(19) 대한민국특허청(KR) (12) 등록특허공보(B1) (45) 공고일자 2014년01월22일 (11) 등록번호 10-1354652 (24) 등록일자 2014년01월13일 (51) 국제특허분류(Int. Cl.) C12N 15/62 (2006.01) C07K 19/00 (2006.01) C12N 15/70 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-7015307 (22) 출원일자(국제) 2009년12월02일 심사청구일자 2011년07월01일 (85) 번역문제출일자 2011년07월01일 (65) 공개번호 10-2011-0106333 (43) 공개일자 2011년09월28일 (86) 국제출원번호 PCT/KR2009/007142 (87) 국제공개번호 WO 2010/064838 국제공개일자 (30) 우선권주장 2010년06월10일 61/193,463 2008년12월02일 미국(US) (56) 선행기술조사문헌 Mike S. S. Chang 등, Science's STKE. Vol. 2000(47), PL. 1 (2000년) Anne Scheller 등, European Journal of Biochemistry. Vol. 267, pp. 6043-6049 (2000 년) (73) 특허권자 조대웅 서울특별시 강남구 논현로 218, 삼익아파트 1-1209 (도곡동) 주식회사 프로셀제약 서울특별시 구로구 디지털로 273, 1008호 1009호 (구로동, 에이스트윈타워2) (72) 발명자 조대웅 서울특별시 강남구 논현로 218, 삼익아파트 1-1209 (도곡동) 임정희 경기도 광명시 금당로 11, 하안주공6단지아파트 603동 1507호 (하안동) (74) 대리인 특허법인이룸 Wenge Wang 등, TRENDS in Biotechnology Vol.22(9), pp.431-434 (2004년) 전체 청구항 수 : 총 30 항 심사관 : 최준호 (54) 발명의 명칭 세포투과성 p53 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함 유하는 항암 조성물 (57) 요 약 본 발명은 종양 억제인자 (tumor suppressor) p53 에 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 세포투과성을 갖는 p53 재조합 단백질, 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질의 발현벡터, 및 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질을 유 효성분으로 함유하는 항암제용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포투과성 p53 재조합 단백질은 종 양억제 인자인 p53 을 세포의 핵 내로 전달하여 사이클린-의존성 키나아제와 사이클린의 복합체 형성을 억제하여 세포주기 저해와 세포사멸 유도에 관여하는 신호전달 기작을 효과적으로 재활성화시키므로, 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 다양한 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 항암제로 유용하게 사용될 수 있다. - 1 -
특허청구의 범위 청구항 1 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 인간 종양 억제인자 p53 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 서열번호: 6 및 서열번호 8 의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 있는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 2 제 1 항에 있어서, 상기 거대분자 전달 도메인이 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 JO-39 MTD 및 서열번호: 8 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-41 MTD 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 3 제 1 항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 한쪽 말단에 세포핵 배치 서열 (nuclear localization sequence: NLS) 및 히스티딘-표지 (histidine-tag) 친화성 도메인으로부터 선택되는 1 종 이상이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 4 제 1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질: 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p53 N-말단에 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 JO-39 MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p53 C-말단에 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 JO-39 MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p53 양 말단에 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 JO-39 MTD 가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p53 N-말단에 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 갖는 JO-41 MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p53 C-말단에 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 갖는 JO-41 MTD 가 융합된 재조합 단백질; 및 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 전장의 p53 양 말단에 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 갖는 JO-41 MTD가 융합된 재조합 단백질. 청구항 5 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 서열번호; 14, 16, 18, 20, 22 및 24 의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아 미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 6 제 1 항 내지 제 3 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 서열번호: 48, 50, 52, 54, 56 및 58 의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아 - 2 -
미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 7 제 1 항의 세포투과성 p53 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드. 청구항 8 제 7 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 13, 15, 17, 19, 21 및 23 의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드. 청구항 9 제 7 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 47, 49, 51, 53, 55 및 57 의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드. 청구항 10 제 7 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터. 청구항 11 제 10 항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터가 pet28a(+)-hnm 39 p53, pet28a(+)-hnm 41 p53, pet28a(+)-hnp53m 39, pet28a(+)-hnp53m 41, pet28a(+)-hnm 39 p53m 39 및 pet28a(+)-hnm 41 p53m 41 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발 현벡터. 청구항 12 제 10 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균. 청구항 13 하기 단계를 포함하는 제1항의 세포투과성 p53 재조합 단백질을 생산하는 방법: 1) 제12항의 형질전환 세균을 배양하여 세포투과성 p53 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 2) 발현된 세포투과성 p53 재조합 단백질을 배양액으로부터 회수하는 단계. 청구항 14 제 1 항의 세포투과성 p53 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 p53 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물. 청구항 15 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 갖는 인간 종양 억제인자 p53 의 결절형 (truncated) 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 서열번호: 6 및 서열번호: 8 의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 거 대분자 전달 도메인(macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 있는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 16 제 15 항에 있어서, 상기 거대분자 전달 도메인이 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 JO-39 MTD 및 서열번호: 8 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-41 MTD 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. - 3 -
청구항 17 제 15 항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 한쪽 말단에 세포핵 배치 서열 및 히스티딘-표지 친화성 도메인으로부터 선택되는 1 종 이상이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 18 제 15 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질: 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 갖는 결절형 p53 N-말단에 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 JO-39 MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 갖는 결절형 p53 C-말단에 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 JO-39MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 갖는 결절형 p53n-말단에 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 갖는 JO-41 MTD 가 융합된 재조합 단백질; 및 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 갖는 결절형 p53 C-말단에 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 갖는 JO-41 MTD 가 융합된 재조합 단백질. 청구항 19 제 15 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 서열번호: 28, 30, 32, 34, 38, 40, 42 및 44 의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선 택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 20 제 15 항 내지 제 17 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 서열번호: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 및 78 의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선 택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 p53 재조합 단백질. 청구항 21 제 15 항의 세포투과성 p53 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드. 청구항 22 제 21 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 27, 29, 31, 33, 37, 39, 41 및 43 의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택 되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드. 청구항 23 제 21 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 및 77 의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택 되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드. 청구항 24 제 21 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터. - 4 -
