방 및 치료효과를 확인하였으며 (실험예3), C57BL/6N 생쥐를 이용한 COPD (만성폐쇄성 폐질환) 모델에서 B기관지 폐포세척액 내 염증세포의 수를 현저하게 감소함을 확인하였으며, 활성산소족의 생성 억제, 호중구 엘라스타제 (elastase) 활성억제, IL-6, TNF-a 수준의 감소, 염증세포의 침윤 감소 현상 등을 확 인함으로서 (실험예 4) 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여, 본 발명 을 완성하였다. [0034] 과제의 해결 수단 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (a)의 신규 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타 [e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2- hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} 화합물 (KS534), 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 제공한다. - 8 -
화학식 1 [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 본 발명의 염으로는 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세 톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거 나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레 인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바 닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다. 또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다. [0041] 본 발명의 유도체들은 당업계에 잘 알려진 실리카겔 컬럼, 및 재결정법을 이용한 정제과정을 반복수행하는 분리 방법 및 정제방법, 예를 들어, 한국특허공개 제 10-2006-125499호에 개시된 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 정제물로부터 분리하는 방법 또는 화학적으로 합성하여 제조하거나, 상업적으로 구 - 9 -
입가능하다. [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] 본원에서 정의되는 상기 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 이 의 용매화물로 제조가능하다. 따라서, 본 발명은 상기 화합물들은 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 포함함을 특징으 로 한다. 본 발명의 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염 은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석 출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인 산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구 연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바 닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다. 또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화 합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다. [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] 또한, 본 발명의 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명 의 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되 는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형 태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다. 이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 본 발명의 화합물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 건조된 산꼬리풀(Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 을 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메 탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하 게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 10~100% 메탄올을 수회 섞은 다음에 10 내지 150, 바람직하 게는 20 내지 70 의 온도에서 30분 내지 72시간, 바람직하게는 1시간 내지 48시간 초음파 추출법, 열수 추출 법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 냉침추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물들은 상기에서 얻은 조추출물을 역상크로마토그래피법, 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피, Diaion HP-20 컬럼크로마토그래피, 세파덱스 컬럼 크로마토그래피법 등의 하나 이상의 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 본 발명의 화합물인 신규 구조의 KS-534 화합물을 분리가능하다. 본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 화합물들을 대상으로 HT1080, H292 또는 EL4 세포에 대한 세포독성 실험, TNF-α에 의해 유도된 MUC5AC의 발현에 미치는 영향실험, NF-κB 루시페라제 (Luciferase) 리포터 (reporter) 어세이 (assay), NF-κB 전사인자의 활성 저해 효과 실험(실험예 1)을 통하여, NF-κB 활성 억제를 통한 목표 유전자 (MMP-9, MUC5AC 및 IL-4)의 mrna 발현 억제, NF-κb전사인자 활성 억제현상을 통하여 천식 및 COPD를 포함한 폐질환 치료에 유용함을 확인하였으며, MUC5AC 단백질 생성에 대한 저해 효과실험을 통하여 농 - 10 -
도 의존적으로 MUC5AC 생성을 억제함을 확인하였으며 (실험예 2); 난백알부민을 이용한 천식유발 실험동물에서 의 항천식 효과실험을 통하여 호산구를 비롯한 염증세포의 수의 현저한 감소현상; 인터루킨-4, 인터루킨-5 와 13 수준의 현저한 감소효과, IgE의 현저한 감소, 염증세포의 침윤의 감소, 기관지상피의 배상세포의 점액분비의 현저한 감소 현상 등을 통하여, 천식예방 및 치료효과를 확인하였으며 (실험예3), C57BL/6N 생쥐를 이용한 COPD (만성폐쇄성 폐질환) 모델에서 B기관지 폐포세척액 내 염증세포의 수를 현저하게 감소함을 확인하였으며, 활성 산소족의 생성 억제, 호중구 엘라스타제 (elastase) 활성억제, IL-6, TNF-a 수준의 감소, 염증세포의 침윤 감소 현상 등을 확인함으로서 (실험예 4) 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함 으로써, 상기 조성물을 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기 능식품으로 유용함을 확인하였다. [0054] [0055] 또한, 식물은 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 식물 추출물로부터 분리된 화합 물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다. 