청구항 25 제 24 항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터가 pet28a(+)-hnm 39 Δp53 및 pet28a(+)-hnm 41 Δp53, pet28a(+)-hm 39 Δp53 및 pet28a(+)-hm 41 Δp53 로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터. 청구항 26 제 24 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균. 청구항 27 제 26 항에 있어서, 형질전환 세균이 대장균 DH5α/HNM 39 Δp53 (기탁번호: KCTC 11596BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균. 청구항 28 제 26항에 있어서, 형질전환 세균이 대장균 DH5α/HM 39 Δp53 (기탁번호. KCTC 11595BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균. 청구항 29 하기 단계를 포함하는 제15항의 세포투과성 p53 재조합 단백질을 생산하는 방법: 1) 제26항의 형질전환 세균을 배양하여 세포투과성 p53 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 2) 발현된 세포투과성 p53 재조합 단백질을 배양액으로부터 회수하는 단계. 청구항 30 제15항의 세포투과성 p53 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 p53 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물. 명 세 서 [0001] 기 술 분 야 본 발명은 종양 억제인자 (tumor suppressor) p53 에 거대분자 전송 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 세포투과성을 갖는 p53 재조합 단백질, 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질을 코딩하 는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질의 발현벡터 및 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 p53 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물에 관한 것이다. [0002] [0003] 배 경 기 술 p53은 체내에서 주요한 종양 억제 단백질이며 세포주기 조절, 세포사 (apoptosis)의 시작, DNA 수선 (DNA repair), 노화 (scnescences)에 관여하는 전사인자로 다양한 신호전달 체계를 통합하는 단백질의 거대한 네트워 크의 중심에 있다. 원발성 종양 (primary tumor)의 약 50% 에서 p53 유전자의 돌연변이가 관찰되며 나머지에서 는 p53 조절인자들의 변화가 관찰되는 점에서, p53은 인간의 종양을 효과적으로 억제한다. 실제로 p53 돌연변이 암세포에서 p53을 복구시키면 암세포 사멸을 유도할 수 있음이 확인되었다. 정상세포의 경우 p53 단백질은 MDM2 (Murine double minute 2) 와 결합되어 비활성화되고 합성되자마자 빠르게 분해되기 때문에 매우 낮은 수준으로 존재한다. 하지만 여러 스트레스 신호들에 의해 DNA에 손상이 가해지면 p53이 증가되고 활성화되어 세포의 증식을 중지 (arrest) 시키거나 세포사멸을 야기시켜 세포주기를 조절하고 악성전환 (malignant transformation)을 일으키지 않도록 보호한다. 또한, 세포가 증식하기 위해서 G1기를 거쳐 DNA 복제, 그리고 G2기를 거쳐 세포분열 (M기)을 하는 일련의 단계를 거치는데, 이를 세포주기라 하며 여러 확 인지점 (check point)이 있어서 세포주기를 조절한다. G1기를 유도하는 주된 요소 중의 하나가 p53 전사인자에 의해 활성화되는 p21 단백질이다. p21 단백질은 사이클린-CDK 복합체 (cyclin-cyclin dependent kinase - 5 -
complex)의 저해제로 p53에 의해 유도되는 p21발현 증가에 의해 사이클린-CDK 복합체의 활성을 저해하게 된다. [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] MDM2 (Murine double minute 2)는 대표적인 p53 저해인자로서 p53 전사 활성화 도메인에 결합함으로써 p53이 타겟 유전자 발현을 유도하지 못하도록 한다. 또한 p53에 대한 유비퀴틴리가아제 (ubiquitin ligase)로 작용하 여 p53을 유비퀴틴화 (ubiquitinylation) 시킴으로써 26S proteasome 경로를 통해 분해시킨다, 손상을 입은 세 포에서 유도된 p53은 MDM2의 전사를 활성화 시키며, MDM2는 p53의 분해를 촉진시킨다. p53이 분해되면 다시 MDM2 발현이 증가하는데 이렇게 p53과 MDM2 사이의 피드백 기작에 의해 조절된다. 돌연변이 (mutant) 또는 비활성화 (inactivated)된 p53은 대부분의 인간 종양에서 발견되는데, p53과 관련된 신 호전달체계는 매우 복잡한 조직특이성을 갖는다. 섬유모세포 (fibroblast)나 상피세포 (epithelial cell)는 DNA 손상 및 수복이 이루어질 때 p53이 세포성장주기를 한시적이거나 영구적인 방식으로 G1기와 G2기 상에 묶어 두 어 세포의 성장 및 분열을 억제한다. 인간의 p53 유전자는 393개의 아미노산으로 구성된 단백질로 4개의 기능적 인 도메인으로 구성된 모듈구조로서 유기적인 형태를 나타내며, 단백질의 주요한 부분은 도메인의 핵심 (core) 으로 알려진 p53 DNA 결합도메인 (DNA binding domain: DBD, 아미노산 102-292)이다. 이미 알려진 모든 종양성 돌연변이의 약 90%가 이 부분에 위치하고 있다. p53의 조절과 활성화는 돌연변이 산물 ATM (ataxiatelangiectasia mutated)과 ATR(ataxia telangiectasia and Rad3 related)에 의해 매개되는 세린 (Ser)과 트레 오닌 (Thr)의 인산화, 히스톤 아세틸라아제 (histone acetylase)에 의한 p53 전사기능 조절, 카르복시 말단영역 의 라이신 잔기의 유비키틴화와 서모일레이션에 의한 단백질 번역 후 이러한 변경을 통해 나타난다. 분자암 치료에서 가장 효과적인 접근법은 돌연변이에 의해 p53 활성을 잃은 종양에서 야생형 (wild type) p53 기능을 재생하는 것이다. 이를 위한 지금까지의 방법은 유전자 도입 (gene delivery)에 의해서 돌연 변이된 p53 을 가진 종양에 야생형 p53을 발현시키는 방법이나, 또는 종양에서 p53을 활성화 시킬 수 있는 소분자를 찾는 것이었다. 그럼에도 불구하고 이러한 모든 시도들은 지금까지 충분치 못한 가능성만을 보여주고 있으며, 부적절 한 물리 화학적 특징을 보여주고 있어 암 치료제로서 특징화되어 있지 않다. 따라서, 종양 억제인자인 p53에 거대분자의 세포 내 전송을 가능케 하는 "거대분자 전달 도메인 (Macromolecule Transduction Domain: MTD)"을 융합시켜 세포 투과성을 부여한 p53 재조합 단백질 (Cell Permeable CP-p53)을 제조하여 항암효능을 가진 질병치료 물질을 만들고자 하였다. 본 연구팀이 개발한 거대분자 세포 내 전송 도메인 (MTD)의 경우 세포간 전달 (cell-to-cell delivery)이 가능 하여 모든 종류의 투여 경로를 통해 거대분자의 전신적 전송이 가능하므로, CP-p53이 생체 세포 내로 효과적으 로 전달되어 인간의 다양한 암에서 발생되는 p53 결손 (deficiency) 또는 기능 상실 (loss-of function)을 치 료할 수 있는 신개념의 단백질 소재 바이오 신약으로 개발될 수 있을 것으로 확신하였다. 이에 본 발명자들은 체내에서 p53의 과발현을 유도하거나 p53 단백질을 직접 체내에 고효율로 전송할 수 있다면 종양형성 및 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 확신하고, 이를 이용하여 신규 항암제의 개발을 위해 예의 연구 노력하였다. 한편, 합성화합물 (synthetic compound) 또는 천연물의 작은 분자들 (small molecules)은 세포 안으로 전달될 수 있으나, 단백질, 펩티드, 핵산 같은 거대분자들 (macromolecules)은 분자량 때문에 세포 내로 전송될 수 없 다. 이러한 거대 분자들은 분자량 500 이상의 거대분자로 살아있는 세포의 원형질막 (plasma membrane), 즉 이 중 지질막 구조 (lipid bilayer structure)를 통과할 수 없음이 널리 알려져 있다. 이를 극복하기 위한 방법으 로 "거대분자 세포 내 전달기술 (macromolecule intracellular transduction technology: MITT)"이 개발되었는 데 (한국특허출원: 제10-2009-7017564호, 미국특허출원: 12/524935, 캐나다특허출원: 제2,676,797호, 중국특허 출원: 제200880003468.9호, 호주특허출원: 제2008211854호, 인도특허출원: 5079/CHENP/2009, EU특허출원: 제 08712219.8호, 일본특허출원: 출원번호 미지정(USPP: 60/887,060에 기초한 우선권 주장)), 이는 치료용 거대분 자들 (therapeutic macromolecule)의 생체 내 전달을 가능케 함으로써 기존의 의약품 개발 기술로는 불가능했던 펩티드, 단백질, 유전자 자체 등을 이용한 바이오 신약물의 개발을 가능하게 한다. 이 기술에 따르면, 거대분자 들은 "소수성 거대분자 전달 도메인 (hydrophobic macromolecule transduction domain)"과 다른 여러 가지 세 포 내 운반체들과 융합되어 재조합 단백질 형태로 합성 또는 발현, 정제되고 생체내 투여되어 세포 내로 전달된 후, 특정 세포내 위치로 정확하고 빠르게 운반되어 필요한 여러 가지 역할을 효과적으로 발휘할 수 있다. 이처 럼 거대분자 전달 도메인 (MTD)은 펩티드, 단백질, DNA, RNA, 합성화합물 등과 융합되어 세포 내로 들어갈 수 없는 많은 불투과성 물질들의 전송을 가능케 한다. 이에 본 발명자들은 종양 억제인자 p53에 거대분자 전달 도메인을 융합시켜 세포투과성을 부여한 p53 재조합 단 백질을 제조하고 이 재조합 단백질이 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 환경 하에서도 세포 외부로부터 대량의 종 양 억제인자 p53을 세포의 핵 내로 효과적으로 전달하여 인간의 다양한 암에서 발생되는 p53 결손 또는 기능 상 - 6 -
실을 치료할 수 있는 항암제로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 발명의 내용 [0011] 해결하려는 과제 따라서 본 발명의 목적은 종양 억제인자 p53 에 세포투과성을 부여하여 이를 세포 내로 고효율로 도입함으로써 인간의 다양한 암에서 발생되는 p53 결손 또는 기능 상실을 치료할 수 있는 항암제로서 세포투과성 p53 재조합 단백질을 제공하는 것이다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 과제의 해결 수단 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양 억제인자 p53 과 거대분자 전송 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여되어 p53 을 세포 내로 고효율로 도입하는 세포투과성 p53 재조합 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 아울러 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 이 발현벡터로 형질 전환된 형질전환 세균을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 형질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 세포투과성 p53 재조합 단백질의 제조방법을 제 공한다. 마지막으로 본 발명은 상기 p53 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 세포투과성 p53 결손 또는 기능 상실을 치료하기 위한 항암제용 약학 조성물을 제공한다. [0017] 발명의 효과 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 p53 재조합 단백질은 종양 억제인자 p53을 세포의 핵 내로 고효율로 도입하 여 사이클린-CDK 복합체 형성을 방해하여 암세포의 세포주기를 저해함으로써 생체 내 불필요한 세포증식을 억제 하고, 이로 인해 암세포의 사멸을 유도하여 인간의 다양한 암에 대한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다. [0018] 도면의 간단한 설명 도 1 은 각각 본 발명에서 거대분자 전송 도메인 (MTD)으로 사용된 JO-39 및 JO-41 MTDs 의 정량적 세포투과성 을 유세포분석기를 이용하여 확인한 결과이고, 도 2 는 본 발명에서 거대분자 전달 도메인 (MTD)으로 사용된 JO-39 및 JO-41 MTDs 의 세포투과성을 NIH3T3 세 포에서 동초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과이고, 도 3 는 본 발명에서 거대분자 전달 도메인 (MTD)으로 사용된 JO-39 및 JO-41 MTDs 의 조직투과성을 다양한 마 우스 조직에서 동초점 레이저 주사현미경으로 관찰한 결과이고, 도 4 는 본 발명에 따라 전장 형태의 p53 에 JO-39 및 JO-41 MTDs가 각각 융합된 p53 재조합 단백질의 구조를 나타낸 것이고, 도 5 는 본 발명에 따라 결절형 (truncated) p53 에 JO-39 및 JO-41 MTDs 가 각각 융합된 p53 재조합 단백질의 구조를 나타낸 것이고, 도 6 은 본 발명에 따라 전장 형태와 결절형의 p53 에 JO-39 및 JO-41 MTDs 가 각각 융합된 p53 재조합 단백질 을 코딩하는 cdna 를 PCR 로 증폭한 결과이고, 도 7 은 도 6 의 PCR 증폭산물이 pgem-t Easy 벡터에 클로닝 되었음을 나타낸 것이고, 도 8 은 본 발명의 p53 재조합 단편을 pet-28a(+) 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이고, 도 9 는 본 발명의 p53 재조합 단백질의 발현을 단백질 발현 유도제인 IPTG 의 존재(+) 또는 부재 (-) 하에서 조사한 결과이고, 도 10 은 JO-39 및 JO-41 MTDs 와 세포핵 배치 서열 (nuclear localization sequence: NLS)이 결절형의 p53 에 - 7 -