본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 90 중량 %로 포함한다. [0056] 따라서, 본 발명은 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타 [e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2- hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS- 534) 화합물을 유효성분으로 포함하는 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시) 헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트 {(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy) hexahydro-1h-3,6- methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한 다. 본 발명에서 산꼬리풀은 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 본 발명의 산꼬리풀로부터 분리된 화합물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 열풍 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에 서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 산꼬리풀 추출물로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물의 투여로 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 상기 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물 로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메 타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8ahydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4- dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환 환자에게 투여함을 포함하는 알 러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하기 위한 치료방법을 제공한다. [0062] 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 상기 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추 출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H- 3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro- 8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4- - 11 -
dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 유효성분으로 포함하고 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제을 함유한 조 성물을 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환환자에게 투여함을 포함하는 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환을 치료하기 위한 치료방법을 제공한다. [0063] [0064] 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환 환자를 치료하기 위한 치료제 제조를 위한 상기 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시) 헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타 [e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2- hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS- 534) 의 용도를 제공한다. 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환 환자를 치료하기 위한 치료 제 제조를 위한 상기 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타 [e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2- hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS- 534) 을 유효성분으로 포함하고 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 함유한 조성물의 용도를 제공한다. [0065] 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁 액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무,알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제 제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 봉해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형 제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이 러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외 에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유 제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들 면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. [0066] [0067] [0068] [0069] 상기한 제제에는 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일 과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝 솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투 여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명은 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타 [e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2- hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS- - 12 -
534) 을 유효성분으로 함유하는 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 을 제공한다. [0070] [0071] [0072] [0073] 본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영 양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 정제물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다. 또한, 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡 슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능 식품으로 제조 및 가공이 가능하다. 또한, 본 발명은 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 및 개선효과를 갖는 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로- 8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시 벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6- methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 주성분으로 함유하는 건강보조 식품을 제공한다. [0074] [0075] 또한, 본 발명은 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 및 개선효과를 갖는 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum) 추출물로부터 분리된 (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로- 8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시 벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2-hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6- methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS-534) 을 주성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가물을 제공한다. 또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. [0076] [0077] [0078] [0079] 본원에서 정의되는 주성분 이라 함은 전체 식품 조성물 100% 중량 기준 대비 약 1 내지 99%(w/w), 바람직하 게는, 5 내지 60%, 보다 바람직하게는, 20 내지 50%(w/w) 중량을 함유함을 특징으로 한다. 상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화 학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨 가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다. 본 발명의 화합물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자 류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품 과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성 분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, - 13 -
(예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상 적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우 마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다. [0080] [0081] 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍 미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지 만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 또한, 본 발명의 화합물은 목적 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물 은 100 ml을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. [0082] 상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 화합물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다. [0083] 발명의 효과 본 발명에 따른 화합물들이 HT1080, H292 또는 EL4 세포에 대한 세포독성실험, TNF-α에 의해 유도된 MUC5AC의 발현에 미치는 영향실험, NF-κB 루시페라제 (Luciferase) 리포터(reporter) 어세이 (assay), NF-κB 전사인자 의 활성 저해 효과 실험(실험예 1)을 통하여, NF-κB 활성 억제를 통한 목표 유전자 (MMP-9, MUC5AC 및 IL-4)의 mrna 발현 억제, NF-κb전사인자 활성 억제현상을 통하여 천식 및 COPD를 포함한 폐질환 치료에 유용함을 확인 하였으며, MUC5AC 단백질 생성에 대한 저해 효과실험을 통하여 농도 의존적으로 MUC5AC 생성을 억제함을 확인 하였으며 (실험예 2); 난백알부민을 이용한 천식유발 실험동물에서의 항천식 효과실험을 통하여 호산구를 비롯 한 염증세포의 수의 현저한 감소현상; 인터루킨-4, 인터루킨-5 와 13 수준의 현저한 감소효과, IgE의 현저한 감 소, 염증세포의 침윤의 감소, 기관지상피의 배상세포의 점액분비의 현저한 감소 현상 등을 통하여, 천식예방 및 치료효과를 확인하였으며 (실험예3), C57BL/6N 생쥐를 이용한 COPD (만성폐쇄성 폐질환) 모델에서 B기관지 폐포 세척액 내 염증세포의 수를 현저하게 감소함을 확인하였으며, 활성산소족의 생성 억제, 호중구 엘라스타제 (elastase) 활성억제, IL-6, TNF-a 수준의 감소, 염증세포의 침윤 감소 현상 등을 확인함으로서 (실험예 4) 만 성 폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 상기 조성물을 알러지, 염증, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. [0084] 도면의 간단한 설명 도 1은 KS-534의 화학 구조식이며; 도 2는 KS-534의 1 H- 1 H COSY 스펙트럼 결과이며; 도 3는 KS-534의 qrt-pcr를 이용한 MUC5AC의 mrna 발현 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이며; 도 4는 루시페라제 어세이법을 이용한 TNF-α-유도 NF-κB 활성에 대한 KS-534 시료들의 억제 효과를 나타낸 도 이며(통계 분석은 스튜턴트 시험법 (Student'st-test)을 수행하고 P 값(**, <0.01)을 통계적으로 유의한 것으 로 간주함): 도 5는 변형된-ELISA법을 이용한 MUC5AC의 단백질 발현 수준에 대한 저해효과를 나타낸 도이며(통계 분석은 스 튜턴트 시험법 (Student'st-test)을 수행하고 P 값(**,<0.01 and ***,<0.001)을 통계적으로 유의한 것으로 간 주함): - 14 -
도 6는 KS-534의 BALF내에서 염증 세포수에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 7는 KS-534의 BALF내에서 시토킨에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 8는 KS-534의 혈청중 총 IgE 및 OVA-특이 IgE 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 9는 KS-534의 폐조직에서 염증 반응에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 10는 KS-534의 폐조직에서 점액 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 11는 KS-534의 BALF내에서 염증 세포수에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 12는 KS-534의 반응성 산소종 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 13는 KS-534의 BALF 내용물 및 엘라스타제 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 14는 KS-534의 