각각 융합되어 있는 p53 재조합 단백질의 세포 투과성을 측정을 유세포분석기로 관찰한 결과이고, 도 11 은 JO-39 및 JO-41 MTDs 와 세포핵 배치 서열 (nuclear localization sequence: NLS) 이 전장형태의 p53 과 융합된 재조합 단백질의 세포투과성을 동초점 레이저 주사현미경으로 분석한 결과이고, 도 12 는 JO-39 및 JO-41 MTDs 와 세포핵 배치 서열 (nuclear localization sequence: NLS) 이 결절형의 p53 과 융합된 재조합 단백질의 세포투과성을 동초점 레이저 주사현미경으로 분석한 결과이고 도 13 은 본 발명에 따른 세포투과성 결절형의 p53 재조합 단백질의 세포 내 기능을 인간 결장암 세포주인 HCT- 116 세포주에서 웨스턴 블롯팅으로 p21 발현 양상을 분석한 결과이고, 도 14 는 본 발명에 따른 결절형의 p53 재조합 단백질을 종양이 형성된 마우스에 피내주사로 매일 투여하면서 17 일 동안 매일 종양 크기의 변화를 측정한 결과이고, 도 15 는 본 발명에 따른 결절형의 p53 재조합단백질을 종양이 형성된 마우스에 피내주사로 매일 17 일 동안 투 여한 뒤 투여 전과 투여 종료 후의 종양 크기를 비교한 사진이다. [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 [발명의 실시를 위한 최선의 형태] 본 발명은 종양 억제인자 p53 과 거대분자 전달 도메인 (MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여되어 p53 을 세포 내로 고효율로 도입할 수 있는 세포투과성 p53 재조합 단백질 (CP-p53) 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 종양 억제인자 p53과 거대분자 전달 도메인 (MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여된 단백질을 사용하 였다. 상기에서 세포핵 배치 서열(NLS)에 전장형태의 p53이 융합된 재조합 단백질로서 NLS-p53(Np53)은 서열번호: 12의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 11의 염기서열을 갖는 폴 리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 상기에서 JO-39 MTD(MTD 39 )를 이용하여 제조된 전장 형태의 p53 재조합 단백질로서, NLS-MTD 39 -p53(nm 39 p53)은 서열번호: 14의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 13의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0026] NLS-p53-MTD 39 (Np53M 39 )은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 15의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0027] NLS-MTD 39 -p53-mtd 39 (NM 39 p53m 39 )은 서열번호: 18 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 17 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0028] [0029] 상기에서 JO-41 MTD(MTD 41 )를 이용하여 제조된 전장 형태의 p53 재조합 단백질로서 NLS-MTD 41 -p53(nm 41 p53)은 서열번호: 20의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 19의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0030] NLS-p53-MTD 41 (Np53M 41 )은 서열번호: 22의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 21의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0031] NLS-MTD 41 -p53-mtd 41 (NM 41 p53m 41 )은 서열번호: 24 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 23 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0032] [0033] [0034] 상기에서 결절형 (truncated) p53 재조합 단백질의 제조에 사용되는, Δp53 은 서열번호: 26 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 25의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 상기에서 세포핵배치 서열에 결절형 p53 이 융합된 재조합 단백질로서, - 8 -
[0035] [0036] [0037] NLS-Δp53(NΔp53)은 서열번호: 36 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 35 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 상기에서 JO-39 MTD(MTD 39 )를 이용하여 제조된 결절형 p53 재조합 단백질로서, MTD 39 -Δp53(M 39 Δp53)은 서열번호: 28 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 에를 들면, 서열번호: 27의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0038] Δp53-MTD 39 (Δp53M 39 )은 서열번호: 30 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 29의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0039] NLS-MTD 39 -Δp53(NM 39 Δp53)은 서열번호: 38 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호. 37 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0040] NLS-Δp53-MTD 39 (NΔp53M 39 )은 서열번호: 40 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 39 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0041] [0042] 상기에서 JO-41 MTD(MTD 41 )를 이용하여 제조된 결절형 p53 재조합 단백질로서, MTD 41 -Δp53(M 41 Δp53)은 서열번호: 32 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 31의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0043] Δp53-MTD 41 (Δp53M 41 )은 서열번호: 34 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 33의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩 되고; [0044] NLS-MTD 41 -Δp53(NM 41 Δp53)은 서열번호: 42 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 41 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0045] NLS-Δp53-MTD 41 (NΔp53M 41 )은 서열번호: 44 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 43 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0046] [0047] [0048] 또한, 본 발명에서는 분리, 정제의 용이성을 위하여 상기 p53 재조합 단백질에 히스티딘 표지(His-tag)가 추가 로 포함된 형태도 사용된다. 상기에서 JO-39 MTD(MTD 39 )를 이용하여 제조된 전장 형태의 p53 재조합 단백질로서, His-NLS-MTD 39 -p53(hnm 39 p53)은 서열번호: 48 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 47 의 염 기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0049] His-NLS-p53-MTD 39 (HNp53M 39 )은 서열번호: 50 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 49 의 염 기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0050] His-NLS-MTD 39 -p53-mtd 39 (HNM 39 p53m 39 )은 서열번호: 52 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 51 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0051] [0052] 상기에서 JO-41 MTD(MTD 41 )를 이용하여 제조된 전장 형태의 p53 재조합 단백질로서 His-NLS-MTD 41 -p53(hnm 41 p53)은 서열번호: 54 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 53 의 염기서 열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0053] His-NLS-p53-MTD 41 (HNp53M 41 )은 서열번호: 56 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 55 의 염 기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0054] His-NLS-MTD 41 -p53-mtd 41 (HNM 41 p53m 41 )은 서열번호: 58 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 57의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0055] 또한, 상기에서 제조된 결절형 p53 재조합 단백질로서, JO-39 MTD(MTD 39 )를 이용하여 제조된 것으로서, - 9 -
[0056] His-MTD 39 -Δp53(HM 39 Δp53)은 서열번호: 64 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 63 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0057] His-Δp53-MTD 39 (HΔp53M 39 )은 서열번호: 66 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 65 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0058] His-NLS-MTD 39 -Δp53(HNM 39 Δp53)은 서열번호: 68의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 67 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0059] His-NLS-Δp53-MTD 39 (HNΔp53M 39 )은 서열번호: 70의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 69 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0060] [0061] 상기에서 JO-41 MTD(MTD 41 )를 이용하여 제조된 결절형 p53 재조합 단백질로서, His-MTD 41 -Δp53(HM 41 Δp53)은 서열번호: 72 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 71 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0062] His-Δp53-MTD 41 (HΔp53M 41 )은 서열번호: 74 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 73 의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0063] His-NLS-MTD 41 -Δp53(HNM 41 Δp53)은 서열번호: 76의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 75 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0064] His-NLS-Δp53-MTD 41 (HNΔp53M 41 )은 서열번호: 78의 아미노산 서열을 가지며, 이는 예를 들면, 서열번호: 77 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] 본 발명의 특징은 거대분자 세포 내 전달기술 (MITT)을 이용하여 세포 내로의 도입이 용이하지 않은 거대분자인 종양 억제인자 p53 에 특정한 거대분자 전달 도메인 (이하, "MTD"로 약칭함)을 융합시켜 세포투과성을 부여함으 로써 p53 을 세포 내로 고효율로 전달하는 것이다. 이때 거대분자 전달 도메인은 p53 의 한쪽 말단에만 융합되 거나, 또는 그의 양쪽 말단 모두에 융합될 수 있다. 분비 단백질 (secreted protein) 유래 소수성 펩티드인 MTD 를 이용한 세포 내 전달기술은 생체 내 p53 농도의 실시간 정량적 조절 (real-time quantitative regulation) 을 가능케 하여 p53 의 암 조직으로의 전달을 매개하고 개개의 암세포 내로 분포될 수 있게 만든다. 이러한 효과는 암세포에서 억제되어있는 p53 의 활성화 단계를 회복시켜줌으로써 세포주기 억제효과와 암세포 사멸을 유도할 수 있는 환경을 제공할 수 있다. 본 발명에서는 종양 억제인자 p53에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인 (MTD)으로서 세포 내로 거대분자의 전달을 가능케 하는 펩티드 도메인에 상기 p53을 융합하여 세포투과성을 갖는 p53 재조합 단백질을 개발하였다. 본 발명에서 "세포투과성 p53 재조합 단백질" 이란 거대분자 전달 도메인과 종양 억제인자 p53 을 포함하며, 이 들의 유전적 융합이나 화학적 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 여기서 "유전적 융합" 이란 단백질 을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형의 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 암세포의 세포주기를 저해함으로써 생체 내의 불필요한 세포증식을 억제하는 p53 은 서열번호: 1 의 염기서열 및 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 종양 억제인자로서, G1 기에서 세포분열 진행을 조절하는 세포주기 저 해 단백질로 작용한다. 종양 억제인자 p53 은 서열번호: 2 의 아미노산 서열에서 1번부터 393번까지의 아미노산 을 포함하는 도메인으로 구성된다. 종양 억제인자 p53 의 결정형인 Δp53은 서열번호: 3 의 염기서열 및 서열번호: 4 의 아미노산 서열을 갖는 종 양억제인자로서 아미노산 서열에서 1번부터 101번까지의 아미노산을 포함하는 도메인으로 구성된다. 종양 억제인자 p53 에 융합될 수 있는 다른 거대분자 전달 도메인으로는 서열번호: 5 의 염기서열 및 서열번호: 6 의 아미노산 서열을 갖는 세포투과성을 갖는 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 종양 억제인자 p53 에 융합될 수 있는 다른 거대분자 전달 도메인으로는 서열번호: 7 의 염기서열 및 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 갖는 세포투과성을 갖는 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 상기 서열번호: 6 및 서열번호: 8으로 기재되는 아미노산 서열 중의 어느 하나를 포함하는 거대분자 전달 도메 - 10 -