BALF내에서 IL-6 및 TNF-α에 미치는 영향을 나타낸 도이며: 도 15는 KS-534의 폐조직에서 염증반응에 미치는 영향을 나타낸 도이다 [0085] 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽 게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다. [0086] [0087] 참조예 1: 분석 기기 융점(Melting points)은 기기 (Koflermicrohostage)에서 보정없이 측정하고 광학 회전율(Optical rotation)은 기기 (Jasco P-1020 polarimeter)에서 분석하였으며, UV 데이터는 기기 (UV-VIS 2450 spectrometer), FT-IR 스 펙트라(spectra)는 기기 (Jasco FT/IR-4200), NMR 스펙트라(spectra)는 내분 표준물질(internal standard)로 테트라메틸실란 (tetramethylsilane)을 이용하여 기기(Varian UNITY 400 MHz FT-NMR spectrometer)에서 기록하 였다. HRESIMS 는 기기 (Waters Q-TOF Premier spectrometer)에서 수행하고 HPLC 분리는 UV/VIS-155 탐지기 (detector), 펌프(pump 305)를 이용하여기 기기(Gilson)에서 수행하였다. [0088] 실시예 1: 산꼬리풀 추출물로부터 신규 화합물 분리 [0089] [0090] 1-1.조추출물 제조 산꼬리풀 (Pseudolysimachion rotundum var. subintegrum = Veronica rotunda var. subintegra) 전초 (GAP 재 배, 충북 음성군 소이면 비산리 244번지, KRIB 0020697, Plant Extract Bank of KRIBBm 대전, Korea) 2.0 kg을 건조, 절단한 후, 산꼬리풀 전초 시료에 메탄올 10L를 가하여 상온에서 24시간 동안 냉침 추출하였다. 그 후, 78 에서 12시간 교반하면서 환류 추출을 수행한 후 진공 여과하여 상층액을 회수하였다. 상기 과정을 2회 반복 하여 상층액을 회수하고 이 추출액을 감압농축기(EYELA, N-2100, JAPAN)로 감압 농축하여 산꼬리풀 메탄올 추출 물 198.7 g 을 수득하였다. [0091] [0092] 1-2. 분획물 제조 1-1 단계에서 얻은 조추출물 (20 g) 을 역상 크로마토그래피법으로(preparative reversephase chromatography; Zeoprep C18, 75 μm, 200 250 mm, Zeochem, Louisville, U.S.A) 용매(25% MeOH-water solution)를 이용하 여 유출하였고 여기에서 얻은 분획들(f1-f4)을 회수하고 감압농축하였다. 이중 분획 f2 (5.0 g)를 중간압 액체 크로마토그래피법으로(medium pressure liquid chromatography (MPLC), 컬럼: RP C-18 (Zeoprep C18, 10 μm, 20 250 mm, Zeochem, Louisville, U.S.A)에서 경사 혼합 전개 용매 (MeOH-water solution= 2:8, 3:7, 4:6, 10:0)로 유출하여 5개 소분획 (f2a, f2b, f2c, f2d, 및 f2e)을 수득하였다. [0093] - 15 -
[0094] [0095] 1-3. KS-534 화합물 분리(도 1 참조) 상기 소분획 f2b (0.8 g)을 세파덱스(Sephadex LH-20 (90% MeOH)로 정제하여 소분획 2b1 및 f2b2을 얻고 이중 소분획 f2c을 HPLC (Atlantis T3 5μm ODS, 19 250 mm, Waters, Miliford, U.S.A., 18% MeCN-water)를 수 행하여 하기 물성치를 갖는 신규 구조의 이리도이드 배당체 KS-534 (105.2 mg)을 수득하였다. [0096] [0097] [0098] [0099] (1) (3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-클로로-8a-히드록시-5-(2-히드록시아세톡시)헥사히드로-1H-3,6-메타노시클로 펜타[e][1,3]디옥세핀-7-일 3,4-디히드록시벤조에이트{(3R,5S,5aS,6R,7S,8R,8aS)-8-chloro-8a-hydroxy-5-(2- hydroxy acetoxy)hexahydro-1h-3,6-methanocyclopenta[e][1,3]dioxepin-7-yl 3,4-dihydroxybenzoate} (KS- 534) 화합물 성상 :밝은 갈색분말상 [α] 20 D -30.0 (c 0.2, MeOH). 분자식: C 22 H 26 ClO 13 [0100] HRESEMS (observed m/z 533.1035 [M-H] - ): quasimolecular 3:1 ion cluster [0101] IR spectrum: 3412 cm -1 (hydroxyl group); 1692 cm -1. (α,β-unsaturated ester carbonyl) [0102] 13 C and DEPT NMR spectra: 표 1 [0103] [0104] 1 H- 1 H COSY spectrum (도 2=Fig. 2 ) NOESY spectrum (도 2) 표 1 [0105] 1 H (400 MHz) and 13 C (100 MHz) NMR spectroscopic data for KS-534 in DMSO-d6 Position δ C KS-534 δ H (J in Hz) Agluc 1 90.6 5.55, d (1.6) 3 93.5 5.30, d (2.4) 4 32.9 2.38, dd (13.4, 8.2) 1.94, dd (13.4, 2.4) 5 33.0 2.26, ddd (9.6, 8.8, 2.2) 6 85.7 4.96, dd (8.8, 2.2) 7 69.2 4.54, d (8.8) 8 78.3 9 46.4 2.55, br d (10.0) 10 60.8 3.56, d (12.4) 3.86, d (12.4) 11 Glc 1' 96.8 4.50, d (7.6) 2' 73.0 2.91, d (8.4) 3' 76.5 3.13, m 4' 70.1 3.04, t (9.2) 5' 77.1 3.13, m 6' 60.9 3.69, d (8.8) 3.43, dd (12.0, 5.6) Aroyl - 16 -
1" 119.8 2" 116.4 7.39, d (2.1) 3" 145.1 4" 150.9 6.83, d (8.0) 5" 115.4 7.37, dd (8.0, 2.1) 6" 122.1 7" 165.6 [0106] [0107] 실험예 1: 세포독성실험 본 실험에 앞서, HT1080, H292 또는 EL4 세포에 대한 실시예 시료들의 세포독성을 확인하기 위하여 하기와 같 이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 실험하였다(Ishiyama et al., Talanta, 44, pp.1299-1305, 1997; Tominaga et al., Anal. Commun., 36, pp.47-50, 1999) [0108] [0109] 1-1. 세포 준비 및 배양 HT1080(CRL-12012), H292(CRL-1848) 및 murine EL4 cells (TIB-39) 들을 회사(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. HT1080과 EL4 cells은 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum; Gibco) 및 항생제 (100 units/ml penicillin+ 100/ml streptomycin)가 첨가된 DMEM 배지 (SB30243.01, Dulbecco s modified Eagle medium; DMEM, HyClone)에서 배양하였고, H292 cell은 10% 우태아혈청 및 항생제가 첨가된 RPMI 배지 (SH30027.01, RPMI 1640, Gibco)에서 배양하였으며, 가습된(humidified) 5% CO 2 대기조건 하에서 37 에서 배양 하였다. [0110] PMA (P8139, Phorbol 12-myristate 13-acetate)는 회사(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)에서 구입하고 TNF-α 는 회사 (300-01A, Peprptech, USA)에서 구입하여 사용하였다. [0111] [0112] 1-2-1. H292 세포에서의 KS-534의 세포독성 평가 인간의 폐암점막세포인 H292 세포를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 10% 첨가한 RPMI 배지(Gibco)에 5 10 4 cells/ml의 농도로 현탁하여 100 μl씩 96 웰-플레이트에 접종하여 12시간 동안 부착하였다. KS-534 화합물을 농 도별로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 세포 수를 셀 수 있는 CCK-8(Dojindo사) 키트에서 설명한 대로, 배 지 90 μl에 CCK-8 용액을 10 μl 혼합하여 웰당 100 μl씩 첨가하였고, 최소 30분에서 최대 4시간까지 반응시킨 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.2% 처리한 음성대조군을 100%로 하여 상기 수학식 1에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 수학식 1 [0113] [0114] 본 실험 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, KS-534의 농도에 따른 H292 세포의 세포생존율을 조사해본 결과, 20μ M 이하에서는 세포독성이 없음을 확인함으로써, 다음 실험에 적용하였다. [0115] 시료 농도 (μm) H292세포생존율 (%, 평균±±편차) 음성대조군 0 100.00 ±± 2.50 표 2-17 -
KS-534 2.5 101.88 ±± 3.71 5 102.46 ±± 3.96 10 99.89 ±± 4.79 20 97.87 ±± 2.92 [0116] [0117] 1-3. mrna 발현수준 (expression level) 측정. 총(total) RNA 분리, cdna 합성 및 정량적 실시간 (quantitative real-time) PCR을 문헌에 기재된 방법대로 수행하였다 (Kim et al., Journal of Cellular Biochemistry, 104, pp.1906-1917, 2008). [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] 요약하면, 총 RNA를 시약(TRIzol reagent, 155596-026, Life Technologies)으로 분리하고 1차 가닥(first strand) cdna를 효소(Omniscript Reverse Transcriptase, 205113, Qiagen, CA)를 이용하여 합성하였다. 반-정 량적(Semi-quantitative) PCR 증폭(amplification)은 기기 1(S1000 Thermal cycler, Bio-rad, USA) 및 기기2 (2 Greenstar master mix, Bioneer, Korea) 를 이용하여 공급자 지시에 따라 수행하였다. MMP-9, MUC5AC 및 IL-4 특이적 산물(specific products)을 증폭하기 위하여 하기 프라이머 (primers) 3개 세트 를 이용하였다: MMP-9: (forward) 5 -AGA CCT GAG AAC CAA TCT CAC-3 및 (reverse) 5 - GGC ACT GAG GAA TGA TCT AA-3 MUC5AC: (forward) 5 -TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT -3 and (reverse) 5 -CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G -3 IL-4: (forward) 5 -GAA TGT ACC AGG AGC CAT ATC-3 and (reverse) 5 -CTC AGT ACT ACG AGT AAT CCA -3. 정량적 대조군(quantitative controls)으로서, 연속적으로 발현되는 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)인 인체(human) GAPDH에 대한 프라이머를 사용하였다. 인체 GAPDH에 대한 프라이머: (forward) 5 -CGG AGT CAA CGG ATTT GGT CGT AT -3 및 (reverse) 5 -AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3. 마우스 GAPDH에 대한 프라이머: (forward) 5 -AAC TTT GGC ATT GTG GAA GG -3 및 (reverse) 5 -ACA CAT TGG GGG TAG GAA CA-3. 상기 PCR 혼합물을 94 에서 5 분간 변성하고 94 에서 30초간, 60 에서 30초 및 72 에서 30초간 35사이 클(cycles), 및 최종연장 (final extension)으로서, 72 에서 10분간 1사이클(cycle)을 수행하였다. PCR 후, 15 PCR 산물을 겔 전기영동법 (1% agarose gel electrophoresis, A-7020, Bioneer, Korea)을 수행하고 기기 (UVtransilluminator, DUT-260, CoreBio)하에서 불화 에티디움 (RedSafe TM, O008-091015, intron, Korea)으로 시각화하였다. [0126] [0127] [0128] [0129] 1-3-1. KS-534의 MUC5AC의 발현에 미치는 영향 본 연구에서는 인간의 폐암점막세포인 H292에서 TNF-α에 의해 유도된 MUC5AC의 발현이 KS-534에 의해 억제되는 지를 평가하였다. 만성폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료효과를 분석하기 위하여, KS-534에 의한 MUC5AC mrna 발현 저해 효과를 확인하였다. 구체적으로, TNF-α로 유도된 MUC5AC의 생성량 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction, real-time PCR, quantitative real time polymerase chain reaction, qpcr)과 MUC5AC 면역분석 (immunoassay)을 이용하여 측정하였다. 세포준비는 48 웰-플레이트에 H292세포를 2 10 4 cells/well의 농도로 분 주하여 24시간 동안 부착시킨 후, 0.1 % FBS를 포함한 배지로 교체하여 24 시간을 배양하였다. KS-534를 10 μm 농도별로 2시간 동안 처리하였고, TNF-α를 20 ng/ml 의 농도로 처리하고, 12시간 배양하였다. [0130] Total RNA를 추출하기 위해서 TrizolB(invitrogen)을 사용하여 리보핵산(RNA)을 추출하였고, 정량 후, Omniscript RT kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 상보적 핵산(cDNA)를 합성하였다. 합성된 - 18 -