인은 세포막을 관통하여 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 포함하는 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 유입을 매개할 수 있는 세포투과성 폴리펩티드이다. 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인은 N-말단 영 역, 소수성 영역 및 C-말단의 분비 단백질 절단 부위 (secreted protein cleavage site)의 3 부분으로 이루어 진 시그널 펩티드 (signal peptides)에서 헬릭스 (helix)를 형성해 세포막 표적 (targeting) 활성을 부여하는 소수성 영역을 갖도록 고안된 것이다. 이러한 거대분자 전달 도메인은 세포에 손상을 주지 않으면서 직접 세포 막을 관통함으로써 표적 단백질을 세포 내로 이동시켜 목적하는 기능을 발휘하게 할 수 있다. [0074] [0075] 본 발명에 따라 종양 억제인자 p53 과 Δp53 에 융합될 수 있는 서열번호: 6 또는 서열번호: 8 로 기재되는 아 미노산 서열을 갖는 거대분자 전달 도메인을 하기 표 1에 나타내었다. [표 1] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] 본 발명의 세포투과성을 갖는 p53 재조합 단백질은 거대분자 전달 도메인으로 상기 2 종의 MTDs 중의 어느 하나 가 종양 억제인자 p53 의 한쪽 또는 양쪽 말단에 융합되고, 필요에 따라, 이 융합 컨스트럭트의 한쪽 말단에 SV40 거대 T 항원 (SV40 large T antigen) 유래 세포핵 배치 서열 (nuclear localization sequence: NLS)과 용 이한 정제를 위한 히스티딘-표지 (histidine-tag, His-Tag) 친화성 도메인이 융합되어 있는 구조를 가질 수 있 다. 종양 억제인자 p53 에 융합될 수 있는 세포핵 배치서열로는 서열번호: 9 의 염기서열 및 서열번호: 10 의 아미 노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 사용될 수 있으나. 이에 제한 되지 않으며, 당업계에 잘 알려져 있는 다른 세포 핵 배치서열도 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서는, 종양 억제인자 p53 에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인으로 아밀로이드 베 타 A4 단백질 전구체 (Amyloid beta A4 protein precursor, ABPP) 로부터 유래된 서열번호: 6 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-39 MTD (이하, "MTD39"로 약칭함), 또는 스트렙토마이세스 코엘리콜러 (Streptomyces coelicolor)로부터 유래된 분비 단백질 (secreted protein)인 서열번호: 8 의 아미노산 서열을 갖는 JO-41 MTD (이하, "MTD 41 "로 약칭함)를 사용한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서는, 거대분자 전달 도메인으로 JO-39 MTD 또는 JO-41 MTD 를 이용한 세포투과 성 p53 재조합 단백질로서 이들 각각에 대해 2 개의 전장 형태 (full-lengthforms)를 고안한다. 본 발명에서 용어 "p53 의 전장 형태"는 종양 억제인자 p53 의 서열번호: 2 로 기재되는 아미노산 서열에서 하 나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환을 포함하지 않는 온전한 형태의 아미노산 서열을 포함 하는 형태를 의미한다. 그러나 전장 형태의 p53 뿐만 아니라, p53 의 항암활성을 손상시키지 않은 범위 내에서 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환에 의한 다양한 변형을 포함하 는 p53 유도체도 본 발명에 사용될 수 있다. 도 4 를 참고로 하면, 본 발명에 따른 전장 형태의 p53 재조합 단백질은 1) 전장 p53의 N-말단에 His-NLS와 JO-39 MTD가 융합된 His-NLS-MTD 39 -p53(hnm 39 p53), 2) 전장 p53의 N-말단에 His-NLS와 C-말단에 JO-39 MTD가 융합된 His-NLS-p53-MTD 39 (HNp53M 39 ), 3) 전장 p53 의 N-말단에 His-NLS-JO-39 MTD 와 C-말단에 JO-39 MTD가 융합된 His-NLS-MTD 39 -p53- MTD 39 (HNM 39 p53m 39 ), [0086] [0087] [0088] 4) 전장 p53의 N-말단에 His-NLS와 JO-41 MTD가 융합된 His-NLS-MTD 41 -p53(hnm 41 p53), 5) 전장 p53의 N-말단에 His-NLS와 C-말단에 JO-41 MTD가 융합된 His-NLS-p53-MTD 41 (HNp53M 41 ), 6) 전장 p53 의 N-말단에 His-NLS-JO41 MTD 와 C-말단에 JO-41 MTD 가 융합된 His-NLS-MTD 41 -p53- - 11 -
MTD 41 (HNM 41 p53m 41 )의 형태일수 있고, 또는 [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] 상기 1) 내지 6)의 재조합 단백질에서 히스티딘 표지 (His-tag)가 포함되지 않은 형태일 수도 있다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서는, 거대분자 전달 도메인으로 JO-39 MTD 및 JO-41 MTD 를 이용한 세포투 과성 결절형 p53 재조합 단백질이다. 본 발명에서 용어 "결절형 (truncated form) p53"은 서열번호: 4 의 아미노산 서열에서 1 번부터 101 번까지의 아미노산을 포함하는 도메인을 갖는 종양억제인자 p53 의 유도체를 의미한다. 그러나, 상기와 같은 형태뿐만 아 니라, Δp53 의 항암활성을 손상시키지 않은 범위 내에서 그의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 부가, 삽입 또는 치환에 의한 다양한 변형을 포함하는 Δp53 유도체도 본 발명에 사용될 수 있다. 도5를 참고로 하면,본 발명에 따른 결절형 p53 재조합 단백질은, 7) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 및 JO-39 MTD 가 융합된 His-NLS-HTD 39 -Δp53(HNM 39 Δp53), 8) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 와 C-말단에 JO-39 MTD 가 융합된 His-NLS-Δp53-MTD 39 (HNΔp53M 39 ), 9) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 및 JO-41 MTD 가 융합된 His-NLS-MTD41-Δp53(HNM 41 Δp53), 10) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 와 C-말단에 JO-41 MTD 가 융합된 His-HLS-Δp53-MTD 41 (HNΔp53M 41 ), 11) 결절형 p53 의 N-말단에 히스티딘 표지와 JO-39 MTD 가 융합된 His-MTD 39 -Δp53(HM 39 Δp53), 12) 결절형 p53의 N-말단에 히스티딘 표지가 융합되고, C-밀단에 JO-39 MTD 가 융합된 His-Δp53-MTD 39 (HΔ p53m 39 ), [0099] [0100] 13) 결절형 p53 의 N-말단에 히스티딘 표지와 JO-41 MTD 가 융합된 His-MTD 41 -Δp53(HM 41 Δp53), 14) 결절형 p53의 N말단에 히스티딘 표지가 융합되고, C-말단에 JO-41 MTD가 융합된 His-Δp53-MTD 41 (HΔp53M 4 1)의 형태일수 있고, 또는 [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0107] 상기 7) 내지 14)의 재조합 단백질에서 히스티딘 표지 (His-tag)가 포함되지 않은 형태일 수도 있다. 본 발명에서는 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질의 대조군으로서 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지와 NLS 만이 융합된 p53 재조합 단백질 His-NLS-p53(HNp53)을 제조한다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 46 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 45 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 본 발명에서는 상기 세포투과성 Δp53 재조합 단백질의 대조군으로서, MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지만이 융합된 Δp53 재조합 단백질 His-Δp53(HΔp53)을 제조한다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 60 의 아미노산 서 열을 가지며, 이는 서열번호: 59 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 또한, 본 발명에서는 상기 세포투과성 Δp53 재조합 단백질의 다른 대조군으로서, NTD 가 융합되지 않고 히스티 딘 표지와 NLS 만이 융합된 Δp53 재조합 단백질 His-NLS-Δp53(HNΔp53)을 제조한다. 이 대조군 단백질은 서열 번호: 62 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 61 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 다. 나아가, 본 발명은 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡 터 및 이 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다. 본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA 를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 말 한다. 본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열 과 목적하는 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 달성할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려 - 12 -
진 효소 등을 사용한다. [0108] [0109] 본 발명에 사용가능한 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 (cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터 (promoter), 오퍼레이터 (operator), 개시코돈 (initiation codon), 종결코돈 (termination codon), 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signal), 인핸서 (enhancer)와 같은 발현 조절서열 외에도, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 (signal sequence) 또 는 리더서열 (leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성 적 (constitutive) 또는 유도성 (inducible)일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 이와 같이 제조된 본 발명의 재조합 발현벡터는 예를 들면, pet28a(+)-hm 39 p53 일 수 있다. 상기 재조합 발현벡 터 pet28a(+)-hm 39 p53 은 pet-28a(+) 벡터 (Novagen, Germany)의 다중 클로닝 부위 (multi cloning site, MCS) 중 NdeI 제한 효소 부위에 본 발명에 따른 세포투과성 p53 재조합 단백질로서 전장의 p53 N-말단에 JO-39 MTD 가 융합된 재조합 단백질 HM 39 p53을 코딩하는 뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 의미한다. [0110] [0111] [0112] 본 발명의 일 실시예에서는, 단백질의 정제를 용이하게 할 목적으로 세포투과성 p53 재조합 단백질의 N-말단 부 위에 인위적으로 6 개의 히스티딘표지를 포함시켜 발현시키기 위하여, His-Tag 서열을 가지고 있는 pet-28a(+) 벡터 (Novagen, USA)에 본 발명의 뉴클레오티드를 클로닝한다. 상기 재조합 발현벡터로부터 발현되는 세포투과성 p53 재조합 단백질은 전장 형태의 p53 의 한쪽 또는 양쪽 말 단에 JO-39 MTD 및 JO-41 MTD 중의 하나가 융합되고, 그의 N-말단 부위에 히스티딘-표지와 NLS 가 연결되어 있 다. 본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다. 본 발명의 형질전환 세균은 바 람직하게는 대장균일 수 있으며, 대장균을 본 발명의 재조합 발현벡터, 예를 들면 본 발명에 따른 전장의 p53 N-말단에 JO-39 MTD 가 융합된 세포투과성 재조합 단백질 HM 39 p53 을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 pet28a(+)-hm 39 p53 을 이용함으로써 많은 양의 세포투과성 p53 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 형 질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행 될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법 (microprojectile bombardment), 전기충격 유전자 전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaHPO 4 ) 침전, 염화칼슘 (CaCl 2 ) 침전, PEG-매개 융합법 (PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection) 및 리포좀 매개법 (liposome-mediated method) 등이 포함되나 이에 제한되지 않 는다. [0113] 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기의 방법으로 제조된 결절형 p53 N-말단에 세포핵 배치 서열과 JO-39 MTD 가 융합된 HNM 39 Δp53 및 결절형 p53 N-말단에 JO-39 MTD 가 융합된 HM 39 Δp53 각각을 포함하는 재조합 발현벡터 를 대장균 DH5α 에 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균을 2009 년 11 월 17 일자로 한국생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내 생물자원센터 (Biological Resource Center)에 기 탁번호 KCTC11596BP 및 KTC11595BP로 기탁하였다. [0114] [0115] [0116] 본 발명은 또한, 상기 형질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 세포투과성 Δp53 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 본 발명의 형질전환 세균에 도입된 재조합 발현벡터에서 본 발명의 세포투과성 p53 재조합 단 백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 형질전환 세균을 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것에 의해 수행된다. 