cdna를 주형과 하기 표 2에 나타낸 MUC5AC 및 GAPDH 프라이머를 각각 혼합하고, PCR mix(pcr Master Mix, Bioneer, Korea)를 사용하여 94 에서 5분간 변성(Denaturation)을 하고, 95 에서 30초, 60 에서 45초, 72 에서 45초로 30 사이클(cycle)을 반응시킨 후, 72 에서 10분간 효소를 불활성화시키는 PCR을 수행하였다(표 3, 도 3). [0131] 유전자 프라이머 MUC5AC sense 5`-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3` antisense 5`-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G-3` GAPDH sense 5`-CGG AGT CAA CGG ATTT GGT CGT AT -3` antisense 5`-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3` 표 3 [0132] [0133] 실험 결과: 상기 도 3에 그래프와 이를 정리한 표 4에서 나타난 바와 같이, TNF-a를 처리한 군에서 MUC5AC의 양이 증가하였 고, 이를 100% 기준으로 볼 때, KS-534를 10 μm 처리에 의해 MUC5AC의 mrna 발현양이 58.47 % 감소함으로써, KS-534에 의한 MUC5AC 발현 저해율이 41.52%임을 확인하였다. 이러한 실험을 통해, 본 발명에서는 KS-534 에 의 해 MUC5AC의 발현이 억제됨을 확인하였다 (실험예 1-2, 표 2). 이는 본 발명의 KS-534가 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료효과가 있음을 시사한다. [0134] 표 4 The summary for inhibitory activity of Muc5AC mrna expression by KS-534 시료 농도 TNF-α MUC5AC mrna 발현양 저해율(%) (μμm) (20 ng/ml) (TNF-α처리군에 대한 상대적인 %) 음성대조군 0-7.02 ± 2.82 92.82 TNF-α처리군 0 + 100.00 ± 25.35 0.00 KS-534 10 + 58.47 ± 18.50 41.52 [0135] [0136] [0137] 1-4. NF-κB 루시페라제(Luciferase) 리포터(reporter) 어세이(assay). NF-κB 루시페라제(Luciferase) 리포터(reporter) 어세이(assay)를 문헌에 기재된 방법대로 수행하였다 (Pulin Che et al., Assay Drug Dev Technol., 10, 6168, 2012). NF-κB 루시페라제 (Luciferase) 리포터(reporter) 어세이(assay)에 대한 안정된 세포를 확립하기 위하여, NF-κB 반응성 엘리먼트 (response element)를 제조사 프로토콜대로 벡터 (pgl4.32vector, E849A, promega)에 클론화하고 이용하여 Lipofectamine 2000 (11668-019, Invitrogen)를 이용하여 세포(Beas2B cells, CRL-9609, ATCC)에 감염시켰다. 감염된 세포를 2 주간 마이신(400ng/mL of Hygromycin)을 이용하여 선별하고 콜로니들을 개별적으로 클론하고 증식하였다. 세포를 5 10 3 세포/웰(well) 농도로 96-웰 플레이트 상에 위치하였다. 24시간 후에 화합물들을 2 시간 전에 지정된 농도로 전치리하고 12 시간 동안 20 ng/mltnf-α로 처치하였다. 루시페라 제(Luciferase) 활성은 키트(E6110, OneGlo Luciferase Assay kit, Promega)로 측정하였다. DMSO를 담체 대조 군(vehicle control)으로 이용하였다. [0138] [0139] 1-5. KS-534에 의한 NF-κB 전사인자의 활성 저해 효과 TNF-α 는 MUC5AC 발현을 유도하기 위해 NF-κB 전사인자를 활성화시킨다고 보고되었다[ Busse, P. J., Zhang, T. F., Srivastava, K., Lin, B. P., Schofield, B., Sealfon, S. C. & Li, X. M. (2005) Chronic exposure to TNF-alpha increases airway mucus gene expression in vivo, The Journal of allergy and clinical immunology. 116, 1256-63; Smirnova, M. G., Birchall, J. P. & Pearson, J. P. (2000) TNF-alpha in the regulation of MUC5AC secretion: some aspects of cytokine-induced mucin hypersecretion on the in vitro model, Cytokine. 12, 1732-6]. 상기 결과에서, KS-534에 의해 MUC5AC 발현 억제 효과를 확인한바, 실제로 - 19 -
MUC5AC 프로모터에 존재하는 NF-κB 전사인자의 활성이 저해되는지를 확인하고자 하였다. [0140] 본 실험을 위해서, 정상적인 인간기관지상피 세포(normal human bronchial epithelium) 인 Beas2B 세포에 루시 퍼레이즈 리포터 벡터 pgl4.32(luc2p/nf-κb-re/hygro, Promega사) 가 안정적으로 발현되는 세포를 구축하였다. 실험을 위해, 세포는 DMEM (Hyclone사)에 10% FBS사 포함된 배지로 96 웰 플레이트에 5 10 4 cells/ml의 농도로 현탁하여 100 μl씩 접종하여 12시간 동안 부착한 다음, 0.1 % FBS를 포함한 배지로 교체하여 12 시간을 더 배양하였다. KS-534를 10 μm 로 2시간 동안 처리하고, TNF-α를 20 ng/ml 의 농도로 처리하여, 12시간 배양하였다. 루시퍼레이즈의 활성화 정도를 One-glow Luciferase Assay system(promega사)을 이용하여 확인하였다. 먼저 96 웰플리이트에서 배지를 모두 제거하고 PBS 완충용액으로 2회 세척한다음, 각 웰당 60 μl 의 세포용해 완충액(passive lysis buffer, PLB)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 약 30분이 경과한 후, 세포 용 출액 50μL씩 취하여 새로운 96웰 플레이트에 옮겨준 후, 반딧불이 루시퍼레이즈의 기질이 포함된 50 μl의 LAR II 시약을 첨가하여 발광되는 정도를 Microplate Luminometer LB 96V (EG&G Berthold사)를 이용하여 0.5초간 측정하였고, 그 결과는 하기 도 4 의 그래프로 나타내고, 이를 표 5에 나타내었다. [0141] 본 실험 결과, 도 4의 그래프와 이를 정리한 표 5에서 나타난 바와 같이, TNF-a를 처리한 군에서 NF-κB 활성이 증가하였고, 이를 100% 기준으로 볼 때, KS-534에 의한 NF-κB 활성을 측정한 결과, KS-534 10 μm에서 36.65 % 저해됨을 확인하였다. [0142] 표 5 The summary for inhibition rate of NF-κb activity by KS-534 시료 농도 TNF-α NF-κB activity 저해율(%) (μμm) (20 ng/ml) (TNF-α처리군에 대한 상대적인 %) 음성대조군 0-34.05 ± 1.99 65.95 TNF-α처리군 0 + 100.00 ± 6.22 0.00 KS-534 10 + 63.35 ± 6.18 36.65 [0143] 상기한 바와 같이, 폐암점막세포인 H292 세포에서 TNF-α에 의해 유도된 MUC5AC mrna와 단백질 발현이 KS-534에 의해 억제효과가 있는지를 실험한 결과, TNF-α에 의해 유도된 MUC5AC의 mrna 발현양을 100% 기준으로 볼 때, KS-534를 10 μm 처리에 의해 MUC5AC의 mrna 발현양이 41.52 %의 저해율을 보이고, TNF-a에 의해 유도된 MUC5AC의 단백질 발현양을 100% 기준으로 볼 때, KS-534의 2.5, 5, 10 μm에서 MUC5AC의 단백질 발현양이 각각 6.62, 21.73, 35.23 % 저해됨을 확인하였으며, 이를 통해 KS-534에 의해 MUC5AC mrna와 단백질 발현이 모두 유 의적으로 저해됨을 확인하였으며 또한, TNF-a에 의해 유도된 KS-534에 의해 NF-κb전사인자 활성이 유의적으로 억제됨을 확인하였다. [0144] [0145] 실험예 2: MUC5AC 단백질 생성 저해 효과 본 실험에 앞서, MUC5AC 단백질 생성에 대한 실시예 시료들의 저해 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌 에 기재된 방법을 응용하여 실험하였다(Sikder, MA. et al., Phytotherapy research : PTR. 28, 62-8. 2014). [0146] [0147] [0148] 1-1. KS-534에 의한 MUC5AC 단백질 생성 저해 효과 만성폐쇄성 폐질환(COPD)과 같은 염증성 질환의 예방 또는 치료효과를 분석하기 위하여, KS-534에 의한 MUC5AC 분비 저해 효과를 확인하였다. 생성된 MUC5AC의 면역분석(immunoassay)을 위해서 회수한 상등액 50 ul를 96 웰-플레이트에 분주하고 50 로 설 정된 항온기에서 건조시켰다. 1% BSA가 첨가된 PBS로 세척한 다음, MUC5AC 항체(ab3649, abcam사)와 상온에서 1 시간 반응하고, 2차 항체를 분주하여 1시간 동안 반응시켰다. 재세척한 후 3,3,5,5 -tetramethylbenzidine peroxide solution(54827-17-7, Sigma-aldrich)를 20분간 반응시킨 다음, 황산용액으로 반응을 정지시킨 후, - 20 -
마이크로플레이트 측정기(VERSAmax microplate reader, SMP500-14915, Molecular Devices, USA)로 450 nm에서 발색 정도를 측정하였고[8. Sikder, M. A., Lee, H. J., Mia, M. Z., Park, S. H., Ryu, J., Kim, J. H., Min, S. Y., Hong, J. H., Seok, J. H. & Lee, C. J. (2014) Inhibition of TNF-alpha-induced MUC5AC mucin gene expression and production by wogonin through the inactivation of NF-kappaB signaling in airway epithelial cells, Phytotherapy research : PTR. 28, 62-8; Takeyama, K., Dabbagh, K., Lee, H. M., Agusti, C., Lausier, J. A., Ueki, I. F., Grattan, K. M. & Nadel, J. A. (1999) Epidermal growth factor system regulates mucin production in airways, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 3081-6], 그 결과는 하기 도 5의 그래프로 나타내고, 이를 표 6에 나타내었다. [0149] 상기 실험 결과, 하기 상기 도 5에 그래프와 이를 정리한 표 6에서 나타난 바와 같이, TNF-a를 처리한 군에서 MUC5AC의 분비량이 증가하였고, 이를 100% 기준으로 볼 때, KS-534에 의한 MUC5AC의 분비량을 측정한 결과, KS- 534의 농도 의존적으로 MUC5AC 생성이 2.5, 5, 10 μm에서 각각 6.62, 21.73, 35.23 % 저해됨을 확인하였다. [0150] 표 6 The summary for inhibitory activity of Muc5AC secretion by KS-534 시료 농도 TNF-α MUC5AC 분비량 저해율 (μm) (20 ng/ml) (TNF-α처리군에 대한 상대적인 %) (%) 음성대조군 0-25.98 ± 0.88 74.02 TNF-α처리군 0 + 100.00 ± 1.22 0.00 KS-534 2.5 + 93.38 ± 0.90 6.62 5 + 78.27 ± 2.16 21.73 10 + 64.77 ± 1.56 35.23 [0151] [0152] 실험예 3. 천식유발 실험동물에서의 항천식 효과 상기 실시예 시료들의 천식유발 실험동물에서의 항천식 효과를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 실험법을 응용 하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 [(Shin, I. S., Hong, J., Jeon, C. M., Shin, N. R., Kwon, O. K., Kim, H. S., Kim, J. C., Oh, S. R., Ahn, K. S. (2013) Diallyl-disulfide, an organosulfur compound of garlic, attenuates airway inflammaion via activation of the Nrf-2/HO-1 pathway and NF-kappaB suppression, Food and Chemical Toxicology. 62, 506-13]. [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] 3-1. 난백알부민을 이용한 천식유발 및 시료 투여 암컷 6 주령의 SPF (specific pathogen-free) Balb/c 생쥐 (20 g)는 샘타코 (Samtako, Korea)사에서 공급받았 다. 동물은 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2, 습 도 55±15%, 12 시간 (light-dark cycle)의 환경에서 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 1주간의 순화기간을 거친 생쥐에게 2주 간격으로 2 mg 수산화알루미늄 (A8222, Sigma-Aldrich, MO, USA)과 난 백알부민 20 ug (A5503, Sigma-Aldrich)을 현탁한 인산완충용액 200 ul을 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민 복강투여 후 21일부터 23일까지 1% 난백알부민을 초음파분무기 (NE-U12, Omron Corp., Japan)를 이 용하여 30 분간 흡입시켰다. 마지막 난백알부민 노출 후 24시간 뒤, 기도과민성을 측정하였고, 48시간 뒤에 펜토바비탈 (50 mg/kg, Entobal, Hanil, Korea)를 복강투여하여 마취시킨 후 복대정맥을 통하여 혈액을 채취하였고, 기관지 절개를 실시하여 총 1.4 ml의 PBS로 기관지폐포 세척을 실시하여 검체를 수거하였다. 실험군은 정상대조군 (NC, 난백알부민 투여 및 흡입하지 않는 군), 천식유발군 (OVA, 난백알부민 투여 및 흡입한 군), 약물대조군 (Mon, montelukast 30 mg/kg 투여 + 난백알부민 투여 및 흡입한 군), KS534 투여군 (Piscroside C, 30 mg/kg 투여 + 난백알부민 투여 및 흡입한 군)으로 설정하여 진행되었다. 약물 및 시료는 첫 번째 난백알부민 투여 후 21일부터 23일까지 경구 투여하였다. 각 군당 7 두의 생쥐를 사용하였다. 통계처리는 실험결과에 따른 여러 변수에 따른 평균값과 표준편차 (mean±sd)로 계산하였고 각 집단 간의 비교 는 SPSS 10.0을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 사후검정으로 Dunnett's multiple comparison test를 - 21 -
이용하여, 각 그룹간 유의성을 검증하였다. 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정 하였다. [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] 3-2. 기관지 폐포세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 분리 및 염증세포 수 측정 각 개체의 기관지폐포 세척액은 회수된 즉시 원심분리기(Mega17R, Hanil, Korea)를 이용하여 상등액을 분리하여 냉동보관하였다. 분리된 세포들은 다시 적정량의 PBS로 희석하고, Cytospin (Hanil, Korea)을 이용하여 세포를 슬라이드에 부착 시킨 후, Diff-Quik 염색(38721, Sysmex, Switzerland)을 실시하여 호산구를 비롯한 그 외 염증세포를 현미경 을 통해 검경한 후, 400배의 배율에서 각 시료당 염증세포 수를 개수하였다. 실험 결과: 호산구증가증은 천식에 있어 주요한 특징 중에 하나이다. 천식유도군에서는 정상대조군에 비해 총 염증세포의 수가 크게 증가하였으며, 특히 호산구의 증가가 특징적으로 관찰되었다. 반면, KS534 투여군 호산구를 비롯한 염증세포의 수에서 현저한 감소가 관찰되었다 (도 6). [0163] [0164] 3-3. 