상기 형질전환 세균을 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 형질전환 세균이 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 후, 이를 본 배양용 배지에 접종 하고 적합한 조건, 예컨대 유전자 발현 유도제인 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드 (isopropyl-β-dthiogalactoside, IPTG)의 존재 하에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배양이 완료되면, 상기 배양물로부터 실질적으로 순수한 재조합 단백질을 회수할 수 있다. 본 발명에서 용어 "실질적으로 순수한"은 본 발명의 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 숙주세포로부터 유래된 다른 단백질을 실질 적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 상기 형질전환 세균에서 발현된 재조합 단백질의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수 행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각 (cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심 - 13 -
분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석 (황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이 용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있 다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬 럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 병용하여 이용할 수 있다 (Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] 한편, 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균에서 발현된 재조합 단백질은 단백질 분리 시 단백질의 특성에 따라 용해성 분획 (soluble fraction)과 불용성 분획 (insoluble fraction)으로 구분될 수 있다. 발현된 단백질의 대부분이 용해성 분획에 있을 경우에는 상기에 기술된 방법에 따라 별다른 어려움 없이 단백질을 분리 및 정제 할 수 있다. 그러나 발현된 단백질의 대부분이 불용성 분획, 즉, 봉입체 (inclusion body) 형태로 존재하는 경 우에는, 우레아, 계면활성제 등의 단백질 변성제가 포함된 용액으로 최대한 단백질을 용해시킨 후 원심분리하여 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행함으로써 정제할 수 있다. 이때, 단백질 변성제가 포함 된 용액에 의해 단백질의 구조가 변형되어 그 활성을 잃을 수 있으므로 불용성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정 중에는 탈염 및 원상화 (refolding) 단계가 필요하다. 즉, 상기 탈염 및 원상화 단계는 단백질 변성제가 포함되지 않은 용액을 이용하여 투석 및 희석을 수행하거나 또는 필터를 이용하여 원심분리를 할 수 있다. 또한, 상기 용해성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정중에도 정제 시 사용하는 용액 내의 염 농도가 높을 경 우에는 이러한 탈염 및 원상화 단계를 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서는, 본 발명에 따른 세포투과성 p53 재조합 단백질이 봉입체 형태로서 불용성 분획에 존재함을 확인하고, 불용성 분획으로부터 이를 정제하기 위하여 용해성 분획을 트리톤 X-100 과 같은 비이온성 계면활성제를 함유하는 완충액에 용해시킨 다음 초음파로 처리하고 원심분리하여 침전물을 수득한다. 상기 수득 한 침전물을 변성제인 우레아가 포함되어 있는 용액에 용해시킨 후 원심분리하여 상층액을 수득한다. 우레아를 이용하여 불용성 분획으로부터 최대한 용해된 본 발명의 재조합 단백질은 히스티딘-결합 정제 키트를 사용하여 정제하고, 이후 정제된 단백질은 투석막 등을 이용한 투석에 의해 염분의 제거 및 단백질 구조의 원상화 과정을 수행함으로써 본 발명의 재조합 단백질을 수득할 수 있다. 아울러 본 발명은 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 p53 결손 또는 기능 상실을 치 료하기 위한 항암제용 약학 조성물을 제공한다. 종양 억제인자인 p53 이 결손되거나 기능이 상실된 경우에 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 p53 재조합 단백 질은 세포의 핵 내로 종양 억제인자인 p53 을 고효율로 도입하여 사이클린-의존성 키나아제와 사이클린의 복합 체 형성을 방해하고 암세포의 세포주기를 저해함으로써 생체 내의 불필요한 세포증식을 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 p53 재조합 단백질은 세포주기 저해와 세포사멸 유도에 관연하는 신 호전달 기작의 재활성화를 통해 암세포의 사멸을 유도하여 인간의 다양한 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 항 암제로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 경구 투여 용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도 체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함한다. 경구 투여용의 경우, 본 발명에 따른 재조합 단백질은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 사 용될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함하며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스 코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클 로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 사용할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995). 본 발명에 따른 조성물은 다양한 비경구 또는 경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표 적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤 제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 - 14 -
및/또는 글리신)와 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우 에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추 가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] 본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제와 기 타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물의 투여 경로로는 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사, 종양 직접 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명의 재조합 단백질의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있 으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1 회 투여 시 5 내지 20 mg의 유효 투여량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 재조합 단백질의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건 강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설을 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정 될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 재조합 단백질의 항암 제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명 의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적 으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. 실시예 1: 선택된 MTB 의 세포투과성 실험 <1-1>유세포 분석 (flow cytometry) 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)으로서 이후의 실시예에 사용 되는 JO-39 MTD(MTD 39 ) 및 JO-41 MTD (MTD 41 )의 세포투과성을 정량적으로 검증하기 위해, 문헌 (Yang Y. 등, FEBS Lett. 532(1-2): 36-44, 2002; Motejadded H, 등, Biotechnol Lett. 31(4): 543-9, 2009)에 기재된 방법 에 따라 EGFP (enhanced green fluorescent protein)에 상기 각각의 MTD 가 융합된 재조합 단백질을 제조하여 이들의 세포내 유입을 FACS (fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다. [0130] 이를 위해 가용성 형태로 분리, 정제된 EGFP-MTD 39 및 EGFP-MTD 41 의 재조합 단백질을 FITC (fluorescein-5- isothiocyanate, Molecular Probe)를 이용하여 형광 표지하였다. 2 내지 20 mg의 재조합 단백질에 333 mg/ml 농도의 FITC 1 μl를 혼합한 후 빛을 피해 상온에서 2 시간 동안 진탕하면서 결합시켰다. 형광으로 표지된 EGFP- MTD 39 및 EGFP-MTD 41 의 재조합 단백질을 4 에서 1 일간 DMEM 배지에 대해 투석하여 표지되지 않은 FITC 를 제 거하였고, 이로부터 회수된 재조합 단백질은 브래드포드 (Bradford) 단백질 정량법으로 그 농도를 분석하였다. 그 결과 각각의 재조합 단백질의 농도는 약 1 μg/μl로 측정되었다. [0131] [0132] 한편, 마우스의 대식세포에서 유래된 RAW 264.7 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin, WelGENE) 500 mg/ml을 함유하는 DMEM 배지 (WclGENE)에 접종하고 37, 5% CO 2 의 습윤 조건 하에서 배양하였다. 배양 후, 상기에서 준비된 FITC-표지 EGFP-MTD 39 및 EGFP-MTD 41 재조합 단백질 각각을 10 μm 농도로 RAW 264.7 세포에 처리한 후 37 에서 1 시간 더 배양하였다. 이어서, 상기 재조합 단백질이 처리된 RAW 264.7 세포의 세 포막에 노출되어 있는 유리 FITC 를 제거하기 위해 트립신/EDTA (T/E, Invitrogen)를 처리하고, 저온의 PBS (phosphate buffered saline)로 3 회 세척하였다. 준비된 세포에 대해 셀퀘스트 프로 세포측정 분석 소프트웨어 (CsllQuest Pro cyometric analysis software)를 이용한 FACScan 유세포 분석기 (flow cytometly, Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 이때 각 시료의 세포 농도는 1 10 4 세포/μl이었고, 분석 실험은 2 회 이상 수행 하였다. 본 발명에 따른 EGFP-MTD 39 및 EGFP-MTD 41 재조합 단백질의 세포투과성은 세포투과성이 없을 거라 기대 - 15 -
되는 음성 대조군 (scrambled MTD), 세포투과성이 이미 확인된 양성 대조군 (kfgf4-유래 MTD), FITC-형광 단일 처리군 및 단백질을 처리하지 않은 세포군을 비교군으로 하여 세포투과성을 결정하였다. [0133] 그 결과, 도 1 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인으로서 JO-39 MTD 와 JO-41 MTD 가 융합된 재조합 단백질이 대조군에 비하여 높은 수준의 원형질막 투과 능력을 나타냄을 확인하였다. 도 1에서 회 색의 곡면은 세포 단독, 검은색 점선 1( )은 FITC 단독, 점선 2 ( )는 세포투과성이 없는 음성 대조 군 (scrambled MTD), 점선 3( )은 세포투과성 있는 양성 대조군 (kfgf4-유래 MTD), 실선은( )JO-39 MTD 와 JO-41 MTD 각각의 재조합 단백질을 나타낸다. [0134] [0135] <1-2> 동초점 레이저 주사 현미경 관찰 I 상기 실시예 <1-1>에서 유세포 분석으로 1 차적으로 세포투과성이 확인된 JO-39 MTD 와 JO-41 MTD 의 세포 내 전달부위를 시각적으로 확인하기 위하여, 마우스의 섬유아세포에서 유래한 NIH3T3 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)에 FITC-표지된 EGFP-MTD 39 및 EGFP-MTD 41 재조합 단백질을 10 μm 의 농도로 처리하고 37 에서 1 시 간 동안 배양한 후 동초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)으로 관찰하였다. 사용된 NIH3T3 세포는 8-웰 챔버 슬라이드 (8-well chamber slide, LabTek, Nalgen Nunc)에서 24 시간 동안 배양하였 다. 이때, NIH3T3 세포는 10% FBS 및 5% 페니실린/스트렙토마이신 500 mg/ml을 함유하는 DMEM 배지에서 배양 하였다. 배양된 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, 무혈청 DMEM, FITC 함유 무혈청 DMEM, 또는 FITC-표지된 재조합 단백질 각각을 10 μm로 함유하는 무혈청 DMEM으로 37, 5% CO 2 하에서 1 시간 동안 처리하였다. 1 시간 경과 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 실온에서 20 분간 처리하여 고정시켰다. [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] 상기에서 고정된 세포는 MTD 의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 핵을 형광 염색하는 PI (propidium iodide, Sigma-Aldrich) 대조염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였다. 1 μg/ml 농도로 5 분간 PI 로 염색한 후, 세포를 PBS 로 3 회 세척하였다. 세포 내 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 10 μl의 DABCO (Fluca) 함유 폴리비닐 알코올 중첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후 에 동초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 이때 동초점 레이저 주사 현미경은 노르마스키 필터 (normaski filter)를 이용하여 세포의 원형, FITC 형광 및 PI 형광을 관찰하였고, FITC 는 488 nm에서 여기되고 530 nm대 역통과 필터 (bandpass filter)로 검출되었다. 그 결과, 도 2 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인으로서 JO-39 MTD 와 JO-41 MTD 가 융합된 재조합 단백질은 세포 단독, FITC 단독, 음성 대조군 (scrambled MTD) 및 양성 대조군 (kfgf4-유래 MTD) 대조군에 비하여 핵 내에 광범위하게 분포하고 있음을 확인하였다. JO-39 MTD 및 JO-41 MTD 재조합 단백질 의 세포내 핵 국소화는 상기 유세포 분석의 상대적 세포투과성 결과에 비례하는 것이다. 실시예 2: 선택된 MTD 의 조직투과성 실험 <2-1> 동초점 레이저 주사 현미경 관찰 상기 실시예 1 에서 배양된 세포를 대상으로 세포투과성이 확인된 본 발명의 JO-39 MTD 및 JO-41 MTD 가 조직 상태에서의 투과성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 이를 위해 FITC-표지된 EGFP-MTD 39 및 EGFP-MTD 41 재조합 단백질을 2 가지 대조군 (음성 대조군 (scrambled MTD) 및 양성 대조군 (kfgf5-유래 MTD)과 함께 7 주령의 누드마우스 (Balb/c nu/nu mice, 중앙실험동물, 서울)에 300 μg씩 복강 주사 (intraperitoneal injection) 하였다. 1.5 시간 후 각 그룹 마우스를 희생시키고 이로부터 간, 신장, 비장, 폐, 심장 및 뇌 조직을 적출하였다. 적출된 조직을 OCT 화합물로 봉입하고 냉동시킨 후 마이크 로톰 (microtome)을 이용하여 두께 14 μm로 박절하였다. 조직 절편을 슬라이드 위에 놓고 동초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 이때, 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위하여 10 μl의 중첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후에 관찰하였다. [0142] [0143] 그 결과, 도 3 에 나타난 바와 같이, 유세포의 상대적 세포투과성 결과에 비례하여 뚜렷한 FITC 형광 (연두색) 으로 염색된 각 조직 내로의 단백질 전달이 관찰되었다. 상기 결과로부터 본 발명에서 거대분자 전달 도메인으 로 사용되는 JO-39 MTD 및 JO-41 MTD가 조직투과성이 우수하여 목적하는 단백질을 효과적으로 조직 내에 전달할 수 있음을 확인하였다. 실시예 3: 세포 및 조직 투과성 p53 재조합 단백질 (CP-p53)의 제조 - 16 -
[0144] <3-1> 상기 실시예 1 과 2 에서 세로 및 조직 투과성이 확인된 본 발명의 JO-39 MTD(MTD 39 ) 및 JO-41 MTD(MTD 41 )을 이용하여 세포투과성 p53 재조합 단백질을 제조하기 위하여 각각의 MTD 에 대해 하기와 같은 전장 형태 및 결절형 재조합 단백질을 고안하였다. (도 4,도 5) [0145] [0146] [0147] [0148] 1) 전장 p53 의 N-말단에 His-NLS 가 융합된 His-NLS-p53(HNp53) 2) 전장 p53 의 N-말단에 His-NLS 와 JO-39 MTD 가 융합된 His-NLS-MTD 39 -p53(hnm 39 p53), 3) 전장 p53의 N-말단에 His-NLS 와 C-말단에 JO-39 MTD 가 융합된 His-NLS-p53-MTD 39 (HNp53M 39 ), 4) 전장 p53 의 N-말단에 His-NLS-JO39MTD 와 C-말단에 JO-39 MTD 가 융합된 His-NLS-MTD 39 -p53- MTD 39 (HNM 39 P53M 39 ), [0149] [0150] [0151] 5) 전장 p53의 N-말단에 His-NLS와 JO-41 MTD가 융합된 His-NLS-MTD 41 -p53(hnm 41 p53), 6) 전장 p53 의 N-말단에 His-NLS 와 C-말단에 JO-41 MTD 가 융합된 His-NLS-p53-MTD 41 (HNp53M 41 ), 7) 전장 p53 의 N-말단에 His-NLS-JO41MTD 와 C-말단에 JO-41 MTD 가 융합된 His-NLS-MTD 41 -p53-mtd 41 (HNM 41 p53 M 41 ), [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] [0168] [0169] [0170] 8) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 가 융합된 His-NLS-Δp53(HNΔp53), 9) 결절형 p53의 N-말단에 히스티딘 표지가 융합된 His-Δp53(HΔp53), 10) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 와 JO-39 MTD 가 융합된 His-NLS-MTD 39 -Δp53(HNM 39 Δp53), 11) 결절형 p53 의 N-말단에 히스티딘 표지와 JO-39 MTD 가 융합된 His-NLS-Δp53-MTD 39 (HNΔp53M 39 ), 12) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 및 JO-41 MTD 가 융합된 His-NLS-MTD 41 -Δp53(HNM 41 ΔP53), 13) 결절형 p53 의 N-말단에 His-NLS 와 C-말단에 JO-41 MTD 가 융합된 His-NLS-Δp53-MTD 41 (HNΔp53M 41 ), 14) 결절형 p53 의 N-말단에 히스티딘 표지와 JO-39 MTD 가 융합된 His-MTD 39 -Δp53(HM 39 Δp53), 15) 결절형 p53 의 N-말단에 히스티딘 표지와 C-말단에 JO-39 MTD가 융합된 His-Δp53-MTD 39 (HΔp53M 39 ), 16) 결절형 p53 의 N-말단에 히스티딘 표지와 JO-41 MTD 가 융합된 His-MTD 41 -Δp53(HM 41 ΔP53) 및 17) 결절형 p53 의 N-말단에 히스티딘 표지와 C-말단에 JO-41 MTD 가 융합된 His-Δp53-MTD 41 (HΔp53M 41 ), 상기 재조합 단백질의 유전자 컨스트럭트를 제조하기 위하여, 각각에 대해 특이적으로 고안된 프라이머 쌍과 인 간 p53 cdna를 주형으로 사용하는 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 이때 HNp53 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 79 및 82의 염기서열을 가지고; HNM 39 p53 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 80 및 82의 염기서열을 가지고, HNp53M 39 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 79 및 83의 염기서열을 가지고, HNM 39 p53m 39 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 80 및 83의 염기서열을 가지고, HNM 41 p53 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 81 및 82 의 염기서열을 가지고; HNp53M 41 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 79 및 84 의 염기서열을 가지고; HNM 41 p53m 41 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 81 및 84 의 염기서열을 가지고; HΔp53 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 85 및 88 의 염기서열을 가지고; - 17 -
[0171] [0172] [0173] [0174] HM 39 ΔP53 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 86 및 88 의 염기서열을 가지고; HM 41 Δp53 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 87 및 88 의 염기서열을 갖는다. 상기에서 각각의 재조합 단편의 증폭을 위해 사용한 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 하기 표 2 에 정리하였다. [표 2] [0175] [0176] [0177] [0178] [0179] PCR 반응은 주형 유전자로 인간 p53 cdna 100 ng, 각 0.2 mm 의 최종 농도 dntp 혼합물 (dgtp, datp, dttp 및 dctp, 각 2 mm), 0.5 μm의 각 프라이머, 10 Taq 완충용액 10 μl, Taq 중합효소 (Takara, Japan) 0.5 μl를 포 함하는 용액을 최종 부피 100 μl 반응액으로 하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 95 에서 2 분간 열 변성 (denaturing)시킨 후 95 에서 45 초, 67 에서 45 초 및 72 에서 45 초의 반응을 30 회 반복하였고, 최종적으 로 72 에서 5 분간 증폭하였다. 반응이 끝난 후 0.8% 아가로즈 겔에 전기영동 (electrophoresis)을 수행하여 증폭된 생성물을 확인하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, MTD 가 융합된 각각의 재조합 단편이 목적하는 크기로 증폭되었음을 확인하였다. 아가로즈 겔에서 증폭된 재조합 단편을 회수한 후 이들 각각을 상용의 키트 (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 추출, 정제하였다. 추출한 단편을 pgem-t Easy 벡터 (Promega, USA)에 삽입한 후 (도 7), MTD 가 융합된 p53 재조합 단백질 유전자 단편이 삽입된 pgem-t Easy 벡터를 대장균 DH5α 감응세포 (competent cell)에 형질전환시켰다. 이를 50 μg/ml 암피실린 (ampicillin)이 포함된 평판 LB 배지에 접종하고 37 에서 밤새 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하고, 이를 다시 액체 LB 배지에서 배양한 후, 이로부터 각각 의 p53 재조합 단백질 유전자가 삽입된 pgem-t Easy 벡터를 다량으로 수득하였다. 도 7 은 pgem-t Easy 벡터에 삽입된 재조합 단편을 NdeI 제한효소 (Enzynomics, Korea)로 분리하여 0.8% 아가 로스 겔에 전기영동한 것으로, 이로부터 각각의 재조합 단편이 상기 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 상기에서 각각의 p53 재조합 단백질 유전자가 삽입된 pgem-t Easy 벡터를 제한효소 NdeI 을 사용해 37 에서 2 시간 동안 절단 (digestion)하여 각각의 재조합 단편을 얻었다. 아가로즈 겔에서 재조합 단편을 회수한 후 이들 각각을 상용의 키트 (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 추출, 정제하였다. 한편, 히스티 딘-표지 (histidine-tag)와 T7 프로모터를 가진 발현벡터 pet-28a(+) 벡터 (Novagen, USA)를 제한효소 NdeI 을 사용해 상기와 동일한 조건으로 절단하였다. 상기에서 추출된 각각의 재조합 단편과 절단된 pet-28a(+) 벡터를 - 18 -