기관지 폐포세척액 (BALF) 내 cytokine 분석 각 개체에서 분리한 기관지폐포세척액에서 인터루킨 (Interleukin)-4, -5, -13 의 생성량은 시판용 효소면역분 석 (Enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA) kit (R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 cytokine 분석은 제조사의 실험방법에 따라 실시하였으며, ELISA reader(versamax, Molecular Devices, USA) 기를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. [0165] 본 실험 결과, Th2 타입의 cytokines인 인터루킨-4는 천식유도군에 정상대조군에 비해 크게 증가되었으며, 반면 montelukast 투여군에서는 천식유도군에 비해 유의성 있게 감소하였다. KS534 투여군에서 천식유도군에 비해 인터루킨-4의 현저한 감소가 관찰되었다. 또한 인터루킨-5 와 -13의 경우에도 KS534 투여군 천식유도군에 비하 여 유의성 있는 감소가 관찰되었다 (도 7). [0166] [0167] [0168] 3-4. 혈청내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE 측정 후대정맥을 통하여 수득한 혈액은 상온에서 30분간 반응시킨 후, 원심분리 (3000 rpm, 15 min) 하여 혈청을 얻 었다. 혈청 내 IgE 및 난백알부민 특이 IgE의 측정을 위하여 ELISA법을 이용하였다. IgE는 시판되는 IgE(432402, Biolegend Ins., USA)를 사용하여 측정하였으며, 난백알부민 특이 IgE는 96-well flat bottom ELISA plate(2592, Costa, USA)에 난백알부민을 20 ug/ml의 농도로 0.1 M NAHCO3 완충액 (ph 8. 3)에 녹여 4 에서 16시간 반응시켰다. 그 후 1% bovine serum albumin 이 함유된 PBS(P2007, Biosesang, Korea)로 비특이 반응을 억제시켰다. 혈청 검체는 1:400 으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 세척하였다. peroxidase가 결합된 HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal A(432402, Biolegend Ins., USA)를 4000 배 희석하여 실온에서 1시간 반응시킨 후, 발색은 3.3 5.5 -tetramethylbenzidine substrate(432402, Biolegend Ins., USA)로 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측 정하였다. [0169] 본 실험 결과, 천식유발군은 혈청 내 IgE의 량이 정상대조군에 비해 현저하게 증가하였으며, 반면 약물대조군인 montelukast 투여군은 천식유발군에 비해 유의성 있는 감소를 나타냈다. KS534 투여군 또한 천식 유발군에 비 해 IgE의 현저한 감소가 관찰되었다. 또한 난백알부민 특이 IgE의 경우에도 천식유발군에서 정상대조군에 비해 크게 증가되는 반면, KS534 투여군에서는 천식유발군에 비해 현저한 감소가 나타났다 (도 8). [0170] 3-5. 조직병리 검사 - 22 -
[0171] 폐를 떼어내어 즉시 10% formaldehyde 용액에 고정한 후 세절하여 흐르는 물에 8 시간 수세한 다음, epoxy에 포 매하고, 이것을 microtome으로 절편을 만들어 표준방법에 의하여 폐조직내 염증을 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을, 기관지내 점액분비를 관찰하기 위하여 periodic acid Schiff (PAS, IMEB Inc., USA) 염색 수 행하였다. 광학현미경을 이용하여 폐조직의 병리학적 변화를 검경하였다. [0172] 본 실험 결과, 천식유발군의 기관지 및 혈관 주위에 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 반면, montelukast 투여군에서는 이러한 염증세포의 침윤의 감소가 인정되었으며, 또한 KS534 투여군에서도 기관지 및 혈관 주위의 염증세포의 침윤이 감소됨이 확인되었다. 이러한 감소는 montelukast 투여군과 비교하여 볼 때, 유 사하게 관찰되었다 (도 9). [0173] [0174] [0175] [0176] 기관지내 점액분비는 천식이 유발된 경우 현저하게 증가된다. 본 실험에서도 천식유발군에서는 기관지상피의 배 상세포에서 점액분비의 증가가 관찰되었다. 반면, montelukast 투여군에서는 점액분비가 감소되었고, 또한 KS534 투여군에서 기관지상피의 배상세포의 점액분비가 현저하게 감소됨이 관찰되었다 (도 10). KS534는 난백알부민으로 유발된 천식의 다양한 증상들을 예방 및 치료할 수 있다는 결과를 얻을 수 있었다. KS534는 천식으로 유발된 호산구 증가증을 비롯한 염증세포의 침윤을 효과적으로 억제하였다. 또한 Th2 타입 인 터루킨-4, -5, -13 및 혈청 내 IgE와 난백알부민 특이 IgE의 생성을 현저하게 감소시켰다. 이러한 효과는 폐 조 직의 병리학적 검사시 확인할 수 있었다. 천식으로 인한 기관지 및 혈관주위의 염증세포의 광범위한 침윤과 기 관지내 과도한 점액분비는 KS534의 투여로 인하여 현저하게 감소되었다. 본 실험에서 KS534은 Th2 타입의 면역반응 야기되는 cytokine의 생성을 효과적으로 억제하였다. 특히 천식의 발 병에 있어 중요한 인터루킨-4, 5, 13을 효과적으로 억제하였다. 이로 인하여 기관지폐포세척액내 호산구의 수를 비롯한 염증세포의 수가 현저하게 감소하였다. 또한 폐조직의 염증반응 및 기관지내 점액의 과다생성을 억제하 였다. 결론적으로, KS534은 Th2 면역반응을 억제하여 천식의 주요증상인 호산구증가증, 폐염증, 점액생성을 효과적으 로 완화시키는 것으로 생각된다. 또한 이러한 KS534의 천식예방 및 치료효과는 현재 시판되는 montelukast와 유 사하게 확인되어 효과적인 천연물 유래의 천식치료제로서 적용될 수 있을 것으로 사료된다. [0177] [0178] 실험예 4. COPD 유발 실험동물에서의 항-COPD 효과 상기 실시예 시료들의 COPD 유발 실험동물에서의 항-COPD 효과를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 실험법을 응 용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. [Bhavsar, T., Liu, X. J., Patel, H., Stephani, R., Cantor, J. O. (2008) Preferential recruitment of neutrophils by endothelin-1 in acute lung inflammation induced by lipopolysaccharide or cigarette smoke, International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 3, 477-81] [0179] [0180] 4-1. 실험 동물 수컷 6 주령의 SPF (specific pathogen-free) C57BL/6N 생쥐 (22 ~24 g)은 코아텍 (Korea)사에서 공급받았다. 동물은 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2, 습도 55 ±15%, 12 시간 (light-dark cycle)의 환경에서 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. [0181] [0182] 4-2. 시료 및 투여방법 2종류의 시료 KS534(15, 30 mg/kg), Roflumilast (10 mg/kg)는 0.5% sodium carboxymethyl cellulose(c9481, Sigma-Aldrich, USA)에 녹여 준비하였다. 시료 KS534, Rolflumilast(ROF II-492, HETERO, India)를 각각 담배 연기 노출 1시간 전에 경구투여하였다. - 23 -