혼합하고, 여기에 T4 DNA 연결효소 (ligase; Takara, 일본)를 첨가한 후 16 에서 12시간 동안 라이게이션 (ligation)시킨 다음, 대장균 DH5α 감응세포에 형질전환시켜 재조합 단백질 발현벡터를 수득하였다, [0180] [0181] 도 8 은 pet-28a(+) 벡터에 삽입된 재조합 단편을 NdeI 제한효소로 분리하여 0.8% 아가로스 겔에 전기영동한 것으로, 이로부터 각각의 재조합 단편이 상기 벡터에 올바르게 삽입되었음을 확인하였다. 이렇게 수득된 재조합 단백질 발현벡터를 각각 pet28a(+)-hnp53, pet28a(+)-hnm 39 p53, pet28a(+)-hnm 41 p53, pet28a(+)-hnp53m 39, pet28a(+)-hnp53m 41, pet28a(+)-hnm 39 P53M 39, PET28a(+)-HNM 41 p53m 41, pet28a(+)-hnδp53, pet28a(+)-hnm 39 Δp53 및 pet28a(+)-hnm 41 Δp53, pet28a(+)-hδp53, pet28a(+)-hm 39 Δp53, pet28a(+)-hm 41 Δp53 으로 명명하였고, 이들 중에서 재조합 발현벡터 pet28a(+)-hnm 39 Δp53 및 pet28a(+)-hm 39 Δp53 로 대장균 DH5α 를 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균 DH5α/HNM 39 Δp53 과 DH5α/HM 39 Δp53 을 2009 년 11 월 17 일자로 한국 생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 내 생물자원센터 (Biological Resource Center)에 기탁번호 KCTC 11596BP 및 KCTC 11595BP 로 기탁하였다. [0182] [0183] [0184] 염기서열 분석결과, 상기에서 JO-39 MTD(MTD 39 )를 이용하여 제조된 전장 형태의 p53 재조합 단백질로서 His-NLS-p53(HNp53)은 서열번호: 46 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 45 의 염기서열을 갖는 폴리뉴 클레오티드에 의해 코딩되고; His-NLS-MTD 39 -p53(hnm 39 p53)은 서열번호: 48 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 47 의 염기서열을 갖 는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, [0185] His-NLS-p53-MTD 39 (HNP53M 39 )은 서열번호: 50 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 49 의 염기서열을 갖 는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, [0186] His-NLS-MTD 39 -p53-mtd 39 (HNM 39 p53m 39 )은 서열번호: 52 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 51 의 염기서 열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0187] [0188] 상기에서 JO-41 MTD(MTD 41 )를 이용하여 제조된 전장 형태의 p53 재조합 단백질로서, His-NLS-MTD 41 -p53(hnm 41 p53)은 서열번호: 54 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 53 의 염기서열을 갖 는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, [0189] His-NLS-p53-MTD 41 (HNp53M 41 )은 서열번호: 56 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 55 의 염기서열을 갖 는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, [0190] His-NLS-MTD 41 -p53-mtd 41 (HNM 41 p53m 41 )은 서열번호: 58 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 57 의 염기서 열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0191] [0192] 염기서열 분석 결과, 상기에서 JO-39 MTD(MTD 39 )를 이용하여 제조된 결절형 p53 재조합 단백질로서, His-MTD 39 -Δp53(HM 39 Δp53)은 서열번호: 64 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 63 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0193] His-Δp53-MTD 39 (HΔp53M 39 )은 서열번호: 66 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 65 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0194] His-NLS-MTD 39 -Δp53(HNM 39 Δp53)은 서열번호: 68 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 67 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0195] His-NLS-Δp53-MTD 39 (HNΔp53M 39 )은 서열번호: 70 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 69 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; [0196] [0197] 상기에서 JO-41 MTD(MTD 41 )를 이용하여 제조된 결절형 p53 재조합 단백질로서, His-MTD 41 -Δp53(HM 41 Δp53)은 서열번호: 72 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 71 의 염기서열을 갖는 - 19 -
폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, [0198] His-Δp53-MTD 41 (HΔp53M 41 )은 서열번호: 74 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 73 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다 [0199] His-NLS-MTD 41 -Δp53(HNM 41 Δp53)은 서열번호: 76 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 75 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0200] His-NLS-Δp53-MTD 41 (HNΔp53M 41 )은 서열번호: 78 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 77 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. [0201] [0202] [0203] [0204] [0205] [0206] [0207] [0208] [0209] [0210] 본 발명에서는 상기 세포투과성 p53 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 세포핵 배치 서열만이 융합된 p53 재조합 단백질 His-NLS-p53(HNp53)을 제조하고, 이 대조군 단백질은 서열번호: 46 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 45 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클 레오티드에 의해 코딩된다. 본 발명에서는 상기 Δp53 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지만이 융합된 Δp53 재조합 단백질 His-Δp53(HΔp53)을 제조하고, 이 대조군 단백질은 서열번호: 60 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 59 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클 레오티드에 의해 코딩된다. 또한, 본 발명에서는 상기 Δp53 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지와 세포핵 배 치 서열이 융합된 Δp53 재조합 단백질 His-NLS-Δp53(HNΔp53)을 제조하고, 이 대조군 단백질은 서열번호: 62 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 61 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클 레오티드에 의해 코딩된다. 실시예 4: 재조합 단백질의 발현 <4-1> 최적의 숙주균주 선발 세포투과성 p53 재조합 단백질의 발현유도에 가장 적합한 숙주균주를 선발하기 위하여, LacI 프로모터를 갖는 대장균 BL21 (DE3), BL21 Gold (DE3), BL21 CodonPlus (DE3) 및 BL21 Gold (DE3) plyss (Stratagene, USA)를 대상으로 하기 실험을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 <3-1>에서 제조된 재조합 발현벡터 각각을 상기 대장균 균주 BL21 (DE3), BL21 Gold (DE3), BL21 CodonPlus (DE3) 및 BL21 Gold (DE3) plyss 각각에 열 충격 (heat shock) 방법으로 형질전환시킨 후 50 μg/ml의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 1 ml LB 배지에 접종하고 37 에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 100 ml LB 배지에 접종하고 37 에서 OD 600 이 0.6 내지 0.7 에 도달할 때까지 배양하였다. 이 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 1 mm의 아이소프로필-β-D- 티오갈락토사이드 (isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)를 첨가하고 37 에서 3 시간 동안 추가로 배양하였 다. 이 배양액을 4 에서 7,000 g, 20 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체 를 용해 완충액 (lysis buffer: 100 mm NaH 41 PO 4, 10 mm Tris-HCl, 8 M 우레아, ph 8.0)에 현탁한 후 초음파 처 리를 수행하여 세포를 파쇄하였으며, 이를 14,000 g 로 15 분간 원심분리하여 용해성 분획과 불용성 분획을 얻었다. 이 용해성 분획과 불용성 분획을 각각 SDS-PAGE 에 걸어 단백질 발현 특성과 발현량 정도를 분석하였다. [0211] [0212] [0213] 다양한 숙주균주를 대상으로 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 조사한 결과, BL21 CodonPlus (DE3) 균주에서 가장 높은 발현량이 확인되어 이를 재조합 단백질의 발현을 위한 최적의 균주로 선택하였다. <4-2> 재조합 단백질의 발현 상기 실시예 <4-1>에서 최적의 균주로 확인된 대장균 BL21 CodonPlus (DE3)에 재조합 발현벡터 pet28a(+)- HNp53, pet28a(+)-hnm 39 p53, pet28a(+)-hnm 41 p53, pet28a(+)-hnp53m 39, PET28a(+)-HNp53M 41, pet28a(+)- HNM 39 p53m 39, pet28a(+)-hnm 41 p53m 41, pet28a(+)-hnδp53, pet28a(+)- HNM 39 Δp53 및 pet28a(+)-hnm 41 Δp53, pet28a(+)-hδp53, pet28a(+)-h M 39 Δp53, pet28a(+)-hm 41 Δp53 각각을 열 충격 방법으로 형질전환시킨 후 50 μg - 20 -
/ml의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 상기 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 25 ml LB 배지에 접종하고 37 에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 1 l LB 배지에 접종하고 37 에서 OD 600 이 0.6 내지 0.7 에 도달할 때까지 배양하였다. 이 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 0.65 mm 의 IPTG 를 첨가하고 37 에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 이 배양액을 4 에서 4,000 g, 20 분간 원심분리하여 상등액을 제 거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 용해 완충액 (100 mm NaH 41 PO 4, 10 mm Tris-HCl, 8 M 우레아, ph 8.0)에 현탁한 후 초음파 처리를 수행하여 세포를 파쇄하였으며, 이를 14,000 g 로 15 분간 원심분리하여 용 해성 분획과 불용성 분획을 얻었다. 이 용해성 분획과 불용성 분획을 각각 SDS-PAGE 에 걸어 단백질 발현 특성 과 발현량 정도를 분석하였다. [0214] [0215] [0216] [0217] 도 9 에 나타난 바와 같이, 약 53 kda 의 크기를 갖는 본 발명의 세포투과성 p53 재조합 단백질은 봉입체 형태 로 대부분 불용성 분획에 포함되어 있으며, IPTG 무처리 배양액 (-)에 비해 IPTG 처리 배양액(+)에서 목적 단백 질의 발현이 현저히 증가되었음을 확인하였다. 실시예 5: 재조합 단백질의 정제 본 발명에 따른 세포투과성 p53 재조합 단백질은 봉입체 형태로 불용성 분획에 존재하므로 이를 정제하기 위하 여 강력한 변성제로서 8 M 우레아 (urea)를 이용하였다. 먼저, 본 발명의 재조합 발현벡터 각각으로 형질전환된 BL21 CodonPlus (DE3) 균주를 상기 실시예 3 과 같이 1 l 의 LB 배지에 배양하였다. 각각의 배양액을 원심분리하여 수득한 균체를 20 ml의 용해 완충액 (100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-HCl, 8 M우레아, ph 8.0)에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 현탁하고, 이를 마이크로팁 (microtip)이 장착된 초음파 균질기를 이용하여 저온에서 균체를 파쇄하였다. 이때, 처리시간은 장치의 출력을 최대출력의 25%로 설정하고, 7 분간 45 초 처리 후 10 초 방치를 반복하였다. 충분히 용균된 봉입체를 4 에서 4,000 g, 20 분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액을 나이트릴로트라이 아세트산 아가로스 (nitrilotriacetic acid agarose)에 Ni 를 부여한 Ni-NTA 아가로스 레진에 로우딩하였다. 이때 Ni-NTA 아가로스는 미리 용해 완충액으로 수차례 세척하여 평형화시킨 후 사용하였다. 상층액을 4 에서 8 시간 이상 진탕기로 천천히 교반하면서 레진에 흡착시켰다. 재조합 단백질이 포함된 봉입체가 흡착된 레진을 4 의 분당 회전수 1,000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여 반응액을 제거하였고, 비특이적 흡착 물질을 제거하기 위해 레진을 세척 완충액 (washing buffsr: 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-HCl, 8 M우레아, ph 6.3)을 이용하여 5 회 세척하였다. 세척된 레진에 ph 4.0 의 산성 조건에서 레진 용적 2 배의 용출 완충액 (elution buffer: 100 mm NaH 2 PO 4, 10 mm Tris-HCl, 8 M 우레아, ph 4.5)을 로우딩하고 진탕기에서 2 시간, 또는 8 시간 이상을 교반 하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 12% SDS-PAGE 겔에서 전기영동을 수행한 후 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R (coomassie brilliant blue R)로 가볍게 진탕하면서 염색하고, 목적 단백질 의 밴드가 명확해질 때까지 탈색액을 이용하여 탈색하였다. [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] 그 결과, 도 9 에 나타난 바와 같이, 마커 단백질의 전기영동 위치와 비교하여 JO-39 MTD 및 JO-41 MTD 가 각각 융합된 모든 세포투과성 p53 재조합 단백질이 약 53 kda 부위에서 검출되어 불용성 분획으로부터 정제되었음을 확인하였다. 실시예 6: 단백질의 활성 재생 상기 실시예 5 에서와 같이 불용성 분획으로부터 정제된 본 발명의 재조합 단백질은 강력한 변성제인 8 M 우레 아에 의해 변성되었기 때문에 이를 활성 형태로 전환시키기 위하여 하기와 같이 원상화 과정을 수행하였다. 먼저, 정제된 재조합 단백질을 원상화 완충액 (refolding buffer: 0.55 M 구아니딘 [Guanidine] HCl, 0.88 M L-아르기닌, 50 mm 트리스-HCl, 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 100 mm NDSB, 1 mm 산화형 글루타치온 [glutathione oxidized] 및 1 mm 환원형 글루타치온 [glutathione reduced])을 이용하여 4 에서 72 시간 이상 투석하여 변 성제를 제거함으로써 재조합 단백질이 재활성, 즉 원상화되도록 하였다. 이때 24 시간 마다 용기 내 원상화 완 충액을 교환해주었다. 이후 활성화된 재조합 단백질을 세포 배양용 배지인 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가 된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 대해 투석막 (Snakeskin pleated, PIERCE)을 사용하여 4 에서 9 시간 동안 교반하면서 투석하였다. 이때 3 시간 마다 용기 내 DMEM 을 교환해주었다. 상기 원상화 과정에 의 해 활성 형태로 전환된 세포투과성 p53 재조합 단백질을 이후의 실험에 사용하였다. 실시예 7: 선택된 MTD 의 세포투과성 실험 - 21 -
[0223] [0224] [0225] [0226] [0227] <7-1> 유세포 분석 (flow cytometry) 본 발명에 따른 세포투과성 Δp53 재조합 단백질의 세포투과성을 정량적으로 검증하기 위해, 하기와 같이 포유 동물 세포에서 각각의 재조합 단백질의 세포내 유입을 FACS (fluorescence-activated cell sorting)로 분석하 였다. 먼저, 상기에서 가용성 형태로 분리, 정제된 세포투과성 p53 재조합 단백질을 FITC (fluorescein-5- isothiocyanate, Molecular Probe)를 이용하여 형광 표지하였다. 2 내지 20 mg의 재조합 단백질에 333 mg/ml 농도의 FITC 1 μl를 혼합한 후 빛을 피해 상온에서 2 시간 동안 진탕하면서 결합시켰다. 형광으로 표지된 세포 투과성 p53 재조합 단백질은 4 에서 1 일간 DMEM 배지에 대해 투석하여 표지되지 않은 FITC 를 제거하였고, 이 로부터 회수된 재조합 단백질은 브래드포드 (Bradford) 단백질 정량법으로 그 농도를 분석하였다. 그 결과 각각 의 재조합 단백질의 농도는 약 1 μg/μl로 측정되었다. 한편, 마우스의 대식세포에서 유래된 RAW 264.7 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin, WelGENE) 500 mg/ml을 함유하는 DMEM 배지 (WelGENE)에 접종하고 37, 5% CO 2 의 습윤 조건 하에서 배양하였다. 배양 후, 상기에서 준비된 FITC-표지 세포투과성 Δp53 재조합 단백질 (HM 39 Δp53, HM 41 Δp53, HNM 39 Δp53, HNM 41 Δp53) 각각을 10 μm 농도로 SAW 264.7 세포에 처리한 후 37 에서 1 시간 더 배양하였다. 이어서, 재조합 단 백질이 처리된 RAW 264.7 세포의 세포막에 노출되어 있는 유리 FITC를 제거하기 위해 트립신/EDTA (T/E, Invitrogen)를 처리하고, 저온의 PBS (phosphate buffered saline)로 3회 세척하였다. 준비된 세포에 대해 셀 퀘스트 프로 세포측정 분석 소프트웨어 (CellQuest Pro cyometric analysis software)를 이용한 FACScan 유세 포 분석기 (flow cytometry, Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 이때 각 시료의 세포 농도는 1 10 4 세포/μl 이었고, 분석 실험은 2 회 이상 수행하였다. 본 발명에 따른 세포투과성 p53 재조합 단백질의 세포투과성은 MTD 를 포함하지 않는 대조군 단백질 (Hp53)의 세포투과성과 비교하여 결정하였다. [0228] 그 결과, 도 10 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 모든 세포투과성 p53 재조합 단백질은 대조군에 비하여 높은 수준의 원형질막 투과 능력을 나타냄을 확인하였다. 도 10 에서 회색의 곡면은 세포 단독, 검은색 곡선은 FITC 단독, 파랑색 곡선은 MTD 가 융합되지 않은 대조군 (HNp53), 적색 곡선은 세포투과성 재조합 단백질 HNM 39 Δp53, HNM 41 Δp53을 나타낸다. 도 10에서 회색의 곡면은 세포 단독, 검은색 점선 1 ( )은 FITC 단독, 점선 2 ( )는 세포투과성이 없는 음성 대조군 (scrambled MTD), 점선 3 ( )은 MTD가 융합되지 않은 대조군 (HΔp53, HNΔp53), 실선은( ) 세포투과성 재조합 단백질 HM 39 Δp53, HNM 39 Δp53, HM 41 Δp53, HNM 41 Δp53 각 각을 나타낸다. [0229] [0230] <7-2> 동초점 레이저 주사현미경 관찰 II 상기 실시예에서 유세포 분석으로 1 차적으로 세포투과성이 확인된 본 발명의 세포투과성 p53 재조합 단백질의 세포 내 위치를 시각적으로 확인하기 위하여, 마우스의 섬유아세포에서 유래한 NIH3T3 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)에 FITC-표지된 세포투과성 p53 재조합 단백질 (HNM 39 p53, HNM 41 p53, HNp53M 39, HNp53M 41, HNM 39 p53m 39 및 HNM 41 p53m 41 )을 10 μm 의 농도로 처리하고 37 에서 1 시간 동안 배양한 후 동초점 레이저 주사현 미경 (confocal laser scanning microscopy)으로 관찰하였다. 사용된 NIH3T3 세포는 8-웰 챔버 슬라이드 (8- well chamber slide, LabTek, Nalgen Nunc)에서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, NIH3T3 세포는 10% FBS 및 5 % 페니실린/스트렙토마이신 500 mg/ml을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포를 PBS 로 3 회 세척 한 후, 무혈청 DMEM, FITC 함유 무혈청 DMEM, 또는 FITC-표지된 재조합 단백질 각각을 10 μm 로 함유하는 무혈 청 DMEM 으로 37, 5% CO 2 하에서 1 시간 동안 처리하였다. 1 시간 경과 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 실온에서 20분간 처리하여 고정시켰다. [0231] 상기에서 고정된 세포는 MTD 의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 핵을 형광 염색하는 PI (propidium iodide, Sigma-Aldrich) 대조염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였다. 1 μg/ml 농도로 5분 간 PI 로 염색한 후, 세포를 PBS 로 3 회 세척하였다. 세포 내 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 10 μl의 DABCO (Fluca) 함유 폴리비닐 알코올 중첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후 에 동초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다. 이때 동초점 레이저 주사현미경은 노르마스키 필터 (normaski - 22 -
filter)를 이용하여 세포의 원형, FITC 형광 및 PI 형광을 관찰하였고, FITC 는 488 nm에서 여기되고 530 nm 대역통과 필터 (bandpass filter)로 검출되었다. [0232] [0233] [0234] 그 결과, 도 11 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 FITC-표지된 세포투과성 p53 재조합 단백질은 세포 단독, FITC 단독 및 MTD 부재 대조군 (HNp53)에 비하여 핵 내에 광범위하게 분포하고 있음을 알 수 있다. JO-39 MTD 또는 JO-41 MTD 에 융합된 세포투과성 p53 재조합단백질의 세포내 핵 국소화는 상기 유세포 분석의 상대적 세포 투과성 결과에 비례하는 것으로, 상기 결과로부터 본 발명의 세포투과성 p53 재조합 단백질의 세포투과성을 확 인하였다. <7-3> 동초점 레이저 주사현미경 관찰 III 상기 실시예에서 유세포 분석으로 1 차적으로 세포투과성이 확인된 본 발명의 세포투과성 Δp53 재조합 단백질 의 세포 내 위치를 시각적으로 확인하기 위하여, 마우스의 섬유아세포에서 유래한 NIH3T3 세포 (한국세포주은행, 서울, 대한민국)에 FITC-표지된 세포투과성 p53 재조합 단백질 (HNM 39 Δp53 및 HNM 41 Δp53)을 10 μm의 농도로 처리하고 37 에서 1 시간 동안 배양한 후 동초점 레이저 주사현미경 (confocal laser scanning microscopy)으로 관찰하였다. 사용된 NIH3T3 세포는 8-웰 챔버 슬라이드 (8-well chamber slide, LabTek, Nalgen Nunc)에서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, NIH3T3 세포는 10% FBS 및 5% 페니실린/스트렙토 마이신 500 mg/ml을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포를 PBS 로 3 회 세척한 후, 무혈청 DMEM, FITC 함유 무혈청 DMEM, 또는 FITC-표지된 재조합 단백질 각각을 10 μm 로 함유하는 무혈청 DMEM 으로 37, 5 % CO 2 하에서 1 시간 동안 처리하였다. 1 시간 경과 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 실온에서 20 분간 처리하여 고정시켰다. [0235] [0236] [0237] [0238] 상기에서 고정된 세포는 MTD 의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 핵을 형광 염색하는 PI (propidium iodide, Sigma-Aldrich) 대조염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였다. 1 μg/ml 농도로 5분 간 PI 로 염색한 후, 세포를 PBS 로 3회 세척하였다. 세포 내 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 10 μl 의 DABCO (Fluca) 함유 폴리비닐 알코올 중첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후에 동초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다. 이때 동초점 레이저 주사현미경은 노르마스키 필터 (normaski filter)를 이용하여 세포의 원형, FITC 형광 및 PI 형광을 관찰하였고, FITC 는 488 nm에서 여기되고 530 nm 대역통과 필터 (bandpass filter)로 검출되었다. 그 결과, 도 12 에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 FITC-표지된 세포투과성 Δp53 재조합 단백질은 세포 단 독, FITC 단독 및 MTD 부재 대조군 (HNΔp53)에 비하여 핵 내에 광범위하게 분포하고 있음을 알 수 있다. JO-39 MTD 또는 JO-41 MTD 에 융합된 세포투과성 p53 재조합 단백질의 세포내 핵 국소화는 상기 유세포 분석의 상대적 세포투과성 결과에 비례하는 것으로, 상기 결과는 본 발명의 세포투과성 Δp53 재조합 단백질의 세포투과성을 다시 한번 입증하는 것이다. 실시예 8: 세포투과성 p53 재조합 단백질의 세포 내 기능 세포투과성이 입증된 p53 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 암 세포주를 대상으로 하기와 같이 웨스턴 블롯팅 (western blotting) 분석을 수행하였다. 본 실험에 이용된 인간 결장암 세포주 HCT-116 은 한국 세포주은행 (서울, 대한민국)에서 구입하였다. 상기 세포주들은 RPMI 1640 배지 (L-글루타민 300 mg/l, 25 mm HEPES 및 25 mm NaHCO 3 89.3%, 열 불활성화 우태아 혈청 9.8%, 스트렙토마이신/페니실린 0.9%)를 이용하여 5 % CO 2 가 공급되는 37 배양기에서 배양하였다. [0239] 6-웰 플레이트에 한 웰당 2 ml의 FBS 함유 RPMI 1640 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 HCT-116 세포들 을 각각 5 10 6 세포/ml의 농도로 접종하였다. 상기 웰 플레이트를 37 에서 1 일간 배양하여 세포들이 웰 플레 이트에 부착하면서 성장하도록 하였다. 배지를 제거한 후 웰 플레이트에 부착된 세포를 저온의 PBS 로 세척하였 다. 본 발명에 따른 세포투과성 p53 재조합 단백질 및 대조군으로서 MTD 가 융합되지 않은 p53 단백질 (Hp53)을 각각 20 μm 농도로 각 웰에 500 μl씩 처리한 후, 2 시간 동안 5% CO 2 가 공급되는 37 배양기에서 반응시켰 다. 2 시간 처리 후, 세포를 PBS 로 2 회 세척하고 혈청 존재 하에서 동일한 조건으로 9 시간 동안 배양하였다. [0240] 배양이 종결된 후, 세포를 100 μl의 용해 완충액 (20 mm HEPES, ph 7.2, 1% 트리톤-X, 10% 글리세롤 및 단백 분해효소 억제제 [proteinase inhibitor])을 이용하여 얼음에서 30 분간 분쇄하여 수집하고, 획득된 세포 용해 물 (cell lysate)을 100 에서 10 분간 가열한 후 상기 재조합 단백질을 20 μm 농도로 SDS-PAGE 로우딩 완충액 - 23 -